FI94772C - Alkioiden in vitro viljelytekniikka - Google Patents

Description

* I

. 94772

Alkioiden in vitro viljelytekniikka

Keksintö kohdistuu lintujen alkion in vitro viljelytekniikkaan, jota voidaan soveltaa erityisesti siipikarjaan, etenkin kanoihin.

Kananpojan alkiota ei olla kyetty manipuloimaan kokeellisesti sen kehityksen aikuvaiheissa hedelmöittymisestä jakautumiseen johtuen munasolun suuruudesta, hauraudesta sekä luoksepääsemät— tömyydestä. Tätä ongelmaa on käsitelty viimeaikaisissa yleiskatsauksissa, joiden kohteena ovat olleet mahdolliset reitit ulkopuolisten geenien siirtämiseksi lintuihin (Freeman ja Messer, 1985? Crittenden ja Salter, 1986). Perry <1986 a,b) on ottanut vaihtoehtoisen kannan ja hän esittää, että linnun munasolun geneettinen manipulointi on toteutettavissa. Täydellisen viljelyjärjestelmän toteuttamisella kananpojan alkiota varten pyrittiin saamaan aikaan keino manipuloidun munasolun kasvattamiseksi kypsäksi. Alalla on nyt saatu aikaan menetelmä alkion in vitro viljelemiseksi sen kehittymisen keskivaiheeseen saakka, ja tässä asiassa myös edistytään. Tätä tekniikkaa ei voida soveltaa ainoastaan siipikarjan geneettiseen manipulointiin vaan myös linnun kehittymisen perusmekanismien selvittämiseen sekä haitallisten piirteiden tutkimiseen. Se on lisäksi toivottu vaihtoehto munivan kanan kirurgiselle käsittelylle.

ψ

Kananpojan alkio saa alkunsa itulevystä, joka on sytoplasman pieni, munasolun (tuttu keltuainen) eläinnavassa sijaitseva alue. Alkion kehityksen ensimmäisen kolmanneksen aikana se kelluu keltuaisen pinnalla, kun taas alkion ulkopuolisia kalvoja kasvaa keltuaisen ympärille ja niihin syntyy verisuonia. Kehityksen loppujakson aikana alkio kasvaa munan sisältämien ravintovarastojen kustannuksella. Oheisia tarkoituksia varten kananpojan kehitys on jaettu kolmeen vaiheeseen sen mukaan, miten vaatimukset muuttuvat peräkkäisissä vaiheissa hedelmöittymisestä kuoriutumiseen.

- 94772 7 I vaihe: Hedelmöittymisestä alkiokalvon (blastodermi) muodostumiseen. Tämä vaihe tapahtuu munanjohtimessa ja päättyy munin— taan. Sukusolujen vuorovaikutus tapahtuu 15 minuutin kuluttua munasolun irtoamisen jälkeen ja ensimmäinen pilkkova jakautuminen 4 tuntia myöhemmin (Perry, 19R7). Seuraavien 20 tunnin aikana tapahtuva jakautuminen johtaa yksinkertaiseen snluker— rokseen, joka sijaitsee alkiokalvon alla olevan ontelon päällä (Kochav, Ginsburg ja Eyal—Giladi, 1980). Munasolun kulkiessa munanjohtimen läpi sen magnumiin kerääntyy suuri määrä albumiinia, ja sitten munasolun ja albumiinin välille muodostuu kuori-kalvo, josta jakautuminen alkaa. Albumiinin tilavuus kaksinkertaistuu kohdussa kohtunesteen (pumppausnesteen) absorboitumisen seurauksena ja lopulta kuori kalkkiutuu hitaasti. Pitkien ajanjaksojen ajan yhden munan päivittäin munivien kanojen tapauksessa munintaa seuraa 15 — ^0 minuutin kuluessa seuraava munansolun irtoaminen ja jakso toistuu.

II vaihe; Alkion morfogeneesi. Tämä vaihe tapahtuu munan hauto— mi sen ensimmäisten kolmen vuorokauden aikana Cvaiheet 1-18, Hamburger ja Hamilton (1951)1. Vaiheessa 20 alkion pituus on 10 mm, ja alkion ulkopuolinen alkiokalvo ulottuu keltuaisen ympäri sen ekvaattoriin saakka.

III vaihes Alkion kasvu. Tämä vaihe tapahtuu munan hautomisen viimeisten 18 vuorokauden aikana [vaiheet 18 - 45, Hamburger ,V ja Hamilton (1951)1.

Käytettävissä on useita menetelmiä vaiheessa II olevien alkioiden lyhytaikaiseksi viljelemiseksi (New, 1966) sekä pitemmällä olevien alkioiden pitkäaikaiseksi viljelemiseksi (Dunn, Fitz-harris ja Barnett, 1981; Ono ja Wakasugi, 1984; Rowlett ja Simkiss, 19B5, J985, 19B7). Eräät menetelmät käsittävät alkion siirtämisen pois keltuaisesta, kun taas toisissa menetelmissä alkio ja knko keltuainen siirretään vi1jelyastiaan. Viimeksi mainitussa menetelmässä päästään edul1isimpiin olosuhteisiin pitkäaikaista viljelyä varten, ja ainoastaan sitä käytetään oheisessa viljelyjärjestelmässä.

>1 I «Hi Hiili li i let I

3 94772

Oheisen keksinnön ensimmäisen piirteen mukaisesti aikaan saadaan menetelmä lintujen alkioiden viljelemiseksi in vitro alkion kasvuvaiheen aikana, tämän menetelmän käsittäessä alkion hautomisen suljetussa astiassa, jossa alkion yläpuolella on ilmatila, joka ilmatila on erotettu ulkoisesta ilmakehästä kaasua osittain läpäisevällä sulkimella.

Tämä suljin on edullisesti kalvo. Suljin voi olla muovia, esimerkiksi polyetyleeniä. Ollaan todettu, että kaupallisesti saatava tarttuva kalvo muodostaa sopivan sulkimen, erityisesti kahtena kerroksena käytettäessä. Sulkimena voidaan käyttää mitä tahansa muuta materiaalia, jolla on tarttuvan kalvon sopivat ominaisuudet.

Materiaalin sopivuus sulkimeksi voidaan mitata epäsuoraan mittaamalla hiilidioksidin ja/tai vesihöyryn läpäisevyys. Hiilidioksidin läpäisevyys voidaan määrittää mittaamalla munan albumiinin pH:n nousu haudonnan kestettyä 24 tuntia 38 *C:n lämpötilassa muuten läpäisemättömissä astioissa. Albumiinia tulisi alussa käsitellä hiilidioksidilla pH:n laskemiseksi 0,1 yksikköä. Alueella 0,5 — 1,5 oleva pH:n nousu on yleensä sopiva, edullisen arvon ollessa 0,5 tai 0,7 - 1,0 tai 1,3, esimerkiksi noin 0,9. Vesihöyryn läpäisevyys voi olla alueella 5 tai 10 -30 tai 40 mg/cma/24 tuntia.

,V Astia on edullisesti osa munasta, joka valitaan tavallisesti siitä samasta lajista, jota viljellään. Typlän pään poistaminen kokonaisesta munasta ollaan todettu erityisen tarkoituksen-mukaiseksi; erityisen sopivaksi ollaan todettu halkaisijaltaan 40 mm:n reikä, joka on keskitetty akselille.

Munan tylpässä päässä oleva reikä suljetaan kaasua osittain läpäisevällä sulkimella. Suljin voidaan saada tarttumaan munan-kunreen albumiinilla. Läpäisevyysominaisuudet ovat edullisesti samankaltaiset kuin luonnollisessa munassa.

4 94772

Keksinnön tämän piirteen eräissä suoritusmuodoissa voi olla läsnä viljelyalustaa, erityisesti mikäli aikaisemmat viljely-vaiheet on toteutettu in vitro, mutta menetelmä vni myös toimia ilman sitä, esimerkiksi mikäli aikaisemmat vi1jelyvaiheet nn toteutettu luonnollisesti. Vi 1jelyalusta, mikäli sitä on läsnä, käsittää tavallisesti albumiinia joko 1aimentamattomassa tai laimennetussa muodossa sekä toivottavaa kohdun sisäistä nestettä.

Käytettäessä kanan munia on edullista, että alkion ja sulkimen välisen tilan syvyys on 5 - 15 mm, esimerkiksi noin 10 mm.

Haudotun alkion sekoittaminen varovaisesti on edullista, ainakin alussa. Varovainen sekottaminen voidaan todettaa ajoittaisella keinuvalla liikkeellä, esimerkiksi 30 asteen kulmassa. Perinteisiä inkubointilämpötiloja, esimerkiksi noin 38 *C, voidaan käyttää.

Keksinnön tämän piirteen mukaiset in vitro viljelymenetelmät soveltuvat ajanjaksoon, joka alkaa 4. vuorokaudesta (hedelmöittymisestä laskien) ja päättyy kuoriutumiseen, joka tapahtuu yleensä noin 22. vuorokautena. Alkioelämän parina viimeisenä päivänä (esimerkiksi 13) on kuitenkin edullista, ettei sekoittamista käytetä. Lisäksi vähän ennen (esimerkiksi 1-2 vuorokautta ennen) arvioitua kuoriutumisaikaa on edullista, että V sulkimeen tehdään reikiä, jotta astiaan pääsisi tietty määrä ilmaa. Lisää ilmaa voidaan päästää myöhemmin sisään esimerkiksi poistamalla suljin ja valinnaisesti peittämällä munankuoressa (mikäli munaa käytetään astiana) oleva reikä kiinteällä levyllä, jollaisena voidaan käyttää petrimaljaa.

• « ! Oheisen keksinnön toisen piirteen mukaisesti aikaan saadaan

« V

menetelmä lintualkion viljelemiseksi in vitro alkion morfo-geneesin aikana, tämän menetelmän käsittäessä alkion hautomisen vi1jelyalustassa, nesteellä täytetyssä, suljetussa, nestettä läpäisemättömässä astiassa.

5 94772 Tämä astia voi olla kaasua osittain läpäisevä. Kaasun läpäisevyys voidaaan saada aikaan munankuorella (yleensä yhdessä kuoren sisäkalvon kanssa) Ja/tai muulla tavalla kaasua osittain läpäisevällä sulkimella, Jonka edulliset ominaisuudet ovat samat kuin keksinnön ensimmäisen piirteen tapauksessa. Huomattakoon, että munankuori ja kuoren sisäkalvo ovat kaasua osittain läpäiseviä.

Vi 1jelyalusta on edullisesti nestemäistä albumiinia, jota voidaan ottaa talteen juuri munituista munista.

Astia nn nytkin edullisesti osa munasta, mutta edullinen rakenne eroaa jonkin verran keksinnön ensimmäisen piirteen yhteydessä kuvatusta rakenteesta. Kyseessä olevassa piirteessä on edullista, että terävä pää poistetaan, esimerkiksi siten, että saadaan 32 mm:n reikä. Tällä taataan ilmatilan läsnäolo kuoren ulkokalvon ja kuoren sisäkalvon välissä; tämä vaikuttaa edulliselta ilmatilan laajentuessa viljelemisen aikana haihtumalla menetetyn veden korvaamiseksi.

Mikäli munan, josta terävä pää on poistettu, sulkemiseen käytetään suljinta, niin munaa voidaan viljellä yleisesti vaakasuorassa asemassa, jolloin suljin on toisella kyljellä. Suljin tulee pitää tiukasti paikoillaan munan kuorta vasten.

V Erittäin edullista on se, että viljeltäviä alkioita sekoitetaan varovaisesti tai kohtalaisesti. Ajoittainen tai jatkuva keinuttaminen esimerkiksi 90 asteen kulmassa tunneittain toistuvina jaksoina tai muun pituisin vastaavin väliajoin on edullista.

Keksinnön tämän piirteen mukainen menetelmä alkaa yleensä noin l 1. vuorokautena hedelmöittymisen jälkeen (toisin sanoen suun nilleen munninnan normaaliaikana) ja se voi kestää 2 tai useampia vuorokausia, esimerkiksi jopa 8 vuorokautta. Edullista on kuitenkin se, että keksinnön tämän piirteen mukaista menetelmää jatketaan noin 3 tai 4 vuorokautta ennen alkion siirtämistä ensimmäisen piirteen mukaiseen menetelmään.

6 94772

Oheisen keksinnön kolmannen piirteen mukaisesti aikaan saadaan menetelmä lintualkion viljelemiseksi in vitro alkion morfo-geneesin aikana ja alkion kasvuvaiheen aikana, tämän menetelmän käsittäessä alkion viljelemisen ensin keksinnön toisen piirteen mukaisella menetelmällä ja sitten alkion viljelemisen keksinnön ensimmäisen piirteen mukaisella menetelmällä.

On edullista, että siirtyminen tapahtuu 2-5 vuorokauden, esimerkiksi 4 vuorokauden, kuluttua hedelmöittymisestä.

Oheisen keksinnön neljännen piirteen mukaisesti aikaan saadaan menetelmä lintualkion viljelemiseksi in vitro alkiokalvon muodostumiseen saakka, menetelmän käsittäessä hedelmöittyneen munasolun, jota ympäröi tiheää albumiinia oleva kapseli, viljelemisen vi1jelyalustaan osittain upotettuna. Optimaalisten tulosten saavuttamiseksi tämän alustan tulisi yleensä olla samalla tasolla yleensä ylimmäisenä sijaitsevan itulevyn kanssa, mutta albumiinikapselin tason alapuolella.

Hedelmöittynyt muna voidaan saada kirurgisesti kanasta. Mikäli käytetään kirurgisia tekniikoita, niin muna otetaan edullisesti keskimagnumista, kapeasta liitoksesta (isthmus) esimerkiksi 50 — 150 mm päästä. Hedelmöittyneen munan ottaminen magnumin tästä alueesta on todettu edulliseksi siinä suhteessa, että tällöin tiheää albumiinia olevan, hedelmöittynyttä munasolua V ympäröivän kapselin paksuus vaikuttaa optimaaliselta.

Vi 1jelyalusta voi olla nestemäistä albumiinia, joka on voitu liuottaa vedellä ja/tai suolaliuoksella. Yleensä on edullista käynnistää laimeata albumiinia käsittävä viljelmä suolaliuoksella (esimerkiksi 3:2), minkä jälkeen (esimerkiksi 1. vuoro-kauden jälkeen) albumiini laimennetaan suolaliuoksella (esi— • * merki ksi 2:1).

Keksinnön tämän piirteen mukainen prosessi toteutetaan edullisesti suljetussa astiassa. Tämä astia on voitu valmistaa läpäisemättömästä materiaalista kuten lasista, ja joka astia voidaan sulkea kaasua niukasti läpäisevällä kalvolla kuten SARAN WRAP

7 94772 (tavaramerkki). Tähän tarkoitukseen voidaan käyttää mitä tahansa muuta sellaista materiaalia, jolla on tuotteen SARAN WRAP sopivat ominaisuudet. Kaasun (esimerkiksi hiilidioksidin ja/tai vesihöyryn) läpäisevyys voidaan määrittää edellä kuvatulla tavalla. Hiilidioksidin läpäisevyyttä määrittävässä kokeessa pH-arvo voi nousta 24 tunnin aikana 0,5 - 1,0, esimer— kiksi 0,6 - 0,8 yksikköä. Vesihöyryn läpäisevyys voi olla 1,0 -10, esimerkiksi 2-5 mg/cma/24 h.

Yleensä on niin, että keksinnön tämän piirteen mukaisesti viljeltyä alkiota viljellään tämän jälkeen keksinnön toisen piir— teen mukaista menetelmää noudattaen. Näin ollen keksinnön viidennen piirteen mukaisesti aikaan saadaan menetelmä lintualk.ion viljelemiseksi in vitro alkiokalvon muodostumiseen saakka ja alkion mor-fogeneesin aikana, tämän menetelmän käsittäessä lin-tualkion viljelemisen keksinnön neljännen piirteen mukaiselle menetelmällä, minkä jälkeen alkiota viljellään keksinnön toisen piirteen mukaisella menetelmällä.

Mikäli on toivottavaa käyttää käytännöllisesti katsoen täydellistä viljelyjärjestelmää 1intoalkioita varten hedelmöittyneestä munasolusta alkaen ja kuoriutumiseen päättyen, niin on selvää, että keksinnön edellä kuvattuja eri piirteitä sovelletaan tarkoituksenmukaisesti peräkkäin. Näin ollen oheisen keksinnön kuudennen suoritusmuodon mukaisesti aikaan saadaan menetelmä V lintualkion viljelemiseksi in vitro alkiokalvon muodostumiseen saakka, alkion mor-f ogeneesin aikana sekä kuoriutumiseen päättyvän alkion kasvun aikana, tämän menetelmän käsittäessä lint.u-alkion viljelemisen oheisen keksinnön neljännen piirteen mukaisella menetelmällä, minkä jälkeen alkiota viljellään keksinnön toisen piirteen mukaisella menetelmällä ja sitten alkiota vil-! jellään keksinnön ensimmäisen piirteen mukaisella menetelmällä.

Yleensä on edullista, että toisessa vaiheessa vastaanottavat munat, mikäli astioina käytetään munia, ovat hieman suurempia kuin luovuttajamunat, esimerkiksi 1 — 2 ml:n verran. Mikäli kolmannessa vaiheessa astioina käytetään munia, niin vastaanottavat munat ovat edullisesti olennaisesti suurempia (esimer— 8 94772 ki k«si noin IB ml) kuin ne, joita käytetään välittömästi edeltävässä vaiheessa.

Eri suoritusmuotoja kuvataan nyt seuraaviin piirustuksiin viitaten oheisen keksinnön paremmaksi ymmärtämiseksi ja sen esittämiseksi, miten keksintö voidaan toteuttaa. Näissä piirustuksissa:

Kuvio 1 esittää kaaviota viljelyjärjestelmistä kananpojan alkioita varten, ja siitä nähdään erillisten järjestelmien ja yhdistettyjen järjestelmien kattamat kehitysvaiheet;

Kuvio 2 esittää juuri munitun kananmunan rakennetta (julkaisusta Dawes, 1975);

Kuvio 3 on kaavio vaihetta III (4. vuorokaudesta kuoriutumiseen) varten tarkoitetusta viljelyjärjestelmästä;

Kuvio 4 on kaavio vaihetta II (1. — 4. tai 9. vuorokausi) var— ten tarkoitetusta viljelyjärjestelmästä; sekä Kuvio 5 on kaavio vaihetta I (hedelmöittyneestä munasolusta 1. vuorokauteen) varten tarkoitetusta viljelyjärjestelmästä.

Keksinnöstä esitetään nyt erilaisia esimerkkejä. Näissä esimer— keissä käytetään seuraavia materiaaleja, mikäli toisin ei mainita.

Viljeltyjen, eloon jääneiden alkioiden lukumäärät esitetään taulukossa t.

• < - ♦ « ·

!l ! U i UI) IMU

9 94772

Taulukko 1

Tiettyjen ajanjaksojen ajan erityisille kehitysvaiheille, alkaen 2 tunnin kuluttua hedelmöittymisestä (O. vuorokausi), sopivissa vi1jelyjärjestelmissä kasvatettujen ja eloon jääneiden kananpoikien alkioiden lukumäärä

Kehitys- Viljely- Viljeltyjen Eloonjääneiden vaihe järjes- alkioiden kananpoikien tai telmät lkm. alkioiden lkm.

4. vuorokaudesta III 69 25 (36 V.) kuor i utumiseen 1. vuorokaudesta II 47 35 (74 7.) 8. vuorokauteen 1. vuorokaudesta II - III 59 16 (27 7.) kuori utumiseen O. vuorokaudesta I - II 35 23 (67 7.) 7. vuorokauteen O. vuorokaudesta I- II -III 96 8(8%) kuor i utumi seen

Eläimeti Kaupallisen Warrens-kannan munivia kanoja (Isa Brown) pidettiin erillisissä häkeissä, valoisan jakson pituuden ollessa 14 h/24 h. 28 - 32 viikon ikäisinä, kun ne olivat munineet pitkien ajanjaksojen ajan 1 munan vuorokaudessa, ne keinosiemennettiin punaisista Rhode sland-kukoista juuri talteenote-tulla spermalla.

Hedelmöittymistä seurattiin säännöllisin väliajoin tarkastelemalla hautomattomia munia näköhavainnon perusteella, jolloin « se todettiin paremmaksi kuin 90 7.. Hedelmöittyneissä munissa itualue nähdään valkoisena renkaana (halkaisija 3—4 mm), joka sulkee sisäänsä puolittain läpinäkyvän alueen, ja hedelmöitty-mättömissä munissa se näyttää rakkuloituneelta levyltä (halkaisija 2-3 mm).

« l 10 94772

Munatϊ Alkioiden lähteenä viljelyjärjestelmiä II ja III varten (esimerkit 1—3) käytettiin munia, jotka munivat kanat olivat munineet edeltävien 24 tunnin aikana. Tästä kanaparvesta saatuja, juuri munittuja munia (hedelmöittyneitä ja hedelmöittymät-tömiä) käytettiin myls albumiinin lähteenä vi 1 jelyalust.aa var— ten. Nestemäistä albumiinia otettiin talteen munan sisemmästä ja ulommasta ai. bumi ini kerroksesta (kuvio 2), ja sitä käytettiin saman vuorokauden sisällä viljelemiseen. Vastaanottavat kuoret viljelyjärjestelmää II varten (esimerkit 2-5) saatiin tästä munivasta kanaparvesta. Suuremmat kuoret, joita käytettiin vi1jelyastioina järjestelmässä III (esimerkit 1, 3, 5), olivat peräisin paikallisesta hautomosta (D.B. Marshall, Whitburn,

West Lothian) saadun kaupallisen broi1 eri kannan kaksi keltuaista sisältäneistä munista, ja niitä käytettiin viljelemiseen 1-2 viikon sisällä munimisesta.

Päällystävä kalvoa Kahta erilaista muovipäällystettä käytettiin vi1jelyastioiden sulkemiseen. Tuotteen SARAN WRAP (Dow Chemical Company) kaasujen läpäisevyys on pieni (Dunn, Fitzharris & Barnett, 1981), ja se oli parhaiten sopiva järjestelmään I. Tarttuva kalvo (mikä tahansa merkki, lukuunottamatta edullisesti niitä, joista PVC-1isäaineet puuttuvat) on kaasuja osittain läpäisevä (Dunn et ai.. 1981), ja sitä käytettiin järjestelmissä II ja III. Läpäisevyyskokeet toteutettiin päällystävillä kalvoilla, joita käytettiin sillä hetkellä viljeltyjen l alkioiden hautomiseen käytetyissä olosuhteissa. Hiilidioksidin COa läpäisevyys määritettiin epäsuorasti mittaamalla viljely-alustan (nestemäinen albumiini ja suolaliuos suhteessa 2:1) pH—arvon suureneminen lasiastioissa (60 ml; halkaisija 40 mm), jotka sisälsivät 25 ml alustaa, ja jotka oli suljettu päällystävällä kalvolla. Viljelyalustaa käsiteltiin aluksi COa:11a ;* pH:n alentamiseksi sopivaan arvoon. Tuotteen SARAN WRAP (yksi kerros) tapauksessa pH nousi arviolta 0,7 yksikköä, pH—arvosta 7,2 — 7,5 pH—arvoon 7,8 — 8,2, sinä aikana, kun alustaa inku— boitiin 24 tuntia 41,5 *C:n lämpötilassa, suhteellisen kosteuden ollessa O. Tarttuvan kalvon (kaksi kerrosta) tapauksessa pH nousi arviolta 1,0 yksikköä, pH-arvosta 7,2 - 7,5 pH-arvoon * 8,3 — 8,5, sinä aikana, kun alustaa inkubotiin 24 tuntia 38 11 94772 *C:n lämpötilassa, suhteellisen kosteuden ollessa 45 — 55 %. Vesihöyryn läpäisevyys määritettiin mittaamalla vesihäviö maljoilta (350 ml; halkaisija 104 mm), jotka sisälsivät 150 ml vettä. Maljat suljettiin päällystävällä kalvolla ja niitä inku-boitiin edellä kuvatulla tavalla. Tuotteen SARAN WRAP tapauksessa keskimääräinen läpäisevyys oli 3,4 mg/cm*/24 h (vaihtelu 3,2 - 3,8 mg). Tarttuvan kalvon tapauksessa keskimääräinen läpäisevyys oli 22 mg/cm*/24 h (vaihtelu 15 — 2B mg).

Hautominen: Alkioiden viljelemiseen käytettiin lukuisia kierto-ilmalla ja automaattisilla kääntömekanismeilla varustettuja kaappimal1 isiä haudontalaitteita (CURFEW malli 248). Vallitsevat olosuhteet, eli lämpötila, kosteus ja tarjottimien kaltevuuskulma kussakin haudontalaitteessa, sovitettiin vastaamaan vaatimuksia alkion kehityksen jokaisessa erityisessä vaiheessa. Viljelmät siirrettiin yhdestä haudontalaitteesta seuraavaan sopivina ajanhetkinä, ja niitä tarkast.el ti in vähintään 2 tai 3 vuorokauden välein. Kuoriutumista edeltävän ja sitä välittömästi seuraavan ajanjakson ajaksi viljelmät laitettiin pöydän päällä pidettävään haudontalaitteeseen, jossa ilma seisoi (CURFEW malli 146), jossa oli läpinäkyvä kansi usein tapahtuvien tarkastelujen mahdollistamiseksi. Kosteus pidettiin tietyllä tasolla, Fischersin hiushygrometri1lä (Ballenkamp) mitattuna, käyttäen haudontalaitteiden pohjalle sijoitettuja vesiastioita (vetoisuus 2 litraa). Laitteet puhdistettiin ja desin-f ioiti in kerran kuussa MILTON-steri lointinesteel lä (Richardson-Vi cks Ltd.).

Steri i1 isyys; Kaikki toimenpiteet toteutettiin puolisterii1 eis-sä olosuhteissa. Munan albumiinin bakteriostaattisten ominaisuuksien ansiosta ei ollut välttämätöntä käyttää täysin asepti-·’ siä varotoimenpiteitä. Munat huuhdottiin nopeasti 70 X alkoho lissa pian niiden taiteenottamisen jälkeen ja sitten ne pyyhittiin 70 X alkoholilla välittömästi ennen käyttöä. Kaikki laitteet, tislattu vesi ja -Fysiologiset suolaliuokset autoklavoi-tiin. Suolaliuokset steriloitiin suodattamalla. Päällystävän kalvon tapauksessa kalvorullan ulommat kerrokset hylättiin ja kalvosta leikattiin arkkeja (100 mm*) ja ne laitettiin sterii- 12 94772 lien paperiarkkien väliin. Tämä toimenpide, munan albumiinin taiteenottaminen Ja viljelmien valmistaminen suoritettiin puh-dasilmakaapeissa. Antibiootteja (penisilliiniä 100 μ/ml; streptomysiiniä 100 mcg/ml) lisättiin munan albumiiniin, jota käytettiin tarttuvaa kalvoa olevan sulki men liimaamiseksi vastaanottaviin kuoriin järjestelmässä III.

Esimerkki 1

Alkioiden viljeleminen 4. kehittyrnisvuorokaudesta kuoriutumiseen. Viljelyjärjestelmän III mukainen menetelmä

Vastaanottavat munat saatiin kaksi keltuaista sisältäneistä munista. Munan tylpän pään ympäri porattiin hai kaisijaltaan 40 mm:n ympyrä ja kuoren huippu, joka sisälsi i1mavaraston, poistettiin. Kuoren sisältö heitettiin poi, minkä jälkeen kuori huuhdottiin tislatulla vedellä, ja sitten se täytettiin uudestaan vedellä kuoren sisäkalvon kuivumisen estämiseksi. Vastaanottavien kuorien tilavuudet vaihtelivat alueella 65 — 75 ml.

Kolme vuorokautta haudotut munat, joiden sisältämät alkiot olivat vaiheissa 15-20, murrettiin auki ja niiden sisältö tyhjennettiin matalaan maljaan, joka oli vuorattu tarttuvalla kalvolla. Alkiot siirrettiin tästä tarttuvasta kalvosta muodostetussa pussissa vastaanottaviin kuoriin, minkä jälkeen tarttuva kalvo vedettiin hitaasti ulos kuoresta pitäen alkio ylimmäisenä. Tämä siirtämismenetelmä on kuvattu yksityiskohtaisesti Rowlett: in ja Simkiss:in julkaisussa (1987). Kuori suljettiin 2 kerroksella tarttuvaa kalvoa käyttäen nestemäistä albumiinia kalvon liimaamiseksi kuoreen (kuvio 3). Alkion ja kalvon välisen tilan syvyys oli keskimäärin 10 mm.

Viljelmiä inkuboitiin 38 *C:n lämpötilassa ja niitä keinuteltiin aika-ajoin 30 asteen kulmassa 5 vuorokautta, sitten niitä pidettiin paikoillaan 10 vuorokautta. Viimeisten 3-4 vuorokauden ajaksi ne laitettiin kuoriutumista varten paikoillaan pysyvään haudontalaitteeseen, jossa vallitsi 37 eC:n lämpötila. Suhteellinen kosteus oli alueella 45 - 60 X. 1-2 vuorokautta ennen kuoriutumisen arvioitua ajankohtaa, kun nokka on rikkonut ’* alkion suonirakkokalvon (chorioallantois) ja tunkeutunut ilma- 13 94772 tilaan, tarttuvaan kalvoon tehtiin pieniä reikiä. Tarttuva kalvo korvattiin petrimaljan kannella useita tunteja ennen kuori utumi sta.

Kuoriutumisaste oli 36 7. (taulukko 2) ja 72 7. kuoriutuneista kananpojista vaikutti terveiltä. Niiden keskimääräinen paino oli 35 g, kun taas munassa kasvaneiden vertailukananpoikien paino oli 46 g. Heiveröisten kananpoikien epänormaalisuuksista voidaan mainita epätäydellisesti kutistunut keltuaispussi, parantumatta jäänyt napa sekä viat raajoissa. Tahmeat kananpojat olivat tavallisia, mikä tila liittyy absorboitumatta jääneen albumiinin pienen määrän läsnäoloon kuoressa.

Taulukko 2

Eloon jääneiden kananpojan alkioiden lukumäärä joidenkin ajanjaksojen välein sen jälkeen, kun ne siirrettiin munista vastaanottaviin kuoriin kolmantena hautomisvuorokautena. Viljelyjärjestelmä III

Hautomis- Elävien Elävät alkiot/ vuorokaudet alkioiden kaikki viljellyt munimisesta lukumäärä alkiot (X) 3 69 9 48 69 .14 39 57 18 32 46 21 27 39 kuori utumi nen 21-22 25* 36 * * Kuoriutuneiden kananpoikien lukumäärä sisältää sekä terveet että heiveröiset kananpojat.

□no ja Ulakasugi (1984) kehittivät kuoritekniikan 3 vuorokautta haudotuista munista saatujen viiriäisten alkioiden viljelemiseksi. He osoittivat, että munan kuori oli alkion olennainen kaisiumlähde. Rowlett ja Simkiss (1985, 1987) sovelsivat tätä - 94772 14 tekniikkaa siipikarjaan ja he saavuttivat kuoriutumisasteeksi 20 Vaikuttaa siltä, että luovuttaja-alkion ja isäntäkuoren välinen kantojen tai lajien erilaisuus ei häiritse suonirakko-kalvon toimintaa kalsiumin absorptiossa ja kaasujen vaihdossa.

Rowlett ja Simkiss suosittelevät viljelyjen pyörittämistä hau-donnan ensimmäisen osan aikana (1987). Vaikka yleisenä käytäntönä onkin kanojen munien pyörittäminen koko haudonnan ajan, niin New (1957) osoitti kuitenkin, että kriittisen ajanjakson muodostavat haudonnan 3. - 8. vuorokausi. Joukolla kokeita on kuitenkin saatu varmistetuksi, että viljelmien kääntäminen on optimaalisen kehittymisen edellytys, sekä osoitetuksi, että tämä liikuttaminen on toteutettava ainoastaan viljelmien ensimmäisten viiden haudontavuorokauden aikana (kehittymisen 4. - 9. vuorokausi). Keksinnön puitteissa toteutetuissa kokeissa viljelmien, joita ei käännelty, kuoriutumisaste oli 18 X (n = 77), kun taas kuori utumi saste oli 36 7. (taulukko 2) viiden vuorokauden ajan pyöritetyissä viljelmissä, joita pidettiin tämän jälkeen paikoillaan. Pyörittämisjakson pidentäminen 15 vuorokauteen johti huonompaan kuoriutumisasteeseen. Kuori utu— misaste, eli elävien alkioiden lukumäärä prosentteina 9. kehit-tymisvuorokautena, oli 62 7. (n = 33) vain ensimmäisten viiden vuorokauden ajan pyöritettyjen viljelmien tapauksessa ja 40 7.

(n = 71) 15 vuorokauden ajan pyöritettyjen viljelmien tapauksessa.

Vastaanottavien kuorien sulkiminä käytettiin tarttuvaa kalvoa muiden tutkijoiden käyttämien väljien kansien sijasta. Tämän muunnoksen etuna on se, että munien hautomisessa voidaan käyttää vakio-olosuhteita (kiertoilmajärjestelmä, suhteellinen kosteus 50 - 60 7.) siten, että vastaanottavaan kuoreen liittyvä suonirakkokalvon alue on normaalissa ympäristössä. Hyvin kos— * t teissä olosuhteissa, suhteellisen kosteuden ollessa yli 70 7., kuoriutumisaste pieneni 10 prosentiksi (n = 38). Tarttuva kalvo saattaa säätää tehokkaasti olosuhteita alkion yläpuolella olevassa tilassa rajoittamalla kaasujen vaihtoa ja veden häviämistä tästä osastosta. Munan i1mavarastossa vesihöyryn paine on ·" suurempi kuin ympäristössä ja 0a-jännitys pienenee C0a-jänni- 15 94772 tyksen suurentuessa hautomisajan edetessä (Wangensteen ja Rahn, 1970/71).

Kaasuja osittain läpäisevillä päällystävillä kalvoilla on osoitettu päästävän ihanteellisiin olosuhteisiin ajatellen kananpoikien alkioiden kehittymistä kuorettomassa viljelmässä (Dunn et ai., 1981). Kokeissa, joissa käytettiin avoimiksi jätettyjä kuoria, viljelmiä haudottiin hyvin kosteissa olosuhteissa, joissa C0»-pitoisuus oli 1,5 7. viiriäisten tapauksessa (Ono ja Wakasugi, 1984), sekä ilmassa kananpoikien tapauksessa (Rowlett ja Simkiss, 1987). Viimeki mainitun tutkimuksen perusteella voidaan olettaa, että ilmaan verrattuna Oa/COa-eron ylläpitäminen vi1jelyastiässä ei ole niin tärkeätä normaalille kehittymiselle viljelmässä kuin veden häviämisen estäminen ilmatilaa vasten olevasta suojattomasta suonirakkokalvosta. Oheisessa esimerkissä tarttuvaa kalvoa käytettiin kahtena kerroksena, koska eräissä olosuhteissa vain muutama alkio pysyi elossa 19 vuorokautta kuoressa, joka oli suljettu vain yhdellä kaivokerroksel1 a. Tarttuvan kalvon toinen etu on se, että se saattaa osaltaan vähentää kontaminnitumista mikro-organismeil-1 a.

Fsimerkki 2

Alkioiden viljeleminen 1. — 9. kehitysvuorokautena. Viljelyjärjestelmän II mukainen menetelmä *

Vastaanottaviksi kuoriksi valittiin munia, jotka olivat 3-4 g painavampia kuin 1uovottajamunat. Kuoren terävään päähän porattiin halkaisijaltaan 32 mm:n reikä ja munan sisältö heitettiin pois. Kuoret huuhdottiin tislatulla vedellä ja sitten ne täytettiin uudestaan vedellä kuoren sisäkalvon kuivumisen « <*' estämiseksi. Hedelmöittyneen munan, jota ei ollut haudottu, kuori leikattiin auki saksilla, kuori murrettiin auki käsin ja munan sisältö valutettiin lasipurkkiin (halkaisija 50 mm; tilavuus 60 ml). Tämän jälkeen se siirrettiin vastaanottavaan kuoreen dekantteri1asin (halkaisija 35 mm; tilavuus 70 ml) avulla. Tällä menetelmällä alkiokalvon, keltuaisen ja viskoosin ·*' ai burniini kapselin vaurioituminen oli mahdollisimman vähäistä.

16 94772

Kuoret täytettiin reunaan saakka nestemäisellä albumiinilla (1-5 ml), joka oli saatu juuri munituista munista, ja reikä suljettiin palalla tarttuvaa kalvoa, välttäen valmistamisen aikana huolellisesti ilmakuplien jättämisen munan sisään. Tarttuvaa kalvoa pidettiin paikoillaan kahdella nylonrenkaal1 a, jotka oli laitettu kuoren kumpaankin päähän, ja joita pidettiin kiinni joustavien, pienillä tapeilla kiinnitettyjen nauhojen avulla (kuvio 4). Alkuperäistä tilaa vastaaviksi tehtyjä munia haudottiin kyljellään ja niitä keinutettiin aika-ajoin tai jatkuvasti 90 asteen kulmassa joka tunti toistuvina jaksoina 38 *C:n lämpötilassa, suhteellisen kosteuden ollessa 30 - 50

Viljelmät läpivalaistiin 7., 9. ja 10. haudontavuorokautena ja eloon jääneitä alkioita haudottiin edelleen. Normaalisti kehittyneet alkiot todettiin 74 prosentissa viljelmiä 7. haudontavuorokautena (taulukko 3). Kuolleisuus oli suuri seuraa-vien 2 vuorokauden aikana ja vain yksi alkio pysyi elossa yli 10 vuorokautta. Kaikissa preparaateissa kuoren tylpässä päässä oleva ilmavarasto oli laajentunut haihtumalla hävinneen veden korvaten.

Taulukko 3

Floon jääneiden kananpojan alkioiden lukumäärä tiettyjen ajanjaksojen välein sen jälkeen, kun ne oli siirretty hautomatto— mistä munista vastaanottaviin kuoriin. Viljelyjärjestelmä II

.* Haudonta- Elävien Elävät alkiot/ vuorokaudet alkioiden viljelmät muninnasta lukumäärä yhteensä (7.) 0 47 6 39 83 \ 7 35 74 » 9 15 32

Callebaut (1983) on kuvannut menetelmän viiriäisten alkioiden viljelemiseksi vastaanottavissa munankuorissa 2-3 vuorokauden **' ajan (numerotietoja ei esitetä). Tämä tekniikka käsitti hedel — il lii t mu i.i iu > 17 94772 möittyneen luovuttajamunan sisällön siirtämisen tyhjään isäntä-soluun, minkä Jälkeen preparaatti suljettiin petrimaljal1 a Ja sulalla paraffiinivahalla. Tätä menetelmää on kehitetty edelleen kananpoikien alkioita varten käyttämällä sulkemiseen tarttuvaa kalvoa Ja pyörittämällä preparaatteja hautomisen aikana. Paikoillaan pidettyihin viljelmiin perustuvissa kokeissa eloonjäämisaste oli 50 % 7. vuorokautena ja nämä alkiot olivat tavallisesti jälkeenjääneitä ikäänsä vastaavaan kehitysasteeseen verrattuna. Pyrittäessä kasvattamaan 1. vuorokauden alkioita ilmatilan sisältävissä viljelyjärjestelmissä I ja III todettiin, että kuolleisuus oli suuri toisen ja kolmannen haudonta— päivän aikana. Samanlaisia havaintoja ovat tehneet Dunn et ai. (1981) kuorettomissa viljelyjärjestelmissään. Näissä järjestelmissä esiintyvien kehityshäiriöiden voidaan ehkä katsoa johtuvan siitä seikasta, että alkiokalvoa peittää ainoastaan ohut albumi ini kai vo. Romano-f-f (1943) on korostanut nestemäiseen albumiiniin upottamisen merkitystä alkiokalvon kehittymiselle koko keltuaiseen. AIkiokalvoalueen jatkuva huuhtoutuminen nestemäisellä albumiinilla, jollaiset olosuhteet saavutetaan ilmaa sisältämättömässä kuoressa, saattaa edesauttaa alkiokalvon alla olevan onkalon muodostumista. Tämä onkalo täyttyy albumiinista peräisin olevalla nesteellä varhaisen kehityksen aikana (New, 1956). Tämä prosessi on oietettavasti häiriintynyt preparaateissa, joissa riittävät albumiinimäärät puuttuvat alkion 1ähei syydestä.

«

Callebaut:in (1983) viljelyjärjestelmää viiriäisten alkioita varten on muokattu tässä esimerkissä muun muassa korvaamalla petrimaljaan ja parat-f i ini vahaan perustuva suljin tarttuvalla kalvolla, pyörittämällä viljelmiä inkuboinnin aikana ja soveltamalla sitä kananpoikien alkioihin. Nämä muunnokset pidensivät *; kehittymistä viljelmissä 4 vuorokaudella ja ne johtivat suureen eloonjäämi sasteeseen.

Esimerkki 5

Alkioiden viljeleminen kehittymisen 1. vuorokaudesta kuoriutumiseen. Viljelyjärjestelmien II — III mukainen menetelmä I·· » 18 94772

Hautomattorni sta munista saatuja alkioita viljeltiin 3 vuorokautta esimerkissä 2 kuvatulla tavalla (kuvio 4). Sitten preparaatit poistettiin haudontalaitteesta yksi kerrallaan, kuoreen tehtiin viilto ja sisältö siirrettiin suurempaan kuoreen esimerkissä 1 kuvatulla tavalla (kuvio 3). Yritykset poistaa pienemmän kuoren sisältö olemassaolevan aukon kautta johtivat väistämättömästi alkion ja alkion ulkopuolisten kalvojen vaurioitumiseen. Viljelmiä inkuboitiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Eloonjäämisasteet esitetään taulukossa 4.

Taulukko 4

Eloon jääneiden kananpoikien alkioiden lukumäärä tiettyjen ajanjaksojen välein sen jälkeen, kun ne on siirretty hautomat-tomista munista pieniin vastaanottaviin kuoriin, sekä 3 vuorokauden kuluttua suuriin vastaanottaviin kuoriin. Viljelyjärjestelmät II - III.

Hautomis- Elävien Elävät alkiot/ vuorokaudet alkioiden viljelmät munimisesta lukumäärä yhteensä (X) 0 59 3 55 93 9 34 58 14 28 47 18 21 36 21 17 29

Kuoriutuminen 16* 27 21 - 22 * Kuoriutuneiden kananpoikien lukumäärä sisältää sekä * terveet että heiveröiset linnut Häviöt haudonnan varhaisessa osassa koostuivat alkioista, jotka eivät kyenneet kehittymään järjestelmässä II, sekä alkioista, jotka vaurioituivat järjestelmään III siirtämisen aikana. Kuolleisuus 3. ja 9. vuorokauden välissä johtui todennäköisesti myös vaurioitumisesta siirtämisen aikana. Kuoriutumisaste oli 19 94772 27 7. ja kuten esimerkissä 1 esitetään, noin 20 prosentissa juuri kuoriutuneista kananpojista esiintyi koipi- ja keltuais-pussivikoja. Joukko näistä vastasyntyneistä kasvatettiin täysikasvuisiksi ja niiden sukusolujen elinkelpoisuus testattiin. Kahdesta koekanasta (munien tuottamisaste 89 7. ja 75 %, vastaavasti), jotka oli keinosiemennetty punaisista Rhode Island-kukoista saadulla spermalla, saatujen munien kuoriutumisaste oli 63 7. ja 80 X, vastaavasti. Warren-kanoista, jotka oli keinosiemennetty kahdesta koekukosta saadulla spermalla, saatujen munien kuori utumi saste oli 80 V. ja 15 %, vastaavasti. Kaksi koekanaa ei alkanut munia.

Viljelyjärjestelmässä II kehittyminen estyi 8. - 10. kehitys-vuorokautena, ja se vaikutti liittyvän suonirakkokalvon ja kuoren sisäkalvon välisen kosketuksen puuttumiseen. Chalazan katkeaminen alkuperäiseen tilaan palautetussa munassa on saattanut vaikuttaa keltuaisen kelluvuuteen ja näin ollen edelleen alkion ulkopuolisten kalvojen etäisyyteen kuori kalvosta, jolloin kaasujen vaihtomekanismi on häiriintynyt. Tämän ongelman kiertämiseksi alkiot siirrettiin järjestelmään, jossa alkion ulkopuoliset, verisuonia käsittävät kalvot sijaitsivat ilman ja albumiinin rajapinnan läheisyydessä. Sopivin aika viljelyjärjestelmään III siirtämiseksi oli kolmannen haudontavuoro-kauden loppupuolella, kun verisuonien kehittyminen oli käynnistynyt ja kun alkuperäiseen tilaan saatetun munan komponentit "·' olivat edelleen riittävän kestäviä kestääkseen käsittelyä.

Tietyissä kokeissa, joissa alkioita viljeltiin 1. kehitysvuoro-kaudesta alkaen paikoillaan pidetyissä, ilmatilan sisältävissä kuorissa (kuvio 3), eloonjäämisaste oli pieni ja kuoriutuvuus oli nolla (M. Naito, henkilökohtainen tiedonanto).

Toimenpide, joka kytkee vaiheen II mukaisen menetelmän vaiheen III mukaiseen menetelmään, on uusi. Tämä on ensimmäinen julkaisu lintualkioiden onnistuneesta viljelemisestä alkaen alkio-kalvovaiheesta (vaihe 1) ja päättyen kuoriutumiseen.

20 .94772

Esimerkki 4

Hedelmöittyneiden munien viljeleminen 7. vuorokauteen saakka. Viljelyjärjestelmät I ja II. Menetelmä.

Kanat otettiin 2,75 tuntia arvioidun munimisajan jälkeen, kun ensin oli varmistettu, että munittu muna oli hedelmällinen. Päivittäisen lisääntymisjakson tällä hetkellä seuraava munasolu on irronnut ja se kulkee parhaillaan magnumin läpi, jossa magnumissa tapahtuu albumiinin kerrostuminen. Munanjohtimissa olevien alkioiden taiteenot.tamiseksi kanat tapettiin injektoimalla niihin suonen sisäisesti natriumpentobarbitöniä (EXPIRAL, Ceva Ltd.), vatsa kynittiin ja pyyhittiin 70 7. alkoholilla. Hedelmöittyneen munan sisältävä osa munanjohtimesta nostettiin ulos vatsaontelosta, se leikattiin irti ja laitettiin suolaliuoksella kostutetun paperin sisältävään steriiliin maljaan. Suurin osa munista sijaitsi 50 - 150 mm:n etäisyydellä magnumin reunasta, isthmus mukaan lukien.

Munanjohtimen seinämään tehtiin pitkä viilto ja munasolu valutettiin lasidekantteriin (halkaisija 35 mm; tilavuus 70 ml), välttäen keltuaista ympäröivän, viskoosia albumiinia olevan kapselin vahingoittuminen. Munasolut siirrettiin lasipurkkeihin (halkaisija 40 mm; tilavuus 60 ml), jotka sisälsivät noin 5 ml viljelyalustaa, ja keltuaista käänneltiin itulevyn saamiseksi ylimmäiseksi. Alustaa lisättiin tasolle, joka oli samalla * korkeudella kuin itulevy, mutta albumi ini kapse1 in pinnan ala puolella ja astiat suljettiin SARAN WRAP—kaivoila ja varmistettiin joustavalla nauhalla (kuvio 5). Tarvitun alustan kokonaistilavuus riippui keltuaisen ja albumiinikapselin yhteisestä koosta, ja tämä tilavuus oli 8 — 12 ml. Niissä viljelmissä, joissa itulevy sijaitsee keltuaisen sivulla, astiat kallistet-ti in sen takaamiseksi, ettei itulevyn yläpuolella oleva albu-miinikapseli ole uppoutunut alustaan. Valmisteita inkuboitiin 41 - 42 *Csn lämpötilassa 24 tuntia, viiveajan, joka kuluu munasolun irroittamisesta magnumista hautomisen aloittamiseen, ollessa korkeintaan 20 minuuttia.

21 94772

Vi 1jelyalusta koostui nestemäisestä albumiinista (2 osaa),

Joka oli saatu Juuri munittujen munien sisemmästä Ja ulommasta albumiini kerroksesta, sekä suolaliuoksesta <1 osa). Tämä suolaliuos sisälsi 50 mM KHC0s, 30 mM NaHCOs, 10 mM KC1, 2,5 mM MgCla-6Ha0, 0,7 mM CaCla*2HsO ja 11 mM glukoosia. Viljelyalus-tan pH laskettiin alkuperäisestä arvosta 8,4 alueelle 7,2 - 7,4 sekoittamalla COa-ilmakehässä, ja se pidettiin tässä alemmassa arvossa valmistelevien toimenpiteiden toteuttamisen ajan säilyttämällä sitä suljetuissa astioissa.

Kehittymisaste 24 tunnin kuluttua voidaan varmistaa karkeasti tarkastelemalla itualuella näköhavainnon perusteelle. Alkio-kalvon kasvun ja alkiokalvon alla sijaitsevan onkalon muodostumisen osoittaa samea rengas (halkaisija 3 mm), joka sulkee sisäänsä osittain läpinäkyvän alueen. Kuitenkin kehittymis— tehokkuuden täsmälliseksi määrittämiseksi näitä preparaatteja viljeltiin edelleen 3—6 vuorokautta II järjestelmässä.

Alkiot laitettiin II vaihetta varten tarkoitettuun viljelyjärjestelmään, kuten esimerkissä 2. Vastaanottavat kuoret valmisteltiin munista, jotka olivat noin 3 - 4 g painavampia kuin 1uovuttajakanojen muni mat edelliset munat. Viljelmät jäähdytettiin huoneen lämpötilaan ja laitettiin vastaanottaviin kuoriin, jotka täytettiin sitten vi1jelyalustalla (10 - 20 ml) ja suljettiin tarttuvalla kalvolla (kuvio 4). Alkuperäiseen tilaansa palautettuja munia haudottiin siten, että ne makasivat kyljellään, 38 aC:n lämpötilassa, suhteellisen kosteuden ollessa 30 - 50 X, ja keinuttaen munia aika-ajoin 90 asteen kulmassa tunneittain toistuvina jaksoina. Viljelmät poistettiin kuorista tarkastelua varten 7., 8. tai 9. haudontavuorokautena.

«

Tulokset esitetään taulukossa 5.

. · « 94772 22

Taulukko 5

Kanan hedelmöittyneiden munasolujen, Jotka oli poistettu magnumista 2,75 tuntia edellisten munien munimi sen Jälkeen, kehittyminen. Viljelyjärjestelmät I - II.

Muna— Alkioiden Elossa olevat alkiot esitettynä solujen lukumäärä haudontavuorokautena lukumäärä vaiheissa 27-29 789 35 24 2/2 9/17 0/4

Normaaleja alkioita kehittyi vaiheisiin 27 - 29 saakka 67 prosentissa viljelmiä. Ne eivät pysyneet elossa tätä vaihetta pitemmälle, vaan ne kuolivat tavallisesti varhain 8. haudonta-vuorokautena. Jäljellä olevissa viljelmissä ei joko tapahtunut kehittymistä lainkaan tai niissä todettiin vain alkiokalvoon liittyvän solukerroksen kehittymistä tai epämuodostuneita alkioita (katso taulukot 6, 7).

Taulukko 6

Kanan hedelmöittyneiden munasolujen, joita viljeltiin vastaanottavissa kuorissa koko haudonnan ajan, kehittyminen. I vaiheen viljelyjärjestelmän kokeilu-*-.

; Prosenttia viljelmistä

Muna- Hau— Elävät Epämuodos— Alkio- Itu- solujen donta alkiot* tuneet kalvon levyt lkm. (vrk) alkiot kasvu 48 3-5 19 6 46 29 « « + Alkuperäiseen muotoon saatetut munat laitettiin en simmäiseksi 24 tunniksi suljettuihin muovipusseihin ja niitä keinuteltiin 90 asteen kulmassa tunneittain toistuvin jaksoin. Sen jälkeen niitä inkuboitiin II järjestelmän mukaisella menetelmällä.

23 94772 * Alkiot olivat kehittymisikäänsä nähden 12 tuntia tai enemmän Jälkeenjääneitä.

Taulukko 7

Kanan hedelmöittyneiden munasolujen kehittyminen viljelyalus-tassa, Joka koostui nestemäisestä, 1aimentamattomasta tai suolaliuoksella laimennetusta tai pelkällä vedellä laimennetusta albumiinista. Vaiheiden I — II viljelyjärjestelmän kokeilut.

Prosenttia viljelmistä

Muna— Hau— Elävät Epämuodos- Alkio- Itu- solujen donta alkiot* tuneet kalvon levyt

Alusta lkm. (vrk) alkiot kasvu

Lai mentamaton 35* 6-7 51 17 29 3

Laimennettu suolaliuoksella 90* 7-B 51 13 24 12

Laimennettu vedellä 17 7-8 59 18 O 23 + Kuolleisuus oli suuri 7. haudontavuorokautena laimen tamatt omassa albumiinissa Ja 8. haudontavuorokautena laimennetussa albumiinissa.

* Näissä preparaateissä vilJelyastiat I vaiheen järjestelmää varten suljettiin tarttuvalla kalvolla Ja tarttuvan kalvon kerros laitettiin suoraan albumiini-kapselin päälle.

Viljelyjärjestelmä I vaihetta varten perustui joukkoon kokeita, joilla testattiin ensimmäisten 24 kehitystunnin vaatimuksia. Kokeet toteutettiin hedelmöittymisen jälkeen eri vaiheissa olevilla munasoluilla ja niitä käsiteltiin eri tavoin ennen niiden siirtämistä tavanomaiseen viljelyjärjestelmään II vaihetta varten munasolujen kehittämiseksi edelleen ja niiden analysoimiseksi. Tarkastelun kohteena olevan viljelyjärjestelmän piirteitä olivat: itulevyn päällä olevan materiaalin syvyys, vi1jelyalustan koostumus, kaasujen vaihto ja itulevyn 24 94772 avaruudel1inen sijainti.

Tärkeä tekijä oli itulevyn päällä olevan albumiinin syvyys. Suhteellisen ohuen albumiinikapselin yympäröimien munasolujen, jotka oli saatu magnumin etuosasta, sekä paksun albumiinikapselin ympäröi mi en munasolujen, jotka oli saatu magnumin takaosasta, tapauksessa eloonjäämisaste oli pienempi kuin magnumin keskivaiheilta <50 - 150 mm isthmuksesta) poistettujen munasolujen tapauksessa. Magnumin keskivaiheilta saatujen munasolujen kehitys estyi, mikäli albumiinikapseli poistettiin, jolloin itulevy kellui alustan pinnalla. Kehittyminen estyi myös siinä tapauksessa, että täydellinen munasolu, kapseli mukaan lukien, upotettiin alustaan. Kokeissa (taulukko 6), joissa testattiin järjestelmän II (kuvio 4) käyttöä hedelmöittyneiden munasolujen viljelemiseen, todennäköisin syy kehityshäiriöihin oli kapselin käsittävän munasolun uppoaminen vi1jelyalustaan. Tällaisissa valmisteissa, joita haudottiin ensimmäiset 24 tuntia suljettu pinta ylimmäisenä, itulevyn ja sulkimena toimivan tarttuvan kalvon välinen etäisyys vaihteli ja riippui keltuaisen kellu-vuudesta.

Tarkoin määritelty kasvualusta ei ollut olennaista kehitykselle vaiheessa I. Alkiot kasvoivat hyvin 1 aimentamattomassa albumiinissa 6 vuorokautta vaiheisiin 25 — 26 saakka. Kuitenkin tämän vaiheen ylittävää kehittymistä varten oli välttämätöntä käyttää * laimennettua albumiinia (taulukko 7). Suolaliuoksen koostumus perustui tutkijoiden Beadle, Conrad ja Scott (1938) sekä Leonard (1968) esittämiin tietoihin albumiinin ioni koostumuksen eroista kohdussa ennen turpoamista olevien munien ja munittujen munien välillä. Glukoosia lisättiin pitoisuutta kohtunesteessa (Davidson ja Draper, 1969) vastaavana pitoisuutena munan muo-dostumisen kohtuvaiheen alkaessa. Alkuperäiseen muotoon palautetuissa munissa nesteen kokonaismäärä (sunlaliuos plus tur— poamisliuos) oli karkeasti ottaen sama kuin turpoamisnesteen määrä munituissa munissa. Turpoamisneste muodostaa noin puolet munan ai burniinisisällöstä, joka vaihtelee alueella 36 - 40 ml munasta riippuen. Kokeista, joissa alustassa oleva albumiini oli laimennettu pelkästään tislatulla vedellä, saatiin saman- . 94772 25 kaltaisia tuloksia kuin kokeissa, joissa laimentimena käytettiin suolaliuosta (taulukko 7). Näin ollen vesi on tärkeä aineosa lyhytaikaisessa viljelyssä vaiheeseen 29 saakka.

Kaasuympäristnä vi1jelyastiassa ja siihen liittyvää alustan happo-emäs-tasapainoa ei tarvinnut säätää täsmällisesti munan-johdinvaiheessa kehittymistä varten. Kohdussa albumiinin pH vaihtelee alueella 7,15 - 7,4 (Sauveur ja Möngin, 1971). pH nousee munassa arvoon parin tunnin sisällä munimisesta johtuen COa:n vuotamisesta kuoren läpi (Dawes, 1975). Sitä vastoin albumiinin happipitoisuus kohdussa on pieni ja se tasapainottuu munassa 2 tunnin sisällä munimisesta (Uishart, henkilökohtainen tiedonanto). I vaihetta varten tarkoitettua viljelymenetelmää varten alustan pH asetettiin tavanmukaisesti alueelle 7,2 — 7,4 COa:lla vastaamaan olosuhteita in vivo; alustan happitaso oletettiin samaksi kuin ympäristössä. Astiat suljettiin SARAN WRAP-kalvoila pH:n pitämiseksi arvoa 7,B pienempänä sekä kostean ilmakehän ylläpitämiseksi kammiossa.

Kehittymistä ei häirinnyt viljeleminen korkeammassa pH:ssa, vaikka eloonjääneiden alkioiden lukumäärä pienenikin jonkin verran. Hedelmöittyneet munasolut laitettiin vastaanottaviin kuoriin, jotka täytettiin alustalla, pH 7,4, siten, että alusta ulottui itulevyn tasolle, ja kuoret peitettiin kansilla. Niitä haudottiin 24 tunnin ajan 42 *C:n lämpötilassa 10 % C0a:ssa ! tai ilmassa, suhteellisen kosteuden ollessa 80 7.. Viljelyalus— tan pH nousi keskimäärin 0,31 yksikköä ja 1,15 yksikköä, vastaavasti. Alkioita viljeltiin järjestelmässä II edelleen 6 vuorokautta. Normaaleja alkioita kehittyi 55 prosentissa (n = 33) viljelmiä, joita haudottiin 10 7. C02:ssa, ja 41 prosentissa (n = 29) viljelmiä, joita haudottiin ilmassa.

Alalla on esitetty, että painovoima vaikuttaa bilateraalisen symmetrian määräytymiseen kohdussa toteutuvassa kehitysvaiheessa (Kochav ja Eyal—Giladi, 1971). Itualueen avaruudelliseen sijoittumiseen kohdistuneet tutkimukset ovat osoittaneet, että alkioakselit muodostuvat viistossa sijaitseviin alkioihin, muttei vaakasuorassa asennossa oleviin alkioihin, määräytymisen 26 94772 kriittisen jakson aikana (Olzanska, SJolajska Ja Lassota, 1984). Oheisessa keksinnössä ei saatu näitä havaintoja tukevia tuloksia. Alkioakselit muodostuivat 68 prosentissa (n = 34) viljelmiä, jotka oli kasvatettu vaakasuorista itulevyistä, ja 74 prosentissa (n = 34) viljelmiä, jotka oli kasvatettu viistoista itulevyistä.

I vaihetta varten tarkoitettu menetelmä ja sen yhdistäminen II vaihetta varten tarkoitettuun menetelmään on täysin uutta. Tämä on ensimmäinen julkaisu, jossa esitetään linnun alkioiden kasvattaminen in vitro hedelmöittyneestä munasolusta vaiheeseen 29 saakka, eli ajanjakso, joka kattaa ensimmäisen kolmanneksen alkion elämästä. Alalla on julkaistu kaksi muuta esitystä munanjohtimessa olevien alkioiden viljelemisestä koko keltuaista käyttäen. Howarth (1971) on viljellyt munanjohtimen etuosasta saatuja munasoluja aikiokalvovaiheeseen (vaihe 1) saakka eloonjäämisasteen ollessa tällöin 60 V. (n = 10). Jotta voitaisiin estää keltuaisen nouseminen pinnalle, munasolut, joista tässä vaiheessa puuttui albumiini kapseli, laitettiin muovikuoriin, jotka oli upotettu nestemäistä albumiinia sisältäviin dekant— teri1aseihin. Kochav ja Eyal-Giladi (1971) ovat kasvattaneet kohdussa sijainneita alkioita monisoluisesta vaiheesta neljän aikeisjaokkeen vaiheeseen (vaihe 8). Tässä tutkimuksessa kuori-kalvo poistettiin, keltuainen ja albumiini siirrettiin -fysiologista suolaliuosta sisältävään dekantteriin ja keltuaista pi- | ; dettiin kiinni chalazalla itualueen pakottamiseksi viistoon asentnon.

Tätä viljelymenetelmää hedelmöittyneen munasolun kehittämiseksi 7 vuorokauden ajan voidaan käyttää kokei1ujärjestelmänä, jolla selvitetään ennen jakautumisvaihetta toteutetun kokeellisen V manipuloinnin vaikutus erilaisiin kehitystapahtumiin linnuissa.

Tässä laboratoriossa itulevyn sytoplasmaan on injektoitu ulkopuolisia geenejä, ja niiden kohtaloa on seurattu alkioissa alueella 2 h — 7 vrk vaihtelevin aikavälein.

27 94772

Esimerkki 5

Hedelmöittyneen munan viljeleminen kuoriutumiseen saakka. Viljelyjärjestelmien I — II — III mukainen menetelmä.

Munasoluja, jotka oli otettu talteen munanjohtimen keskimag-numin alueelta, viljeltiin 24 tuntia I vaihetta varten tarkoitetussa järjestelmässä (kuvio 5), ne siirrettiin II vaihetta varten tarkoitettuun järjestelmään (kuvio 4) ja niitä haudottiin 3 vuorokautta. Käytetyt toimenpiteet on kuvattu esimer— kissä 4 lukuunottamatta sitä, että nestemäisen albumiinin ja suolaliuoksen välinen suhde viljelyalustassa oli 3:2 järjestelmässä I ja 2:1 järjestelmässä II. Jotta saataisiin taatuksi se, että alkion käytettävissä on tarpeellinen määrä viljely-alustaa sen pitkäaikaista kehittymistä varten, niin järjestelmää II varten valmistetut vastaanottavat kuoret olivat tilavuudeltaan 1 — 2 ml suurempia kuin edeltävät, luovuttajakanojen munimat munat. Kun hautominen oli kestänyt yhteensä 4 vuorokautta, alkiot siirrettiin III vaihetta varten olevaan järjestelmään (kuio 3), kuten esimerkissä 3 esitetään. III järjestelmää varten valmistetut vastaanottavat munat olivat keskimäärin tilavuudeltaan 18 ml suurempia kuin II järjestelmässä käytetyt vastaanottavat kuoret. Tilavuusero määräsi ilmatilan koon kammiossa. Viljelmiä haudottiin 38 1C:n lämpötilassa 5 vuorokautta, heiluttaen niitä 30 asteen kulmassa, sitten 10 vuorokautta paikoillaan, ja ne laitettiin lopulta paikoillaan pysyvään *; haudontalaitteeseen 36 — 37 1C:n lämpötilaan kuoriutumista varten (taulukko 8).

· > 28 94772

Taulukkn B

Toimenpiteet kananpojan alkioiden hautomiseksi hedelmöittyneestä munasolusta kuoriutumiseen saakka

Peräkkäiset Heilutettu/ Lämpö- Suht. kosteus hautomis- paikoillaan Kulma tila, *C (Tl) haudonta- vuorokaudet laitteessa

0- 1 paikoillaan - 41-42 O

1- 4 heilutettu 90* 38 30—50 4-9 heilutettu 30* 38 30-50 9-19 paikoillaan — 38 40-55 19-22 paikoillaan - 36—37 40—60

Taulukossa 9 esitetään tulokset yhdeksästä kokeesta, joissa viljelmiä haudottiin neljännestä 19:teen vuorokauteen olosuhteissa, joissa suhteellinen kosteus oli 30 - 55 TL.

Taulukko 9

Kanan hedelmöittyneiden munasolujen eloonjääminen ja kuoriutu-misaste tietyin väliajoin viljelmässä. Viljelyjärjestelmät I - II - III.

Haudonta- Elävien alkioiden Elävät alkiot/ ; vuorokaudet lukumäärä viljelmät yhteensä (TL) 0 96 4 55 57 10 31 32 15 26 27 19 18 19 22 10 10

Kuoriutuminen 22-23 8* 8 t Viisi kananpoikaa oli terveitä.

Il I IM.fc lii li IIIU < 29 94772

Varhaiset tappiot koostuivat neljäntenä vuorokautena alkioista, jotka eivät kehittyneet, ja 10. vuorokautena alkioista, jotka olivat vahingoittuneet järjestelmästä II järjestelmään III siirrettäessä. Hedelmoittyineistä munasoluista viljellyt alkiot olivat heiveröisiä ja ne vaurioituivat herkemmin kuin alkiot, joita oli viljelty 1. vuorokaudesta alkaen. Kuoriutumisaste oli 8 7. ja arviolta puolet kuoriutuneista kananpojista oli terveitä. Suhteellisen kosteuden ollessa suurempi, 50 — 60 7. kuoriutumisaste oli samankaltainen (n = 85), mutta vain yksi kananpoika oli terve. Yksi heikko kananpoika kuoriutui viljelmistä, joita oli haudottu olosuhteissa, joissa suhteellinen kosteus oli 75

Yhteensä 7 tervettä kananpoikaa kuoriutui viljellyistä hedelmöittyneistä munasoluista, mukaan lukien se, jota oli viljelty muokatulla menetelmällä. Kaksi kukkoa eli täysikasvuiseksi saakka; toinen niistä on hedelmällinen, ja se tuottaa kuoriutumi sasteeksi 75 7. keinosiemennettyjen Warren—kanojen munilla, ja toinen näistä kukoista on hedelmätön. Kaksi 9 viikon ikäistä nuorta kanaa vaikuttaa terveiltä. Muut linnut pysyivät elossa 1, 8 ja 16 viikkoa, vastaavasti

Edellä on tarkasteltu niitä syitä, miksi 3 erillistä viljelyjärjestelmää käytetään peräkkäisiä kehitysvaiheita varten. Vaikuttaa siltä, että superstratum!11 a on ratkaiseva osa alki-: oiden kasvuun. Alkion ja superstratumin välinen oikea suhde määritettiin empiirisesti ja viljelykammion mallia muokattiin asianmukaisella tavalla muuttuvien vaatimusten tyydyttämiseksi alkion kehityksen eri vaiheissa. I vaiheessa liiallinen alusta alkion yläpuolella oli haitallista ja II vaiheessa se oli kasvulle välttämätöntä. Liiallinen alusta ei ollut haitallista • III vaiheessa ennenkuin 8. vuorokautena, jolloin kehittyminen estyi, mikäli verisuonia käsittävät alkion ulkopuoliset kalvot eivät olleet kammiossa kosketuksessa ilmakehän kanssa.

Järjestelmien I, II ja III kytkeminen toisiinsa kananpojan alkion kasvun ylläpitämiseksi viljelmässä, alkaen hedelmöitty-* mistä pian seuraavasta vaiheesta ja päättyen kuoriutumiseen, 30 94772 on itse uusi toimenpide. Tämä on ensimmäinen Julkaisu, Jossa kuvataan täydellinen viljelyjärjestelmä linnun alkiota varten (Perry, 1988).

Täydellisen in vitro järjestelmän aikaansaamisei1 a kananpojan alkiota varten on monia erilaisia sovellutusmahdollisuuksia perustutkimuksen ja soveltavan tutkimuksen alueilla. Se tarjoaa mahdollisuuden manipuloida linnun munasolua esimerkiksi injektoimalla siihen vieraita geenejä tai kokonaisia genomeja, sekä selvittää tällaisten manipulointien vaikutuksia kuoriutuneessa kananpojassa ja todennäköisesti myös täysikasvuisessa linnussa. Nämä menetelmät toimivat myös suuntaviivoina laadittaessa in vitro tekniikoita munanjohti mesta saatuja alkioita varten, jotka ovat varhaisemmassa ja pitemmälle edistyneessä vaiheessa kuin tällä hetkellä käytetyt alkiot. Menetelmää voidaan soveltaa sellaisilla aloilla kuin in vitro hedelmöittäminen sekä oletettujen totipotenttien solujen istuttaminen alkioon.

Mahdollinen sovellutusalue on transgeenisen siipikarjan tuottaminen. Kasvuun ja 1isääntymissuorituskykyyn liittyvien tekijöiden muokkaaminen on edullista si pikarjateol1isuudelle. Lisäksi uusia proteiineja koodaavien geenien istuttaminen linnun itu-linjaan on mahdollisesti arvokas tekniikka biolääketieteelli-sesti tärkeiden proteiinien tuottamiseksi munanvalkuaisessa. Kotikanan suuri 1isääntymiskyky tekee kotikanan edulliseksi : ; muihin maatalouseläimiin verrattuna tällä teknologian alueella.

Kana on täysikasvuinen 6 kuukaudessa ja se kykenee tuottamaan noin 300 munaa ensimmäisen munimisvuoden aikana.

Yhteenvetona voidaan esittää, että keksinnössä saadaan aikaan erilliset viljelyjärjestelmät kolmea kehitysvaihetta varten siten, että alkiot siirretään yhdestä järjestelmästä seuraavaan alkion koko elinajan kattaen. Koejärjestely kokonaisuudessaan sekä toimenpiteiden järjestys esitetään kaavamaisesti kuviossa 1. Esimerkkinä esitetty menetelmä III vaihetta varten on erillinen järjestelmä (esimerkki 1). Esimerkkinä esitetty menetelmä II vaihetta varten menee osittain päällekkäin III vaihetta • · .

* varten tarkoitetun menetelmän kanssa (esimerkki 2), mutta siir— 31 94772 to näiden järjestelmien välillä tulisi tehdä edullisesti tietyssä vaiheessa johtuen alkion muuttumisesta heiveröisemmäksi iän mukana (esimerkki 3). I vaihetta varten oleva menetelmä kattaa ajanjakson, joka alkaa noin 2 tuntia munasolun irtoamisen jälkeen, kun albumiini on kerrostumassa ja kun uros— ja naaraspuoliset esitumat ovat suurentumassa (Perry, 1987). Se edellyttää kytkemistä II vaihetta varten olevaan menetelmään sen analysoimiseksi (esimerkki 4), ja tämän jälkeen III vaihetta varten tarkoitettuun menetelmään täydellisen viljelyjärjestelmän saamiseksi (esimerkki 5).

• · « 32 94772

Ki r jal1i suusvi i tteet

Baedle, B.W., Conrad, R.M. ja Scott, H.M. (1938).

Composition of the uterine secretion of the domestic fowl. Poultry 5ci.. 17; 498—504.

Callebaut, M. (1983). Autoradiographic demonstration of the penetration of alhumen-derived material through the vitelline membrane into the egg yolk, exterior to the avian blastoderm. Poul try Sci. 62; 1657-1659.

Crittenden, L.B. ja Salter, D.W. (1986). Gene insertion and long-term goals. Avian Diseases. 30; 43—46.

Davidson, M.F. ja Draper, M.H. (1969). The accumulation of glukose in the white of the egg of the hen. J- Physiol. 202; 119—120p.

Dawes, C.H. (1975). Acid—base relationship within the avian egg. Binl. Rev. 50; 351-371.

Dunn, B.E., Fitzharris, T.P. ja Barnett, B.D. (1981). Effects of varying chamber construction and embryo pre-inkubation age on survival and growth of chick embryos in shell-less culture. Anat. R«=»c. 199: 33-43.

: : Freeman, B.M. ja Messer, L.I. (1985). Genetic manipulation of the domestic fowl - a review. World's Poultry Science Journal 41_: 124-132.

Hamburger, V. ja Hamilton, H.L. (1951). A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morph. 88; 49-67.

Howarth, B. (1971). An examination of sperm capacitation in the fowl. Biol. Reprod. 3: 338—341.

Kochav, S. ja Eyal-Giladi, H. (1971). Bilateral symmetry in • « .

* chick embryo determination by gravity. Science. 171: 1027-1029.

33 94772

Kochav, S., Ginsburg, M. ja Eyal—Giladi, H- (1980). From cleavage to primitive strak -formation: a complementary normal table and a new look at the first stages of development of the chick.

II. Microscopic anatomy and cell population dynamics. Dev.

Biol. 79: 296-308.

Leonard, E.M. (1968). The accumulation of minerals in the avian oviduct. Ph.D. Thesis, Univ. of Edinburgh.

New, D.A.T. (1956). The formation of the subblastodermic fluid in the hens' egg. J. Embrvol. exp. Morph. 4: 221-227.

New, D.A.T. (1957). A critical period for the turning of hens' eggs. J, Embrvol. exp. Mornh. 5: 293-299.

New, D.A.T. (1966). "The culture of vertebrate embryos". London: Academic Press.

□lszanska, R., Szolajska, E. ja Lassota, Z. (1984). Effect of spatial position of uterine quail blastoderms cultured in vitro on bilateral symmetry formation. Roux's Arch. Dev. Biol. 193: 108-110.

□no, T. ja Wakasugi, N. (1984). Mineral content of quail embryos cultured in mineral—rich and mineral-free conditions.

: Poultry Sci. 63: 159—166.

Perry, M.M. (1986a). Embryo manipulation in poultry. Proc.

XXVII. Br. Poultry Breeders' Roundtable.

Perry, M.M. (1986b). Embryo manipulation in poultry. Edinburgh .·' Centre for Rural Economy. Annual Report, 1985-86, 19-24.

Perry, M.M. (1987). Nuclear events from fertilisation to the early cleavage stages in the domestic fowl (Gallus domesticus).

J. Anat. 150: 99-109.

• « « 94772 34

Perry, M.M. (1988). A complete culture system tor the chick embryo. Nature 331: 70-72.

Romanoff, A.L. (1943). Cultivation of the early chick embryo in vitro. Anat. Rec. 87: 365-369.

Rowlett, K. ja Simkiss, K. (1985). The surrogate egg. Npu Rci — enti st 1469: 42-44.

Rowlett, K. ja Simkiss, K. (19B7). Explanted embryo culture:

In vitro and in ovo techniques for domestic fowl. Br. Poultry Sci 28: 91-101.

Sauveur, B. ja Mongin, P. (1971). Etude comparative du fluide uterine et de 1’albumen de l’oeuf in utero chez le poule. Ann. Biol, anim. Biorh. Bioohys. 11: 213-224.

Wangensteen, O.D. ja Rahn, H. (1970/71). Respiratory gas exchange by the avian embryo. Respir. Physiol. 11: 31-45.

• ( 9 >1 i ItTi mil l.t i at . .

Claims (10)

3s 94772

1. Menetelmä linnun alkion viljelemiseksi in vitro al-kiokalvon muodostumiseen saakka, tunnettu siitä, että hedelmöittynyttä munasolua, jota ympäröi tiheää albumiinia oleva kapseli, viljellään viljelyaluetaan osittain upotettuna, jolloin alustan pinta on yleensä samalla tasolla itulevyn kanssa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se suoritetaan läpäisemättömässä astiassa, joka on suljettu alhaisen läpäisevyyden omaavalla kalvosulkimella.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnet-tu siitä, että viljelyalusta on nestemäistä albumiinia, jota on voitu laimentaa vedellä ja/tai suolaliuoksella.

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, jota seuraa toinen vaihe, joka käsittää alkion viljelemisen alkion morfogeneesin aikana hautomalla alkiota viljelyalue-tassa suljetussa astiassa, joka on ääriään myöten täytetty nesteellä, tunnettu siitä, että astia ja suljin ovat nestettä läpäisemättömiä mutta kaasua osittain läpäiseviä.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toisessa vaiheessa viljelyalusta on nestemäistä albumiinia.

6. Patenttivaatimuksen 4 tai 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että viljeltyjä alkioita pidetään toisessa vaiheessa varovaisessa tai kohtalaisessa liikkeessä.

7. Jonkin patenttivaatimuksista 4-6 mukainen menetelmä, joka lisäksi sisältää kolmannen vaiheen linnun alkioiden viljelemiseksi in vitro alkion kasvuvaiheen aikana, tunnettu siitä, että alkiota haudotaan suljetussa astiassa, joka käsittää ilmatilan alkion yläpuolella, joka ilmatila on erotettu ulkoisesta ilmakehästä kaasua osittain läpäisevällä sulkimella. 94772

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kolmannessa vaiheessa astia on munan osa.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että muna on kananmuna ja että alkion ja sulkimen välisen tilan syvyys on 5-15 mm.

10. Jonkin patenttivaatimuksista 7-9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että haudottavaa alkiota pidetään kolmannessa vaiheessa varovaisesti liikkeessä, ainakin alussa.