JP2718946B2

JP2718946B2 - インビトロ胚培養法

Info

Publication number: JP2718946B2
Application number: JP63150375A
Authority: JP
Inventors: マリーペリーマーガレット
Original assignee: ジ、アグリカルチュラル、アンド、フッド、リサーチ、カウンシル
Priority date: 1987-06-19
Filing date: 1988-06-20
Publication date: 1998-02-25
Anticipated expiration: 2013-02-25
Also published as: AU1816188A; FI882923A0; JPH0198433A; KR970000596B1; ATE98423T1; PT87756A; CA1324972C; NO882707L; EP0295964B1; NO882707D0; NZ225076A; KR890000658A; FI94772C; ES2047548T3; EP0295964A1; PT87756B; DE3886274T2; DE3886274D1; FI94772B; DK175847B1

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、鳥類胚インビトロ培養技術に関するもので
あり、それは家禽、特に雌鳥への適用に特に好ましい。

（従来の技術および解決すべき課題）受精から卵割に至る発育初期の段階におけるニワトリ
の胚は、大きさ、もろさおよび卵の相対的な得がたさの
理由によって実験的な介入を受け入れなくなっている。
この問題は、外因性遺伝子の鳥への転移の可能な経路に
関する最近の調査で報告されている［フリーマンとメッ
サー 1985年クリンテンデンとサルター 1986年（Free
man and Messer,1985;Crittenden and Salter 198
6）］。ペリー（Perry 1986,a,b）は、他の調査を行な
いそして鳥類卵の遺伝子操作が実施可能であることを示
唆している。ニワトリの胚用の完全な培養システムを案
出する目的は、操作される卵を発育させて成熟させる手
段を提供することであった。今まさに、胚の発育の中間
段階に対するインビトロ培養法が確立され、さらに、そ
のための向上が図られている。その技術は、家禽の遺伝
子工学ばかりでなく、鳥類発育の基本的な機構の研究お
よび有害な遺伝的性質の研究にも適用されるであろう。
その上、好ましいその他の方法を卵を産む雌鳥に外科的
に提供する。

（課題を解決するための手段）本発明は次のように特定される。

（１）周囲に濃厚卵白嚢を有し、一部が培養培地中に沈
められ、該培養培地の表面が胚盤の位置と概して同じで
ある。受精卵を培養することからなる、胚盤葉形成まで
の鳥類の胚のインビトロ培養方法。

（２）上記培養方法が透過性の低いフイルムシールで密
封された不透過性容器中で行われる、上記（１）に記載
の方法。

（３）培養培地が水および／または塩溶液で希釈される
液状卵白である、上記（１）または（２）に記載の方
法。

（４）液体でふちまで満たした密封容器中の培養培地に
おいて胚をインキュベートすることからなり、容器およ
びそのシールが液体不透過性であるが部分的にはガス透
過性であることを特徴とする、胚形態形成中における鳥
類の胚のインビトロ培養方法。

（５）培養培地が液状卵白である、上記（４）に記載の
方法。

（６）培養される胚が穏やかから適度に攪拌される、上
記（４）または上記（５）に記載の方法。

（７）胚より上位に空隙にあり、該空隙が部分ガス透過
シールによって外部大気から分離されている、密封容器
において該胚をインキュベートすることからなる、胚成
長階段中における鳥類の胚のインビトロ培養方法。

（８）容器が卵殻の一部である上記（７）に記載の方
法。

（９）卵が雌鳥の卵であり、胚とシール間の空隙深さが
５〜15mmである上記（８）に記載の方法。

（10）インキュベートされる胚は少なくとも初期に穏や
かに攪拌される上記（７）から（９）のいずれかに記載
の方法。

（作用）ニワトリの胚は、胚円盤状組織、即ち卵の動物極に位
置する小領域の細胞膜で生ずる（普通の卵黄）。発育の
1/3の間、胚は卵黄の表面に浮遊してとどまり、一方胚
体外膜は卵黄の周りに成長しそして血管新生化を生ず
る。残りの発育期間において、胚は卵の食物貯蔵を犠牲
にして成長する。このため、ニワトリの発育は受精から
孵化に至る連続する段階における変化する必要条件に従
って３フェースに分割されている。

フェースI.受精から胚盤葉形成このフェースは、輸卵管で生じそして産卵で終わる。
生殖体相互作用は、排卵から15分以内に生じ、そして最
初の卵割分割は、約４時間後に生ずる［ペリー1987年，
（Perry,1987）］。その後の20時間で、その後の分割に
より亜胚盤葉形成（subblastodermal）キャビティの上
に横たわる細胞の単層が生じる［コカーフ、ギンスバー
フとアイアルーギラディー1980年（Kochav,Ginsburg an
d Eyal−Giladi,1980）］。輸卵管を通過する間、卵は
マグナム部（magnum）において卵白（albumen）で、そ
の後卵割が始まる峡部において卵殻膜で包まれる。子宮
において、卵白は子宮体液（ポンプ体液）の吸収によっ
て容積で二倍となり、そして最終的に卵殻は、徐々にカ
ルシウム沈着を受ける。１日当り１個の卵を長期間産む
雌鳥にとって、産卵は、次の排卵によって15〜30分以内
に起こり、そしてこのサイクルが繰り返される。

フェースII.胚の形態発生このフェースは、卵のインキュベーションの最初の３
日に生じる［ステージ１−18,ハンバーガーとハミルト
ン1951年（stage 1−18,Hamburger and Hamilton［195
1］）］。ステージ20において、胚は、10mmの長さであ
り、胚体外胚盤葉は、卵黄の周りを赤道方向に拡大す
る。

フェースIII.胚の生長このフェースは、卵のインキュベーションの最終18日
に生じる［ステージ18−45,ハンバーガーとハミルトン1
951年（stage 18−45,Hamburger and Hamilton［195
1］）］。

種々の方法は、ニェースIIにおける胚の短期間培養
［シュー1966年（new 1966）に、そしてより高等な胚の
長期間培養［デュン，フィッツハリスとバーネット 19
81年，オノのワカズギ 1984年、ローレットとシムキス
1985年 1987年（Dunn,Fitzharris and Barnett,198
1;Ono and Wakasugi,1984;Rowlett and Simkiss,1985,1
987）］に有効である。あるものは、卵黄からの胚の移
植を含むのに対し、他のものは、胚およびそのまま卵黄
を培養容器へ移すことを含んでいる。後者の方法は、長
期間培養でより好ましい条件を与え、そして今日の培養
システムに広く使用されている。

本発明の第１の態様によると、周囲に濃厚卵白嚢を有
し、一部が培養培地中に沈められ、該培養培地の表面が
胚盤の位置と概して同じである、受精卵を培養すること
からなる、胚盤葉形成までの鳥類の胚のインビトロ培養
方法が提案される。この際、上記本発明の方法におい
て、培養方法が透過性の低いフィルムシートで密封され
た不透過性容器中で行われることが好ましい。

そのシールは、好ましくフィルム形態である。そのシ
ールは、プラスチック材料、例えばポリエチレン製であ
る。商業上入手可能なクリングフィルムが、特に二層で
使用された場合に、適切なシールを形成することが見い
出されている。クリングフィルムの適切な特性を有する
いかなる他の材料も使用してよい。

シールとして使用する材料の適合性は、二酸化炭素お
よび／または水蒸気の透過性を測定することによって間
接的に測定できる。即ち、二酸化炭素の透過性は、不透
過性容器内で38℃において24時間インキュベーション
後、卵白のpH上昇を試験することによって測定される。
卵白は、最初二酸化炭素ガスを供給してpH0.1以下であ
るべきである。0.5から1.5のpH上昇は、一般に好まし
い、好適な範囲は0.5または0.7から1.0または1.3であ
り、例えば約0.9である。水蒸気透過性は５または10か
ら30または40mg/cm²/24時間である。

容器は好ましくは卵殻の一部であり、それは通常培養
される種類の同一種から選ばれる。卵から丸い方の端
（blunt end）を除くことが特に適切であることが見い
出されている；つまり、卵の軸を中心とする40mm直径の
穴が特に好適であることが見い出された。

卵の丸い方の端における穴は、部分的なガス透過性シ
ールで密封される。シールは卵白を用いて卵殻に付着さ
せてもよい。好ましい透過特性は天然の卵の特性に類似
する。

本発明の上記態様の具体的な実施において、特に、先
行培養ステージがインビトロである際には、培養培地は
存在してもよいが、例えば先行培養ステージが自然に行
なわれる場合には、プロセスは培養培地なしでも働く。
存在する培養培地は、通常卵白、未希釈または希釈した
状態で、そして好適な子宮内体液からなる。

雌鳥の卵を使用する際には、胚とシール間の空隙深さ
は、５〜15mm、例えば約10mmであるであることが好まし
い。

少なくとも初期段階に、穏やかにインキュベート胚を
撹拌することが好ましい。穏やかに撹拌することは、例
えば30°の角度間の、間欠振動によって達成し得る。従
来のインキュベーション温度、例えば約38℃が保持され
る。

本発明の上記態様によるインビトロ培養法は、（受精
から数えて）約４日から孵化、一般に約22日に起こる、
までに使用することが好ましい。しかしながら、胚生命
の最終の数日（例えば13日）は、撹拌しないことが好ま
しい。加えて、推定孵化時間の直前（例えば、１〜２日
前）には、一定の空気を容器内に入れるためにシールに
穴を開けることが好ましい。更に、空気はその後供給さ
れる。例えばシールを除き、必要であれば（卵殻が容器
を形成する時に）卵殻の穴を任意にペトリ皿で与えられ
る固形円盤で覆うことにより達成される。

本発明の第２の態様によれば、液体でふちまで満たし
た密封容器中の培養培地において胚をインキュベートす
ることからなり、容器およびそのシールが液体不透過性
であるが部分的にはガス透過性であることを特徴とす
る、胚形態形成中における鳥類の胚のインビトロ培養方
法が提案される。

また、本発明の第３の態様によれば、胚より上位に空
隙があり、該空隙が部分ガス透過シールによって外部大
気から分離されている、密封容器において該胚をインキ
ュベートすることからなる、胚成長段階中における鳥類
の胚のインビトロ培養方法が提案される。

容器は、部分的にガス透過性であってもよい。ガス透
過性は、（一般に内卵殻膜と組み合わせた）卵殻によっ
ておよび／または部分ガス透過シール、その好適な特性
は本発明の第１の態様で示されている、によって提供さ
れるだろう。卵殻および内卵殻膜は、部分的にガス透過
性であることに注意すべきである。

培養培地は、新鮮な卵から集められる液体卵白が好ま
しい。

容器は、再び卵殻の一部であることが好ましいが、好
適な構成は、本発明の第１態様とは若干異なる。この態
様において、例えば32mmの穴で除かれるのは鋭い方の端
が好ましい。上記により、外卵殻膜と内卵殻膜間に空隙
を存在させる；このことは、空隙が培養中に拡大して蒸
発による水分損失を補うため有益であると思われる。

シールが鋭い方の端を除いた卵を密封するために使用
されている際には、卵は一般的に水平位置で培養され、
その後シールが一側面にある。シールは、卵殻にしっか
りと固定されるべきである。

培養胚を穏やかないし適度に撹拌することが極めて好
ましい。例えば90°の角度間の一定周期で、またはその
他の類同する間隔ごとに間欠または連続振動することが
好ましい。

本発明の上記態様による方法は、一般に受精後約１日
に（即ち、産卵のほぼ通常の時間）に始まり、そして２
またはそれ以上、例えば８日まで、続くだろう。しかし
ながら、本発明の上記態様による方法が、胚を第１の態
様による方法に移す前に、３日ないし４日間ほどしか続
けられないことが好ましい。

本発明において、胚の形態発生および胚の成長段階の
間の鳥類の胚のインビトロ培養方法が提供されてもよ
い。すなわち、この方法は、胚を本発明の第２の態様に
よる方法で培養した後、胚芽を第３の態様による方法に
よって培養することからなることが好ましい。

移動が受精後２〜５日、例えば４日で起こることが好
ましい。

また、本発明の胚盤葉形成まで鳥類の胚をインビトロ
で培養する方法は、受精卵を培養し、周囲に濃厚卵白嚢
を有し、一部が培養培地に沈められた受精卵を培養する
ことからなることを特徴とするものである。胚盤は概し
て上位にあるが卵白嚢の位置よりは下であり、最適な結
果を得るためには、培地の表面は胎盤の位置と概して同
じでなければならない。

受精卵は、雌鳥から外科的に得られてもよい。外科手
術が使用される場合には、卵はマグナム中部から、例え
ば峡部から50〜150mmの地点から、取ることが好まし
い。受精卵をマグナム部のこの領域から取ることは、受
精卵が高密度卵白の周囲カプセルの最適厚みを有すると
思われる点で好ましいこと見い出される。

培養培地は、水および／または塩溶液で希釈される液
体卵白である。一般に、液溶液を有する希釈卵白（例え
ば、3:2）で培養を始め、その後（例えば、１日後）塩
溶液で卵白を希釈（例えば、2:1）することが好まし
い。

本発明の態様による方法は、密封容器内で行なわれる
ことが好ましい。容器は、ガラスのような不透過性物質
からなり、サランラップ（商標）のような低ガス透過性
フィルムで密封されてもよい。サランラツプの適切な特
性を有するいかなる他の物質をも使用できる。ガス透過
性は、上記の如く測定される（例えば、二酸化炭素およ
び／または水蒸気）。24時間のpH上昇は、二酸化炭素透
過性試験において0.5〜1.0、例えば0.6〜0.8である。水
蒸気透過性は、1.0〜10、例えば２〜5mg/cm²/24時間で
ある。

本発明において、胚を胚盤葉形成までおよび胚形態形
成中培養する際には、本発明の第１の態様で培養された
胚を、その後本発明の第２の態様による方法によって培
養することが好ましい。

さらに、受精から孵化までの鳥類の胚を実際に完全に
培養するシステムを使用することが望ましいならが、種
々の上記本発明の態様を順次採用することが適切である
と理解されるだろう。したがって、本発明において、胚
盤葉形成までは第１の態様に従って、胚形態形成中は第
２の態様に従って、さらに胚成長段階中は第３の態様に
従って、鳥類の胚を培養することからなる、胚盤葉形成
まで、胚形態形成中および胚成長段階中における鳥類の
胚のインビトロ培養方法が好ましく使用される。

卵が容器として使用される際には、第２ステージにお
いて容器としての卵殻はドナー卵より、例えば１〜2m
l、若干大きいことが一般に好ましい。第３の段階にお
いて卵が容器として使用される際には、容器としての卵
殻は、直接的な前のステージにおいて使用されたものよ
り相当に大きい（例えば約18ml）ことが好ましい。

本発明をより理解し、かつどのように効果に導かれる
かを示すために、図面を参照して種々の実施態様を記載
する。

第１図は、個々および連接したシステムによってカバ
ーされた発育の期間を示すニワトリの胚の培養システム
の概略図を示す。同図は、一連の３培養システムにより
カバーされたニワトリの胚発育期間および培養における
完全発育システム間の胚の移動時期を示す。

第２図は、新たに産卵した雌鳥の卵の構造を示す図で
ある［ダウズ 1975年ら（Dawes,1975）］。

第３図は、フェースIII（４日〜孵化）の培養のシス
テム図である。

第４図は、フェースII（１日〜４または９日）の培養
システム図である。このシステムは、さらに３〜４日か
ら初期成長フェースへの発育を示す。

第５図は、フェースＩ（受精から２時間〜１日）の培
養システム図である。

ここで、本発明の多くの実施例を説明する。実施例に
おいて特記されない限り下記物質を使用する。

培養胚の生存率を第１表に要約する。

動物ワレンズ（Warrens）［イサブラウン（Isa B
rown）］の商業用種の産卵用雌鳥を個々のケージに入
れ、かつ14時間照明/24時間サイクルで保持した。28−3
2週齢で、長期間にわたり１卵／日で産卵すると、ロー
デアイランドレッド種の雄鳥（Rhode Island Red Cocke
rels）から集めた新鮮な精液で人工受精された。

受精率を非インキュベート卵の目視により定期的に観
察したところ、90％以上であることが見い出された。受
精卵において、胚領域は、半透明領域を囲む白いリング
（直径３−4mm）として観察され、そして非受精卵にお
いては空胞を含む円盤（直径２−3mm）として現われ
る。

卵前24時間の間に産卵用雌鳥によって産卵された卵
は、培養システムIIとIIIの胚の源として使用された
（実施例１−３）。この雌鳥種が産んだ新鮮な卵（受精
および非受精）も同様に培養培地用の卵白源として使用
された。液体卵白は、卵（第２図）の内部よおび外部卵
白層から集められ（図２）、そして培養のため同日内に
使用された。培養システムII（実施例２−５）用の容器
卵殻は、産卵用雌鳥から得られた。システムIII用の培
養容器として使用されるより大きな卵殻（実施例1,3,
5）は、地方の孵卵所［［ディー．ビー．マーシャル，
ウイットバーン，ウエストロチイアン（D.B.Marshal
l,Whitburn,West Lothian）］から得られた商業用ブロ
イラー種の双卵黄卵からのものであり、産卵１−２週間
以内に培養に使用された。

ラッピングフィルム二種類のプラスティックラ
ップを培養容器の密封用に使用した。サランラップ（ダ
ウケミカルカンパニー）は、低ガス透過性を有し
［ダン、フィッツハリスとバーネット1981年（Dunn,Dit
zhasrris and Barnett,1981）］、最もシステムＩに適
していた。タリングフィルム（どのブランドでもよい
が、好ましくはPVC付加物を欠くもの）は、部分的にガ
ス透過性であり［ダン等 1981年（Dunn et al.,198
1）］、フェースIIとIIIに使用された。透過性テスト
は、培養胚をインキュベートするための条件下において
実際に使用されたラッピングフィルムに対して行なわ
れた。CO₂の透過性は、25mlの培地を含有し、かつラッ
ピングフィルムで密封されたガラスジャー（60ml、直径
40mm）中の培養培地（液体卵白：塩溶液＝2:1）のpH上
昇の測定によって間接的に測定された。培養培地は、pH
を適当な値にまで下げるために最初にCO₂を供給した。
サランラップ（一層）の場合、pHは41.5℃、湿度０で24
時間のインキュベーションの間に平均0.7ユニット、pH
7.2−7.5からpH7.8−8.2に上昇した。クリングフィル
ム（２層）の場合、pHは、38℃、相対湿度45−55％で24
時間のインキュベーショの間に平均1.0ユニット、pH7.2
−7.5からpH8.3−8.5に上昇した。水蒸気の透過性は、1
50mlの水を含む皿（350ml、直径104mm）からの水分損失
を測定することによって決定した。皿をラッピングフ
ィルムで密封し、そして前述と同様にしてインキュベー
トした。サランラップの場合、平均透過性は、3.4mg/cm
²/24時間（範囲3.2−3.8mg）であった。クリングフィ
ルムの場合、平均透過性は、22mg/cm²/24時間（範囲15
−28mg）であった。

インキュベーション自動回転機構を有する多くの圧
縮空気キャビネットモデルインキュベーション（カ
ルフューモデル CURFEW Model 248）を胚の培養に使用
した。各インキュベーターにおける温度、湿度とトレイ
の傾斜角度の条件は、胚発育の各期間における要求に合
うように調節した。培養物を適当な時間に１インキュベ
ーターから次のものに移し、２ないし３日以上の間隔で
検査した。孵化前および孵化直後の期間の場合、培養し
たものを、しばしば観察するために透明な蓋を取付けた
テーブルトップスティルエアーインキュベーター（カル
フューモデル146）に投入した。湿度は、インキュベー
ターの底に置かれた水の皿（２リットル容量）を使用し
て、フィッシャーヘアーハイグロメータ（ガレンカ
ンプ）で測定してある所定のレベルで保持された。装置
を洗浄し、ミルトン滅菌後（MILTON sterilising flui
d）［リチャードソン−ヴィックスリミテッド（Richr
dson−Vicks Ltd）］で毎月滅菌した。

滅菌操作の全ては、半滅菌状態で行なった。卵白の
細菌静止特性は、厳重な無菌対策を不必要とした。卵を
集荷後直ちに70％アルコールで簡単にリンスして、使用
直前に70％アルコールで洗浄して水を除いた。装置の全
て、蒸留水と生理食塩水をオートクレーブ処理した。塩
溶液は濾過滅菌された。ラッピングフィルムの場合、
フィルムのロールの外側層を廃て、シート（100mm²）を
切り、シート状の滅菌紙の間に置いた。この操作、卵白
の集荷と培養物の調製をクリーンエアーキャビネット内
で行なった。抗生物質（ペニシリン100U/ml;ストレプト
マイシン100μg/ml）を、システムIIIの容器卵殻を密封
するクリングフィルムを装着するために使用する、卵白
に加えた。

（実施例）実施例１発育の４日から孵化までの胚の培養培養システムIII法容器卵殻を二倍卵黄卵から調製した。直径40mmの円を
卵の丸い方の端の周りにドリルで開け、空気セルを含む
卵殻のキャップを取り除いた。内容物を取り除いた後、
卵殻を蒸留水で洗浄し、その後水で満たして内卵殻膜の
脱水を防止した。容器卵殻の容積は65〜75mlの範囲であ
った。ステージ15−20における胚を含む３日間インキュ
ベートされた卵を割って開け、クリングフィルムで裏付
けした浅い皿におとした。胚をクリングフィルムザ
ックから容器卵殻に移し、その後胚を最上部に保持する
ようにクリングフィルムを徐々に抜いた。詳細な移動方
法は、ローレットとシムキス（Rowlett and Simkiss 19
87）の報告に示されている。卵殻を、卵殻へフィルム
（第３図）を接着するために液体卵白を使用して、２層
のクリングフィルムで密封した。胚とフィルム間の空隙
の深さは平均10mmであった。

培養物を38℃でインキュベートし、５日間30°の角度
間を間欠的にゆり動かし、その後、10日間静止状態で保
持した。最後の３−４日間、37℃で静止孵化インキュベ
ーターに置かれた。相対湿度は45−60％の範囲であっ
た。予定孵化時期の１〜２日前に、くちばし状が漿尿膜
を突いて空隙まで至った時、小さな穿孔がクリングフィ
ルムに設けられた。クリングフィルムを孵化の数時間
前にペトリ皿の蓋で置き換えた。

孵化率は36％（第２表）であり、孵化の72％が健常で
あった。平均重量は、普通の卵（ovo）で成長した対照
ニワトリの46gに比較して35gであった。弱い動物の異常
性としては、不完全に収縮した卵黄嚢、未回復のへそお
よび肢欠損があった。べたべたする雛は一般的であり、
その状態は卵殻内のある未吸収卵白の存在と関連した。

オノとワカスギ（1984年）は、３日インキュベートし
た卵から得られたウズラの胚を培養する卵殻技術を案出
した；即ち、彼等は、卵殻が胚用のカルシウムの必須源
であることを示した。ローレットとシムキス（1985年,1
987年）は、家禽にこの技術を採用して20％の孵化率を
得た。カルシウム吸収とガス交換における漿尿膜の機能
は、ドナー胚とホスト卵殻間の種または種類の違いによ
って損なわれなかったと思われる。

初期インキュベーション中の培養物の回転は、ローレ
ットとシムキス（1987年）によって勧められている。イ
ンキュベーションの間、雌鳥の卵を回転することが一般
的に行なわれているが、ニュー（1957年）は、臨界期間
がインキュベーション３〜８日目の間であることを示し
た。一連の実験において、培養物を回転することが最適
発育の要件であることが確認され、そしてこのような操
作は培養物のインキュベーションの最初の５日の間に
（発育の４−９日）成さなければならないことが示され
た。我々の実験において、非回転培養物の孵化率は、５
日間回転、その後静止した状態で保持された培養物の36
％（第２表）に比較して18％（ｎ＝77）であった。回転
期間を15日にまで延ばすと、孵化率がより低くなった。
発育９日の生存胚の割合である孵化率は、最初の５日の
み回転した培養物の場合が62％（ｎ＝33）、そして15日
間回転した培養物の場合が40％（ｎ＝71）であった。

容器卵殻用のクリングフィルムシールを他の研究者に
よって使用された開放フィッティング蓋の代りに使用し
た。このような修正の利点は、卵の標準的なインキュベ
ーション条件（強制空気システム、相対湿度50−60％）
が使用できるので、容器卵殻と結合した漿尿膜の領域が
通常の環境を受けることである。高湿度、例えば相対湿
度70より高い湿度％では、孵化率は10％に減少した（ｎ
＝38）。クリングフィルムは、ガス交換及びこのコン
パーメントからの水分損失を制限することによって、胚
上の空隙の環境を制御するのに有効である。卵の空気セ
ルにおいて、水蒸気圧は常圧よりも高く、そしてO₂張力
は、CO₂張力がインキュベーション時間と共に上昇する
と、低下する［ワイゲスティーンとラーン1970/71年（W
angesteen and Rahn,1970/71）］。

部分的にガス透過性であるラッピングフィルムは、
卵殻のない培養におけるニワトリの胚の発育用最適条件
を与えることが示されている［ダン等1981（Dunn et a
l.,1981）］。非シール卵殻での実験において、培養物
は、高湿度でウズラの場合に1.5％CO₂（オノとワカス
ギ、1984年）、ニワトリの場合に空気中（ローレットと
シムキス,1987年）でインキュベートされている。後者
の研究は、培養容器中において空気に対するO₂／CO₂の
差を維持することが、空隙に面する非保護漿尿膜からの
水分損失を妨げることよりも、培養における通常の発育
に対して余り重要でないことを示唆する。本発明の実施
例においては、場合によっては単層フィルムで密封され
た卵殻中で19日目まで生存した胚が少ししかなかったの
で、二層のクリングフィルムが使用された。クリング
フィルムの第２の利益は、微生物による汚染を減少す
る助けとなることである。

実施例２発育１日から９日までの胚の培養培養システムII法ドナー卵より３−4g重い卵を容器卵殻用に選んだ。直
径32mmの開口部を卵殻の鋭い方の端にドリルで穴を開
け、その内容物を廃てた。卵殻を蒸留水ですすぎ、その
後水で再び充たし内卵殻膜の脱水を防止した。非インキ
ュベート受精卵の卵殻にはさみで切り込みをつけ、その
卵殻を手で割って開け、その内容物をガラスジャーに落
とした（直径50mm;容積60ml）。次に、内容物をビーカ
ー（直径35mm;容積70ml）を介して容器卵殻に移した。
この方法は、胚盤葉、卵黄そして粘性卵白カプセルの損
傷を最小限にする。新鮮な卵から集められた液体卵白
（１−5ml）で卵殻の縁まで満たし、開口部をクリング
フィルムシートで密封した調製時に空気の泡が入ること
を防止した。クリングフィルムは、卵殻のいずれか一方
の端上に置かれた２リング（ナイロン）によって所定の
位置に保持され、そして一組の小さな木くぎにかけられ
た弾性バンドにより固定された（第４図）。再構成卵
は、横にしてインキュベートされ、間欠または連続して
90°の角度間を一時間周期で38℃、相対湿度30−50％で
ゆり動かした。培養物をインキュベーション7,9,10日に
明りに透かして調べ、そして生存胚を再インキュベート
した。通常の発育を示す胚は、インキュベーション７日
において74％の培養物で観察された（第３表）。死亡率
は、翌２日において高く、唯１つの胚のみが10日を越え
て生存した。調製の全てにおいて卵殻の丸い方の端にお
ける空気セルは、蒸発による水分損失に代って拡大し
た。

カレバウト［Callebaut（1983）］は、２−３日間、
容器卵殻でウズラの胚を培養する方法を記載している
（データは示されていない）。その技術は、受精ドナー
卵の内容物の空のホスト卵殻に移し、その後調製物をペ
トリ皿と溶融パラフィンで密封することからなってい
る。ニワトリの胚の場合に、その方法は、シールとして
クリングフィルムを使用し、そしてインキュベーション
の間調製物を回転することによって改善されている。静
止培養実験において、生存率は７日で50％であり、これ
らの胚は発育年齢において通常遅れる。空隙を含む培養
システムＩとIIIにおいて１日目の胚を育てようとした
ところ、死亡率はインキュベーションの２〜３日目にお
いて高いことが見い出された。類似の観察がダン（Dun
n,1981）等の卵殻のない培養システムにおいて成されて
いる。これらのシステムにおける発育不全は、胚盤葉が
卵白の薄層のみによって覆われている事実に起因するで
あろう。ロマノフ（Romanoff 1943）は、全卵黄上に胚
盤葉を発育させるために液体卵白への沈積が重要である
ことを強調している。液体卵白に胚盤葉領域を連続的に
沈めると、即ち空気が排出される卵殻において得られる
条件は、亜胚盤葉キャビティの形成を助ける。このキャ
ビティーは、発育初期の間、卵白由来の液体で満たされ
る（ニュー1956年）。たぶん、胚近傍の十分量の卵白を
欠く調製法においてはこの方法は損なわれる。

ウズラ胚用のカレバウト（1983年）の培養システム
は、その中から、ペトリ皿／パラフィンワックスシール
をクリングフィルムに置換し、インキュベーションの
間培養物を回転し、そしてそれをニワトリの胚に採用す
ること等によって、本実験例において修飾された。この
ような修飾は、４日間培養における発育を延長し、高生
存率が得られた。

実施例３発育１日から孵化までの胚の培養培養システムII〜IIIの法非インキュベート卵の胚を実施例２に記載したのと同
様にして３日間培養した（第４図）。次に、調製物をイ
ンキュベーターから除くと同時に、卵殻に切り込みを入
れ、そして内容物を実施例１で記載したのと同様にして
より大きな卵殻に移した。より小さな卵殻の内容物を存
在する開口部から除こうとすると、胚および胚体外膜に
常に損傷を与えてしまった。培養物を実施例１に記載し
たのと同様にしてインキュベートした。

生存率を第４表に記載する。

初期インキュベーション段階における損失は、システ
ムIIで発育しなかった胚およびシステムIIIに移す間に
損傷を受けた胚を合計したものであった。３〜９日目の
死亡率は、おそらく移動中の損傷によるものであった。
孵化率は27％であり、そして実施例１で記載したように
孵化したニワトリの約20％は肢および卵黄嚢の欠損を示
した。いくつかの新生児は成熟まで育てられ、そして生
殖体の生育能力についてテストされた。ローデアイラン
ドレッド種の雄鳥によって人工受精された２羽の実験用
雌鳥（卵産出率はそれぞれ89％と75％であった）の卵の
孵化率はそれぞれ63％と80％であった。２羽の実験用雄
鳥からの人工受精されたウォーレン雌鳥からの卵の孵化
率は、それぞれ80％と15％であった。２羽の実験用雌鳥
は産卵しなかった。

培養システムIIにおいて、発育阻害は、発育の８−10
日において生じたが、これは漿尿膜と内卵殻膜間の接触
の欠如と関連があると思われた。再構成卵におけるカラ
ザの破壊は卵黄の浮力に影響を与え、またそれは胚体外
膜の卵殻膜からの距離に影響して、それ故にガス交換機
構を損なう。この問題を回避するために、胚を脈管胚体
外膜が空気／卵白境界面に近接するシステムに移した。
培養システムIIIへの移動の最も好ましい時期は、脈管
構造の発育が進行中であり、再構成卵の成分が取扱いに
絶えるのに十分頑健である、インキュベーションの３日
目の終り頃であった。胚が空隙を含む静止卵殻内で発育
の１日目から培養される実験（第３図）は、低生存率お
よび零孵化率を与えた［エム、ナイトー，パーソナル
コミュニケーション（M.Natio,personal communicatio
n）］。

フェースIIからフェースIIIシステムを結びつけるス
テップは新規の方法である。これは、胚盤葉段階（ステ
ージ１）から孵化に至る鳥類の胚の有効な培養法に関す
る最初の報告である。

実施例４受精卵から７日までの培養培養システムＩ〜II法雌鳥は、産卵の予定日後2.75時間に捕獲され、その卵
が受精していることが確認された。日々の生殖サイクル
において、この時点では、次の卵は排卵され、そして卵
白が沈積するマグナム部（magnum）を横切っている。輸
卵管胚を回収するために、雌鳥をペンタバルビタールナ
トリウム［イックスピラル、セバリミテッド（EXPIRAL,
Cava Ltd.）］を静脈内注射して殺し、腹部内の臓物を
引き出し、そして70％アルコールで洗浄した。受精卵を
含む輸卵管部を腹腔内から持ち上げ、切除後、生理食塩
水で湿らせた紙を含む滅菌洗面器に入れた。大部分の卵
は、峡部とマグナム部の境界から50−150mmの距離に位
置していた。

長い切り込みを輸卵管壁につけ、そして卵を、卵黄を
囲む粘性卵白カプセルに損傷を与えることなく、ガラス
ビーカー（直径35mm;容積70ml）に滑らせた。卵を約5ml
の培養培地を含むガラスジャー（直径40ml;容積60ml）
に移し、そして胚盤が上位になるように卵黄を動かし
た。培地を、胚盤を同じ位置であるが卵白カプセル面よ
りは下の位置まで、加え、そして容器を弾性バンドで堅
めたサランラップで密封した（第５図）。要求される培
地の全容積は、卵黄に卵白カプセルを加えた量に依存
し、８−12mlであった。胚盤が卵黄の側にある培養にお
いて、容器を、胚盤より上位の卵白カプセルを培地中に
沈めないように傾けた。調製物を、マグナム部からの卵
の回収とインキュベーション間が20分以下の遅れで、41
−42℃で24時間インキュベートした。

培養培地は、新鮮な卵の内部および外部卵白層から集
められた液体卵白（２部）と塩溶液（１部）から成って
いた。塩溶液は、40mMのKHCO₃,30mMのNaHCO₃,10mMとKC
l、2.5mMのMgCl₂・６H₂O,0.7mMのCaCl₂・２H₂Oと11mMの
グルコースを含んでいた。培養培地のpHを、CO₂を混入
することによって初期値8.4から7.2−7.4に下げ、そし
て密封容器に培地を貯蔵することにより調製工程の間、
低い値を保持していた。

24時間後の発育状態は、胚領域を目視することによっ
ておおよそ確認することができる。胚盤葉の成長および
亜胚盤葉キャビティの形成は、半透明領域を含む不透明
リング（直径3mm）によって示される。しかしながら、
発育可能性の正確な評価のため、調製物をシステムIIに
おいて更に３−６日培養した。

胚を、実施例２に記載したのと同様にして、フェース
II用の培養システムに置いた。容器卵殻を、ドナー雌鳥
が産んだ卵より約３−4g重い、卵から調製した。培養物
を常温に冷却した後、培養培地（10−20ml）を満たした
容器卵殻に入れ、クリングフィルムで密封した（第４
図）。再構成卵を、１時間サイクルで90°の角度間を間
欠ロッキングしながら、38℃、相対湿度30−50％で、イ
ンキュベートした。培養物を、インキュベーションの7,
8または９日目に調査のために、卵殻から除いた。

結果を第５表に記載する。

正常な胚は、培養物の67％でステージ27−29まで発育
した（第７図）。それらは、このステージ以降は生存せ
ず、通常インキュベーションの８日目の初めに死んだ。
残存する培養物には、発育しないもの、または細胞の胚
盤葉シートのみが発育シートしたもの、または奇形胚の
いずれかが存在した（第6,7表参照）。

フェースＩ用の培養システムは、最初の24時間の発育
に関する必要条件をテストするために設計された一連の
実験に基づいていた。テストは、受精後、異なるステー
ジで卵について行ない、そして次の発育および分析用の
フェースIIの標準培養システムに移す前に、様々な処理
を施した。試験された培養システムの態様は次のようで
あった：胚盤を覆う物質の深さ、培養培地の組成、ガス
交換そして胚盤の空間の位置。

重要な因子は、胚盤より上位の卵白の深さであった。
マグナム前部からの相対的に薄い卵白カプセルまたはマ
グナム後部からの厚い卵白カプセルで包み込まれた卵
は、マグナム中間部（峡部から50−150mm）から回収さ
れた卵よりも短い生存率を与えた。マグナム中間部から
の卵の発育は卵白カプセルが除かれると阻害され、これ
により胚盤を培地表面に浮かせた。同様に、カプセルご
と卵が培地に沈められると、発育が阻害された。受精卵
培養のシステムII（第４図）を使用する実験において
（第６表）、発育失敗の最も起こりやすい場合は、カプ
セルに包まれた卵の培養培地への水没である。最初の24
時間密封された表面を上位してインキュベートした上記
調製物において、クリングフィルムシールからの胚盤の
距離が変化し、そしてその距離は卵黄の浮力に依存して
いた。

培養培地を正確に定義することは、フェースＩの発育
には必須ではなかった。胚は、非希釈卵白中６日間でス
テージ25−26まで十分に成長した。しかしながら、この
ステージを越える発育には、プランピング前の、子宮卵
の卵白の、及び産卵の卵白のイオン組成の相違に関す
る、希釈卵白（第７表）を使用する必要があった。塩溶
液組成は、ピードル（Beadle）、コンラッドとスコット
（Conrad and Scott 1938）そしてレオナルド（Leonard
1968）によって与えられたデータを基礎とするもので
あった。グルコースを、卵形成の子宮フェースの開始に
おける子宮体液［デービットソンとドラッパー（Davids
on and Draper,1969）］と、同一濃度で加えた。再構成
卵において体液の総量（塩溶液＋プランピング液（plum
ping fluid）は、卵のプランピング液量とほぼ等しかっ
た。卵間で36−40mlの差がある卵白量の約半分はプラン
ピング液から成る。培地中の卵白を蒸留水のみで希釈し
た実験は、希釈剤（第７表）として塩溶液を使用して得
られた結果に類似する結果を与えた。したがって、ステ
ージ29までの短期間培養の場合に、水は重要な成分であ
る。

培養容器における空気組成とそれに関連する培地の酸
塩基バランスは、輸卵管フェースにおける発育にとって
正確な調整を決して必要としなかった。子宮において、
卵白のpHは7.15と7.4の間を変動する［ソーバーとモン
ギン（Souveur and Mongin,1971）］。卵において、卵
殻を通って流出するCO₂のために、産卵の数時間以内にp
H8.4に上昇する［ダウズ（Dawes,1975）］。反対に、子
宮における卵白の酸素含有量は低く、卵ではインキュベ
ーション２時間以内の空気に匹敵する［ウィシャート、
パーソナルコミュニケーション（Wishart,personal com
munication）］。フェースＩの規定された培養法の場合
のpHは、インビボ条件に適合させるためにCO₂を用い
て、慣用的に7.2−7.4に調整されていた；培地のO₂量は
常温であるとみなされた。容器をサランラップで密封し
てpH7.8未満に保持し、そして室において湿気の多い大
気を保持した。

発育は、生存胚の数において若干の減少があるけれど
も、高pH培養によって損なわれなかった。受精卵を、胚
盤と同じ位置までpH7.4の培地で満たされた、容器卵殻
に入れ、卵殻を蓋で覆った。それらを10％CO₂または空
気中で相対湿度80％、42℃で24時間インキュベートし
た。培養は培地のpHは、それぞれ平均で0.31ユニットと
1.15ユニット上昇した。胚をその後更に６日間システム
IIで培養した。正常な胚は、10％CO₂中でインキュベー
トした培養物の55％（ｎ＝33）、そして空気中でインキ
ュベートした培養物の41％（ｎ＝29）で発育した。

発育の子宮フェースにおける左右対称の決定が重力に
よって影響を受けることが提案されている［コカーブと
アイアル−ギィラディー（Kochav and Eyal−Giladi,19
71）］。胚領域の空間の位置に関する実験から、決定の
臨界期間の間、胚軸線が斜めに置かれた胚中に形成され
たが水平に置かれた胚中では形成しないことが示された
［オルザンスカ、スジョラズカとラソッタ（Olzanska,S
jolajska and Lassota,1984）］。本研究において、上
記知見を支持する証拠は得られなかった。胚軸線は、水
平胚円盤から成長した培養物の68％（ｎ＝34）で、そし
て斜めの胚円盤から成長した培養物の74％（ｎ＝34）で
形成された。

フェースＩ法及びフェースII法との組み合わせは全く
新しい。このことは、受精卵からステージ29、即ち胚の
生存期間の初めの1/3をカバーする期間の、鳥類胚のイ
ンビトロにおける成長の最初の報告である。全卵黄につ
いて輸卵管胚の培養に関して二つの他の報告がある。ホ
ワース（Howarth,1971）は、輸卵管の前部領域から得ら
れた卵を生存率60％（ｎ＝10）で胚盤葉ステージ（st.
1）まで培養している。卵黄が表面に浮くことを避ける
ために、この段階いおいて卵白カプセルの欠ける卵を、
液体卵白のビーカーに浸漬したプラスチック製の殻に投
入した。コカーブとアイアル−ギィラディー（1971年）
は、子宮胚を多細胞ステージから４−体節ステージ（s
t.8）まで成長させた。この研究において、卵殻膜を除
き、卵黄と卵白を生理食塩水溶液の入ったビーカーに移
し、そして卵黄をカラザによって浮遊させ、強制的に胚
領域を斜めの位置に置いた。

受精卵を７日間発育させる培養方法は、鳥類において
発育方法の範囲で前分割ステージにおける実験介入効果
を試験するモデルシステムを提供する。実験室におい
て、外因性遺伝子を胚円盤細胞質に注入し、そして２時
間から７日間にかけて胚における運命を調べた。

実施例５受精卵から孵化までの培養培養システムＩ〜II〜III法。

輸卵管の中間マグナム領域から回収した卵をフェース
Ｉのシステムで24時間培養し（第５図）、フェースIIの
システムに移し（第４図）、そして３日間インキュベー
トした。その方法は、培養培地の塩溶液に対する液体卵
白の割合をシステムＩで3:2、システムIIでは2:1に変更
して、実施例４に記載されている。培養培地の不可欠な
量を長期間発育の胚に供給することを保証するために、
システムII用に調整された容器卵殻は、ドナー雌鳥が前
に産んだ卵よりも容積で１−2ml大きかった。全４日の
インキュベーション後、胚を実施例３に記載したのと同
様にフェースIII（第３図）のシステムに移した。シス
テムIII用に調整した容器卵殻は、平均でシステムIIで
使用される容器卵殻よりも容積で18ml大きかった。容積
差は、チェンバーにおける空隙の大きさを決定した。培
養物を30°の角度間それらを回転しながら、38℃で５日
間、その後静止位置で10日間インキュベートし、そして
最終的に36−37℃で静止孵化インキュベーターに入れた
（第８表）。

培養物を相対湿度30−55％で４〜19日目までインキュ
ベートした９実験の結果を第９表に示す。

初期の損失は、４日目の発育しなかった胚および10日
目のシステムIIからIIIに移動する間に損傷を受けた胚
からなる。受精卵から培養された胚はもろく、１日から
培養された胚よりも損傷を受けやすかった。孵化率は８
％であり、孵化の約半数が健常であった（第８図）。よ
り高湿度、相対温度50−60％において、孵化率は似てい
る（ｎ＝85）が、唯１つの孵化のみが健常であった。培
養物から孵化した１匹の弱いニワトリを相対湿度60−75
％でインキュベートした。

合計で、上記修飾された方法により培養された１匹を
含む、７匹の健常なニワトリを、培養受精卵から孵化さ
せた。２羽の雄鳥が成熟まで生存した；そのうちの１羽
は生殖力に富んでおり、ワーレン雌鳥と人工受精させた
卵から75％の孵化率があったが、他の１羽は生殖能力が
ない（第９図）。２つの９週齢の若いめんどりは健常に
見える。残りの鳥類は、それぞれ、1,8及び16週間生存
した。

発育の継続期間に対し上記３つの別々の培養システム
を採用した理由は、前に論じられている。上槽が胚の成
長において重要な役割を担うように思われる。胚と上層
との適正な関係は経験的に決定され、そして適正な調整
は胚の発育の異なるフェースでのそれぞれの必要性を満
たすように培養チェンバー設計においてなされた。フェ
ースＩにおいて、胚より上位の過剰な培地は好ましくな
く、フェースIIにおいてそれは成長には必須である。過
剰な培地は８日目までならフェースIIIでは有害ではな
かったが、それ以降では、脈管胚体外膜がチェンバー中
で大気圧に曝されると発育が阻害された。

受精直後のステージから孵化までの培養においてニワ
トリの胚の成長を支持するシステムＩ〜II〜IIIの組み
合わせは、それ自体新しい方法である。このことは、鳥
類の胚の完全な培養システムの最初の報告である［ペリ
ー（perry,1988）］。

ニワトリの胚用完全インビトロシステムの確立は、基
礎的および応用研究領域における広範で有効に適用され
る。例えば、外部遺伝子または全ゲノムの注入によって
鳥類卵を操作しそして、孵化ニワトリおよび多分成熟し
た鳥のかかる操作効果を調べる機会を提供する。上記方
法は初期および現在用いられているものよりより進んだ
ステージにおける輸卵管胚のインビトロ技術を案出する
ガイドラインをも提供し、これらはインビトロ受精分野
および推定上の全能細胞を胚に挿入するのに使用され
る。

潜在的な適用は、形質転換家禽の生産である。成長お
よび再生産性能の因子の修正は、家禽産業への利益であ
る。その上、新規タンパク質遺伝子の鳥類の生殖系列へ
の挿入は、卵白における生物医学的に重要なタンパク質
の産生に関する潜在的に価値ある技術である。家禽の高
生殖能力は、この技術分野において他の農場動物に比べ
利益を与える。雌鳥は、６ケ月で成熟し、そして産卵の
１年目に約300個の卵を産卵できる。

要約すると、発育の３つのフェースのための別々の培
養システムが案出され、胚は一つのシステムから次ぎの
システムへと移動させて全胚生存期間をカバーする。技
術の全実験設計および順序は、第１図に示されている。
フェースIIIに関する具体的な方法は、分離したシステ
ム（実施例１）である。フェースIIに関する具体的な方
法は、フェースIII（実施例２）のものと重複するが、
年齢とともに胚はもろくなるので、この二つのシステム
間の移動は好ましくは特定のステージにおいてなされる
（実施例３）。フェース１の方法は、卵白沈着が行なわ
れ、かつオスとメスの前核が大きくなる場合に、排卵後
約２時間で始まる期間をカバーする［ペリー（Perry,19
87）］。このフェースＩの方法は、分析を目的としてフ
ェースIIの方法（実施例４）と、そしてその後完全培養
システムを目的としてフェースIIIの方法（実施例５）
と組み合わせる必要がある。

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【図面の簡単な説明】

第１図は、個々および連接したシステムによってカバー
された発育の期間を示すニワトリの胚の培養システム図
を示す。第２図は、新たに産卵した雌鳥の構造を示す図である
［ダウズ 1975年から（Dawes,1975）］。第３図は、フェースIII（４日〜孵化）の培養システム
図である。第４図は、フェースII（１日〜４または９日）の培養シ
ステム図である。第５図は、フェースＩ（受精から１日）の培養システム
図である。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】周囲に濃厚卵白嚢を有し、一部が培養培地
中に沈められ、該培養培地の表面が胚盤の位置と概して
同じである、受精卵を培養することからなる、胚盤葉形
成までの鳥類の胚のインビトロ培養方法。
【請求項２】該培養方法が透過性の低いフィルムシール
で密封された不透過性容器中で行われる、請求項第１項
に記載の方法。
【請求項３】培養培地が水および／または塩溶液で希釈
される液状卵白である、請求項第１項または第２項に記
載の方法。
【請求項４】液体でふちまで満たした密封容器中の培養
培地において胚をインキュベートすることからなり、容
器およびそのシールが液体不透過性であるが部分的には
ガス透過性であることを特徴とする、胚形態形成中にお
ける鳥類の胚のインビトロ培養方法。
【請求項５】培養培地が液状卵白である、請求項第４項
に記載の方法。
【請求項６】培養される胚が穏やかから適度に攪拌され
る、請求項第４項または第５項に記載の方法。
【請求項７】胚より上位に空隙にあり、該空隙が部分ガ
ス透過シールによって外部大気から分離されている、密
封容器において該胚をインキュベートすることからな
る、胚成長階段中における鳥類の胚のインビトロ培養方
法。
【請求項８】容器が卵殻の一部である請求項第７項に記
載の方法。
【請求項９】卵が雌鳥の卵であり、胚とシール間の空隙
深さが５〜15mmである請求項第８項に記載の方法。
【請求項１０】インキュベートされる胚は少なくとも初
期に穏やかに攪拌される請求項第７項から第９項のいず
れかに記載の方法。