JPH0198433A - インビトロ胚培養法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、鳥類胚培養技術に関するものであり、それは
家禽、特に雌鳥への適用に特に好ましい。

（従来の技術および解決すべき課題） 受精から卵割に至る発育初期の段階におけるニワトリの
胚は、大きさ、もろさおよび卵の相対的な得がたさの理
由によって実験的な介入を受は入れなくなっている。こ
の問題は、外因性遺伝子の鳥への移転の可能な経路に関
する最近の調査で報告されている［フリーマンとメッサ
ー　１９８５年クリテりデンとサルター　１９８６年（
Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｈｅ５ｓｅｒ、　１９８５；
　Ｃｒ１ｔｔｅｎｄｅｎ　ａｎｄ　５ａｌｔｅｒ　１９
８６）］、ベリー（Ｐｅｒｒｙ　１９８６．　ａ、ｂ）
は、他の調査を行なイソして鳥類卵の遺伝子操作が実施
可能であることを示唆している。ニワトリの胚用の完全
な培養システムを案出する目的は、操作化卵を発育させ
て成熟させる手段を提供することであった。今まさに、
胚の発育の中間段階に対するインビトロ培養法が確立さ
ｈ、さらに、そのための向上が図られている。その技術
は、家禽の遺伝子工学ばかりでなく、鳥類発育の基本的
な機構の研究および有害体質の研究にも適用されるであ
ろう。その上、好ましいその他の方法を卵を産む雌鳥に
外科的に提供する。

（課題を解決するための手段） 本発明は次のように特定される。

（１）胚上に空隙があり、該空隙が部分ガス透過シール
によって外部大気と分離されている密閉室で該胚をイン
キュベートしてなることを特徴とする胚成長フェースの
間中鳥類の胚をインビトロ培養する方法。

（２）室が卵の一部である上記第１項に記載の方法。

（３）卵が雌鳥の卵であり、かつ胚とシール間の空隙深
さが５〜１５ｍｍである上記第２項に記載の方法。

（４）インキュベート胚を少なくとも初期に穏やかに撹
拌する上記第１項に記載の方法。

（５）液体で充填された密閉液体非透過性容器内の培養
培地で胚をインキュベートすることを特徴とする胚形態
発生の間中鳥類の胚をインビトロ培養する方法。

（６）容器が部分ガス透過性である上記第５項に記載の
方法。

（７）培養培地が液体アルブミンである上記第５項に記
載の方法。

（８）培養胚が穏やからから適度に撹拌される上記第５
項に記載の方法。

（９）最初に上記第５項に一致する方法によって胚を培
養し、その後請求項第１項に一致する方法によって該胚
を培養することを特徴とする胚形態発生および胚成長フ
ェースの間中鳥類の胚をインビトロ培養する方法。

（１０）濃厚アルブミンの周囲カプセルを有し、かつ部
分的に培養培地に沈めてなる受精卵を培養することを特
徴とする胚盤葉形成まで鳥類の胚をインビトロ培養する
方法。

（１１）培地が一般に胚盤と調和している上記第１０項
に記載の方法。

（１２）培地が水および／または塩溶液で希釈できる液
体アルブミンである上記第１０項に記載の方法。

（１３）密閉容器内で行なう上記第１０項に記載の方法
。

（１４）上記第１０項に記載の方法で鳥類の胚を培養し
、その後上記第５項に記載の方法で該胚を培養すること
を特徴とする胚盤葉形成までおよび胚形態形成の間中鳥
類の胚をインビトロ培養する方法。

（１５）上記第１０項に記載の方法によって鳥類の胚を
培養し、その後、上記第５項に記載の方法によって該胚
を培養し、そしてその後上記第１項に記載の方法によっ
て該胚を培養することを特徴とする胚盤葉形成まで、胚
形態形成の間中および胚成長から卵フ化の間中鳥類の胚
をインビトロ培養する方法。

（作用） ニワトリの胚は、胚円盤状組織、即ち卵の動物種に位置
する小領域の細胞膜で生ずる（普通の卵黄）。発育の１
／３の間、胚は卵黄の表面に浮瀞してとどまり、一方外
部胚膜は卵黄の周りに成長しそして血管新生化を生ずる
。発育の残存期間において、胚は卵の食物貯蔵を犠牲に
して成長する。

このため、ニワトリの発育は、受精からＭ化に至る連続
する段階における変化する必要条件に従って３フエース
に分割されている。

フェース■、受精から胚盤葉形成 このフェースは、卵管で生じそして産卵で終わる。生殖
体相互作用は、排卵から１５分以内に生じ、そして最初
の卵割分割は、約４時間後に生ずる［ベリー　１９８７
年、（Ｐｅｒｒｙ、　１９８７）］　、その後の２０時
間で、その後の分割は亜胚盤葉（Ｓｕｂｂｌａｓｔｏｄ
ｅｒｍａ　Ｉ　）キャビティの上に横たわる単純なシー
ト状細胞を与える［コカーフ、ギンスバーグとアイアル
ーギラディー１９８０年（Ｋｏｃｈａｖ、　Ｇｉｎｓｂ
ｕｒｇ　ａｎｄ　Ｅｙａｌ−Ｇｉｌａｄｉ、　１９８０
）　］　、卵管を通過する間、卵はマグナム（ｍａＱｎ
ｔＪｍ）　ノアルブミン（ａｌｂｕｍｅｎ）で、その後
卵割が始まる峡部の卵殻膜で包まれる。

子宮においてアルブミンは、子宮体液（ポンプ体液）の
吸収によって容積で二倍となり、そして最終的に卵殻は
、徐々にカルシウム沈着を受ける。

１日当り１個の卵を長期間産む雌鳥にとって、産卵は、
次の排卵によって１５〜３０分以内に起こり、そしてこ
のサイクルが繰り返される。

フェースＩＩ　、　　胚の形態発生 このフェースは、卵インキュベーションの最初の３日に
生じる［ステージ１−１８．ハンバーガーとハミルトン
１９５１年（ｓｔａｇｅｓ　１−１８．　Ｈａｍｂｕｒ
ｇｅｒ　ａｎｄ　Ｈａｍｉｌｔｏｎ　［１９５１］）］
。ステージ２０において、胚は、１０順の長さであり、
その外部胚盤葉は、卵黄の周りを赤道方向に拡大する。

フェースＩＩＩ　、　　胚の生長 このフェースは、卵インキュベーションの最終１８日に
生じる［ステージ１８−４５、ハンバーガーとハミルト
ン　１９５１年（ｓｔａｇｅｓ　１８−４５．　Ｈａｍ
ｂｕｒｇｅｒ　ａｎｄ　Ｈａｍｉｌｔｏｎ［１９５月）
］。

種々の方法は、フェースＩＩにおける胚の短期間培養［
−”−、：Ｌ−１９６６年（ｎｅｗ　１９６Ｂ）に、そ
してより高等な胚の長期間培養［デュン、フイツツハリ
スとバーネット　１９８１年、オノとワカスギ　１９８
４年、ローレットとシムキス　１９８５年　１９８７年
（ＤＵｎｎ。

Ｆｉｔｚｈａｒｒｉｓ　ａｎｄ　Ｂａｒｎｅｔｔ、　１
９８１；　ｏｎｏ　ａｎｄ　Ｗａｋａｓｕ（Ｊｉ、　１
９８４；　Ｒｏｗｌｅｔｔ　ａｎｄ　　Ｓｉｍｋｉｓｓ
、　１９８５．１９８７）］に有効である。あるものは
、卵黄からの胚の移植を含むのに対し、他のものは、胚
およびそのままの卵黄を培養容器へ移すことを含んでい
る。後者の方法は、長期間培養でより好ましい条件を与
え、そして今日の培養システムに広く使用されている。

本発明の第１の態様に従うと、胚成長中の鳥類胚のイン
ビトロ培養法、即ち胚を密閉容器内でインキュベートす
る方法であり、胚上には空隙があり、その空隙が部分ガ
ス透過シールによって、外気圧から分離されている、が
提案される。

そのシールは、好ましくはフィルム形態である。

そのシールは、プラスチック、例えばポリエチレン製で
ある。商業上入手可能なりリングフィルムが適切なシー
ルを形成すること、特に二層で使用された場合であるこ
とが見い出されている。クリングフィルムの適切な特性
を有するいかなる他の材料も使用してよい。

シールとして使用する材料の適合性は、二酸化炭素およ
び／または水蒸気の透過性を測定することによって間接
的に測定できる。即ち、二酸化炭素の透過性は、不透過
製容器内で３８℃において２４時間インキュベーション
後、アルブミンのｐＨ上昇を試験することによって測定
される。アルブミンは、最初二酸化炭素ガスを供給して
ｐＨ０゜１以下であるべきである。０．５から１．５の
ｐＨ上昇は、一般に好ましい、好適な範囲は０．５また
は０．７から１．０または１．３であり、例えば約０．
９である。水蒸気透過性は５または１０から３０または
４０■／ａ（／２４時間である。

容器は好ましくは卵の一部であり、それは通常培養され
る種類と同一種から選ばれる。卵から、プラント端（ｂ
ｌｕｎｔ　ｅｎｄ）を除くことが特に適切であることが
見い出されている、つまり、卵の軸を中心とする４０ｍ
ｍ直径の穴が特に好適であることが見い出された。

卵のプラント端における穴は、部分的なガス透過性シー
ルでシールされる。シールはアルブミンを用いて卵殻に
付着させてもよい。好ましい透過特性は天然の卵の特性
に類似する。

特に、先行培養ステージがインビトロであれば、培養培
地は本発明の範囲のある実施態様に存在するが、例えば
先行培養ステージが自然に行なわれるとそのプロセスは
、それなしで働く。存在する培養培地は、通常アルブミ
ン、未希釈または希釈した状態で、そして好適な子宮内
流体からなる。

雌鳥の卵が使用されると、胚とシール間の空間の長さは
、５〜１５ｍｍ、例えば約１０ｍｍであるであることが
好ましい。

少なくとも初期段階に、穏やかにインキュベート胚を撹
拌することが好ましい。穏やかに撹拌することは、間欠
振動、例えば３０°から、によって達成し得る。従来の
インキュベーション温度、例えば約３８℃が保持される
。

本発明の態様に一致するインビトロ培養法は、（受精か
ら数えて）約４日からＭ化、一般に約２２日に起こる、
までに使用することが好ましい。

しかしながら、胚生命の最終の数日（例えば１３日）は
、撹拌しないことが好ましい。加えて、推定靜化時間の
直前（例えば、１〜２日前）には、一定の空気を容器内
に入れるためにシールに穴を開けることが好ましい。更
に、空気はその後供給される。例えばシールを除き、そ
して（卵が容器を形成する時に）卵殻の穴を任意にペト
リ皿で与えられる固形円盤で覆うことにより達成される
。

本発明の第２の態様によれば、胚を液体を充填した密閉
液体不透過容器中の培養培地でインキュ容器は部分的に
ガス透過性であってもよい。ガス透過性は、（一般に内
卵殻膜と組み合わせた）卵殻および／または他の部分ガ
ス透過シール、即ちその好適な特性は、本発明の第１の
態様で示されている、によって提供されるだろう。卵殻
および内卵殻膜は、部分的にガス透過性であることに注
意すべきである。

培養培地は、新鮮な卵から集められる液体アルブミンが
好ましい。

容器は、再び卵の一部であることが好ましいが、好適な
構成は、本発明の第１態様とは若干ことなる。この態様
において、例えば３２ＷＩＩの穴で除かれる鋭い端が好
ましい。このことは、外卵殻膜と内卵殻膜間の空隙の存
在を保障する。このことは、空隙が蒸発による水損失を
補うために培養中に拡大すると有益であると思われる。

シールが鋭い端を除いた卵を密閉するために使用されて
いると、卵は、一般的に水平位置で培養され、その後シ
ールが一側面にある。そのシールは、殻に対して卵の代
わりに強く保持されるべきである。

培養胚を穏やかないし適度に撹拌することが極めて好ま
しい。間欠または連続振動、例えば９０°から１時間ご
とにまたは他の相対的な間隔、が好ましい。

本発明の態様に一致する方法は、一般に受精後約１日に
（即ち、産卵のほぼ通常の時間）に始まり、そして２ま
たはそれ以上、例えば８日まで、続くだろう。しかしな
がら、本発明のこの態様に一致する方法が、胚を第１の
態様に一致する方法に移す前に、３ないし４日のオーダ
ーで続けられることが好ましい。

本発明の第３の態様によれば、それ故に、胚の形態発生
および胚の成長フェースの間鳥類の胚のインビトロ培養
方法が提供される。即ちその方法は、最初に胚を本発明
の第２の態様に一致する方法で培養し、その後、胚芽を
第１の態様に一致する方法で培養することからなる。

移動が受精後２〜５日、例えば４日で起こることが好ま
しい。

本発明の第４の態゛様によれば、胚盤葉形成まで鳥類胚
をインビトロで培養する方法が提供される。

即ち、本方法は、受精卵を培養し、周囲を囲むカプセル
の高密度アルブミンを有し、特に培養培地に沈めてなる
ことを特徴とする。最適結果として、培地は一般に最高
であるがアルブミンカプセルレベルよりも下である幼芽
状円盤と一般に調和すべきである。

受精卵は、雌鳥から外科的に得られるだろう。

外科的技術が使用されると、卵はマグナム、例えば峡か
ら５０〜１５０ｍｍ、取ることが好ましい。

受精卵をマグナムのこの領域から取ることは、受精卵が
その後高密度アルブミンの周囲カプセルの最適厚みを有
すると思われる利益が見い出される。

培養培地は、水および／または塩の溶液で希釈される液
体アルブミンである。一般に、塩溶液を有する希釈アル
ブミン（例えば、３：２）で培養を初め、その後塩溶液
でアルブミンを希釈（例えば、２：１）することが好ま
しい。

本発明の態様に従う方法は、密閉容器内で行なわれるこ
とが好ましい。容器は、ガラスのような不透過性物質か
らなり、サランラップ（商標）のような低ガス透過性フ
ィルムでシールされる。サランラップの適切な特性を有
するいかなる他の物質をも使用できる。ガス透過性は、
上記の如く測定される（例えば、二酸化炭素および／ま
た水蒸気〉。２４時間開）（上昇は、二酸化炭素透過試
験において０．５〜１．０例えば０．６〜０．８である
。水蒸気透過性は、１．０〜１０、例えば２〜５■／ｃ
ｄ／２４時間である。

本発明の態様で培養された胚が、その後本発明の第２の
態様の方法で培養される場合が一般的である。それ故に
、本発明の第５の態様に従うと、胚盤葉形成までの鳥類
の胚のインビトロ培養法、および胚形態発生の間、本発
明の第４の態様で鳥類の胚を培養し、その後第２の態様
に従う方法で胚を培養することからなる方法が提供され
る。

受精から畔化までの鳥類の胚を実際に完全に培養するシ
ステムを使用することが望ましいならば、種々の上記本
発明の態様を順次採用することが適切であると理解され
るだろう。従って、本発明の第６の態様に従えば、胚盤
莱形成まで鳥類の胚をインビトロ培養する方法、胚の形
Ｂ発生の間および胚成長から卵）化までの開本発明の第
４の態様に従う方法によって鳥類の胚を培養し、そして
本発明の第２の態様に従う方法によって胚を培養するこ
とからなる方法、およびその後本発明の第１の態様に従
う方法によって胚が提供される。

卵が容器として使用されるならば、第２ステージにおい
て容器卵殻はドナー卵、例えば１〜２ｍｌ、より若干大
きいことが一般に好ましい。第３の段階において卵が容
器として使用されるならば、容器卵は、直接的な前のス
テージにおいて使用されたものより実質的に大きい（例
えば約１８ｍ１＞ことが好ましい。

本発明をより理解し、かつどのように効果に専かれるか
を示すために、図面を参照して種々の実施態様を記載す
る。

第１図は、個々および連接したシステムによってカバー
された発育の期間を示すニワトリの胚の培養システム図
を示す。同図は、一連の３培養システムによりカバーさ
れたニワトリの胚発育期間および培養における完全発育
システム間の胚の移動時期を示す。

第２図は、新たに産卵した雌鳥の卵の構造を示す図であ
る［ダウズ　１９７５年から（Ｄａｗｅｓ、　１９７５
）］。

第３図は、フェースＩＩＩ（４日〜Ｉｌｌ化）の培養の
システム図である。

第４図は、フェースＩＩ（１日〜４または９日）の培養
システム図である。このシステムは、さらに３〜４日か
ら初期成長フェースへの発育を示す。

第５図は、フェース■（受精から２時間〜１日〉の培養
システム図である。

本発明の多くの実施例が与えられる。実施例において他
のものが述べられていなければ次の物貰が使用される。

培養胚の生存率を第１表に要約する。

第１表　受精後２時間（０日）から発育の特別なフェー
スに対する適切な培養システムにおける特定期間のニワ
トリの胚の成長の生蒔率生！胚または 発　育　ｌ　関　　　培養システム　　　　培養された
胚の敗　　　　ニワトリのＩＩ（％）４日〜非を化　　
ＩＩＩ　　　　　　　６９　　　　２５（３６）１日〜
８日　　　ＩＩ　　　　　　　４７　　　　３５（７４
）１日〜１１１フ化　１１−ＩＩＩ　　　　　５９　　
　　１６（２７）０日〜７日　■〜ＩＩ　　　　　　３
５　　　　２３（６７）Ｏ日〜卯を化　■〜ＩＩ〜ＩＩ
Ｉ　　　９６　　　　　８（８）動物　ワレンズ（Ｗａ
ｒｒｅｎＳ）　［：イサ　ブラウン（Ｉｓａ　Ｂｒｏｗ
ｎ）　］の商業の菌株の産卵用雌鳥を個々のケージに入
れ、かつ１４時間開るい７２４時間サイクルで保持した
。２８−３２週令で、長期間にわたり１卵／日で産卵す
ると、ロープ　アイランド　レッド　カーカレス（ｈｏ
ｄｅ　ｌ５ａｌａｎｄ　Ｒｅｄ　Ｃｏｃｋｅｒｅｌｓ）
から集めた新鮮な精液で人工受精された。

繁殖力は、非インキュベート卵の目視により定期的に観
察され、９０％以上が好ましいことが見い出された。受
精卵において、胚領域は、半透明領域を有む白いリング
（直径３　４ｙｎｍ）として観察され、そして非受精卵
においては赤道円盤（直径２　３ｍｍ＞と思われる。

卵　菌株を横なえることによって２４時間前までに産卵
した卵は、培養システム■とＩＩＩの胚の源として使用
された（実施例１−３）。この菌株からの新鮮な産卵し
た卵（受精および非受精）も同様に培養培地用のアルブ
ミン源として使用された。

液体アルブミンは、卵（第２図）の内部よおび外部アル
ブミン層から集められ、そして培養のため同日内に使用
された。培養システムＩＩ　（実施例２−５）用の容器
卵殻は、横たわるストックから得られた。システムＩＩ
Ｉ用の培養容器として使用されるより大きな卵殻（実施
例１，３．５）は、地方の旬卵所「「デイ−、ビー、マ
ーシャル、ウィツトバーン、ウェスト　ロチイアン（１
）、Ｂ、　Ｍａｒｓｈａｌｌ、　Ｗｈｉｔｂｕｒｎ、　
Ｗｅｓｔ　Ｌｏｔｈｉａｎ）］から得られた商業上のブ
ロイラー菌株の二倍−卵黄卵からのものであり、産卵１
−２週間以内に培養に使用された。

ラッピング　フィルム　二種類のプラスティック　ラッ
プを培養容器のシール用に使用した。サランラップ（ダ
ウ　ケミカル　カンパニー）は、低ガス透過性を有し［
ダン、フィッツハリスとバーネット１９８１年（Ｄｕｎ
ｎ、　Ｆｉｔｚｈａｒｒｉｓ　ａｎｄ　Ｂａｒｎｅｔｔ
、　１９８１）］　、最もシスチムニに適していた。ク
リング　フィルム（ＰＶＣ付加物を欠く好ましい物を除
くいずれかのブランド）は、特にガス透過性であり［ダ
ン等　１９８１年（Ｄｕｎｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９８ｔ
）］　、フェースＩＩとＩＩＩに使用された。透過テス
トは、培養胚をインキュベートするための条件で現に使
用される条件のラッピング　フィルムで行なわれた。

ＣＯ２の透過は、２５ｍ１の培地を含有し、かつラッピ
ングフィルムでシールされたガラスジャー（６０ｍｌ、
直径４０　ｍｍ　＞中の培養培地（液体アルブミン：塩
溶液２：１）のｐＨ上昇の測定によって間接的に測定さ
れた。培養培地は、低ｐＨから適当な値に最初にＣＯ２
を供給された。サランラップ（−層）の場合、ｐＨは４
１．５℃、湿度０で２４時間のインキュベーションの間
に平均０゜７ユニツト、ｐＨ７，２，−７，５からｐＨ
７゜８−８．２に上昇した。クリング　フィルム（２層
）の場合、ＰＨは、３８°Ｃ１相対湿度４５−５５％で
２４時間のインキュベートョの間に平均１゜０ユニツト
、ｐＨ７，２−７，５からｐＨ８，３−８，５に上昇し
た。水蒸気の透過性は、１５０ｍ１の水を含む皿（３５
０ｍｌ、直径１０４　ＩＴＩＩＴ＋）ら水損失を測定す
ることによって決定した。皿をラッピング　フィルムで
シールし、そして前述のようにインキュベートした。サ
ランラップの場合、平均透過は、３．４■／ａ（／２４
時間（範囲３．２−３．８■）であった。クリング　フ
ィルムの場合、平均透過は、２２■／　ｃｘＫ　／　２
４時間（範囲１５−２８■）であった。

インキュベーション　自動回転機構を有する多くの圧縮
空気キャビネット　モデル　インキュベーション（カル
ツユ−モデル　ＣＵＲＦＥＷ　Ｈｏｄｅｌ　２４８）を
胚の培養に使用した。各インキュベーターにおける温度
、湿度とトレイの傾斜角度の条件は、胚発育の特別な期
間における要求に合うように調節した。培養は、適当な
時間に１インキユベーターから次のものに移し、２ない
し３日以上の間隔で検査した。解化前およびｍ化直接の
期間の場合、培養したものを、しばしば観察するために
透明な窓を取付けなテーブルトップエアーインキュベー
ター（カルツユ−モデル１４６）に投入した。湿度は、
インキュベーターの底に置かれた水の皿（２リツトル容
量）を使用して、フィッシャー　へアー　ハイグロメー
タ（ガレンカンプ）で測定しであるレベルを保持した。

装置を洗浄し、ミルトン消毒液（ｔ−ＩＩＬＴＯＮ　Ｓ
ｔｅｒｉｌｉｓｉｎｇ　ｆｌｕｉｄ）　　［リチャード
ソンーヴイックス　リミテッド（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ
−Ｖｉｃｋｓ　Ｌｔｄ月で消毒した。

消毒　操作の全ては、半消毒状態で行なった。

卵アルブミンの細菌静止特性は、厳重な無菌対策を不必
要とした。卵を集荷後直ちに７０％アルコールで簡単に
リンスして、使用直前に７０％アルコールで洗浄して水
を除いた。装置の全て、蒸留水と生理食塩水をオートク
レーブ処理した。ラッピング　フィルムの場合、フィル
ムのロールの外ｊ側層を廃で、シート（１００ｍｍ２）
を切り、シート状の消毒紙の間に置いた。この操作、卵
アルブミンの集荷と培養操作をクリーンエアーキャビネ
ット内で行なった。構成物質（ペニシリン１００μ／ｍ
ｌ：ストレプトマイシン１０　ｏｍｃｇ　／＋ｍｌ　）
を、システムＩＩＩの容器数を密閉るすクリングフィル
ムを装着するために使用する、卵アルブミンに加えた。

（実施例） 実施例１ 発育の４日から滑止までの胚の培養 培養システムＩＩＩ法 容器数を二倍卵黄卵から調製した。直径４０ＩＴｆｆ１
１の円を卵のプラント端の周りにドリルで開け、空気セ
ルを含む卵殻のキャップを取り除いた。内容物を排廃後
、卵殻を蒸留水で洗浄し、その浅水で満たして内卵殻膜
の脱水を防止した。容器数の容積は６５〜７５ｍ１の範
囲であった。ステージ１５−２０における胚を含む３日
間のインキュベート卵を割って開け、クリングフィルム
で裏付けした浅い皿におとした。胚をクリング　フィル
ム　ザックから容器数に移し、その後胚を最上部に保持
するようにクリングフィルムを徐々にそらした。

詳細な移動方法は、ローレットとシムキス（ＲＯＷＩｅ
ｔｔ　ａｎｄ　Ｓｉｍｋｉｓｓ　１９８７）の報告に示
されている。

卵殻を卵殻へフィルム（第３図）を接着するために液体
アルブミンを使用して、２Ｎのクリングフィルムでシー
ルした。胚とフィルム間の空隙の長さは、平均１０ｍｍ
であった。

培養を３８℃でインキュベートし、５日間３０°の角度
から間欠的にゆり動かし、その後、１０日間静止状悪で
保持した。最後の３−４日間、３７℃で静止前止インキ
ュベーションかれた。相対湿度は４５−６０％の範囲で
あった。予定旬化の１〜２日前に、くちばし状のものを
漿尿膜につけて空気を入れると、小さな打ち抜きがクリ
ングフィルムに設けられた。クリング　フィルムを滑化
の数時間前にペトリ皿で置き換えた。

８＃化割合は、３６％（第２表〉、非）化の７２％が健
康であった。平均重量は、オボ（ＯＶＯ）で成長した対
照ニワトリの４６ｇに比較して３５ｇであった。弱い動
物の異常性は、不完全に収縮した卵黄ザック、未回復の
へそおよび肢血管を含んでいた。べたべたするニワトリ
は、一般的であり、その状態は、卵殻内のある未吸収ア
ルブミンの存在と関連している。

第２表　オボ（ＯＶＯ）でのインキュベーション第３日
に容器数に移した後のある間隔におけるニワトリの胚の
生存率 培養システムＩＩＩ 孵化２１−２２　　　　　　　　　　２５”　　　　　
　　　　　　　　　　３６十　卿化ニワトリ数は、健康
なニワトリと弱いものを含む オノとワカスギ（１９８４年）は、３日インキュベート
した卵から得られたウズラの胚を培養する卵殻技術を案
出した。即ち、彼等は、卵殻が胚用のカルシウムの必須
要素であることを示した。ローレットとシムキス（１９
８５年、　１９８７年）は、家禽にこの技術を採用して
２０％の卿化率を得た。ガシルウム吸収とガス交換にお
ける、漿尿膜の機能は、ドナー胚とホスト卵殻間の菌株
または種想によって損なわれなかったと思われる。

インキュベーション初期培養の回転は、ローレットとシ
ムキス（１９８７年）によって勧められている。インキ
ュベーションの間、雌鳥の卵を回転することが一般的に
行なわれているが、ニュー（１９５１年）は、臨界期間
がインキュベーション第３〜第８日の間であることを示
した。一連の実験において、培養物を回転することが最
適発育の要件であることが確認され、そして必要なこの
動きが、培養物のインキュベーションの最初の５日の間
に（発育の４−９日）課されることが示されている。

我々の実験において、非回転培養物の初化率は、５日間
回転、その後静止した状態で保持された培養物の３６％
（第２表）に比較して１８％（ｒ１＝７７）であった。

回転期間を１５日に拡大すると、卿化率が低い結果を生
じた。発育９日の生存胚の割合である１ｊｆｆ化率は、
最初の５日のみ回転した培養物の場合が６２％（ｎ＝３
３）、そして１５日間回転した培養物の場合が４０％（
ｎ＝７１　＞であった。容器般用のクリングフィルムシ
ールを他の研究者によって使用された自由フィッティン
グ窓の代りに使用した。この修正の利益は、卵インキュ
ベーションの標準条件（強制空気システム、相対湿度５
０−６０％）が使用できるので、容器卵殻と結合した漿
尿膜の領域が通常の環境の影響を受けることである。高
湿度、例えば相対湿度７０％、において、卿化率は１０
％に減少しな（ｎ＝３８）。クリング　フィルムは、ガ
ス交換及びこのコンバーメントからの水損失を制限する
ことによって、胚上の空隙の環境を制御する効果を有す
るだろう。卵の空気セルにおいて、水蒸気圧は常圧より
も高く、そして０２張力は、ＣＯ２張力がインキュベー
ション時間とともに上昇すると、低下する［ワイゲステ
ィーンとラーン１９７０／７１年（Ｗａｎｇｅｓｔｅｅ
ｎ　ａｎｄ　Ｒａｈｎ、　１９７０／７１）］。　部分
的にガス透過性であるラッピング　フィルムは、卵殻の
ない培養におけるニワトリの胚の発育用最適条件を与え
ることが示されている［ダン等１９８１（Ｄｕｎｎ　ｅ
ｔ　ａｌ、、　１９８１）］。非シール殻での実験にお
いて、培養物は、高湿度でウズラの場合に１．５％ｃｏ
２　　（オノとワカスギ、１９８４年）、ニワトリの場
合に空気中（ローレットとシムキス、　１９８７年）で
インキュベートされている。後者の研究は、培養容器中
において空気に対する。２／Ｃ’０２の差を維持するこ
とが、空隙に面する非保護漿尿膜からの水損失を妨げる
ことよりも、培養における通常の発育に対して余り重要
ではないことを示唆する。本発明の実施例において、二
層のクリングフィルムは、ある環境において単層フィル
ムでシールされた卵殻中で１９日まで生存した胚が少し
しかない場合に使用された。クリング　フィルムの第２
の利益は、微生物による汚染を減少する助けとなること
である。

実施例２ 発育１日から９日までの胚の培養 培養システムＩＩ ドナー卵より３−４ｇ重い卵は、容器般用に選ばれた。

直径３２順の開口部を卵殻の鋭い端にドリルで六を開け
、その内容物を廃でた。卵殻を蒸留水ですすぎ、その接
水で再び充たし内卵殻膜の脱水を妨げな。非インキュベ
ート受精卵の卵殻にはさみで切り込みをつけ、その卵殻
を手で割って開け、その内容物をガラスジャーに落とし
た（直径５０ｍｍ、容積６０ｍ１）。それらは、その後
、ビーカー（直径３５ｍｍ、容積７０　ｍｌ　＞を介し
て容器膜に移した。この方法は、胚盤葉、卵黄そして粘
性アルブミンカプセルへの最小阻害を保障する。

新鮮な卵から集められた液体アルブミン（１−５ｍｌ　
）で卵殻の縁まで満たし、切り込みをシート状のクリン
グフィルムでシールして調製時に空気の泡が入ることを
避けた。クリングフィルムは、卵殻のいずれか一方の端
上に置かれた２リング（ナイロン）によって適所に保持
され、そして−組の小さな木くぎにかけられた弾性バン
ドにより堅められている（第４図）。再構成卵をそれら
の方法でインキュベートし、そして３８℃、相対湿度３
０−５０％でゆり動かした。培養卵をインキュベーショ
ン７．９．１０日に明りに透かして調べ、そして生存胚
を再インキュベートした。通常の発育胚は、インキュベ
ーション７日において培養物の７４％観察された（第３
表）。死亡率は、次の２日において高く、唯１つの胚の
みが１０日を越えて生存した。調製の全てにおいて卵殻
のブランド端における空気セルは、蒸発による水損失に
代って拡大した。

第３表　非インキュベート卵から容器膜への移動後のあ
る間隔におけるニワトリ胚の生存率培養システムＩＩ カレバウト［Ｃａ１ｌｅｂａｕｔ（１９８３）　］は、
２−３日の間容器卵殻でウズラの胚を培養する方法を記
載している（データは示されていない）。その技術は、
受精ドナー卵の内容物を空のホスト卵殻に移し、その後
調製品をペトリ皿と溶融パラフィンでシールすることか
らなっている。ニワトリの胚の場合に、その方法は、シ
ールとしてクリングフィルムを使用し、そしてインキュ
ベーションの間調製品を回転することによって改善され
ている。静止培養実験において、生存率は７日で５０％
であり、これらの胚は発育年齢において通常遅れる。

空隙を含む培養システム１とＩＩＩにおける１日の胚を
育てる試みにおいて、死亡率はインキュベーションの第
２から第３日において高いことが見い出された。類似の
観察がダン（Ｄｕｎｎ、　１９８１　）等の殻のない培
養システムにおいて行なわれている。これらのシステム
における開発の失敗は、胚盤葉が唯アルブミンの薄層に
よって覆われている事実に基因するであろう。ロマノ７
　（Ｒｏｍａｎｏｆｆ　１９４３）は、全卵黄上に胚盤
葉を発育させるために液体アルブミンへの沈積が重要で
あることを強調している。

液体アルブミンによる胚盤葉領域を連続的に沈めると、
即ち空気が排出される殻において得られる条件は、亜胚
盤葉キャビティの形成を助けるであろう。このキャビテ
ィーは、発育初期の間、アルブミンから誘導された液体
で満たされるにニー１９５６年）。たぶん、胚近傍の十
分なアルブミンを欠く調製法においてこの方法は損なわ
れる。　ウズラ胚用のカレバウト（１９８３年）培養シ
ステムは、その中から、ペトリ皿／パラフィンワックス
シールをクリング　フィルムと置換し、インキュベート
ョの間培養物を回転し、そしてそれをニワトリの胚に採
用することによってこの実験例において修正されている
。その修正は、４日までには培養における発育を拡大し
、そして高生存率を生じた。

実施例３ 発育１日からＭ化までの胚の培養 培養システムＩＩ〜ＩＩＩ法 非インキュベート卵からの胚を実施例２に記載したよう
に３日間培養したく第４図）。調製品は、その後インキ
ュベーターから除かれ、−度に、卵殻に切り込みを入れ
、そして内容物を、実施例１で記載したように、より大
きな卵殻に移した。小さな卵殻の内容物を存在する開口
部から除く試みは、胚および外部胚膜に常に損傷を与え
た。培養物は、実施例１に記載のようにインキュベート
された。

生存率を第４表に与える。

第４表　非インキュベート卵から小容器殻へそして、３
日後に大容器卵殻への移動後のある間隔におけるニワト
リの胚の生存率。

１４　　　　　　　２８　　　　　’４７卵フ化２１−
２２　　　　　　　　　　　１６”　　　　　　　　　
　　２７＋　震化ニワトリ数は、健康な烏及び弱いもの
を含む インキュベーション初期段階における損失は、システム
ＩＩで発育しなかった胚およびシステムＩＩＩに移す間
に損傷を受けた胚を合計したものであった。第３〜９日
間の死亡率は、おそらく移動間の損傷によるものであっ
た。１ｌｌｆ化率は２７％であり、そして実施例１で記
載したようにｍ化の約２０％は、肢および卵黄ザックの
損傷を示した。いくつかの新生児は成熟まで育てられ、
そして生殖体の生育能力についてテストされた。ロープ
　アイランド　レッド　カーカレスから人工受精された
２実験雌鳥（卵産出率はそれぞれ８９％と７５％であっ
た）の卵の孵化率はそれぞれ６３％と８０％であった。

２実験カーカレスがらの人工受精されたウォーレン雌鳥
からの卵の聯化率は、それぞれ８０％と１５％であった
。２実験雌鳥は、産卵の役に立たなかった。

培養システムＩｆにおいて、発育阻害は、発育の８−１
０日において生じ、がっ、漿尿膜と内卵殻膜間の接触の
欠如と結びついていると思われた。

再構成卵におけるカラザの分裂は、卵黄の浮力に影響を
与え、次々と、外部胚膜の卵殻膜からの距離は、それ故
にガス交換構成を損なう。この問題を迂回して避けるな
めに、胚は、脈管外部胚膜が空気／アルブミン境界面に
近接するシステムに移された。培養システムＩＩＩへの
移動の最も好ましい時期は、脈管構造の発育が進行中で
あり、再楕成卵の成分が取扱いに絶える程十分に頑健で
ある場合には、インキュベーションの第３日の終り頃で
あった。胚が停止殻内で発育の１日から培養される実験
に空隙が含まれる（第３図）と、低生存率および零卿化
を与えた［エム、ナイト−、パーソナル　コミュニケー
ション（Ｈ，Ｎａ１ｔｏ、　ｐｅｒｓｏｎａｌｃｏｍｍ
ｕｎｉｃａｔｉｏｎ）］。

フェースＩＩとフェースＩＩＩシステムを結びつけるス
テップは、新規の方法である。この事実は、胚盤葉段階
（ステージ１）から孵化に至る鳥類の胚の有効培養の最
初の報告である。

実施例４ 受精卵から７日までの培養 培養システム１〜ＩＩ法 雌鳥は、産卵の予定日後２．７５時間に捕獲され、その
卵が受精していることが確認された。日々の再生産サイ
クルにおける際に、次の卵は排卵され、そしてアルブミ
ンが沈積するマグナム（ｍａｇｎｕｍ）を横切る。輸卵
管部を回収するために、雌鳥をペンタバルビタンナトリ
ウムＥイックスピラル、セパリミテッド（ＥＸＰＩＲＡ
Ｌ、　Ｃａｖａ　Ｌｔｄ、月を静脈注射して殺し、腹部
を引き抜き、そして７０％アルコールで洗浄した。受精
卵を含む輸卵管部を腹腔内から持ち上げ、して切除後、
食塩水で温めらせな紙を含む消毒洗面器上に置いた。大
部分の卵は、峡部を有するマグナムの縁から５０−１５
０ｍｍの距離に位置していた。

長い切り込みを輸卵管壁につけ、そして卵を、卵黄を囲
む粘性アルブミンカプセルに損傷を与えることなく、ガ
ラスビーカーに滑らせたく直径３５ｍｍ、容積７０ｍ１
）、卵を約５ｍｌの培養培地を含むガラスジャー（直径
４０ｍ１、容積６０　ｍｌ　）に移し、そして卵黄を動
かして最初に胚盤を生じさせた。培地を胚盤と一致する
レベルに加え、しかしその位置はアルブミンカプセル表
面以下である、そして容器を弾性バンドで堅めたサラン
ラップでシールした（第５図）。要求される培地の全容
績は、卵黄にアルブミンカプセルを加えた量に依存し、
８１２ｍ１であった。胚盤を卵黄側に置く培養において
、容器は、胚盤上のアルブミンを培地に沈めないことを
保証するように埋められた。調製品を、マグナムから卵
の回収とインキュベーション間が２０分以下の遅れで、
４１−４２℃で２４時間インキュベートした。

培養培地は、新鮮な卵の内部および外部アルブミン層か
ら集められた液体アルブミン（２部）と塩溶液（１部）
から成っていた。塩溶液は、５０ｍＭのＫ　ＨＣＯ３、
３０ｍ　ＭのＮａＨＣＯ３，１０ｍＭのＫＣｆＪ、２．
５ｍＭのＭｇ（１２・６Ｈ２０，０，７ｍＭのＣａ（、
Ｑ２　・２Ｈ２０と１１ｍＭのグルコースを含んでいた
。培養培地のｐＨは、Ｃ０２雰囲気下で撹拌することに
よって初期値８．４から７．２−７．４に下がり、そし
て密封容器に培地を貯蔵することにより調製工程の間、
低い値を保持していた。

２４時間の発育状態は、胚領域を目視によって簡単に確
認することができる。胚ｆｉ葉の成長および亜胚盤葉キ
ャビティの形成は、半透明領域を含む不透明リング（直
径３　ｍｍ　＞によって示される。

しかしながら、発育可能性の正確な評価のため、調製品
をシステムＩＩにおいて更に３−６日培養した。

胚を、実施例２に記載したように、フェースＩＩ用の培
養システムに置いた。容器殻を、ドナー雌鳥が産んだ卵
より約３−４ｇ重い、卵から調製した。培養物を常温に
冷却し、そして、その後培養培地（１０２０ｍ１）を満
たし、かつクリングフィルでシールされる容器殻に入れ
たく第４図）。

再構成卵を、１時間サイクルで９０°の角度から間欠ロ
ッキングしながら、３８℃、湿度３０−５０％でそれら
の方法により、インキュベートした。

培養物を、インキュベーションの７．８または９日に調
査のために、殻から除いた。

結果は第５表に与えられている。

第５表　すぐ前の卵が産卵された後２．７５時間にマグ
ナムから回収された受精ニワトリ環の発育 培養システム■〜ＩＩ 卵の数　　　ステージ２７−２９における　　　インキ
ュベーションのある日における３５　　　　　　　　　
　２４　　　　　　　　　　２／２　　　　９／１７０
＃１正常な胚は、培養の６７％がステージ２７−２９に
発育した。それらは、このステージ以上生存しなく、通
常インキュベーションの第８日の初めに死にかかってい
る。残存する培養物において、発育しないもの、また細
胞の胚盤葉シートの発育シートのみのもの、または奇形
のいずれかがあった（第６．７表）。

第６表　インキュベーション中容器殻（システムＩＩ　
）で培養された受精ニワトリ環の発育。フェース■培養
システムトライアル＋。

鼻の数　　　インキュベーション　　　生育力のある　
　奇形胚　　　胚！Ｉ　　　胚　盤（日）　　　　　　
　胚　“ ＋　最初の２４時間、再構成卵を密閉プラスティックパ
ックに入れ、１時間サイクルで９０°の角度からロッキ
ングした。その後、それらをシステムＩＩ法によってイ
ンキュベートした。

“　胚は、１２時間またはそれ以上までに発育令が遅れ
た。

第７表　非希釈または塩溶液または水のみで希釈された
液体アルブミンから成る培養培地における受精ニワトリ
環の発育。フェース■〜ＩＩ培養システムトライアル。

１　地　　　卵の敗　　　インキュベー　　正常な胚　
　奇形胚　　　胚ｌ　　　胚　盤−−ジョン（日）　　
−１−〇１！　　　−非希釈　　　３５’　　　　　６
−７　　　　　５１　　　　１７　　　　２９　　　　
　３希釈： 塩溶液　　　９０’　　　　　７−８　　　　　５１　
　　　１３　　　　２４　　　　１２水　　　　　１７
　　　　　　７−８　　　　　　５９　　　　　１８　
　　　　　０　　　　　２３＋　死亡率は、非希釈アル
ブミンの７日にインキュベーションにおいてそして希釈
アルブミンの８日インキュベーションにおいて高かった
。

０　これらの調製において、フェース■システム用の培
養容器をクリングフィルムでシールし、そしてクリング
フィルム層を直接アルブミンカプセル上に置いた。

フェースＩ用の培養システムは、発育の最初の２４時に
必要とする条件のテストするために設計された一連の実
騒に基づいていた。テス１へは、受精後、異なるステー
ジで卵について行ない、そして次の発育および分析用の
フェースＩＩの徨準培養システムに移す前に、異なる処
置にかけられた。

試験された培養システムの態様は次のようであった： 胚盤を覆う物質の厚さ、培養培地組成、ガス交換そして
胚盤の空間の位置。

重要な因子は、胚盤上のアルブミンの長さであった。先
のマグナムからの相対的に薄いアルブミンカプセルまた
は後のマグナムからの厚いアルブミンカプセルで包み込
まれた卵は、中間マグナム（峡部から５０−１５０ｍｍ
＞から回収された卵よりも短い生存率を与えた。中間マ
グナムからの卵の発育は、アルブミンカプセルが除かれ
ると阻害されけ、胚盤を培地表面に浮かせた。同様に、
カプセルで完全な卵が培地に沈むならば発育も阻害され
た。受精卵培養のシステムＩＩ　（第４図）を使用する
実験において（第６表）、発育失敗の最も起こりやすい
場合は、カプセル生卵の培養培地への水没である。最初
の２４時間開も表面をシールしてインキュベートした調
製において、クリングフィルムシールからの胚盤の距離
が変化し、そしてその距離が卵黄の浮力が依存していた
。

特に定める培養培地は、フェース■の発育には必須では
なかった。胚は、非希釈アルブミン中６日間でステージ
２５−２６に十分に成長した。しかしながら、このステ
ージを越える発育には、希釈アルブミン（第７表）を使
用する必要があった。

塩溶液組成は、ビードル（Ｂｅａｄｌｅ）　、コンラッ
ドとスコツト（Ｃｏｎｒａｄ　ａｎｄ　５ｃｏｔｔ　１
９３８）そしてレオナルト（Ｌｅｏｎａｒｄ　１９６８
）によって与えられた。落ちる前の子宮卵アルブミンと
産み落された卵アルブミンのイオン性組成の相違データ
に基づいていた。グルコースを、非形成の子宮フェース
の開始における子宮体液［デービッドソンとトラッパ−
（Ｄａｖｉｄｓｏｎ　ａｎｄ　Ｄｒａｐｅｒ、　１９６
９）コと、同一濃度において加えた。再構成卵において
体液の総量（塩溶液＋プランピング液（ｐｌｕｍｐｉｎ
ｑ　ｆｌｕｉｄ）は、卵のプランピング液量とほぼ等し
かった。プランピング液は、即問で３６　４０ｍ１に変
化するが、卵のアルブミン含量の約１／２から成る。媒
体中のアルブミンが全て蒸留水で希釈された実験は、希
釈剤（第７表）として塩溶液を使用して得らｈｆ。

結果に類似する結果を与えた。このように、ステージ２
９への短期間培養の場合に、水は重要な成分である。

培養容器と関連する培地酸塩基バランスにおけるガス状
環境は、輸卵管フェースにおける発育にとって正確な調
整を決して必要としなかった。子宮において、アルブミ
ンのｐＨは、７．１５と７゜４の間を変動する［ソーバ
ーとモンギン（５ｏｕｖｅｕｒ　ａｎｄ　ｌｌｏｎｇｉ
ｎ、　１９７１）］、、卵において、卵殻を通って流出
するＣＯ２のために、産卵の数時間以内にｐ）（ｓ、４
に上昇する［ダウズ（Ｄａｗｅｓ、　１９７５）］。

反対に、子宮におけるアルブミンの酸素含有是は低く、
卵におけるインキョベーション２時間以内の空気に匹敵
する［ウィシャート、パーソナルコミュニケーＥ／　Ｅ
！　ン（Ｗｉｓｈａｒｔ、　ｐｅｒｓｏｎａｌ　ｃｏｍ
ｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）］。フェース■の規定された培
養法の場合のｐＨは、インビボ条件に適合させるために
ＣＯ２を用いて、慣用的に７．２−７．４に調整されて
いた。容器をサランラップでシールしてｐＨ７゜８以下
を保持し、そして室において湿気の多い大気を保持した
。

発育は、多くの生存胚において若干の減少があるけれど
も、高ｐＨ培養によって損なわれなかった。受精卵を、
胚盤に一致するレベルのＰＨ７゜４の培地で満たされた
、容器殻に入れ、そして殻をフタで覆った。それらを１
０％ＣＯ２または空気中で相対湿度８０％、４２℃で２
４時間インキュベートした。培養は培地のｐ　Ｆ＋は、
それぞれ平均で０．３１ユニツトと１．１５ユニツト上
昇した。胚をその後更に６日間システムｎで培養した。

正常な胚は、１０％ＣＯ２中でインキュベートした培養
物の５５％＜ｎ＝３３＞、そして空気中でインキュベー
トしたものの４１％（ｎ＝２９＞が発育した。

発育の子宮フェースにおける左右対称の決定が重力によ
って影響を受けることが提案されている［コカーブとア
イアルーギイラディ−（Ｋｏｃｈａｖ　ａｎｄ　Ｅｙａ
ｌ−Ｇｉｌａｄｉ、　１９７１月。胚領域の空間の位置
に関する実験は、決定の臨界期間の間、胚軸線が斜めに
置かれた胚中に形成され水平に置かれたもののではない
ことを示している［オルザンス力、スジョラズス力とラ
ソッタ（Ｏｌｚａｎｓｋａ、　５ｊｏｌａｊｓｋａａｎ
ｄ　Ｌａ５ｓｏｔａ、　１９８４月。本研究において、
これらの発見を支持する証拠は得られなかった。胚軸線
は、水平胚円盤から成長した培養物の６８％（ｎ＋＝３
４＞が、そして斜めの胚円盤から成長したものの７４％
（ｎ＝３４）が形成されている。

フェースＩ法とフェースＩＩ法と結びついたものは、全
く新しい。このことは、受精卵からステージ２９、即ち
胚の生存期間の１／３をカバーする期間の、鳥類胚のイ
ンビトロ成長の最初の報告である。全卵黄について輸卵
管胚の培養の二つの他の報告がある。ホワース（ｔｌｏ
ｗａｒｔｈ、　１９７１）は、輸卵管の前部領域から得
られた卵を生存率６０％（ｎ＝１０）で胚盤葉ステージ
（ｓｔ、１）まで培養している。卵黄が表面から浮動す
ることを避けるために、この段階においてアルブミンカ
プセルの欠ける卵を、液体アルブミンのビーカーに浸漬
したプラスチック卵殻に投入した。コカーブとアイアル
ーギイラディー（１９７１年）は、子宮胚を多細胞ステ
ージから４一体筒ステージ（ｓｔ、８）に成長させた。

この研究において、卵殻膜を除き、卵黄とアルブミンを
ビーカーに入った生理食塩溶液に移し、そして卵黄をカ
ラザによって強制的に胚領域から斜め位置に懸濁させた
。

受精卵を７日間発育させる培養方法は、鳥類において発
育方法の範囲で前分割ステージにおける実験介入効果を
試験するモデルシステムを提供する。実験室において、
外因性遺伝子を胚円盤細胞質に注入し、そして２時間か
ら７日間にかけて胚における運命を調べた。

実施例５ 受精卵から卿化までの培養　培養システムＩ〜ＩＩ　−
ＩＩＩ法。輸卵管の中間マグナム領域から回収した卵を
フェースｉｔのシステムで２４時間培養しく第５図）、
フェース■のシステムに移しく第４図）そして３日間イ
ンキュベートした。その方法は、は培養培地の液体アル
ブミンと塩溶液の割合がシステム■で３＝２、システム
ＩＩでは２：１に修正して、実施例４に記載されている
。培養培地の不可欠な量を長期間発育の胚に供給するこ
とを保証するために、システム■１用に調整された容器
殻は、ドナー雌鳥が産んだ前記卵よりも容積で１２ｍ１
多きかった。全４日のインキュベーション後、胚を実施
例３で記載したように、フェースＩＩＩ（第３図）のシ
ステムに移した。システムＩＩＩ用に調整した容器殻は
、平均でシステムＩＩで使用される前記殻よりも容積で
１８ｍ１大きい。容積差は、チェンバーにおける空隙の
大きさを決定しな。培養物を３０°の角度からそれらを
回転しながら、３８℃で５日間、その後静止位置で１０
日間インキュベートし、そして最終的に３６−３７℃で
静止卿化インキュベーターに入れた（第８表）。

第８表　受精卵から卵フ化までのニワトリ胚のインキュ
ベーション方法 インキュベージ３の　　　ロッキング／　　　　　　　
　　　　　　　　　インキュベージコの能日数　　　　
　　　　　　　　静止　　狭　　温度（’Ｃ）　　　　
相対温度（％）ｏ−ｉ　　　　静止　　　　　　４１−
４２　　　０１−４　　　　　　　ロッキング　　　９
０”　　　　　　３８　　　　　　３０−５０４−９　
　　　　　　ロッキング　　　３０°　　　　　３８　
　　　　　３０−５０９−１９　　　　静止　　　　　
　３８　　　４０−５５１９−２２　　　　静止　　　
　　　３６−３７　　４０−６０培養物を相対湿度３０
−５５％で第４〜１９日までインキュベートしたり実験
の結果は第９表に与えられる。

第９表　培養期間における受精へニワトリ卵の生存およ
び前止率　　培養システムＩ　−ＩＩ　−ＩＩＩｏ　　
　　　　　　　　　　９６ 発育に失敗した胚の第４日およびシステムＩＩからＩＩ
Ｉに移動する間に損傷を受けた胚の第１０日の初期損失
を集めた。受精卵から培養された胚は、もろく、１日か
ら培養された胚よりも損傷を受けやすかった。ｍ化率は
８％、そして卵フ化の約半数が健康であった。

より高湿度、相対温度５０−６０％において、明化率は
以ている（ｎ＝８５＞が、唯１つの滑止のみ健康であっ
た。培養物から卵）化された１匹の弱いニワトリを相対
湿度６０−７５％でインキュベートした。

合計で、７匹の健康なニワトリ、この中には修正法によ
り培養された１匹を含んでいる、を培養受精卵から滑化
した。２つのカーカレスが成熟まで生存している。その
うちの１つは生殖力に富んでおり、人工受精卵のワーレ
ン雌鳥の卵から７５％の明化率を与え、他の１つは強く
はない（第９図）。２つの９週令の若いめんどりは健康
に見える。残りの鳥類は、それぞれ１．８そして１６週
間生存した。

発育の継続期間に対し３つの明確な培養システムを採用
した理由は、前に論じられている。上層が胚の成長にお
いて厳しい役割を担うように思われる。胚と上層との適
正な関係は、経験的に決定され、そして適正な調整は、
培養チェンバー設計において、胚発育の異なるフェース
の変化する要求を調節するためになされた。フェースＩ
において、肝玉の過剰な培地は有害であり、フェースＩ
Ｉにおいてそれは成長には必須である。脈管外部胚膜が
チェンバーで大気圧に曝されなければ発育が阻害されな
いときに、過剰な培地は８日までフェースＩＩＩで有害
ではなかった。

受精直後のステージからＭ化までの培養におけるニワト
リの胚の成長を支持するシステム■〜ＩＩ〜ＩＩＩの組
合せは、それ自体新しい方法である。このことは、鳥類
の胚の完全な培養システムの最初の報告である［ぺり−
（ｐｅｒｒｙ、　１９８８）　］。

ニワトリの胚用完全インビトロシステムの確立は、基礎
的および応用研究領域における広範で有効に適用される
。例えば、外部遺伝子または全ゲノムの注入によって鳥
類卵を操作しそして、滑化ニワトリおよび多分成熟した
烏のかがる操作効果を調べる機会を提供する。その方法
は、インビトロ受精分野および推定上の全能細胞を胚に
挿入する際に、初期および今用いられているものよりよ
り進んだステージにおける輸卵管胚のインビトロ技術を
案出するガイドラインも提供する。

潜在的な適用は、移転遺伝子家禽の生産である。

成長および再生産性能の因子の修正は、家禽産業への利
益である。その上、新規タンパク質遺伝子の鳥類遺伝子
ゲノム系への挿入は、卵白における生物医学的に重要な
タンパク貰生産の潜在的に価値ある技術である。家禽の
高再生産能力は、この技術分野における他の農場の動物
にも利益を与える。雌鳥は、６ケ月で成熟し、そして産
卵の第１年目に約３００個の卵を産卵できる。

要約すると、分離培養システムは、発育の３フェース１
．即ち胚が全胚生存期間をカバーするためにあるシステ
ムから次への移動させられる、を案出している。技術の
全実験設計および順序は、第１図のダイヤグラムに示さ
れている。フェースＩＩＩの例証は、分離したシステム
（実施例１）である。

フェースＩＩの例証は、フェースＩＩＩ　（実施例２）
のものと重なるが、年齢とともに好ましいこれらのシス
テム間を移動する（実施例３〉。フェース１の方法は、
アルブミン沈着が行なわれ、かつオスとメスの生殖核が
大きくなる場合に、排卵約２時間で始まる期間をカバー
する［ベリー（Ｐｅｒｒｙ、　１９８７）］。分析用に
フェースＩＩの方法（実施例４）、そしてその後完全培
養システム用のフェースＩＩＩ用の方法（実施例５）と
結合することを要求する。

文献 ビートル、ビー、タフリュー０．コンラツド。

アール、エム９アンド　スコツト、エッチ、エム。

（１９３８）コンポジション　オブ　ジ　ュテリン　セ
クレション　オブ　ザ　トメステック　フォール。

ポールトライ　サイエンス、　第１１巻：　４９８−５
０４頁。

カレバウト、エム、　（１９８３）。オートラジオグラ
フィック　デモンストレーション　オブ　ザ　ペネトレ
ーション　オブ　アルブミン−プライブトマテリアル　
スロー　ザ　ビテリン　メンブラン　インツー　ジ　エ
ラグ　ヨーク、　イツクテリアー　ツー　ジ　アゼアン
　プラストデルム。

ボールトライ　サイエンス、第６２巻：　１６５７−１
６５９頁。

クリテンデン、エル、ビー、アンド　サルタープイー、
ダブリュ（１９８６）。ジーン　インサージョン　アン
ド　ロング　ターム　ゴールス。

アビアン　デジイーシース、第３０巻：４３−４６頁。

デビッドソン、エム、エフ、アンド　ドレイパー、エム
、エイチ（１９６９）。ジ　アキュシュレーション　オ
ブ　グリコース　イン　ザ　ホワイトオブ　ジ　エラグ
　オブ　ザ　ヘン。ジエイ、フィシオル、第２０２巻：
　１１９−１２０頁。

ダウス、シー、エッチ、　（１９７５）。アシッド−ベ
ース　リレーションシップス　ウィズン　ジ　アビアン
　エラグ。パイオル、レス、　第５０巻：３５１−３７
１頁。

デュン、ビー、イー１．フィッツハリス、ティー、ビー
、　アンド　バーネット、ビー、デイ−０（１９８１）
。エファクツ　オブ　ベリイング　チェムバー　コンス
トラクション　アンド　エンプリオス　イン　シェル−
レス　カルチャー。アナト。

レス、　第１９９巻重３３−４３頁。

フリーマン、ビー、エム、アンド　メッサー。

エル、アイ、　（１９８５）ジェネティック　マニピユ
レーション　オブ　ザ　トメスティック　フォールハン
バーガー、ブイ、アンド　ハミルトン、工フチ。エル、
　（１９５１）。ア　シリーズ　オン　ノーマル　ステ
ーシス　イン　ザ　デベロップメントオン　ザ　チック
　エンブリオ。ジェイ１モル主工第８８巻：　４９−６
７頁。

ホワース、ビー、　（１９７１）。アン　イグザミイネ
ーション　オン　スペルム　力パシテーションイン　ザ
　フォール。パイオル、リプロド、第３巻：　３３８−
３４１頁。

コサーブ、ニス、アンド　アイアルーギ、ラディ、エッ
チ、　（１９７１）。パイラテラル　シンメトリ−イン
　チッキ　エンブリオ　デターミネーション　パイ　グ
ラビテイ−。サイエンス、第１７１巻：　１０２７−１
０２９頁。

コサーブ、ニス５．ギンスバーグ、エム、アンド　アイ
アルーギ、ラティ、エッチ、　（１９８０）。フロム　
フレベージ　ツー　ブリミイデブ　ストリーク　フォー
メーション：　ア　コンプレメンタリー　ノーマル　テ
ーブル　アンド　ア　ニュールック　アット　ザ　ファ
ースト　ステーシース　オン　ディベロップメント　オ
ン　ザ　チック。ＩＩ　、マイクロスコピック　アナト
ミー　アンド　セル　ポピユレーション　ダイナミック
ス。

デｙ二！±（庄四工第７９巻：　２９６−３０８頁。

レオナルト、イー、エム、　（１９６Ｂ）。ジ　コミュ
ニケーション　オン　ミネラルス　イン　ジ　アビアン
　オドダクト。ピーエッチ、デイ−９セシス、ユニバー
シイテ仁オン　ニシンバラ。

ニュー、デイ−、エイ、ティー、　（１９５６）。ザ　
フォーメーション　オン　ザ　サブ−ブラストデルシイ
ツク　フルイツト　イン　ザ　ヘンズ　エラグ。ジェイ
、　エンプリオル、アイエックスピー。

モルホ、第４巻：２２１−２２７頁。

ユニー。デイ−、エイ、ティー、　（１９５旬。アクリ
ティカル　ポリオド　フォー　ザ　ターニング　オン　
ヘンズ　エラグ。ジェイ　エンプリオル、アイエックス
ピー、モルホ、第５巻：　２９３−２９９頁。

ニュー、デイ−、エイ、ティー、　（１９６６）。゛ザ
カルチャー　オン　バーチプレート　エンプリオス”。

ロンドン：アカデミツク　プレス。

オルスザンス力、ピー９．スゾラジス力、イー。

アンド　ラソッタ、ゼット、　（１９８４）。イフェク
ト　オン　スバシイアル　ポジション　オン　ステリン
　クライル　ブラストデルムス　カルチヤード　イン　
ビトロ　オン　ビラチラル　シンメトリ−フォーメーシ
ョン。ロークスグ　アーキ。

デフ、パイオル、第１９３巻：　１０８−１１０頁。

オフ。ティー、エンジ　ワカスギ、エヌ、　（１９８／
ｌ）。

ミネラル　コンテント　オン　クライル　エンプリオス
　カルチヤード　イン　ミネラル−リッチアンド　ミネ
ラル−フリー　コンディションズ。

ポールトライ　サイエンス、第６３巻：　１５９−１６
６頁。

ベリー、エム、エム、　　（１９８６ａ）。エンブリオ
マニピユレーション　イン　ホールトライ。プロセス　
ＸＸＸＶＩＩ、ピーアール、ポールトライ　プリーダー
ス、ラウンドテーブル。

ぺり−、エム、エム、　（１９８６ｂ）。エンブリオマ
ニピユレーション　イン　ホールトライ。ニブインバラ
　センター　フォー　ルーラル　エコノミイ。マヌユア
ル　レポート　１９８５〜８６．１９−２４頁。

ベリー、エム、エム、　（１９８７）。ニュークレアー
イベンツ　フロム　フエリティリゼーションツー　ジ　
アーリイ　フレベージ　ステージ−スイン　ザ　トメス
ティック　フォール。（ガルス　ドメスティックス）。

ジエイ、アナト、第１５０巻　９９−１０９頁。

ぺり−、エム、エム、　（１９８８）。ア　コンプリー
ト　カルチャー　システム　フォー　ザ　チッキエムブ
リオ。ネイチャー、第３３巻、７０−７２頁。

ロマノーフ、エイ、アール、　（１９４３）、カルチヤ
−シヨン　オン　ザ　アーリー　チック　エムブリオ　
イン　ヒドロ。アナト、レク、第８７巻：３６５−３６
９頁。

ローレット、ケイ、アンド　シムキス、ケイ。

（１９８５）。ザ　サロゲート　エラグ。ニュー　サイ
エンティスト　第１４６９巻：　１１２−４４頁。

ローレット、ケイ、アンド　シムキス、ケイ。

（１９８７）。イキスプランテット　エムブリオ　カル
チャー：イン　ビトロ　アンド　イン　オル　テクニー
クス　フォー　トメスティック　フォール。

ビイ−アール、ホールトライ　サイエンス、第２８巻：
９１−１０１頁。

サーベアー、ビー５アンド　モンギン、ピー。

（１９７１）。エチュード　コンバチイブ　デュ　フル
イツト　ステリン　エテ　デ　ラアルブミン　デラオル
フ　イン　ステロ　チエ　ラ　ポール。

アン、パイオル、アニマ、ビオケ、ビオフィズ。

第１１巻：２１３−２２４゜ ワンゲルスティーン、オー、デイ−８アンドローン、エ
ッチ、　　（１９７０／７１）。レスビレ−トリー　ガ
ス　イキフチェンジ　バイ　ジ　アビアンエムブリオ。

レフビル、フィシオル、第１１巻。

３１−４５頁。

【図面の簡単な説明】

第１図は、個々および連接したシステムによってカバー
された発育の期間を示すニワトリの胚の培養システム図
を示す。 第２図は、新たに産卵した雌鳥の卵の構造を示す図であ
る［ダウズ　１９７５年から（ＤａＷｅｓ、　１９７５
）１゜ 第３図は、フェースＩＩＩ（４日〜Ｍ化）の培養のシス
テム図である。 第４図は、フェースＩＩ（１日〜４または９日）の培養
システム図である。 第５図は、フェースＩ（受精から１日）の培養システム
図である。

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. （１）胚上に空隙があり、該空隙が部分ガス透過シール
   によって外部大気と分離されている密閉室で該胚をイン
   キュベートしてなることを特徴とする胚成長フェースの
   間中鳥類の胚をインビトロ培養する方法。
2. （２）室が卵の一部である請求項第１項に記載の方法。
3. （３）卵が雌鳥の卵であり、かつ胚とシール間の空隙深
   さが５〜１５ｍｍである請求項第２項に記載の方法。
4. （４）インキュベート胚を少なくとも初期に穏やかに撹
   拌する請求項第１項に記載の方法。
5. （５）液体で充填された密閉液体非透過性容器内の培養
   培地で胚をインキュベートすることを特徴とする胚形態
   発生の間中鳥類の胚をインビトロ培養する方法。
6. （６）容器が部分ガス透過性である請求項第５項に記載
   の方法。
7. （７）培養培地が液体アルブミンである請求項第５項に
   記載の方法。
8. （８）培養胚が穏やかから適度に撹拌される請求項第５
   項に記載の方法。
9. （９）最初に請求項第５項に一致する方法によって胚を
   培養し、その後請求項第１項に一致する方法によって該
   胚を培養することを特徴とする胚形態発生および胚成長
   フェースの間中鳥類の胚をインビトロ培養する方法。
10. （１０）濃厚アルブミンの周囲カプセルを有し、かつ部
    分的に培養培地に沈めてなる受精卵を培養することを特
    徴とする胚盤葉形成まで鳥類の胚をインビトロ培養する
    方法。
11. （１１）培地が一般に胚盤と調和している請求項第１０
    項に記載の方法。
12. （１２）培地が水および／または塩溶液で希釈できる液
    体アルブミンである請求項第１０項に記載の方法。
13. （１３）密閉容器内で行なう請求項第１０項に記載の方
    法。
14. （１４）請求項第１０項に記載の方法で鳥類の胚を培養
    し、その後請求項第５項に記載の方法で該胚を培養する
    ことを特徴とする胚盤葉形成までおよび胚形態形成の間
    中鳥類の胚をインビトロ培養する方法。
15. （１５）請求項第１０項に記載の方法によって鳥類の胚
    を培養し、その後、請求項第５項に記載の方法によって
    該胚を培養し、そしてその後請求項第１項に記載の方法
    によって該胚を培養することを特徴とする胚盤葉形成ま
    で、胚形態形成の間中および胚成長から孵化の間中鳥類
    の胚をインビトロ培養する方法。