CN108849765A - 一种稻飞虱卵的显微注射和人工孵化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种稻飞虱卵的显微注射和人工孵化方法，属于农业昆虫研究领域。该方法主要步骤包括：首先，制备虫卵固定板。将耐高温高压的双面胶一侧保护膜撕掉后粘到滤纸上，另一侧保护膜剪去约0.2cm，高压灭菌后将滤纸置于含有青霉素G钾、硫酸链霉素、硫酸新霉素和两性霉素B的2％琼脂固体培养基上自然浸润。其次，在解剖镜下取稻飞虱卵，用70％乙醇消毒，无菌水润洗，润洗后的虫卵排列于固定板的双面胶上。然后，在卵腹侧中部进行显微注射，注射完毕后，将含有虫卵的固定板置于人工培养箱进行卵的孵化。本发明提供的方法是一种适用于稻飞虱基因编辑、卵发育等研究的卵显微注射和人工孵化方法，为在稻飞虱上开展基因敲除等研究提供了实施途径。
Description
技术领域
本发明涉及一种稻飞虱卵的显微注射和人工孵化方法，属于农业昆虫研究领域。
背景技术
稻飞虱为同翅目飞虱科昆虫，是威胁我国水稻安全生产的重要害虫。在我国发生危害的稻飞虱主要有褐飞虱Nilaparvata lugens、白背飞虱Sogatella furcifera(Horvath)和灰飞虱Laodelphax striatellus Fallen。稻飞虱可通过刺吸水稻茎干和叶片，虫量大时可造成植株干枯，引起火烧状症状。
除刺吸危害外，这三种稻飞虱还传播5种主要的水稻病毒病：(1)灰飞虱传播水稻条纹叶枯病和水稻黑条矮缩病；(2)褐飞虱传播水稻齿叶矮缩病和水稻草矮病；(3)白背飞虱传播南方水稻黑条矮缩病。南方水稻黑条矮缩病2001年首次在我国广东省发现，2009年该病害在我国广东、江西、湖南等9个省份大面积暴发，受害面积约33.33万hm2，2010年受害面积达133万hm2。水稻黑条矮缩病在我国60年代和90年代有过两次大暴发，2007年后在江苏粳稻上普遍发生，2008年仅江苏省发病面积达26.7万hm2。此外，其他几种病毒病害也给水稻生产造成了严重的损失。
褐飞虱、白背飞虱和灰飞虱基因组信息均已公布，为研究稻飞虱基因功能、稻飞虱传病毒机制等研究提供了条件。传统的昆虫基因功能研究主要通过遗传操作方法进行，如通过病毒转染和基于转座子元件的转基因等方法，这些方法操作难度大，仅在少数几种昆虫中有所应用。现常用的技术是对昆虫的若虫或成虫采用饲喂目的基因的dsRNA或采用显微注射方法注射目的基因的dsRNA，降低目的基因的表达量，从而分析目的基因的功能。但dsRNA饲喂或注射方法仅能降低目的基因的表达，不能完全抑制基因的表达，存在一定的局限性。近年来，ZFNs、TALENs、CRISPR/Cas等基因组编辑技术为基因功能研究提供了新的有效方法。利用CRISPR系统可以对目的基因进行精确的编辑，包括对基因组片段进行精确删除、基因组DNA单碱基替换等。采用基因编辑技术研究昆虫基因功能时，昆虫卵的显微注射及人工孵化是开展昆虫基因编辑的关键步骤。稻飞虱的卵呈香蕉形、茄形或新月形等，其卵的显微注射方法不能参照果蝇等模式昆虫卵的常规显微注射方法进行，因此迫切需要针对稻飞虱卵的特点，建立有效的注射方法，并建立卵的人工孵化体系。
发明内容
本发明的目的是提供一种稻飞虱卵的显微注射和人工孵化方法，该方法可用于稻飞虱基因编辑等研究。具体方法包括以下步骤：
1、制备虫卵固定板。
(1)撕掉耐高温高压的双面胶一侧的保护膜，粘到滤纸上，另一侧保护膜剪去约0.2cm，高压灭菌后备用。
(2)将2％琼脂高温灭菌，待冷却至约55℃时，在超净台下加入4种抗生素后将培养基倒入培养皿中，冷却凝固。4种抗生素的成分和浓度如下：
60ug/ml 青霉素G钾
100ug/ml 硫酸链霉素
50ug/ml 硫酸新霉素
0.8ug/ml 两性霉素B
(3)将灭菌的粘有双面胶的滤纸用无菌水润湿，置于含有抗生素的2％琼脂固体培养基上。
2、虫卵的收集和处理。
稻飞虱在水稻幼苗上产卵1小时后，剪取水稻叶鞘，在解剖镜下用显微手术镊取卵，在无菌培养皿上滴一滴70％乙醇，将卵放入10分钟后取出，置于无菌水液滴中进行润洗，取出后置于虫卵固定板上。
3、虫卵的显微注射。
(1)卵的放置。润洗后的虫卵排列于固定板的双面胶上，卵尾粘附至双面胶上，卵冒朝外侧，卵腹侧朝向显微注射针。
(2)卵的显微注射位置：卵体腹侧中部。
(3)显微注射：用5-10微米的显微注射针进行显微注射。使用SHUTTER P-97拉针仪制备显微注射针，参数为：Heat值460，Pull值25，Velocity值26，Time值225。
4、虫卵的人工孵化
(1)注射完毕后，将含有虫卵的固定板盖上培养皿的盖子，置于24～28℃人工培养箱进行卵的孵化；
(2)孵化后的若虫转移至水稻幼苗上培养。
本发明提供的稻飞虱卵显微注射和人工孵化方法，在显微注射时，采用5-10微米的显微注射针对腹部进行注射。针对稻飞虱卵腹侧中部进行注射，受力较稳定，而在卵背侧或其他位置注射时易翻转，不易注射。稻飞虱卵通常为茄形、香蕉形或新月形，注射时无法用玻璃吸管负压固定卵的位置。本发明采用虫卵固定板，解决了虫卵注射时较难固定的问题。虫卵在固定板上排列时，仅卵尾粘附在固定板上，注射后在固定板上直接进行孵化，为卵孵化时的顺利脱壳提供了支撑物。虫卵进行显微注射后，存在伤口，极易被真菌细菌感染。虫卵取卵后，采用70％乙醇进行消毒，减少了卵被真菌细菌感染的风险。显微注射后虫卵在无菌恒湿的固定板上进行孵化，固定板含有4种抗生素，青霉素G钾、硫酸链霉素和硫酸新霉素可以预防细菌感染，两性霉素B可以预防真菌感染，显著提高了卵的孵化率和存活率。
具体实施方式
以下以案例展示本发明的内容，但本发明的内容不限于本文所描述的实施案例。
实施例1：
灰飞虱卵的显微注射和人工孵化方法，该方法包括以下步骤：
1、取产卵期灰飞虱成虫30-50头，放入种植有10-20株水稻苗的一次性塑料杯中，产卵1小时，产卵后将成虫用毛笔扫出；
2、剪取水稻叶鞘，在解剖镜下用显微手术镊取卵，在无菌培养皿上滴一滴70％乙醇，将卵放入70％乙醇10分钟后取出，置于无菌水液滴中进行润洗，取出后置于虫卵固定板上；
3、润洗后的虫卵排列于固定板的双面胶上，卵尾粘附至双面胶上，卵冒朝外侧，卵腹侧朝向显微注射针。
4、用5-10微米的显微注射针对准卵体腹侧进行注射；
5、注射完毕后将固定板转移至25℃人工培养箱进行孵育；
6、孵化后若虫转移至水稻幼苗上进行培养。
稻飞虱卵表面有一层坚硬的卵壳，如若不采用固定板，无法直接进行显微注射。采用本发明的固定板直接进行卵的孵化，可显著提高卵的孵化率。取45头灰飞虱卵，直接放置于不含抗生素的0.8％的琼脂平板上，置于25℃人工培养箱进行培养，孵化至第4天时，卵全部感染真菌或细菌，无法正常孵化；当卵采用70％乙醇处理，并采用无菌固定板孵化时，在孵化第7天时，45头卵正常孵化23头，孵化率为53％，其中部分卵未孵化的原因是由于在取卵时造成损伤，导致卵不能正常孵化。
Claims (4)
1.一种稻飞虱卵的显微注射和人工孵化方法，其特征在于：将虫卵置于虫卵固定板上，在解剖镜下取稻飞虱卵后，用70％乙醇消毒后无菌水润洗，润洗后的虫卵排列于固定板的双面胶上，在卵腹侧中部进行显微注射，注射完毕后，将含有虫卵的固定板置于人工培养箱进行卵的孵化。
2.根据权利要求1所述的方法，虫卵固定板的制备方法为：耐高温高压的双面胶一侧保护膜撕掉后粘到滤纸上，另一侧保护膜剪去约0.2cm，高压灭菌后，置于含有青霉素G钾、硫酸链霉素、硫酸新霉素和两性霉素B的2％琼脂固体培养基上。
3.根据权利要求1所述的方法，卵在固定板上的放置方向为卵尾粘附至双面胶上，卵冒朝外侧，卵腹侧朝向显微注射针。
4.根据权利要求1所述的方法，卵的人工孵化方法为将含有虫卵的固定板置于24～28℃人工培养箱进行孵化。
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|---|---|---|---|---|
| CN113693028A (zh) * | 2021-08-05 | 2021-11-26 | 广州威佰昆生物科技有限公司 | 一种采用显微注射处理柑橘木虱的方法 |
| CN113693030A (zh) * | 2021-08-26 | 2021-11-26 | 华南农业大学 | 一种将昆虫外源共生菌Wolbachia人工转染至柑橘木虱中的方法 |
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| CN108849765B (zh) | 2021-07-02 |
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