CN101720716B - 一种用于培育转基因禽的种蛋孵化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于培育转基因禽的种蛋孵化方法。该方法是将蛋壳的赤道上有被封闭的开孔的种蛋，按照使被封闭的开孔朝上并处于所述种蛋的最高处的方式放置，进行静置孵化；至所述种蛋内的绒毛膜发育到包裹种蛋内的全部内容物时，再将所述种蛋大头朝上小头朝下放置，进行翻蛋孵化；然后再进行静置孵化直至出雏。本发明方法从根本上克服了传统方法中蛋清外溢的缺陷，保证了孵化过程中蛋内的水分和营养平衡，减少了由于蛋清外溢而造成鸡胚死亡的损失，保证了转基因鸡胚的正常发育，提高了转基因鸡胚的孵化率。本发明方法步骤简单，可操作性强，并且适合于其它开窗法转基因操作后的禽类种蛋的孵化，如鹌鹑，家鸭等。因此，本发明方法具有重要的应用价值，适合于推广。

Description

一种用于培育转基因禽的种蛋孵化方法

技术领域

本发明涉及一种用于培育转基因禽的种蛋孵化方法。

背景技术

利用基因工程技术可以将禽类中不利的基因剔除，以提高禽类的抗病抗逆性、提高禽类生产性能和改善肉质。继乳腺生物反应器之后，利用转基因技术将人或动物的抗体基因导入蛋鸡体内，将其改造成输卵管生物反应器，可以使其所产的蛋中含有大量具有经济价值的蛋白质，再用其生产药品和保健品。因此，转基因禽类具有巨大的经济价值和应用前景。

近年来已有不少转基因鸡的研究报告出炉，但是真正可以投入生产的却几乎没有，主要原因之一是转基因禽类的成功孵化比较难实现。

禽类为卵生孵化，其受精卵在体内受精后不久就被蛋清和蛋壳包裹并开始发育，到种蛋产出体外时就已经是有5-6万个细胞的囊胚了，排出的种蛋会在合适的温度湿度等条件下再继续进行发育，所以禽类的转基因不像哺乳类动物那样可以在受精卵单细胞层面上进行显微操作，而大多是对刚产出的种蛋进行囊胚水平上的转基因操作，再使转基因后的种蛋继续孵化培养直至出雏。随之，鸡胚的体外培养体系也建立起来。起初人们将鸡胚放在陶瓷缸、塑料膜中培养，鸡胚最久可以发育到14天，但是没有活的鸡胚出雏；后来发展出代用蛋壳孵化体系，其在体外培养系统中成功获得了出雏的小鸡，但是孵化率较低，主要是因为复杂的体外培养孵化体系并不能很好的满足鸡胚在原蛋壳内的发育要求，再加上其复杂的程序和苛刻的条件，使其推广应用受到限制。

如果要提高转基因鸡的孵化率，最好的方法就是在种蛋原壳中孵化转基因鸡胚。近年来发展出“开窗法”转基因操作种蛋转基因过程，其方法如下：在种蛋原壳的赤道面上开直径0.5-1.0cm的圆窗，透过其对鸡胚X期胚盘进行转基因操作，术后将开口用各种材料(例如胶类、塑料膜、石蜡膜等物质)封闭，使转基因后的鸡胚在种蛋原壳内继续进行孵化。这种称为“开窗法”的操作方法可以成功的获得转基因雏鸡并且孵化率比以往的鸡胚体外培养方法要高。但是与实际需求相比，这种方法的孵化率仍然很低，主要是因为孵化过程中封口后的种蛋普遍出现蛋清外溢的现象，最多可以在一批蛋中100％的出现不同程度的蛋清外溢现象，蛋清的外溢破坏了蛋内水分和营养的平衡，影响了鸡胚的正常发育，并且外溢的蛋清极易滋生细菌，引发细菌的污染，造成鸡胚的死亡。有关研究认为蛋清外溢是由于开窗导致蛋内气压的失衡引起的，所以，又采取封窗前往蛋内添加稀蛋清或是磷酸盐缓冲液的办法来解决，也有采取去掉种蛋钝端部分蛋壳的方法来解决，虽然这样的措施部分降低了蛋清外溢的程度，但是这些方法均操作繁琐，并且也没有在根本上杜绝蛋清外溢的发生。

发明内容

本发明的目的是提供一种孵化种蛋的方法，该方法特别适合应用于转基因禽的培育。

本发明所提供的孵化种蛋的方法，是将蛋壳的赤道上有被封闭的开孔的种蛋，按照使被封闭的开孔朝上并处于所述种蛋的最高处的方式放置，进行静置孵化；至所述种蛋内的绒毛膜发育到包裹种蛋内的全部内容物时，再将所述种蛋大头朝上小头朝下放置，进行翻蛋孵化；然后再进行静置孵化直至出雏。

其中，所述种蛋内的绒毛膜包裹种蛋内的全部内容物时，是指从开始孵化时计起，孵化至第4-5天，优选为第5天。

所述翻蛋孵化共持续12-15天，优选为14天。

所述静置孵化和翻蛋孵化的温度为37-38.5℃，优选为38℃；所述静置孵化和翻蛋孵化的相对湿度为50％-75％，优选为75％。

本发明方法适合于一般禽类种蛋的孵化，如鹌鹑、家鸭和鸡等，而且种蛋的品种不限。

所述种蛋为采取开窗法操作的转基因种蛋。

所述蛋壳的赤道上有被封闭的开孔的种蛋可从商业途径获得，也可按照常规方法(如“开窗法”)制备。

本发明的发明人经过研究发现，开窗法转基因种蛋在孵化过程中出现蛋清外溢的根本原因是蛋清与有机封口物质直接接触造成的。用于封闭开窗的封口膜基本采用的是有机物质，其表面含有许多微小的孔隙，而蛋清是碱性的优良有机溶剂，其中还含有各种各样的酶类物质，在孵化的过程中如果使蛋清与封口膜直接接触，在温暖高湿的孵化环境中，蛋清会渐渐的将封口膜物质溶解，加上孵化时翻蛋造成蛋清流动的反复冲刷，封口膜就会逐渐被溶蚀，其表面的微小孔隙扩大，最终导致蛋清的外溢。

本发明的发明人还发现，开窗法转基因操作中，种蛋赤道上开窗之后，蛋壳内会出现一个微小的空腔(称人工气室)。

本发明的发明人基于以上发现，并结合如下禽类胚胎的发育过程，创造性地提供了一种从根本上克服了蛋清外溢现象的种蛋孵化方法：

种蛋孵化过程中，从开始孵化时计起，孵化33小时后，鸡胚胎膜开始发育，胎膜首先开始包裹胚胎，后逐渐扩大；到孵化第4天时，胎膜基本合拢，内层为羊膜，外层为绒毛膜，此时，羊膜已包裹胚胎，绒毛膜贴着蛋壳且已包裹种蛋内的全部内容物；到孵化第5天时，绒毛膜和尿囊融合形成尿囊绒毛膜，此时尿囊绒毛膜完全合拢并包裹种蛋内的全部内容物；以后胚胎通过尿囊绒毛膜及卵囊膜吸收营养和呼吸，最后孵化至出雏。

本发明方法摒弃了原有的治标不治本的封蛋措施，利用种蛋自身的结构特点和鸡胚发育过程中胎膜的发育特点，创造性地通过在孵化期间对转基因种蛋孵化时蛋位的调整，简单有效地避免了蛋清与封口物质的直接接触。首先，在孵化的前期，即孵化第5天以前，通过种蛋的摆放，即使蛋壳上的开窗处于种蛋的最高处，利用上述人工气室将蛋清与封口膜隔绝，使其相互不能直接接触；在绒毛膜发育到包裹整个种蛋内容物以后，即孵化第5天后，绒毛膜及后续形成的尿囊绒毛膜使蛋清与封口物质隔绝，使其不能直接接触后，再将种蛋大头朝上竖直放置并恢复翻蛋孵化。因此，在整个种蛋的孵化过程中，都彻底隔绝了蛋清与封口膜的直接接触，因而从根本上杜绝了蛋清外溢的可能性。另外，本发明方法还无需在封闭开孔前，向蛋内添加蛋清等补充液体，使操作更简便。

本发明方法从根本上克服了传统方法中蛋清外溢的缺陷，保证了孵化过程中蛋内的水分和营养平衡，减少了由于蛋清外溢而造成鸡胚死亡的损失，保证了转基因鸡胚的正常发育，直接提高了转基因鸡胚的孵化率。本发明方法步骤简单，可操作性强，并适合于其它开窗法转基因操作后的禽类种蛋的孵化，如鹌鹑，家鸭等。因此，本发明方法具有重要的应用价值，适合于推广。

附图说明

图1为种蛋孵化中蛋清外溢现象和蛋清无外溢现象的图。

图2为本发明方法孵化出的雏鸡的图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、开窗法转基因后的鸡种蛋的孵化

本实施例中所用的蛋壳的赤道上有被封闭的开孔的种蛋是通过开窗法进行转基因操作后的鸡种蛋，用于封闭开孔的有机物是石蜡膜(Paraffilm)，而且，在封闭开孔前，种蛋内不添加稀蛋清或磷酸盐缓冲液等。

本发明方法的实验步骤如下：

1、将上述种蛋水平静置于孵化蛋托上，使蛋壳上的窗口朝上并处于种蛋的水平最高处；用喷雾器向种蛋表面喷洒青霉素和链霉素混合溶液(青霉素的浓度为100mg/ml，链霉素的浓度为100mg/ml)，5ml混合溶液/100个种蛋；然后将种蛋静置入孵，孵化时不翻蛋，期间蛋壳上的窗口一直朝上并处于种蛋的水平最高处，温度38度，相对湿度75％。

2、孵化至种蛋内的绒毛膜已包裹种蛋内的全部内容物(即从开始孵化计起，在孵化的第5天)时，将平置的种蛋改成大头朝上，小头朝下竖直放置，并恢复翻蛋，蛋的摆动幅度为45度，翻蛋频率为每2小时翻蛋一次，在温度38度、75％相对湿度的条件下孵化；翻蛋孵化一共进行14天；

3、孵化至第19天，停止翻蛋，将种蛋由孵化蛋托上取下置于蛋盘中，继续在温度38度、75％相对湿度的条件下孵化；

4、孵化至第20-21天，转基因种蛋会陆续出雏，将出雏的小鸡转移至育雏箱中进行后续培养和实验。

同时将经同样开窗转基因操作的鸡种蛋用现有的常规方法进行孵化，以作为对照，现有孵化方法的实验步骤如下：

1、将种蛋大头朝上，小头朝下竖直放置，开启翻蛋，蛋的摆动幅度为45度，翻蛋频率为每2小时翻蛋一次，在温度38度、75％相对湿度的条件下孵化。

2、孵化至第19天，停止翻蛋，将种蛋由孵化蛋托上取下置于蛋盘中，继续在温度38度、75％相对湿度的条件下孵化。

实验设3次重复，用本发明方法共孵化了120个种蛋，用现有方法共孵化了180个种蛋，结果如图1和图2所示。表明，用本发明方法孵化的120个种蛋均无蛋清外溢现象(图1A和图1B)，鸡胚可以在不丧失蛋清的条件下正常发育，最终的转基因种蛋的孵化率为23.5％；而用现有方法孵化的180个转基因种蛋均有不同程度的蛋清外溢现象(图1C为严重外溢，图1D为中度外溢)，鸡胚全部死亡，孵化率为0％。用本发明方法孵化成功的雏鸡如图2所示。

Claims (10)

1.一种孵化种蛋的方法，是将蛋壳的赤道上有被封闭的开孔的种蛋，按照使被封闭的开孔朝上并处于所述种蛋的最高处的方式放置，进行静置孵化；至所述种蛋内的绒毛膜发育到包裹种蛋内的全部内容物时，再将所述种蛋大头朝上小头朝下放置，进行翻蛋孵化；然后再进行静置孵化直至出雏。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述种蛋内的绒毛膜包裹种蛋内的全部内容物时，是指从开始孵化时计起，孵化至第4-5天。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述种蛋内的绒毛膜包裹种蛋内的全部内容物时，是指从开始孵化时计起，孵化至第5天。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述翻蛋孵化共持续12-15天。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述翻蛋孵化共持续14天。

6.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述静置孵化和翻蛋孵化的温度为37-38.5℃；所述静置孵化和翻蛋孵化的相对湿度为50％-75％。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述静置孵化和翻蛋孵化的温度为38℃；所述静置孵化和翻蛋孵化的相对湿度为75％。

8.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述种蛋为禽的种蛋。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述禽为鸡。

10.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述种蛋为采取开窗法操作的转基因种蛋。

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