CN104472397B - 一种用于转基因禽制备的种蛋开窗封口方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于家禽转基因技术领域，具体涉及一种用于转基因禽制备的种蛋开窗封口方法。属于禽蛋接种实验的一种辅助方法，本发明的特征在于：将种蛋消毒后水平放置2h，在种蛋赤道面粘贴一块透明胶带；用眼科剪在粘贴了胶带的赤道面剪切开窗，窗口直径为1‑1.2cm，从锐端向钝端剪切再回到锐端，保留开窗的蛋壳粘连在赤道面靠近锐端处，用眼科镊去除壳膜；通过窗口进行胚胎操作，再将粘连的蛋壳复原，并粘贴一块透明胶带封口，种蛋放回孵化箱孵化和后续实验。本发明提供的种蛋开窗与封口方法，操作简单，方便快捷，不需要特殊的技术和对仪器设备的依赖，适用于多种不同的胚胎操作，封口严密，有效提高了转基因禽制备的效率。
Description
技术领域
本发明属于家禽转基因技术领域，具体涉及一种用于转基因禽制备的种蛋开窗封口方法。实质上属于家禽转基因技术领域的一种辅助方法。与禽蛋接种实验相关。
背景技术
随着分子生物学技术的发展及一系列模式生物基因组计划的相继完成，生命科学研究已取得了重大突破，中国在生命科学领域也做出了巨大的贡献。目前，多种动物的全基因组测序工作已完成，然而基因组序列测定的完成仅仅是基因组计划的第一步，更大的挑战在于如何确定基因的功能并阐述其调控的机理。禽类作为科学研究中的一种模式生物，其胚胎对于基因功能的研究有着无法取代的优点。随着新技术的发展及鸡、鸭等禽类基因组序列的完成，禽类胚胎在发育生物学、遗传学、免疫学等研究领域的重要性日益凸显，推动了禽类功能基因研究工作的开展。利用禽类胚胎模型进行基因功能的研究，首先要解决在胚胎中实现外源基因转移的问题。
种蛋开窗是实现外源基因转移的第一步工作，开窗采用的方法、开窗部位等均严重影响胚胎的存活率及后期的发育情况。种蛋开窗部位主要包括锐端开窗、钝端开窗和赤道面开窗，其中最常用的是赤道面开窗，因为在赤道面开窗，胚胎与眼睛的距离较近，操作方便，并能保持胚胎气室的完整性，利于种蛋的孵化和胚胎的发育。种蛋的开窗方法主要集中在机械开窗法中机械的选择，如马达磨轮、钻孔器、手术刀片、自制开蛋工具等。但总体来说，这些机械开窗法操作费时，有些还需要特殊的工具如钻孔器等，对胚胎的机械损伤大，且容易破坏蛋壳及壳膜，导致胚胎存活率不高。另外，开窗后封口时，常用蛋壳膜或石蜡封口，费时费力；用透明胶带或封口膜封口，密封不严，导致种蛋孵化过程中蛋清外溢现象的出现，严重降低存活率。总的来说，目前的方法存在一些缺陷，可利用率不高。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种用于转基因禽制备的种蛋开窗封口的方法，该方法适用于在鸡、鸭等禽类胚胎中进行基因功能的研究及转基因禽的制备，整个操作过程简单，无须专门的仪器设备，无须特殊的技术要求，可同时进行批量处理，后期胚胎存活率显著提高。
具体地，本发明通过以下技术方案实现：
一种用于转基因禽制备的种蛋开窗与封口的方法，包括开窗和胚胎操作，其特征在于：将种蛋消毒后水平放置2h，使胚盘浮于赤道面，在种蛋赤道面粘贴一块用于开口处的透明胶带；用眼科剪在粘贴了胶带的赤道面剪切开窗，从锐端向钝端剪切再回到锐端，保留开窗的蛋壳粘连在赤道面靠近锐端处，用眼科镊去除壳膜；通过窗口进行胚胎操作，再将粘连的蛋壳用一块用于封口处的透明胶带封口复原，将操作后的种蛋放回孵化箱孵化；
用于开口处的透明胶带长、宽均为3-4cm，粘贴位置在种蛋赤道面。
所述剪切开窗的窗口直径为1-1.2cm，以便于胚胎操作为宜。
所述剪切开窗的剪切方向为：从锐端向钝端再回到锐端，保留开窗的蛋壳粘连在赤道面靠近锐端处。
所述胚胎操作包括脂质体转染、电穿孔、病毒感染、卵黄囊血管注射、药物处理。
所述封口是将剪切开窗的蛋壳用透明封口胶带原位复原。用于封口处的透明胶带长、宽均为2-3cm。
本发明的方法适用于鸡、鸭、鹅或其它禽类的种蛋的开窗与封口，以方便转基因禽制备的种蛋开窗封口。
具体地，本发明的步骤如下所述：
一种用于转基因禽制备的种蛋开窗、封口方法，包括开窗和胚胎操作，本发明的要点在于：将种蛋消毒后水平放置2h，使胚盘浮于赤道面，在种蛋赤道面粘贴一块透明开口胶带；用眼科剪在粘贴了胶带的赤道面剪切开窗，从锐端向钝端剪切再回到锐端，保留开窗的蛋壳粘连在赤道面靠近锐端处，用眼科镊去除壳膜；通过窗口进行胚胎操作，再将粘连的蛋壳用一块透明封口胶带封口复原，将操作后的种蛋放回孵化箱孵化；
其中：用于开口处的透明胶带长、宽均为3-4cm，粘贴位置在种蛋赤道面。
其中：所述剪切开窗的窗口直径为1-1.2cm，以便于胚胎操作为宜。
所述剪切开窗的剪切方向为：从锐端向钝端再回到锐端，保留开窗的蛋壳粘连在赤道面靠近锐端处。
所述胚胎操作包括脂质体转染、电穿孔、病毒感染、卵黄囊血管注射和药物处理。
其中：所述封口是将剪切开窗的蛋壳原位复原。
其中：用于封口处的透明胶带长、宽均为2-3cm。
其中：所述种蛋为鸡、鸭、鹅或其它禽类的种蛋。
本发明提供的种蛋开窗封口方法，操作简单，方便快捷，没有特殊的技术要求；成本低，对仪器设备工具要求低，只需常用的透明胶带、眼科剪和眼科镊即可进行；可以同时进行批量处理，不同批次之间的处理效果不会产生较大差异；既适用于新鲜种蛋，也可用于已孵化的种蛋；开窗后可用于不同的胚胎操作，如脂质体转染、电穿孔、病毒感染、卵黄囊血管注射、药物处理等；用眼科剪在粘贴了透明开口胶带的蛋壳上剪切，可以准确控制开口的大小，减少其他部位蛋壳裂痕的产生，保证整个蛋壳的完整性，对胚胎的机械损伤小，同时也保证了切口的平滑性；已粘贴了胶带的蛋壳再用透明封口胶带封口时，容易粘贴，且剪切开窗的蛋壳仍粘连在赤道面靠近锐端处，封口严密，降低了胚胎后续孵化过程中蛋清流出、水分蒸发的可能性；直接用胶带封口，省去了准备封口蛋壳膜的繁琐过程。
附图说明
图1：是本发明提供的种蛋开窗封口方法的步骤图。图1中的A、B、C、D、E、F图依次展示的是：消毒平放、粘贴胶带、剪切开窗、去除壳膜、胚胎操作、胶带封口等8个主要实验程序和操作的直观图像。
具体实施方式
实施例1
胶带剪切法开窗步骤：
(1)消毒平放：取新鲜种鸭蛋(由武汉市畜牧兽医科学研究所金口育种场提供)消毒后水平放置2h，使胚盘浮于赤道面；
(2)粘贴胶带：在种蛋赤道面粘贴一块透明胶带，用于开口粗的透明胶带长、宽均为3-4cm；
(3)剪切开窗：用眼科剪在赤道面贴胶带处剪切开窗，窗口直径为1-1.2cm，从锐端向钝端剪切，再回到锐端，保留开窗的蛋壳粘连在赤道面靠近锐端处；
(4)去除壳膜：用眼科镊小心去除壳膜，观察种蛋受精情况，若为无精蛋，则弃用；
(5)封口孵化：将粘连的蛋壳复原，并粘贴一块用于封口处的透明胶带封口，透明胶带长、宽均为2-3cm，种蛋放入孵化箱孵化。
实施例2
(1)开窗处理：
1)处理组1：机械开窗+胶带封口，采用简单的机械开窗法，用手术刀片在种鸭蛋(由武汉市畜牧兽医科学研究所金口育种场提供)赤道面刻出直径为1cm的圆形窗口划痕，用眼科剪去除蛋壳，用透明封口胶带封口，将种蛋进行孵化；
2)处理组2：盐酸腐蚀开窗+胶带封口，采用具有挥发性的浓盐酸腐蚀蛋壳开窗，滴加少量浓盐酸在赤道面至蛋壳被腐蚀，无菌磷酸盐缓冲液(PBS配制方法：称取氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸二氢钾0.24g、十二水磷酸氢二钠3.63g溶于800mL双蒸水中，用盐酸调节pH值至7.4，加水定容至1000mL，高压灭菌，室温保存)冲洗，用透明封口胶带封口，将种蛋进行孵化；
3)处理组3：胶带剪切开窗+胶带封口，采用本发明提供的胶带剪切法开窗，用透明封口胶带封口，将种蛋进行孵化；
4)处理组4：胶带剪切开窗+封口膜封口，采用本发明提供的胶带剪切法开窗，用封口膜封口，将种蛋进行孵化；
5)对照组：种蛋正常孵化。
(2)结果分析
不同开窗封口方法的比较发现，胶带剪切法开窗胚胎成活率较高，在60％以上。
表1不同开窗/封口方法对胚胎成活率的影响
实施例3
(1)开窗操作
本实施例主要是对本发明的透明胶带剪切法开窗进行验证检测，用常用的微量进样器将RCASBP.B-GFP逆转录病毒(由华中农业大学家禽实验室提供，为常规方法制备的质粒，华中农业大学的制备方法参考了：J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，《分子克隆实验指南(第三版)》，科学出版社，2002年版，该质粒仅仅是作为本发明方法检测的一个媒介质粒，本发明的验证并不是唯一依靠该质粒，任何具备分子克隆的实验室都可以制备出该质粒)注入种蛋(由华中农业大学实验鸡场提供)的胚盘下腔，用透明封口胶带封口，将种蛋进行孵化，在不同时间取胚观察。
(2)结果分析
通过体视荧光显微镜观察发现，在6.5d和12.5d分别有90.0％和81.3％的胚胎有绿色荧光蛋白的表达。本实施例的效果见表2所述。
表2不同日龄胚胎绿色荧光蛋白表达的阳性率
| 胚胎日龄 | 采集胚胎数 | 阳性个体数 | 阳性率 |
| 6.5d | 20 | 18 | 90.0％ |
| 8.5d | 17 | 15 | 88.2％ |
| 10.5d | 18 | 15 | 83.3％ |
| 12.5d | 16 | 13 | 81.3％ |
由表2所示，本发明能有效实现外源基因在禽类胚胎中的转移并能高效表达。
此外，本发明中所述的胚胎操作中的脂质体转染、电穿孔、病毒感染、卵黄囊血管注射和药物处理发放可参考本领域(畜牧兽医)的教科书，手册等相关文献。
Claims (1)
1.一种用于转基因禽制备的种蛋开窗、封口方法，包括开窗和胚胎操作，其特征在于：将种蛋消毒后水平放置2h，使胚盘浮于赤道面，开窗前在种蛋赤道面上粘贴一块长、宽均为3-4cm的透明开口胶带；用眼科剪在粘贴了透明开口胶带的赤道面剪切开窗，剪切开窗的窗口直径为1-1.2cm，剪切开窗的剪切方向为：从锐端向钝端再回到锐端，保留开窗的蛋壳粘连在赤道面靠近锐端处，用眼科镊去除壳膜；通过窗口进行胚胎操作，再将粘连的蛋壳用一块透明封口胶带在剪切开窗的蛋壳原位处封口复原，封口处的透明封口胶带长、宽均为2-3cm，将操作后的种蛋放回孵化箱孵化。
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| CN104472397A (zh) | 2015-04-01 |
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Granted publication date: 20160824 Termination date: 20161226 |