CN106191111A - 一种阻断转基因家蚕卵滞育的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种阻断转基因家蚕卵滞育的方法，包括如下步骤：(1)以家蚕实用滯育品种作为原始材料，通过转基因处理然后获取转基因滯育蚕卵；(2)将步骤(1)获得的转基因滯育蚕卵置于密闭环境中进行充氧处理，即得转基因阻断滯育蚕卵。该方法直接采用家蚕实用滯育品种作为原始材料，解决了保种困难的问题，且该方法安全、耗时短、便捷、绿色，适合于显微注射的蚕卵解除滯育，为人工阻断转基因家蚕卵滯育提供新途径。
Description
技术领域
本发明属于生物技术、生物工程领域，涉及转基因家蚕的制备方法，尤其涉及一种阻断转基因家蚕卵滞育的方法。
背景技术
随着piggyBac转座子在家蚕转基因中运用的不断完善，转基因技术在家蚕基因功能研究、遗传素材创新和生物反应器开发等领域发挥了重要作用，取得了丰硕的成果。
由于转基因家蚕产生需要经过注射、筛选、验证、杂交等多个步骤，还需要经过多代饲养获得纯品系。因此，目前家蚕转基因研究首选的受体材料主要为多化性家蚕品种的卵，但就其实用性而言具有很大的局限性：1、经济性状差；2、必须进行连续饲养，由于其不具有滞育期，利用其制作的转基因蚕必须依靠连续的饲养繁殖方能维持和继代，从而增加了生产成本和转基因系统丢失的风险。
相对多化性品种而言，二化性家蚕品种经济性状优异，不存在保种困难的问题，且已经大量用于蚕业生产，易于人们接受，使用二化性品种作为家蚕转基因的受体材料，在转基因蚕的推广上极具优势。但是，二化性家蚕品种用于转基因研究和应用，首先要解决的问题是阻断滞育。目前阻断滞育的方法主要有两种：低温催青法和早浸酸法。但是，两种方法均有其弊端，其中，低温催青法耗时长，需要近1个月的时间，且还需要反季节饲养，这些无疑都增加了制备转基因家蚕的难度；而早浸酸法由于浸酸时间过早、脱酸不净等原因影响转基因注射后蚕卵的转青率、孵化率，达不到实际科研生产需要，而不被采用。
因此，建立实用家蚕品种转基因技术，首要技术环节是建立高效的适合于显微注射的蚕卵滞育解除的方法。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种阻断转基因家蚕卵滞育的方法。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种阻断转基因家蚕卵滞育的方法，包括如下步骤：
(1)以家蚕实用滯育品种作为原始材料，通过转基因处理然后获取转基因滯育蚕卵；
(2)将步骤(1)获得的转基因滯育蚕卵置于密闭环境中进行充氧处理，即得转基因阻断滯育蚕卵。
进一步，步骤(1)中，所述家蚕实用滯育品种为二化性家蚕品种或一化性家蚕品种中的一种。
进一步，步骤(1)中，所述转基因滯育蚕卵由以下方法制备：
1)将家蚕实用滯育品种在25～26.5℃下催青后进行饲养，获得蚕蛾；
2)将步骤1)中的蚕蛾交配拆对后投放于上浆的蚕粘纸，在黑暗或者弱光的环境中产卵，每间隔1h收集一次蚕卵，获得G0代蚕卵，并将其置于24℃的环境中保护备用；
3)将步骤2)中的G0代蚕卵用镊子转移至用体积分数为75％的酒精消毒的载玻片上并排列整齐，以收集的时间开始计时，于收集后0～5h用显微注射仪将1～15nl、总浓度400ng/μl的转座载体质粒从蚕卵腹面中央注入，并用无毒的胶水封闭卵壳注射留下的小孔，得到转基因滯育蚕卵。
进一步，步骤(2)中，所述转基因滯育蚕卵为产后4～32h的蚕卵。
进一步，所述转基因滯育蚕卵为产后4～20h的蚕卵。
进一步，步骤(2)中，充氧处理前还包括将转基因滯育蚕卵经35％的甲醛蒸汽消毒5min。
进一步，步骤(2)中，所述充氧处理在氧气浓度为30％～85％、相对湿度为75％～90％、温度为25℃条件下充氧时间为10～50h。
进一步，所述氧气浓度为60％～80％，所述充氧时间为30～50h。
进一步，所述氧气浓度为70％。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种高效简便的方法用于阻断转基因家蚕卵滞育。首先，本发明直接采用生产中普遍使用的家蚕实用滯育品种作为原始材料，可以避免漫长而烦琐的育种过程，直接利用转基因技术创造出各种性状优良的新的特殊的家蚕品种，解决了多化性品种作为转基因素材难以胜任等问题，大大的缩短了育种的周期，节约了大量的人力和物力；其次，该方法克服了家蚕实用滯育品种低温催青法时间过长、早浸酸法孵化率低且不易掌握等缺陷，使用氧气替代盐酸和甲醛，不仅使得阻断家蚕卵滞育技术更安全、便捷、绿色、环保，还有效的简化操作程序，缩短培育时间。经本发明方法处理后，转基因家蚕卵注射条件下的孵化率可高达76.29％，转青率可达94.35％。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
图1为蚕卵经低温催青与经常温催青所用的时长对比图；
图2为经转基因显微注射处理后的滞育蚕卵，在产后不同时间点进行不同氧气浓度充氧处理40h，处理后的蚕卵常规催青约在10天后开始孵化，孵化时间为5天，蚕卵的良卵转青率情况。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例1
(1)以家蚕实用滯育品种作为原始材料，获取转基因滯育蚕卵；
1)将家蚕实用滯育品种在25℃条件下催青后进行饲养，获得蚕蛾；
2)获取滯育蚕卵：将步骤1)得到的蚕蛾交配拆对后投放于上浆的蚕粘纸，在黑暗或者弱光的环境中产卵，每间隔1h收集一次蚕卵，获得G0代蚕卵并将其置于24℃的环境中保护备用；
3)获取转基因滯育蚕卵：将步骤2)中的蚕卵用镊子转移至用75％的酒精消毒的载玻片上并排列整齐，取刚搜集的蚕卵用显微注射仪将1～15nl、总浓度400ng/μl的piggyBac空载：pBac[3xp3EGFP]转座载体质粒从蚕卵腹面中央注入，并用无毒的胶水封闭卵壳注射留下的小孔，得到转基因滯育蚕卵。
(2)获取转基因阻断滯育蚕卵：将步骤(1)中的为产后4h的蚕卵经35％的甲醛蒸汽消毒5min后置于三气培养箱，25℃下，湿度为75％，充入浓度为30％的氧气，并保持充氧时间为50小时密闭环境中进行充氧处理，处理后的蚕卵常规催青约在10天后开始孵化，孵化时间为5天，统计转基因滯育蚕卵经充氧处理后的转青及孵化情况。
实施例2
(1)以家蚕实用滯育品种作为原始材料，获取转基因滯育蚕卵；
1)将家蚕实用滯育品种在26.5℃条件下催青后进行饲养，获得蚕蛾；
2)获取滯育蚕卵：将步骤1)得到的蚕蛾交配拆对后投放于上浆的蚕粘纸，在黑暗或者弱光的环境中产卵，每间隔1h收集一次蚕卵，获得G0代蚕卵并将其置于24℃的环境中保护备用；
3)获取转基因滯育蚕卵：将步骤2)中的蚕卵用镊子转移至用75％的酒精消毒的载玻片上并排列整齐，以收集的时间开始计时，于收集后1h用显微注射仪将1～15nl、总浓度400ng/μl的piggyBac空载：pBac[3xp3EGFP]转座载体质粒从蚕卵腹面中央注入，并用无毒的胶水封闭卵壳注射留下的小孔，得到转基因滯育蚕卵；
(2)获取转基因阻断滯育蚕卵：将步骤(1)中的为产后11h的蚕卵经35％的甲醛蒸汽消毒5min后置于三气培养箱，25℃下，湿度为80％，充入浓度为40％的氧气，并保持充氧时间为40小时密闭环境中进行充氧处理，处理后的蚕卵常规催青约在10天后开始孵化，孵化时间为5天，统计转基因滯育蚕卵经充氧处理后的转青及孵化情况。
实施例3
步骤1)、2)如实施例1；
3)获取转基因滯育蚕卵：将步骤2)中的蚕卵用镊子转移至用75％的酒精消毒的载玻片上并排列整齐，以收集的时间开始计时，于收集后2h用显微注射仪将1～15nl、总浓度400ng/μl的piggyBac空载：pBac[3xp3EGFP]转座载体质粒从蚕卵腹面中央注入，并用无毒的胶水封闭卵壳注射留下的小孔，得到转基因滯育蚕卵；
(2)获取转基因阻断滯育蚕卵：将步骤(1)中的为产后18h的蚕卵经35％的甲醛蒸汽消毒5min后置于三气培养箱，25℃下，湿度为85％，充入浓度为50％的氧气，并保持充氧时间为30小时密闭环境中进行充氧处理，处理后的蚕卵常规催青约在10天后开始孵化，孵化时间为5天，统计转基因滯育蚕卵经充氧处理后的转青及孵化情况。
实施例4
步骤1)、2)如实施例1；
3)获取转基因滯育蚕卵：将步骤2)中的蚕卵用镊子转移至用75％的酒精消毒的载玻片上并排列整齐，以收集的时间开始计时，于收集后3h用显微注射仪将1～15nl、总浓度400ng/μl的piggyBac空载：pBac[3xp3EGFP]转座载体质粒从蚕卵腹面中央注入，并用无毒的胶水封闭卵壳注射留下的小孔，得到转基因滯育蚕卵；
(2)获取转基因阻断滯育蚕卵：将步骤(1)中的为产后25h的蚕卵经35％的甲醛蒸汽消毒5min后置于三气培养箱，25℃下，湿度为85％，充入浓度为60％的氧气，并保持充氧时间为20小时密闭环境中进行充氧处理，处理后的蚕卵常规催青约在10天后开始孵化，孵化时间为5天，统计转基因滯育蚕卵经充氧处理后的转青及孵化情况。
实施例5
步骤1)、2)如实施例1；
3)获取转基因滯育蚕卵：将步骤2)中的蚕卵用镊子转移至用75％的酒精消毒的载玻片上并排列整齐，以收集的时间开始计时，于收集后4h用显微注射仪将1～15nl、总浓度400ng/μl的piggyBac空载：pBac[3xp3EGFP]转座载体质粒从蚕卵腹面中央注入，并用无毒的胶水封闭卵壳注射留下的小孔，得到转基因滯育蚕卵；
(2)获取转基因阻断滯育蚕卵：将步骤(1)中的为产后32h的蚕卵经35％的甲醛蒸汽消毒5min后置于三气培养箱，25℃下，湿度为90％，充入浓度为70％的氧气，并保持充氧时间为10小时密闭环境中进行充氧处理，处理后的蚕卵常规催青约在10天后开始孵化，孵化时间为5天，统计转基因滯育蚕卵经充氧处理后的转青及孵化情况。
实施例6
步骤1)、2)如实施例1；
3)获取转基因滯育蚕卵：将步骤2)中的蚕卵用镊子转移至用75％的酒精消毒的载玻片上并排列整齐，以收集的时间开始计时，于收集后5h用显微注射仪将1～15nl、总浓度400ng/μl的piggyBac空载：pBac[3xp3EGFP]转座载体质粒从蚕卵腹面中央注入，并用无毒的胶水封闭卵壳注射留下的小孔，得到转基因滯育蚕卵；
(2)获取转基因阻断滯育蚕卵：将步骤(1)中的为产后32h的蚕卵经35％的甲醛蒸汽消毒5min后置于三气培养箱，25℃下，湿度为90％，充入浓度为80％的氧气，并保持充氧时间为10小时密闭环境中进行充氧处理，处理后的蚕卵常规催青约在10天后开始孵化，孵化时间为5天，统计转基因滯育蚕卵经充氧处理后的转青及孵化情况。
实施例7
步骤1)、2)、3)如实施例5；
(2)获取转基因阻断滯育蚕卵：将步骤(3)中的为产后18h的蚕卵经35％的甲醛蒸汽消毒5min后置于三气培养箱，25℃下，湿度为85％，充入浓度为85％的氧气，并保持充氧时间为30小时密闭环境中进行充氧处理，处理后的蚕卵常规催青约在10天后开始孵化，孵化时间为5天，统计转基因滯育蚕卵经充氧处理后的转青及孵化情况。
按照实施例1～7的方法，经转基因显微注射处理后，以产后20h的滞育蚕卵为实验对象，在氧气浓度为70％的条件下充氧处理40h，处理后的蚕卵常规催青约在10天后开始孵化，孵化时间为5天，统计孵化卵、转青死卵、滞育卵、死卵(不含转青死卵)，计算转青率和孵化率，结果见表1。
表1
由表1可知，通过充氧处理后，绝大多数转基因滞育蚕卵转变成了转基因阻断滞育蚕卵，并且其良卵孵化率平均可高达76.29％，良卵转青率平均可高达94.35％。
图2为经转基因显微注射处理后的滞育蚕卵在产后时间4h、9h、20h，氧气浓度为30％～85％条件下充氧处理40h，处理后的蚕卵常规催青约在10天后开始孵化，孵化时间为5天，蚕卵的良卵转青率情况。由图可知，三个产后时间的转基因滯育蚕卵经充氧处理后的良卵转青率随着氧气浓度的增加，先增大后变小，均在氧气浓度为70％时达到最大。
对比实施例1
(1)将家蚕滯育蚕卵置于生化培养箱(SPX-250)在15℃的低温、湿度为75％、黑暗条件下催青，至转青后第3天(即孵化前1d)转移到25～26℃保护，催青时间32d。收蚁后常规饲养，得到蚕蛾。将蚕蛾交配拆对后投放于上浆的蚕粘纸获得G0代蚕卵；
步骤(2)如实施例1中3)，获得转基因蚕卵。
将步骤(2)中的转基因蚕卵孵化后，统计孵化卵、转青死卵、滞育卵、死卵(不含转青死卵)，计算转青率和孵化率，其中良卵孵化率为56.01％，良卵转青率为99.29％。虽然通过低温催青处理后，蚕卵的良卵孵化率和良卵转青率都取得了好的结果，但是，由图1可知，图中1轴展示蚕卵经低温催青处理到孵化的时长，需耗时32天；2轴展示蚕卵在25℃条件下催青处理到孵化的时长，仅耗时9天，而充氧处理的对象为25℃条件下催青处理后获得的蚕蛾产下的G0代蚕卵，所以与低温催青相比，大大缩短了获得G0代蚕卵的时间。另外，经低温催青处理后的蚕卵需要反季节饲养，而25℃处理的蚕卵无需反季节饲养，即不需要单独的房间设备来控制饲养条件，减少了饲养成本。
对比实施例2
步骤(1)如实施例1中1)、2)；
(2)收集产下后2h的蚕卵，用15～16％HCI于46℃水浴处理2.5min，然后用自来水冲洗蚕卵约15min；
步骤(3)如实施例1中3)，获得转基因蚕卵。
将步骤(3)中的转基因蚕卵孵化后，统计孵化卵、转青死卵、滞育卵、死卵(不含转青死卵)，计算转青率和孵化率，结果见表2。
表2
由表2可知，对转基因滞育蚕卵进行早浸酸法处理，其良卵孵化率极低，良卵转青率平均为58.64％，由于其孵化率极低，所以早浸酸的方法不能用于转基因注射后蚕卵滞育的阻断。
上述实施例中，家蚕实用滯育品种除了使用二化性家蚕品种，还可以使用一化性家蚕品种，可以达到阻断转基因家蚕卵滯育的效果。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (9)
1.一种阻断转基因家蚕卵滞育的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以家蚕实用滯育品种作为原始材料，通过转基因处理然后获取转基因滯育蚕卵；
(2)将步骤(1)获得的转基因滯育蚕卵置于密闭环境中进行充氧处理，即得转基因阻断滯育蚕卵。
2.如权利要求1所述的一种阻断转基因家蚕卵滞育的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述家蚕实用滯育品种为二化性家蚕品种或一化性家蚕品种中的一种。
3.如权利要求1所述的一种阻断转基因家蚕卵滞育的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述转基因滯育蚕卵由以下方法制备：
1)将家蚕实用滯育品种在25～26.5℃下催青后进行饲养，获得蚕蛾；
2)将步骤1)中的蚕蛾交配拆对后投放于上浆的蚕粘纸，在黑暗或者弱光的环境中产卵，每间隔1h收集一次蚕卵，获得G0代蚕卵，并将其置于24℃的环境中保护备用；
3)将步骤2)中的G0代蚕卵用镊子转移至用体积分数为75％的酒精消毒的载玻片上并排列整齐，以收集的时间开始计时，于收集后0～5h用显微注射仪将1～15nl、总浓度400ng/μl的转座载体质粒从蚕卵腹面中央注入，并用无毒的胶水封闭卵壳注射留下的小孔，得到转基因滯育蚕卵。
4.如权利要求1所述的一种阻断转基因家蚕卵滞育的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述转基因滯育蚕卵为产后4～32h的蚕卵。
5.如权利要求4所述的一种阻断转基因家蚕卵滞育的方法，其特征在于，所述转基因滯育蚕卵为产后4～20h的蚕卵。
6.如权利要求1所述的一种阻断转基因家蚕卵滞育的方法，其特征在于，步骤(2)中，充氧处理前还包括将转基因滯育蚕卵经35％的甲醛蒸汽消毒5min。
7.如权利要求1所述的一种阻断转基因家蚕卵滞育的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述充氧处理在氧气浓度为30％～85％、相对湿度为75％～90％、温度为25℃条件下充氧时间为10～50h。
8.如权利要求7所述的一种阻断转基因家蚕卵滞育的方法，其特征在于，所述氧气浓度为60％～80％，所述充氧时间为30～50h。
9.如权利要求8所述的一种阻断转基因家蚕卵滞育的方法，其特征在于，所述氧气浓度为70％。
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