PT87756B - Processo para a cultura de embrioes in vitro - Google Patents

Description

processo de cultura consiste, por exemplo, em se incubar um embrião num recipiente fechado, existindo nele um espaço de ar acima do embrião, sendo o espaço de ar separado da atmosfera externa por um selo parcialmente permeável aos gases.

-3Este invento está relacionado com uma técnica de cultura de embriões aviários in vitro, que é particularmente adequada para aplicação em aves de capoeira, particularmente galinhas.

embrião de galinha, nas fases iniciais do seu desenvolvimento desde a fertelização até à divisão, não tem sido acessível à intervenção experimental devido ao volume, fragilidade e relativa inacessibilidade do evo. Este problema foi discutido em revisões recentes acerca das possíveis vias de transferência de genes exógenos para aves (Freeman and Messer, 1985; Crittenden and Salter, 1986). Perry (1986a, b) pegou na opinião alternativa e sugeriu que a manipulação genética do ovo aviário é praticável. 0 objectivo de encontrar um sistema de cultura completo para o embrião de galinha foi conseguir um meio de criar o ovo manipulado até à maturidade. Foi agora estabelecido um método para a cultura in vitro até uma fase intermédia do desenvolvimento embrio nário e está-se a fazer progressos neste âmbito. A técnica terá aplicações não só na engenharia genética de aves de capoira mas também na investigação de mecanismos fundamentais do desenvolvimento das aves e no estudo de características prejudiciais. Ainda, ela constituirá uma alternativa desejável à intervenção cirúrgica na galinha poedeira.

embrião de galinha é originado no disco germinal, uma pequena região do citoplasma situado no polo animal do ovo (a familiar gema). Durante o primeiro terço do seu desenvolvimento, o embrião permanece em flutuação na superfície da gema enquanto as membranas extra-embrionárias crescem à volta da gema e ficam vascularizadas. No restante período de desenvolvimento, o embrião cresce à custa das reservas alimentares no ovo. Para os presentes fins, o desenvolvimento da galinha foi dividido em 3 fases de acordo com as diferentes necessidades nas fases sucessivas desde a tilização até à saída da casca.

f er-

-4Fase I. Fertilização até à formação da blastoderme. Esta fase decorre no oviducto e termina na oviposição. A interacção de gâmetas dá-se dentro de 15 minutos após a ovulação e a primeira divisão da clivagem algumas 4 h mais tarde (Perry, 1987 ). Nas 20 h que se seguem subsequentes divisões dão origem a única camada de células cobrindo uma cavidade sub-blastodérmica (Kochav, Ginsburg e Eyal-Giladi, 1980). Durante a sua passagem através do oviducto o ovo adquire albumén no magnum, depois a membrana da casca no isthmus onde começa a clivagem. No útero, o albumén duplica de volume pela absorção do fluido uterino (fluido de esgoto) e finalmente a casca sofre calcificação lenta. Para as galinhas poedeiras com grandes sequências de um ovo por dia, a oviposição é seguida dentro de 15-30 min. pela ovulação seguinte e o ciclo repete-se.

Fase II. Morfogénese embrionária. Esta fase decorre nos primeiros 3 dias de incubação do ovo (fases 1-18, Hamburger e Hamilton / 1951_7 ). Na fase 20, o embrião tem 10 mm de comprimento e a blastoderme embrionária extra estende-se à volta da gema até ao seu equador.

Fase III. Crescimento embrionário. Esta fase decorre nos últimos 18 dias da incubação do ovo (fases 18-45, Hamburger and Hamilton /^_1951_7 ).

Existem vários métodos para a cultura a curto prazo de embriões na Fase II (New, 1966) e para a cultura a longo prazo de embriões mais avançados (Dunn, Fitzharris and Barnett, 1981; Ono and Wakasugi, 1984; Rowlett and Simkiss, 1985, 1987). Algumas envolvem transplantação do embrião apartir da gema, enquanto outros envolvem a transferência do embrião e gema intacta para um recipiente de cultura. Este último método proporciona as condições mais favoráveis para a cultura a longo prazo e é usado exclusivamente para o presente sistema de cultura.

-5De acordo com um primeiro aspecto do presente invento é proporcionado um processo para a cultura in vitro de embriões aviários durante a fase de crescimento embrionário, o processo compreeendendo incubação de um embrião num recipiente fechado, havendo um espaço de ar acima do embrião, o espaço de ar sendo separado da atmosfera externa por uma tampa parcialmente permeável aos gases. A tampa é de preferência na forma de um filtro. A tampa pode ser de material plástico, por exemplo polietileno. Verificou-se que película aderente comercial constitui uma óptima tampa, particularmente quando usada em duas camadas. Qualquer outro material tendo as propriedades adequadas da película aderente pode igualmente ser usado.

A conveniência do material a ser usado como tampa pode ser medida indirectamente através da medição da permeabilidade ao dióxido de carbono e/ou vapor de água; a permeabilidade ao dióxido de carbono pode ser medida testando a subida do pH do albumén do ovo após 24 horas de incubação a 38°C em recipientes que de outro modo seriam impermeáveis. 0 albumén deverá ser inicialmente gaseado com dióxido de carbono para baixar o pH até 0,1. Uma subida de pH entre 0,5 e 1,5 é geralmente adequada, sendo 0,5 ou 0,7 a 1,0 ou

1,3, por exemplo cerca de 0,9, a gama preferida. A permeabi, 2 lidade ao vapor de agua pode ser de 5 ou 10 a 30 ou 40 mg/cm / /24 h.

O recipiente e de preferência parte de um ovo, que será geralmente escolhido da mesma espécie do embrião a ser cultivado. Verificou-se ser particularmente adequado remover o extremo cego de um ovo completo; encontrou-se como particularmente adequado um buraco de 40 mm de diâmetro centrado no eixo do ovo.

O buraco no extremo cego do ovo é fechado com uma tampa parcialmente permeável aos gases. A tampa pode ser feita para aderir à casca do ovo por meio de albuman.

-6De preferência as características de permeabilidade são semelhantes às do ovo natural.

meio de cultura pode estar presente nalgumas realizações deste aspecto do invento, particularmente se as fases de cultura anteriores foram feitas in vitro, mas o processo pode decorrer sem ele, por exemplo quando as fases de cultura anteriores decorreram naturalmente. 0 meio de cultura quando presente compreenderá geralmente albumén, não diluido ou numa forma diluída e de preferência líquido inter-uterino.

Quando se usa ovos de galinha, prefere-se que a profundida do espaço entre o embrião e a tampa seja de 5 a 15 mm, por exemplo cerca de 10 mm.

De preferência agita-se suavemente o embrião incubado, pelo menos inicialmente. A agitação suave pode ser conseguida por embalo intermitente, por exemplo num ângulo de 30°. As temperaturas de incubação convencionais, por exemplo cerca de 38°C podem ser mantidas.

Os processos de cultura in vitro de acor do com este aspecto do invento são adequados para usar entre aproximadamente o dia 4 (contagem a partir da fertilização) até à saída da casca, que geralmente ocorre à volta do dia 22. No entanto, nos últimos dias (por exemplo (3) da vida embrionária, é preferível não haver agitação. Em adição pouco antes (por exemplo 1 a 2 dias antes) do tempo de saída da casca de preferência a tampa é perfurada para deixar entre uma determinada quantidade de ar para dentro do recipiente. Mais tarde pode-se deixar entrar mais ar, por exemplo por remoção da tampa e facultativamente cobrindo o buraco na casca do ovo (quando o ovo constitui o recipiente) com um disco sólido, o qual pode ser uma pica de Petri.

De acordo com um segundo aspecto do presente invento, e proporcionado um processo para a cultura in vitro de um embrião aviário durante a morfogénese embrionária, o processo compreendendo incubação de um embrião num meio de cultura num recipiente impermeável a líquidos fechado e cheio de líquido.

O recipiente pode ser parciálmente permeável aos gases. A permeabilidade aos gases pode ser proporcionada por uma casca de ovo (geralmente em combinação com a membrana interna da casca) e/ou por uma tampa parcialmente permeável aos gases, cujas características preferidas são as do primeiro aspecto do invento. Deve-se notar que a casca do ovo e a membrana interna da casca são parcialmente permeáveis aos gases.

meio de cultura é de preferência albumen líquido, que pode ser de ovos postos de fresco.

Novamente, de preferência o recipiente é parte de um ovo, mas a construção preferida é algo diferente da do primeiro aspecto do invento. No presente aspecto, é de preferência o extremo aguçado que é removido, por exemplo por um buraco de 32 mm. Isto assegura a presença de um espaço de ar entre a membrana externa da casca e a membrana interna da casca; isto parece ser vantajoso pois o espaço de ar espande-se durante a cultura para perfazer a perda de água por evaporação.

Se se usar uma tampa para fechar um ovo do qual o extremo aguçado foi removido, o ovo pode ser cultivado numa posição horizontal com a tampa para um dos lados.

A tampa deve ser mantida firmemente no lugar contra a casca do ovo.

Prefere-se que os embriões em cultura sejam sujeitos a uma agitação suave a moderada. É preferido o balanço intermitente ou contínuo, por exemplo num ângulo de

-890° em ciclos de uma hora ou outros intervalos comparáveis.

Um processo de acordo com este aspecto do invento começará geralmente cerca de 1 dia após a fertilização (ou seja por volta do tempo normal de postura) e pode durar 2 ou mais dias, por exemplo até 8. No entanto, prefere-se que um processo de acordo com este aspecto do invento continue apenas durante 3 ou 4 dias antes da transferência do embrião para um processo de acordo com o primeiro aspecto .

De acordo com um terceiro aspecto do presente invento é proporcionado um processo para a cultura in vitro de um embrião aviário durante a morfogénese embrionária e durante a fase de crescimento embrionário, o processo sendo caracterizado em primeiro lugar pela cultura do embrião por um processo de acordo com o segundo aspecto do invento e subsequentemente cultura do embrião por um processo de acordo com o primeiro aspecto.

Prefere-se que a transição se dê entre 2 e 5, por exemplo 4, dias após fertilização.

De acordo com um quarto aspecto do presente invento é proporcionado um processo para a cultura in vitro de um embrião aviário até à formação da blastoderme, o processo sendo caracterizado pela cultura de um ovo fertilizado, tendo uma cápsula envolvente de albumen denso, parcialmente submerso em meio de cultura. Para resultados óptimos o meio deverá estar geralmente em linha com o disco germinal, o qual estará geralmente mais elevado, mas abaixo do nível da cápsula de albumen.

O ovo fertilizado pode ser obtido cirurgicamente a partir da galinha. Se se usarem técnicas cirúrgicas, o ovo é de preferência retirado do magnum médio, por exemplo à distância de 5 a 150 mm do istmo. A remoção de um ovo fertilizado desta área do magnum verificou-se ser vantajosa por o ovo fertilizado parecer ter então uma espessura óptima da cápsula envolvente de albumen denso.

O meio de cultura pode ser albumen líquido que pode ser diluído com água e/ou uma solução salina. Prefere-se de um modo geral iniciar a cultura com albumen diluído (por exemplo 3:2) com solução salina e subsequentemente (por exemplo após 1 dia) diluir o albumen com solução salina (por exemplo 2:1).

Um processo de acordo com este aspecto do invento decorre de preferência num recipiente fechado. 0 recipiente pode ser feito de um material impermeável como seja vidro, que pode ser selado com um filme pouco permeável aos gases, por exemplo SARAN WRAP (marca registada). Pode ser usado qualquer outro material tendo as propriedades adequadas do SARAN WRAP. A permeabilidade aos gases pode ser medida (e.g. para dióxido de carbono e/ou de água) como descrito acima. A subida de pH em 24 horas pode ser 0,5 a 1,0, por exemplo de 0,6 a 0,8 no teste de permeabilidade ao dióxido de carbono. A permeabilidade ao vapor de água pode ser de 1,0 a

10, por exemplo 2 a 5 mg/cm /24 h.

De um modo geral o que acontecerá é que um embrião cultivado de acordo com este aspecto do invento será subsequentemente cultivado de acordo com um processo do segundo aspecto do invento. Portanto, de acordo com um quinto aspecto do invento, é proporcionado um processo para a cultura in vitro de um embrião aviário até à formação da blastoderme e durante a morfogénese, o processo compreendendo a cultura de um embrião aviário por meio de um processo de acordo com o quarto aspecto do invento e subsequentemente cultura do embrião por um processo de acordo com o segundo aspecto.

Caso se pretenda usar um sistema de cultura práticamente completo para embriões aviários desde o ovo

-10fertilizado até à saída da casca compreender-se-á ser adequado adoptadar vários dos aspectos do invento atrás referidos em sequência. Assim, de acordo com um sexto aspecto do presente invento, é proporcionado um processo para a cultura in vitro de um embrião aviário até à formação da blastoderme, durante a morfogénese embrionária e durante o crescimento embrionário até à saída da casca, o processo sendo caracterizado pela cultura de um embrião aviário por um processo de acor do com o quarto aspecto do presente invento, subsequentemente cultura do embrião por um processo de acordo com o segundo aspecto do invento de cultura e subsequentemente o embrião por um processo de acordo com o primeiro aspecto do invento.

Será geralmente preferido que os ovos recipientes, se se usarem ovos como recipientes, na segunda fase sejam ligeiramente maiores que os ovos dadores, por exemplo em 1 a 2 ml. Se se usarem ovos como recipientes na terceira fase, os ovos recipientes são de preferência substâncialmente (por exemplo cerca de 18 ml) maiores do que os usados na fase imediatamente precedente.

Para uma melhor compreensão do presente invento e para mostrar como pode ser concretizado, serão agora descritas várias realizações, com referência aos desenhos que se seguem, em que:

Figura 1 mostra um esquema de sistemas de cultura para embriões de galinhas para indicar os períodos de desenvolvimento cobertos por sistemas individuais e ligados;

Figura 2 ilustra a estrutura de galinha posto recentemente (retirado de Dawes, de um ovo

1975 ) ;

cultura para a Fase

Figura 3 e um diagrama de um sistema de III (dia 4 até à saída da casca);

-11Figura 4 é um diagrama de um sistema de cultura para a Fase II (dia 1 a dia 4 ou dia 9); e

Figura 5 é um diagrama de um sistema de cultura para a Fase I (ovo fertilizado até dia 1).

Serão dados agora vários exemplos do invento. Nos exemplos são usados os materiais que se seguem, a menos que de outro modo seja estabelecido.

Na Tabela 1 estão resumidas as taxas de sobrevivência dos embriões em cultura.

TABELA 1. Taxas de sobrevivência de embriões de galinha cultivados durante períodos específicos em sistemas de cultura apropriados a fases particulares do desenvolvimento a partir das 2 h pés-fertilização (dias)

Período de	Sistemas de	N2 de embriões Νθ de embriões
desenvolvimento		cultura		cultivados	ou galinhas sobreviventes (%)
Dia 4 até à saída da	casca	III		69	25 (36)
Dia 1 até dia 8		II		47	35 (74)
Dia 1 até à saída da	casca	II a III		59	16 (27)
Dia 0 até ao dia 7		I a II		35	23 (67)
Dia 0 até à saída da	casca	I a II a	III	96	8 (8)

Animais. Galinhas poedeiras de uma estirpe comercial de Warrens (Isa Brown) foram colocadas em gaiolas individuais e mantidas num ciclo de 14 h de luz/24 g. Com 28-32 semanas de idade, guando da postura de ovos em sequências longas de 1 ovo/dia, elas foram inseminadas artificialmente com semen colhido de fresco de galos Rhode Island Red.

A fertilidade foi regularmente testada por inspecção visual de ovos não incubados e encontrou-se ser superior a 90%. Nos ovos férteis, a região germinal é vista como um anel branco (3-4 mm de diâmetro) encerrando uma área semi-transparente e nos ovos não férteis surge como um disco vacuolado (2-3 mm de diâmetro).

Ovos. Ovos postos 24 h antes pelo stock de poedeiras foram usados como fonte de embriões para os sistemas de cultura II e III (Exemplo 1-3). Como fonte de albumen para o meio de cultura usaram-se ovos postos de fresco (férteis e inférteis). Colheu-se albumen líquido a partir das camadas interna e externa de albumen do ovo (Fig. 2) e usou-se no mesmo dia para cultura. As cascas recipientes para o sistema de cultura II (Exemplos 2-5) foram obtidos a partir do stock de poedeiras. As cascas maiores usadas como recipientes de cultura para o sistema III (Exemplos 1, 3, 5) foram de ovos de dupla gema de uma estirpe comercial de frango de carne obtidos de uma chocadeira local (D.B. Marshall, Whitburn, West Lothian) e usados para cultura dentro de 1-2 semanas após postura.

Película envolvente. Empregaram-se dois tipos de película plástica para fechar os vasos de cultura. SARA WRAD (Dow Chemical Company) tem uma permeabilidade aos gases baixa, (Dunn, Fitzharris & Barnett, 1981) e mostrou-se mais adequado para o sistema I. A película aderente (qualquer marca excepto de preferência as não possuidoras de aditivos PVC) é parcialmente permeável aos gases (Dunn et al, 1981) e foi usada para os sistemas II e III. Os testes de permeabilidade foram feitos nas películas envolventes presentemente empregues nas condições usadas para incubação de embriões em cultura. A permeabilidade ao CO^ foi determinada indirectamente por medição da subida de pH do meio de cultura (albumen líquido:solução salina, 2:1) em provetas de vidro (60 ml; 40 mm de diâmetro) contendo 25 ml de meio e fechadas com filme envolvente. O meio de cultura foi inicialmente gaseado com para baixar o pH para um valor adequado. Para

-13SARAN WRAP (uma camada), o pH subiu em média 0,7 unidades, durante a incubação durante Para a película aderente (2 de pH 7,2-7,5 para pH 7,8-8,2 24 h a 41,5°C e humidade zero camadas), o pH subiu em média 1,0 unidades, de pH 7,2-7,5 para pH 8,3-8,5, durante incubação durante 24 h a 38°C e humidade de 45-55%. A permeabilidade ao vapor de água foi determinada medindo a perda de água de placas (350 ml; 104 mm de diâmetro) contendo 150 ml de água. As placas foram tapadas com filme envolvente e incubadas como descrito préviamente. Para SARAN WRAP a permeabilidade média foi de 3,4 mg/cm /24 h (gama 3,2 a 3,8 mg). Para a película aderente a permeabili2 dade média foi de 22 mg/cm /24 h (gama 15-28 mg).

Incubação. Para a cultura de embriões usaram-se incubadoras de ar forçado com mecanismos automáticos de rotação (CURFEW Modelo 248). As condições de temperatura, humidade e ângulo de inclinação dos tabuleiros em cada uma das incubadoras foram ajustadas de acordo com as necessidades em períodos particulares do desenvolvimento embrionário. As culturas foram transferidas de uma incubadora para a seguinte nas alturas certas e incubadas em intervalos não inferiores a 2 ou 3 dias. Durante o período de pré-saída da casca e imediatamente após a saída da casca, as culturas foram colocadas numa estufa de aço com prateleiras. (CURFEW Modelo 146 ) dotada de uma porta transparente de modo a permitir inspecção frequente. A humidade foi mantida num determinado nível, medida com higrómetros de cabelo de Fischer (Gallen Kamp), usando placas (2 litros de capacidade) de água colocadas no fundo das incubadoras. As máquinas foram limpas e desinfetadas todos os meses em líquido esterilizante MILTON (Richardson-Vicks Ltd).

Estabilidade. Todas as operações foram conduzidas em condições de semi-esterilidade. As propriedades bacteriostáticas do albumen do ovo tornam desnecessário tomar precauções de assépcia muito rigorosas. Os ovos foram brevemente lavados com álcool a 70% pouco depois da colheita e depois limpos com álcool a 70% imediantamente antes de usar. Todo o equipamento, água destilada e soluções salinas foram autoclavadas. As soluções salinas foram esterilizadas por filtração. Para a película envolvente rejeitaram-se as primeiras camadas do rolo de película, em seguida cortaram-se folhas (100 mm ) e colocaram-se entre folhas de papel estéril. Esta operação, colheita de albumen do ovo e preparação das culturas foram efectuados em câmaras assépticas. Adicionaram-se antibióticos (penicilina, 100 ^i/ml; estreptomicina, 100 yjg/ml) ao albumen de ovo que foi usado como cola na aderência do filme aderente às cascas recipientes no sistema III.

Exemplo 1

Cultura de embriões desde o dia 4 do desenvolvimento até à saída da casca.

Método do sistema de cultura III.

As cascas recipientes foram preparadas a partir de ovos de duas gemas. Foi picotado um círculo de 40 mm à volta do extremo cego do ovo e removida a tampa da casca contendo a célula de ar. Após rejeição do conteúdo lavou-se a casca com água destilada, depois encheu-se novamente com água para evitar a desidratação da membrana interna da casca. Os volumes das cascas recipientes variou entre 65 e 75 ml. Ovos com três dias de incubação, contendo embriões nas fases 15-20, foram partidos e o conteúdo vertido num vidro de relógio revestido com película aderente. Os embriões foram transferidos no saco de película aderente para as cascas recipientes, em seguida a película aderente foi retirada lentamente mantendo os embriões na parte superior. Os detalhes do método de transferência estão ilustrados numa publicação de Rowlett e Sinkiss (1987). A casca foi fechada com 2 camadas de película aderente, usando albumen líquido para colar o filme à casca (Fig. 3). A profundidade do espaço en-

tre o embrião e o filme foi de 10 mm em média.

As culturas foram incubadas a 38°C e agitadas intermitentemente num ângulo de 30° durante 5 dias, depois foram mantidas numa posição estacionária durante 10 dias. Nos 3-4 dias finais colocaram-se as culturas num incubador estacionário para a eclusão a 37°C. A humidade relativa variou entre 45 e 60%. 1-2 dias antes do tempo calculado para a saída da casca, quando o bico já rompeu a membrana corioaloantóica e penetrou no espaço de ar, fizeram-se pequenas perfurações na película aderente. A película aderente foi substituída por uma tampa de placa de petri várias horas antes da saída da casca.

A taxa de saída da casca foi de 36% (Tabela 2) e 72% dos pintos pareceram saudáveis. 0 seu peso médio foi de 35 g comparado com 46 g para os pintos testemunha crescidos no ovo. As anormalidades dos animais enfraquecidos incluíram sacos de gema incompletamente retraídos, umbigos não cicatrizados e membros defeituosos. Foram vulgares os pontos pegajosos sendo isto devido à presença na casca de algum albumen não absorvido.

-16TABELA 2. Taxa de sobrevivência de embriões de galinha em diferentes intervalos após transferência para cascas recipientes no terceiro dia da incubação no ovo. Sistema de cultura III.

Dias de incubação	Número de	Embriões vivos/
desde a postura	embriões vivos	culturas totais (%)
3	69
9	48	69
14	39	57
18	32	46
21	27	39
Saída da casca 21-22	25+	36

⁺O número de pintos saídos da casca inclui pintos saudáveis e

Ono e Wakasugi (1984) imaginaram uma técnica com cascas para cultura de embriões de codorniz obtidos a partir de ovos incubados durante 3 dias; eles demonstraram que a casca do ovo constituía uma fonte essêncial de cálcio para o embrião. Rowlett e Simkiss (1985, 1987) adaptaram a técnica para aves domésticas e obtiveram uma taxa de saída da casca de 20%. Parece que a função da membrana coriolantóica na absorção do cálcio e trocas gasosas não foi prejudicada por diferenças de estirpes ou espécies entre o embrião dador e a casca hospedeira.

A rotação das culturas durante a primeira parte da incubação foi recomendada por Rowlett e Simkiss (1987). Se bem que seja prática comum rodar os ovos de galinha durante a incubação, New (1957) mostrou que o período crítico é durante o terceiro ao oitavo dia de incubação. Numa' série de ensaios, foi agora confirmado que a rotação das culturas é necessária a um desenvolvimento óptimo e mostrado que este movimento só necessita de ser aplicado durante os primei-

-17ros 5 dias de incubação das culturas (dias 4-9 do desenvolvimento). Na nossa experiência, as culturas não rodadas deram uma taxa de saída da casca de 18% (n=77) comparado com uma taxa de 36% (Tabela 2) para culturas que foram rodadas durante 5 dias e depois mantidos numa posição estacionária. Prolongando-se o período de rotação para 15 dias obteve-se uma taxa de saída da casca mais fraca. As taxas de saída da casca, como percentagem dos embriões vivos no dia 9 do desenvolvimento foram de 62% (n=33) para as culturas rodadas durante apenas os primeiros 5 dias e 40% (n=71) para as culturas rodadas durante 15 dias.

As tampas da película aderente para as cascas recipientes foram usadas em vez das tampas com mau ajustamento empregues por outros investigadores. Uma vantagem desta modificação é que podem ser empregues as condições c vencionais de incubação de ovos (um sistema de ar forçado, humidade relativa de 50-60%), de modo que a região da membrana corioalantóica associada à casca recipiente seja sujeita a um ambiente normal. Com humidade elevada, superior a 70% de humidade relativa, a taxa de saída da casca desceu para 10% (n=38). A película aderente pode ser eficaz na regulação do ambiente no espaço acima do embrião limitando as trocas gasosas e a perda de água deste compartimento. Na célula de ar do ovo, a pressão de vapor de água é superior à ambiente e a tensão de 0^ cai à medida que a tensão de CO₂ sobe com o tempo de incubação (Wangensteen e Rahn, 1970/71).

As películas aderentes que são parcialmente permeáveis nos gases mostrou-se proporcionarem condições óptimas para o desenvolvimento do embrião de galinha em culturas sem casca (Dunn et al., 1981). Em experiências com cascas não fechadas, as culturas foram incubadas em humidade elevada, em 1,5% (O₂ para codornízes (Ono and Wakasugi, (1984) e em ar para galinhas (Rowlett and Sinkiss, 1987 ). A última investigação sugere que a manutenção, no recipiente de cultura, de um diferêncial O₂/CO₂ com ar é menos importante para o

desenvolvimento normal em cultura do que evitar a perda de água a partir da membrana corioalantóica desprotegida em contacto com o ar. No presente exemplo, usou-se uma dupla camada de película aderente uma vez que nalgumas circunstâncias alguns embriões sobreviveram até ao dia 19 em cascas fechadas com uma única camada de película. Uma segunda vantagem da película aderente é que pode ajudar a reduzir a contaminação por microorganismos.

Exemplo 2

Cultura de embriões desde o dia 1 ao dia 9 do desenvolvimento.

Método de sistema de cultura II

Escolheram-se para cascas recipientes ovos 3-4 g mais pesados do que os ovos dadores. No extremo aguçado da casca picotou-se uma abertura de 32 mm de diâmetro e rejeitou-se o conteúdo. Lavaram-se as cascas com água destilada, tornaram-se a encher com água para evitar desidratação da membrana interna da casca. Faz-se uma incisão com tesoura na casca de um ovo fértil não incubado, partiu-se a casca com a mão e o conteúdo foi colocado num copo de vidro (50 mm de diâmetro; volume 60 ml). Transferiu-se isto para uma casca recipiente com a ajuda de uma proveta (35 mm de diâmetro; volume 70 ml). Este processo assegura uma danificação mínima da blastoderme, gema e cápsula de albumen viscoso. Encheram-se as cascas até ao topo com albumen líquido (1-5 ml) colhido de ovos postos de fresco e selou-se a abertura com uma folha de película aderente, tendo cuidado para evitar a inclusão de bolhas de ar na preparação. A película aderente foi mantida na sua posição através de 2 anéis (nylon) colocados à volta de ambos os extremos da casca e seguros por bandas elásticas presas a um conjunto de pequenos pregos (fig. 4). Os ovos reconstituídos foram incubados sobre os seus la-19dos e rodados intermitentemente ou continuamente, num ângulo de 90° com ciclos de uma hora a 38°C e 30-50% de humidade relativa. As culturas foram inspeccionadas aos 7, 9 e 10 dias de incubação e o embrião sobrevivente foi novamente incubado. Ao fim de 7 dias de incubação 74% das culturas apresentaram um desenvolvimento normal dos embriões (Tabela 3). A mortalidade foi elevada nos 2 dias seguintes e apenas 1 embrião sobreviveu ao décimo dia. Em todas as preparações a célula de ar no extremo cego da casca expandiu-se para substituir a perda de água por evaporação.

TABELA 3. Taxas de sobrevivência de embriões de galinha em intervalos após transferência de ovos não incubados para cascas recipientes.

Sistema de cultura II

Dias de incubação Número a partir da postura vivos

47

39

35

15 e embriões Embriões vivos/ culturas totais (%)

Callebaut (1983) descreveu um método para a cultura de embriões de codorniz em cascas de ovos recipientes durante 2-3 dias (não foram apresentados resultados). A técnica consistiu na transferência do conteúdo de um ovo dador fértil para uma casca hospedeira vazia, seguido da cobertura da preparação com uma placa de petri e cera de parafina fundida. Para os embriões de galinha, o método foi afinado pela utilização de película aderente como tampa e rotação das preparações durante a incubação. Em experiências com culturas estacionárias a taxa de sobrevivência foi de 50% aos 7

-20dias e estes embriões foram geralmente retardados no desenvolvimento. As tentativas para criar embriões do dia 1 nos sistemas de cultura I e III que continham um espaço de ar, encontrou-se que a mortalidade foi elevada durante o segundo a terceiro dias de incubação. Observações semelhantes foram feitas por Dunn et al (1981) nos seus sistemas de cultura sem cascas. A incapacidade de desenvolvimento nestes sistemas pode talvez ser atribuída ao facto de a blastoderme ser cober ta apenas por uma camada fina de albumen.

Romanoff (1943) sublinhou a importância da submersão em albumen líquido para o desenvolvimento da região da blastoderme com albumen líquido, uma condição obtida numa casca da qual se excluiu o ar, pode ajudar na formação da cavidade sub-blastodérmica. Esta cavidade fica cheia com líquido, derivado do albumen, durante o desenvolvimento inicial (New, 1956). Possivelmente o processo é prejudicado em preparações sem quantidades suficientes de albumen na vizinhança do embrião.

O sistema de cultura de Callebaut (1983) para embriões de codroniz foi modificado neste Exemplo por, entre outras coisas, substituição da placa de petri/cêra de parafina por película aderente, pela rotação das culturas durante a incubação e pela sua adaptação a embriões de galinha. As modificações prolongaram 4 dias o desenvolvimento em culturas e resultaram numa elevada taxa de sobrevivência.

Exemplo 3

Cultura de embriões desde o dia 1 do desenvolvimento até à saída da casca.

Sistema de cultura II a III. Método

Embriões derivados de ovos não incubados foram cultivados durante 3 dias como descrito no Exemplo 2

-21(fig. 4). As preparações foram então removidas do incubador, uma de cada vez, fez-se uma incisão na casca e transferiu-se o conteúdo para uma casca maior como descrito no Exemplo 1 (Fig. 3). As tentativas para remover o conteúdo da casca mais pequena através da abertura existente invariavelmente danificou as membranas extra-embrionárias. As culturas foram incubadas como descrito no Exemplo 1.

As taxas de sobrevivência estão apresentadas na Tabela 4.

TABELA 4. Taxas de sobrevivência intervalos após transferência de cas recipientes pequenas e após 3 tes grandes. Sistemas de cultura dos embriões de galinha em ovos não incubados para casdias, para cascas recipienII a III.

Dias de incubação	Número de	Embriões vivos/
a partir da postura	embriões	culturas totais
	vivos	(%)
0	59
3	55	93
9	34	58
14	28	47
18	21	36
21	17	29
Saída da casca 21-22	16+	27

⁺0 número de pintos e débeis.

saídos da casca inclui pintos saudáveis foram compostas por -se no sistema II e transferência para ceiro e o nono dia

As perdas na parte inicial da incubação embriões que não conseguiram desenvolverembriões que foram danificados durante a o sistema III. A mortalidade entre o terfoi provávelmente também devida a danifi-22cação durante a transferência. A taxa de saída da casca foi de 27% e conforme descrito no Exemplo 1, cerca de 20% dos pintos saídos da casca apresentam defeitos nas pernas e saco da gema. Alguns recém-nascidos atingiram a maturidade e foram testados quanto à viabilidade dos gâmetas. A taxa de saída da casca de ovos derivados de 2 galinhas experimentais (taxas de produção de ovos de 89% e 75% respectivamente) inseminadas artificialmente a partir de galos Rhode Island Red foi de 63% e 80% respectivamente. As taxas de saída da casca de ovos de galinhas Warren, inseminadas artificialmente a partir de dois galos experimentais foram de 80% e 15%, respectivamente. Duas galinhas experimentais não puseram ovos.

No sistema de cultura II, a paragem no desenvolvimento deu-se nos dias 8-10 do desenvolvimento e pareceu estar associada à ausência de um contacto entre a membrana corioalantóica e a membrana interna da casca. A disrupção da calaza no ovo reconstituído poderá ter afectado a flutuação da gema e, por sua vez, a distância das membranas extra-embrionárias à membrana da casca, inibindo assim o mecanismo das trocas gasosas. Para ultrapassar este problema os embriões foram transferidos para um sistema em que as membranas vasculares extra-embrionárias estavam em proximidade com a interface ar/albumen. A altura mais adequada para a transferência para o sistema de cultura III foi para o fim do terceiro dia de incubação quando o desenvolvimento da vasculatura decorria e os componentes do ovo reconstituído estavam ainda suficientemente robustos para suportar manipulação. Certas experiências em que os embriões foram cultivados desde o dia 1 do desenvolvimento em cascas estacionárias contendo um espaço de ar (Figura 3) deram taxas de sobrevivência baixas e saídas da casca nulas (M. Naito, comunicação pessoal).

O passo que liga a Fase II à Fase III do sistema é um novo processo. Esta é a primeira divulgação da cultura com êxito de embriões aviários a partir da fase de blastoderme (Fase 1) até à saída da casca.

-23Exemplo 4

Cultura de ovos fertilizados até ao dia 7. Sistemas de cultura I a II.

Método.

Retiraram-se as galinhas 2,75 h após o tempo calculado para a postura, tendo a certeza que o ovo posto era fértil. Naquela altura no ciclo reprodutor diário o ovo seguinte ovulou e estava a atravessar o magnum onde o albumen é depositado. Para a recuperação dos embriões do ovi dueto, as galinhas foram mortas com uma injecção intravenosa de pentobarbitona de sódio (EXPIRAL, Ceva Ltd.), o abdómen foi puxado e limpo com álcool a 70%. A porção do oviducto contendo o ovo fertilizado foi deixada fora da cavidade abdominal e, após excisão, foi colocado numa bacia estéril contendo papel humedecido em soro fisiológico. A maior parte dos ovos estava situada a uma distância de 50-150 mm da fronteira entre o magnum e o istmo.

Fez-se uma longa incisão na parede do oviducto e o ovo deslizou para uma proveta de vidro (35 mm de diâmetro; volume, 70 ml), evitando classificação da cápsula de albumen viscoso à volta da gema. Os ovos foram transferidos para copos de vidro (40 mm de diâmetro, 60 ml de volume) contendo cerca de 5 ml de meio de cultura e a gema foi manipulada de modo a trazer ao de cimo o disco germinal. Adicionou-se meio até um nível em linha com o disco germinal, mais abaixo da superfície da cápsula de albumen e o recipiente fechado com SARAN WRAP seguro com uma banda elástica (Fig. 5). O volume total de meio necessário dependeu do tamanho da gema mais cápsula de albumen e totalizou 8-12 ml. Para culturas em que o disco germinal fica para o lado da gema os recipientes foram inclinados para assegurar que a cápsula de albumen acima do disco germinal não estava submersa em meio. As preparações foram incubadas a 41-42°C durante 24 h, com um intervalo não superior a 20 min. entre a retirado do ovo

-24do magnum e incubação.

O meio de cultura consistiu em albumen líquido (2 partes), colhido a partir das camadas interna e externa de ovos postos de fresco e em solução salina (1 parte). A solução salina continha 50 mM KHCO^, 30 mM NaHCO^, mM KC1, 2,5 mM mgCl₂.6H₂O, 0,7 mM CaCl₂.2H₂O e 11 mM glucose. 0 pH do meio de cultura foi baixado de um valor inicial de 8,4 para 7,2-7,4 através de agitação numa atmosfera de CO₂ e foi mantido no nível mais baixo durante o decurso dos processos preparativos pelo armazenamento do meio em recipientes fechados.

O estado de desenvolvimento após 24 h pode ser avaliado de um modo superficial pela inspecção visual da área germinal. O crescimento de uma blastoderme e formação de uma cavidade sub-blastodérmica é indicado por um anel opaco (3 mm de diâmetro) encerrando uma área semi-transparente. No entanto, para uma avaliação precisa do potêncial de desenvolvimento, as preparações foram cultivadas durante mais 3-6 dias no sistema II.

Os embriões foram colocados no sistema de cultura para a Fase II como descrito no Exemplo 2. As cascas recipientes foram preparadas a partir de ovos cerca de

3-4 g mais pesados do que os ovos precedentes postos pelas galinhas dadoras. As culturas foram arrefecidas até à temperatura ambiente e colocadas nas cascas recipientes que foram então cheias com o meio de cultura (10-20 ml) e fechadas com película aderente (Fig. 4). Os ovos reconstituídos foram incubados de ambos os lados a 38°C, h.r. de 30-50%, com alteração da posição num ângulo de 90° em ciclos de uma hora. As culturas foram removidas das cascas para observação aos 7, 8 ou 9 dias de incubação.

Os resultados estão apresentados na Tabela 5

-25TABELA 5. Desenvolvimento de ovos de galinha fertilizados recuperados do magnum às 2,75 h após o ovo ter sido posto. Sistemas de cultura I a II

Número de ovos	Número de embriões	Viabilidade dos embriões em dias determinados da incubação 7 8 9
nas Fases	27-29
35	24		2/2 9/17 0/4

Em 67% das culturas desenvolveram-se embriões normais até às fases 27-29. Eles não sobreviveram para além desta fase, geralmente morrendo mais cedo no oitavo dia da incubação. Nas restantes culturas ou não houve desenvolvimento ou verificou-se desenvolvimento de uma camada blastodérmica de células apenas ou embrião malformado (ver Tabela 6, 7).

TABELA 6. Desenvolvimento de ovos de galinha fertilizados cultivados em cascas recipientes (sistema II) ao longo da incubação. Ensaio em sistema de cultura Fase I⁺.

Percentagem de culturas

Número Incubação Embriões Embriões Crescimento Discos de ovos (dias) viáveis malformados blastodérmico germinais

3-5 19 6 46 29 ⁺Durante as primeiras 24 h, os ovos reconstituídos foram colocados em sacos de plástico fechados e mudada a posição num ângulo de 90° em ciclos de uma hora. Daqui em diante foram incubados pelo método para o sistema II.

Os embriões apresentaram um atraso no desenvolvimento de 12 h ou mais

-26TABELA 7. Desenvolvimento de ovos de galinha fertilizados em meios de cultura consistindo em albumén líquido, não diluído ou diluído com solução salina ou apenas água. Ensaios

dos sistemas	de cultura Fase	I a Fase	II .
			Percentagem de	culturas
Meio	Número de ovos	Incubação (dias)	Embriões . + normais	Embriões malformados	Crescimen- Discos to blasto- germi- dérmico nais
Não diluído	35*	6-7	51	17	29 3
Diluição: Solução salina	90*	7-8	51	13	24 12
água	17	7-8	59	18	0 23

4Mortalidade diluído e 8 elevada dias de com 7 dias de incubação em albumén incubação em albumén diluído não *Nestas Fase I camada albumén preparações, os vasos de cultura foram fechados com película adere de película aderente directamente para o sistema da nte e colocou-se uma sobre a cápsula de sistema de cultura para a Fase I baseou-se numa série de experiências destinadas a testar as necessidades para as primeiras 24 h de desenvolvimento. Fizeram-se testes em ovos nas diferentes fases depois da fertilização e sujeitaram-se a diferentes tratamentos, antes da transferência para o sistema de cultura convencional para a Fase II para posterior desenvolvimento e análise. Os aspectos do sistema ' de cultura que foram examinados são: a profundidade do material que cobre o disco germinal, a composição do meio de cultura, trocas gasosas e a posição espacial do disco germinal.

-27Um factor importante foi a profundidade do albumen acima do disco germinal. Ovos metidos em cápsulas de albumen relativamente finas, do magnum anterior ou em cápsulas de albumen espesso do magnum posterior, deram taxas de sobrevivência mais baixas do que os ovos retirados do magnum médio (a 50-150 mm do istmo). O desenvolvimento dos ovos do magnum médio parou no caso de remoção da cápsula de albumen, permitindo ao disco germinal flutuar à superfície do meio.

O desenvolvimento também parou no caso do ovo completo com cápsula ser submerso em meio. Nas experiências (Tabela 6) sobre o uso do sistema II (Fig. 4) para a cultura de ovos fertilizados, a causa mais provável da ausência de desenvolvimento foi a submersão do ovo encapsulado no meio de cultura. Em tais preparações, incubadas com a superfície fechada para cima durante as primeiras 24 h, a distância do disco germinal à película aderente variou e dependeu da flutuação da gema.

Na Fase I não foi essêncial para o desenvolvimento um meio de cultura definido com precisão. Os embriões cresceram bem em albumen não diluido durante 6 dias até às fases 25-26. No entanto, para o desenvolvimento para além desta fase foi necessário usar albumen diluido (Tabela 7). A composição da solução salina baseou-se em dados oferecidos por Beadle, Conrad e Scott (1938) e Leonard (1968) sobre as diferenças na composição iónica do albumen dos ovos uterinos, antes de se soltarem e do albumen dos ovos postos. Adicionou-se glucose numa concentração equivalente à do líquido uterino (Davidson and Draper, 1969) no começo da fase uterina da formação do ovo. Nos ovos reconstituídos, a quantidade total do fluído (solução salina mais líquido de soltura) foi semelhante à quantidade de fluído de soltura no ovo posto. O fluido de soltura compreende cerca de metade do teor em albumen do ovo que varia de 36 a 40 ml entre os ovos. Experiências em que o albumen no meio foi diluido apenas com água destilada deram resultados semelhantes aos obtidos usando solução salina como diluente (Tabela 7). Assim, para culturas a curto prazo até à Fase 29, a água é um ingrediente im-

-28portante.

ambiente gasoso no recipiente de cultura e o equilíbrio ácido-base do meio relacionado com aquele, não requerem ajustamento preciso para o desenvolvimento na fase oviductal. No útero, o pH do albumen flutua entre 7,15 e 7,4 (Sauveur and Mongin, 1971). No ovo ele sobe para pH 8,4 dentro de algumas horas após a postura, devido ao eflu xo de CO^ através da casca (Dawes, 1975). Pelo contrário, o teor em oxigénio do áLbumen no útero é baixo e no ovo ele equi libra-se com o ar dentro de 2 h de incubação (Wishart, comunicação pessoal). Para o método de cultura definitivo para a Fase I, o pH do meio foi de rotina ajustado a 7,2-7,4, com CC>2 para estar de acordo com as condições in vivo; assumiu-se que o nível de oxigénio do meio é o nível do ambiente.

Os recipientes foram fechados com SARAN WRAP para manter o pH abaixo de 7,8 e para Wanter uma atmosfera húmida na câmara.

desenvolvimento não foi impedido pela cultura a pH mais alto se bem que tenha havido uma ligeira redução no número de embriões sobreviventes. Os ovos fertilizados foram colocados nas cascas recipientes, cheios com meio, pH 7,4 até um nível em linha com o disco germinal e as cascas foram cobertas com tampas. Foram em seguida incubados em 10% CC>2 ou em ar H.R. 80%, a 42°C durante 24 h. O pH do meio de cultura aumentou de uma média de 0,31 unidades e 1,15 unidades, respectivamente. Os embriões foram depois cultivados no sistema II durante mais 6 dias. Em 55% (n=33) das culturas incubadas em 10% CO2 e em 41% (n=29) de culturas incubadas em ar desenvolveram embriões normais.

Foi proposto que a determinação da simetria bilateral na fase uterina do desenvolvimento seja influenciado pela gravidade (Kochav and Eyal-Giladi, 1971). Experiências sobre a posição da área germinal indicaram que os eixos embrionários são formados nos embriões colocados obliquamente e não nos colocados horizontalmente, durante o perío

-29do crítico para a determinação (Olzanska, Sjolajska and Lassota, 1984). No presente trabalho não se obteve evidência para apoiar estes resultados. Os eixos embrionários formaram-se em 68% (n=34) das culturas cultivadas em discos germinais horizontais e em 74% (n=34) das culturas crescidas a partir de discos germinais oblíquos.

método para a Fase I e a sua ligação com o método para a Fase II é inteiramente nova. Esta é a primeira publicação da cultura in vitro de embriões aviários a partir do ovo fertilizado até à Fase 29, i.e. durante um período que cobre o primeiro terço da vida embrionária. Existem duas outras publicações sobre a cultura de embriões oviductos em gema completa. Howarth (1971) cultivou ovos, obtidos a partir da região anterior do oviducto, até à fase de blastoderme (Fase I), com uma taxa de sobrevivência de 60%, (n=10). Para evitar a flutuação da gema até à superfíciç os ovos, que nesta fase não possuem cápsula de albumen, foram colocados em cascas de plástico imersas em provetas de albumen líquido. Kochav e Eyal-Giladi (1971) cultivaram embriões uterinos desde a fase multicelular até à fase de 4-sómitos (fase 8). Neste estudo, a membrana da casca foi removida, a gema e o albumen transferidos para uma proveta de solução salina fisiológica e a gema suspensa pela calaza para forçar a área germinal para uma posição obliqua.

O método de cultura para o desenvolvimen to do ovo fertilizado durante um período de 7 dias proporciona um sistema modelo para testar os efeitos da intervenção experimental em fases de pré-clivagem numa gama de processos de desenvolvimento em aves. Neste laboratório injectámos genes exógenos no citoplasma do disco germinal e examinámos o seu destino nos embriões em intervalos entre 2 h e 7 dias.

\·

-30Exemplo 5

Cultura de ovos fertilizados até à saída da casca. Sistemas de cultura I a II a III. Método

Ovos recuperados da região magnum médio do oviducto foram cultivados durante 24 h no sistema para a Fase I (Fig. 5), transferidos para o sistema para a Fase II (Fig. 4) e incubados durante 3 dias. Os processos estão descritos no Exemplo 4, com a modificação das proporções de albumen líquido para solução salina no meio de cultura passarem a ser 3:2 no sistema I e 2:1 no sistema II. Para assegurar o fornecimento da quantidade necessária de meio de cultura ao embrião para o seu desenvolvimento a longo prazo, as cascas recipientes preparadas para o sistema II foram 1-2 ml maiores em volume do que as dos ovos anteriamente postos pelas galinhas dadoras. Após um total de 4 dias de incubação os embriões foram transferidos para o sistema da Fase III (Fig. 3) como descrito no Exemplo 3. As cascas recipientes preparadas para o sistema III foram, em média, 18 ml maiores em volume do que as cascas recipientes usadas no sistema II.

A diferença de volume determinou o tamanho do espaço de ar na câmara. As culturas foram incubadas a 38°C durante 5 dias, voltadas num ângulo de 30°, depois durante 10 dias numa posição estacionária e finalmente colocadas numa incubadora estacionária para saída da casca a 36-37°C (Tabela 8).

-31TABELA 8. Processo para incubação de embriões de galinha a partir do ovo fertilizado até à saída da casca

Dias sucessivos Rola do/	Temperatura Humidade relativa
de incubação	estacionário	Angulo	(°C)	(8 ) na incubadora
0-1	Estacionário	-	41-42	0
1-4	Rolado	90°	38	30-50
4-9	Rolado	30°	38	30-50
9-19	Estacionário	-	38	40-55
19-22	Estacionário	-	36-37	40-60
	Os resultados	de 9 experiências em que
as culturas	foram incubadas	desde	o quarto até ao décimo nono
dia a humidade relativa, h.	r . , de	30-55%,	estão apresentados
na Tabela 9	•
TABELA 9.	Taxas de sobrevivência	e de saída da casca de ovos
de galinha	fertilizados em	intervalos na	cultura. Sistemas
de cultura	I a II a III.
Dias de	Número de	Embriões	vivos/
incubação	embriões vivos Culturas	totais (%)
0	96
4	55			57
10	31			32
15	26			27
19	18			19
22	10			10
Saída da casca
22-23	8+			8

Cinco pintos eram saudáveis

-32As perdas iniciais eram compostas, no quarto dia, por embriões que não se desenvolveram e no décimo dia, por embriões danificados durante a transferência dos sistemas II para III. Os embriões cultivados a partir de ovos fertilizados eram frágeis e mais susceptíveis a danificação do que os embriões cultivados a partir do dia 1. A taxa de saída da casca foi de 8% e aproximadamente metade do número dos pintos que sairam da casca eram saudáveis. Numa humidade mais elevada, H.R. 50-60%, a taxa de saída da casca foi semelhante (n=85) mas apenas um pinto saído da casca era saudável. Um pinto fraco saiu da casca de culturas incubadas à H.R. de 60-75%.

No total, 7 pintos saudáveis sairam da casca a partir de ovos fertilizados cultivados, incluindo um que foi cultivado por um método modificado. Dois galos sobreviveram até à maturidade, um é fértil, dando uma taxa de saída da casca de 75% a partir de ovos de galinhas Warren inseminadas e o outro não é fértil. Dois frangos de 9 semanas de idade parecem saudáveis. Os restantes sobreviveram durante 1 , 8 e 16 semanas respectivamente.

As razões para a adopção de 3 sistemas de cultura distintos para períodos sucessivos do desenvolvimento foram discutidas atrás. Parece que o substracto desempenha um papel crucial no crescimento dos embriões. A própria relação do embrião com o substracto foi determinada empiricamente e os ajustamentos adequados foram feitos no projecto da câmara de cultura para acomodar as alterações necessárias nas diferentes fases do desenvolvimento embrionário.

Na Fase I, um excesso de meio acima do embrião foi prejudicial e na Fase II ele foi essêncial para o crescimento. Um excesso de meio não foi prejudicial na Fase III até ao dia 8, quando o desenvolvimento foi parado a menos que as membranas vasculares extra-embrionárias tenham sido expostas à atmosfera na câmara.

-33A ligação dos sistemas I a II a III, para suportar o crescimento do embrião de galinha em cultura desde uma fase imediatamente após a fertilização até à saída da casca é em si própria um novo processo. Esta é a primeira publicação de um sistema de cultura completo para o embrião aviário (Perry, 1988).

estabelecimento de um sistema in vitro completo para o embrião de galinha tem uma larga gama de potenciais aplicações em áreas de investigação básica e aplicada. Ele oferece a oportunidade de manipular o ovo aviário através, por exemplo da injecção de genes estranhos ou de genomas completos e de investigar os efeitos de tais manipulações no pinto saído da casca e provávelmente na ave madura. Os métodos também dão orientação para o planeamento de técnicas in vitro para embriões oviductais em fases mais precoces e mais avançados do que as presentemente empregues, com aplicações nos campos da fertilização in vitro e da inserção de células totipotentes putativas no embrião.

Uma aplicação potêncial é na produção de aves de capoéira transgénicas. As modificações dos factores de rendimento de crescimento e reprodução serão benéficas para a indústria avícola. Ainda, a inserção de genes para novas proteínas na linha germinal aviária é uma técnica potêncialmente valiosa para a produção de proteínas biomédicamente importantes na clara do ovo. A elevada capacidade reprodutora da galinha doméstica dá-lhe uma vantagem relativamente a outros animais domésticos neste campo tecnológico. Uma galinha atinge a maturidade em 6 meses e é capaz de produzir cerca de 300 ovos no primeiro ano de postura.

Resumindo, foram projectados sistemas de cultura separados para as 3 fases do desenvolvimento,os embriões sendo transferidos de um sistema para o seguinte para cobrir toda a vida embrionária. Todo o projecto experimental e a ordem das técnicas estão apresentados de forma esque-

-34mática na Figura 1. O método exemplificado para a Fase III é um sistema discreto (Exemplo 1). O método exemplificado para a Fase II sobrepõe-se ao da Fase III (Exemplo 2), mas a transferência entre estes sistemas devera de preferência ser feita numa fase específica devido à maior fragilidade do embrião com a idade (Exemplo 3). 0 método para a Fase I cobre um período gue começa algumas 2 h após a ovulação, guando decorre a deposição de albumen e os pronúcleos macho e fêmea estão a aumentar de tamanho (Perry, 1987). Ele reguere a ligação com o método da Fase II para a sua análise (Exemplo 4) e subsequentemente, com o método para a Fase III para um sistema de cultura completo (Exemplo 5).

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Claims (11)

1. REIVINDICAÇÕES lã. - Processo para a cultura in vitro de embriões aviários durante a fase de crescimento embrionário, caracterizado por compreender a incubação de um embrião num recipiente fechado, existindo nele um espaço de ar acima do embrião, sendo o espaço de ar separado da atmosfera externa por um selo parcialmente permeável aos gases.
2. 2ã. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o recipiente ser parte de um ovo.
3. 3ã. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o ovo ser um ovo de galinha e por a profundidade do espaço entre o embrião e o selo ser de 5 a 15 mm.
4. 4ã. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o embrião incubado ser agitado suavemente, pelo menos inicialmente.
5. 5ã. - Processo para a cultura in vitro de um embrião aviário durante a morfogénese embrionária, caracterizado por compreender a incubação de um embrião num meio de cultura num recipiente impermeável a líquidos, fechado e com líquido dentro.
6. 6â. _ Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o recipiente ser parcialmente permeável aos gases .

   -397ã. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o meio de cultura ser albúmen líquido .
7. 8§. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por os embriões em cultura serem sujeitos a agitação suave a moderada.
8. 9§. - Processo para a cultura in vitro de um embrião aviário durante a morfogénese embrionária e durante a fase de crescimento embrionário, caracterizado por compreender primeiro a cultura do embrião por um processo de acordo com a reivindicação 5 e subsequentemente a cultura do embrião por um processo de acordo com a reivindicação 1.

   lOâ. - Processo para a cultura in vitro de um embrião aviário até à formação da blastoderme, caracterizado por compreender a cultura de um óvulo fertilizado, tendo uma cápsula envolvente de albumen denso, parcialmente submerso em meio de cultura.

   llâ. - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o meio estar geralmente em linha com o disco germinal.
9. 12â. - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o meio de cultura ser albumen líquido que pode ser diluido com água e/ou uma solução salina.
10. 13§. - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por se efectuar num recipiente fechado .

    -4014ã. - Processo para a cultura in vitro de um embrião aviário até à formação da blastoderme e durante a morfogénese embrionária, caracterizado por compreender a cultura de um embrião aviário por meio de um processo como reivindicado na reivindicação 10 e subsequentemente a cultura do embrião por um processo como reivindicado na reivindicação 5 .
11. 15ã. - Processo para a cultura in vitro de um embrião aviário até à formação da blastoderme, durante a morfogénese embrionária e durante o crescimento embrionário até à saída da casca, caracterizado por compreender a cultura de um embrião aviário, por um processo como reivindicado na reivindicação 10, subsequentemente a cultura do embrião por um processo como reivindicado na reivindicação 5 e subsequentemente a cultura do embrião por um processo como reivindicado na reivindicação 1.