CN112741021B - 一种胚蛋注射蛋壳封口的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种胚蛋注射蛋壳封口的方法，包括如下具体步骤：（1）材料准备；将供体胚蛋、所用试剂、仪器、蛋壳及壳膜进行消毒；准备所用病毒；（2）胚蛋开口：先将胚蛋开窗，显示胚胎后进行胚蛋注射；（3）胚蛋封口：先使用壳膜封口，再将蛋壳封口，最后用胶水和胶带封口；（4）重新孵化：将蛋放置于孵化器中进行孵化。本发明降低了胚蛋转基因技术的成本，提高了胚蛋转基因之后的胚蛋成活率，减少了由于胚蛋注射其他物质而导致的孵化率低的问题。
Description
技术领域
本发明属于胚蛋孵化技术领域，具体涉及一种胚蛋注射蛋壳封口的方法。
背景技术
大量人类医用蛋白，由工业生物反应器生产，但建立其生产系统的时间长，而且耗资巨大。未来对基因工程药用蛋白需求的日益增长，使得研究焦点集中在寻求一些更好的生产技术平台。目前，这类医用蛋白产品已在转基因动物中研究成功，包括绵羊、山羊、牛、兔和鸡。2006年利用转基因羊乳汁生产的治疗血凝疾病的转基因药物，终于在芬兰正式上市，给转基因动物在生物制药领域的应用带来了希望。此外，转基因技术也是动物抗病育种领域研究的趋势。在禽类，将转基因禽蛋作为生物反应器，比转基因哺乳动物表达系统有明显的优势。有学者利用慢病毒载体实现了家禽输卵管组织特异性表达2种医用蛋白，这批转基因鸡能传代而且不会出现转基因的沉默，生下了含有抗癌药物的蛋。由于导入了病毒载体后，鸡胚的成活率大幅度降低(一般在10％左右)，而且病毒载体的成本相对较高，由于样本数的问题，使得结果很不稳定，而且试验组之间也很难得出有统计意义的数据，严重制约了转基因禽类生物反应器研究的进展。
目前，转基因禽类生物反应器研究，靶细胞似乎集中到了新产蛋囊胚(操作禽类胚胎的最佳时期)或孵化一定时期后的鸡胚；表达载体集中到了逆转录病毒载体或慢病毒表达载体，载体导入开始趋向于赤道面开窗不换壳培养的方式。在表达载体构建上，国内外还存在较大的差距；而在载体导入鸡胚(靶细胞)的技术上，种蛋具有价格低廉、与哺乳动物胚胎相似和易于操作等诸多优势，一直作为经典的胚胎生物学模型用于科学研究，尤其是在发育生物学上，作为一个重要的模型系统已具有一个多世纪的悠久历史，现在胚蛋已经成为洞悉胚胎发育和胚胎细胞分化生长的一个经典实验模型；而随着生物技术的不断进步和发展，胚蛋已经成为最优秀的实验系统之一。此外，胚蛋在建立医学模型，尤其是肿瘤模型等领域一直是研究热点。
针对产出后家禽胚胎的操作一般有2种方案可供选择，其一是采用替代蛋壳的方法，这种方法对操作要求较高；另一种是在蛋壳上开窗的方法。第一种方法采用的是把胚蛋完全打开，这样可以完全暴露出受精胚。注射完成之后，把注射完的重新找一个空蛋壳再放入密封，这种方法优点是鸡蛋完全暴露对于注射难度来说减小，但换壳过程中操作极为不便，且所需操作环境要求很高，操作难度大，所以一般不采用这种方式。
目前胚蛋注射的方法主要有通过于禽蛋赤道板位置开窗口，保留完整蛋壳膜，以窗口中心为圆心以热熔胶等在蛋壳上围成一个同心封闭圈，待同心封闭圈与蛋壳表面粘合牢固后滴加生理缓冲液，在缓冲液封阻条件下去除蛋壳膜，定位胚胎并进行胚胎操作，然后用事先准备好的蛋壳膜在液面下完全覆盖窗口，以吸水纸吸取封闭圈中的多余液体，再以热熔胶或明胶充填封闭圈内部进行封口；这种方法由于采取了热溶胶的方式导致其在蛋壳上的熔胶温度很高且操作极为不易。在作为实验模型进行操作时，大多采取开窗后复原的技术，但胚蛋开窗后会导致孵化率大幅度下降。对于胚蛋开窗方法还有胶布封口法，采用透气性医用胶布将开窗小口封严；胶布+石蜡膜法，在透气性医用胶布封口的基础上，加封一层石蜡膜，这种方法操作难度较大，且对胚蛋的孵化率有较大的影响。
本发明将转基因中胚蛋注射蛋壳封口方法进一步进行改善；通过对国内外专利文献、期刊杂志及其他公开发表的文献进行检索，本发明在国内外未见报道，我们也未公开发表涉及本发明内容的文章，本发明在国内外公众未知。
发明内容
针对现有技术中，胚蛋注射时寻胚困难以及传统开窗复原、胚蛋注射造成胚蛋破坏大孵化率低的问题，本发明的目的是提供一种胚蛋注射蛋壳封口的方法，有效解决了胚蛋孵化前期寻找注射的困难以及对于胚蛋破坏大而导致的孵化率低的问题，可供有意从事家禽转基因技术研究涉及受精蛋注射方面研究使用。
为了达到本发明的目的，所采取的技术方案包括：
一种胚蛋注射蛋壳封口的方法，包括如下具体步骤：
(1)材料准备；将供体胚蛋、所用试剂、仪器、蛋壳及壳膜进行消毒；准备所用病毒；
(2)胚蛋开口：先将胚蛋开窗，显示胚胎后进行胚蛋注射；
(3)胚蛋封口：先使用壳膜封口，再将蛋壳封口，最后用胶水和胶带封口；
(4)孵化：将蛋放置于孵化器中进行孵化。
作为本申请的优选技术方案，所述步骤(1)中，供体胚蛋处理方法如下：在进行实验前，将事先准备好的授精蛋用75％的酒精清洁鸡蛋表面，同时将钝头向上室温静置。
更优选的，所述静置时间为24h。
作为本申请的优选技术方案，所述步骤(2)中，胚蛋开窗的具体步骤如下：将未孵化的胚蛋钝端向上放置，在钝端的气室部位开一孔，然后沿着孔扩大孔的面积，完全暴露气室，在暴露的气室顶部开一个小窗，尽可能小的破坏内壳膜。
更优选的，所述小窗的面积为0.5-1cm2。
更优选的，所述开孔的工具为镊子。
作为本申请的优选技术方案，所述步骤(2)中，显示胚胎的具体步骤如下：转动胚蛋，直接胚胎处于开口的小窗位置，固定胚蛋，将固定的胚蛋放置于体视镜下确定胚胎位置。
作为本申请的优选技术方案，所述步骤(2)中，胚蛋注射的方法如下：使用显微操作针打入所需剂量的病毒。
作为本申请的优选技术方案，所述步骤(3)中，壳膜封口的方法如下：使用步骤(1)准备好的壳膜，剪出略大于钝头开口的面积，将注射完的胚蛋的开口位置完全覆盖上。
作为本申请的优选技术方案，所述步骤(3)中，蛋壳封口的方法如下：使用步骤(1)准备好的蛋壳，将被壳膜封口的胚蛋连同壳膜完全覆盖起来。
作为本申请的优选技术方案，所述步骤(3)中，用胶水和胶带封口的方法如下：将被蛋壳封口的胚蛋的边缘处首先使用502胶水进行封口固定，然后使用医用胶带将被502胶水固定的位置沿着边缘处再次进行封口，同时使用镊子的后端沿着边缘部分挤压保证蛋壳边缘部分能够完全的粘合固定。
有益效果
本发明提供的一种胚蛋注射蛋壳封口的方法，与现有技术相比，具有如下有益效果：
(1)材料方便寻找且价格便宜方便易得，降低了胚蛋转基因技术的成本；
(2)本发明提高了胚蛋转基因之后胚蛋的成活率，减少了胚蛋由于注射了其他物质而导致的孵化率低导致的成本浪费；
(3)本发明的方法改善了胚蛋注射之后孵化率不高的问题；为后续胚蛋的转基因注射的发展提供了另一种方式，拥有巨大潜力；
(4)对胚蛋的注射有更方便的视野，易于操作。
附图说明
图1为本发明通过开蛋器切的蛋壳；
图2为开口位置及胚蛋位置；
图3为本发明成品胚蛋图；
图4为本发明的具体操作方法示意图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步详细说明。所用试剂或者仪器设备未注明生产厂商的，均视为可以通过市场购买的常规产品。
实施例1
(1)前期准备：
再将事先准备好的授精蛋用75％的酒精清洁鸡蛋表面，再将钝头向上室温静置24h；
用开蛋器取下一蛋壳，使用PBS缓冲液(Ph 7.4)清洗壳膜后，将蛋壳以及将要使用的医用胶带、502胶水、镊子等在紫外线环境下照射30min，灭菌消毒；
准备试验所需的腺病毒，并分别稀释至5倍和100倍。
(2)开蛋注射：
将未孵化的胚蛋钝端向上放置，在钝端(气室部位)用镊子扎一小孔，然后用镊子沿着小孔扩大孔的面积，完全暴露气室；在暴露的气室最顶部撕开壳膜开一个0.5-1cm2的小窗，同时尽可能小的破坏内壳膜；
转动胚蛋(白色圆形)位置，直到胚胎处于开口的小窗位置，固定胚蛋位置；由于已经静置24h，胚胎位置基本开口位置；
将固定的胚蛋放置于体视镜下确定胚胎位置，使用显微操作针对准暴露的胚胎位置插入到胚胎中然后转动显微操作针打入所需的计量的腺病毒。
(3)胚蛋封口：
使用之前准备的壳膜剪出略大于钝头开孔的面积，将注射完成的胚蛋的开口位置完全覆盖上；
使用事先准备好的蛋壳，将被壳膜封口的胚蛋连同壳膜完全覆盖起来；
将被蛋壳封口的胚蛋的边缘处首先使用一遍502胶水进行封口固定，然后使用医用胶带将被502胶水固定的位置沿着边缘处再次进行封口，同时使用镊子的后端沿着边缘部分挤压保证封口的蛋壳边缘部分能够完全的粘合固定。
(4)孵化：
将蛋钝头向上放置于孵化器中，温度37.5℃，湿度60％。在蛋的封口和孵化过程中尽量小心操作。在胚胎期第5、12、18天的成活率及出雏率的结果。结果见表1。
对比例1
其他操作同实施例1，不同点在于未进行开蛋注射以及种蛋封口处理。
对比例2
其他操作同实施例1，不同点在于封口时采用热熔胶封口法(普通封口法)。
表1第5、12、18天的成活率及出雏率的结果
在不同时间点对胚蛋的成活率的结果可以看出，在重新孵化的第5天，胚蛋出现少量的死亡，但整体上处于稳定的状态。普通封口法的在孵化到第五天生物死亡率达到50％，本方法的存活率显著大于传统的方式。到最后的孵化率也可以看出此方法可以有效的增加由于胚蛋注射后的胚蛋的孵化率。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。
Claims (7)
1.一种胚蛋注射蛋壳封口的方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
（1）材料准备；将供体胚蛋、所用试剂、仪器、蛋壳及壳膜进行消毒；准备所用病毒；
（2）胚蛋开口：先将胚蛋开窗，显示胚胎后进行胚蛋注射；
（3）胚蛋封口：先使用壳膜封口，再将蛋壳封口，最后用胶水和胶带封口；
（4）孵化：将蛋钝头向上放置于孵化器中进行孵化；
所述步骤（3）中，壳膜封口的方法如下：使用步骤（1）准备好的壳膜，剪出略大于钝头开口的面积，将注射完的胚蛋的开口位置完全覆盖上；
所述步骤（3）中，蛋壳封口的方法如下：使用步骤（1）准备好的蛋壳，将被壳膜封口的胚蛋连同壳膜完全覆盖起来；
所述步骤（3）中，用胶水和胶带封口的方法如下：将被蛋壳封口的胚蛋的边缘处首先使用502胶水进行封口固定，然后使用医用胶带将被502胶水固定的位置沿着边缘处再次进行封口，同时使用镊子的后端沿着边缘部分挤压保证蛋壳边缘部分能够完全的粘合固定。
2.根据权利要求1所述的一种胚蛋注射蛋壳封口的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，供体胚蛋处理方法如下：在进行实验前，将事先准备好的授精蛋用75%的酒精清洁鸡蛋表面，同时将钝头向上室温静置。
3.根据权利要求2所述的一种胚蛋注射蛋壳封口的方法，其特征在于，静置时间为24h。
4.根据权利要求1所述的一种胚蛋注射蛋壳封口的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，胚蛋开窗的具体步骤如下：
将未孵化的胚蛋钝端向上放置，在钝端的气室部位开一孔，然后沿着孔扩大孔的面积，完全暴露气室，在暴露的气室顶部开一个小窗，尽可能小的破坏内壳膜。
5.根据权利要求4所述的一种胚蛋注射蛋壳封口的方法，其特征在于，所述小窗的面积为0.5-1cm2。
6.根据权利要求4所述的一种胚蛋注射蛋壳封口的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，显示胚胎的具体步骤如下：转动胚蛋，直到胚胎处于开口的小窗位置，固定胚蛋。
7.根据权利要求1所述的一种胚蛋注射蛋壳封口的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，胚蛋注射的方法如下：使用显微操作针打入所需剂量的病毒。
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| GR01 | Patent grant | ||
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