DK175847B1 - Fremgangsmåde til dyrkning af embryoner in vitro - Google Patents

Description

DK 175847 B1 i

Den foreliggende opfindelse angår en in v/tro-teknik til dyrkning af aviære embryoner, hvilken teknik især er egnet til anvendelse til fjerkræ, særligt høns.

I de indledende trin af dets udvikling fra befrugtning til deling har kyllingeembry-5 onet ikke været udsat for eksperimentel indgriben på grund af æggets volumen, skrøbelighed og relative utilgængelighed. Dette problem har været drøftet i nylige review-artikler, der omhandler mulige overføringsmåder for exogene gener til fugle (Freeman og Messer, 1985; Crittenden og Salter, 1986). Perry (1986a,b) har antaget et alternativt synspunkt og foreslår, at genetisk manipulation af det aviære 10 æg er praktisk mulig. Målet med at anvise et fuldstændigt dyrkningssystem for kyllingeembryonet var at tilvejebringe en måde, hvorpå det manipulerede æg kunne udvikle sig til modenhed. Der er nu blevet tilvejebragt en fremgangsmåde til in vitro-dyrkning til et mellemtrin i embryonudviklingen, og der gøres fremskridt på baggrund af dette. Teknikken vil ikke blot kunne anvendes inden for genetisk 15 manipulation af fjerkræ, men også til undersøgelse af grundlæggende mekanismer i den aviære udvikling og i studiet af skadelige træk. Derudover vil den være et ønskeligt alternativ til kirurgisk indgriben i læggehønen.

Kyllingeembryoner skabes i kimskiven, der er et lille cytoplasmaområde, der er 20 beliggende i æggets dyrepol (den velkendte blomme). Under den første tredjedel af dets udvikling forbliver embryonet flydende ved blommens overflade, medens de ekstra-embryone membraner vokser rundt om blommen og bliver vaskulariseret. I den tilbageværende udviklingsperiode vokser embryonet på bekostning af fødere-serverne i ægget. I nærværende sammenhæng er kyllingens udvikling blevet ind-25 ledt i tre faser efter de skiftende behov på forskellige trin fra befrugtning til udklækning.

Fase I. Befrugtning til blastodermdannelse.

30 Denne fase finder sted i æggelederen og afsluttes ved æglægning. Gametinterak-tion finder sted inden for 15 minutter efter ægløsning og den første deling godt 4 timer senere (Perry, 1987). I de efterfølgende 20 timer fører efterfølgende delinger til et enkelt cellelag, der ligger over en subbiastodermal cavitet (Kochav, Ginsburg og Eyal-Giladi, 1980). Under æggets passage gennem æggelederen 35 forsynes det med albumin i magmaet, derefter med skalmembranen i isthmussen,

DK 175847 B1 I

hvor spaltning begynder. 1 uterusen fordobles albuminvolumenet ved absorptionen I

af livmodervæske (pumpevæske), og til sidst undergår skallen langsomt forkalk- I

ning. For høner, der i lange perioder lægger ét æg pr. dag, efterfølges æglægning- I

en af den næste ægløsning inden for 15-30 minutter, og cyklussen gentages. I

Fase II. Embryonmorfogenese. I

Denne fase finder sted i æggets første 3 inkubationsdage (trin 1-18, Hamburger og I

Hamilton [1951]). 1 trin 20 er embryonet 10 mm langt, og det ekstra-embryone I

10 blastoderm strækker sig rundt om blommen til dens ækvator. I

Fase III. Émbryonvækst. I

Denne fase finder sted i æggets sidste 18 inkubationsdage (trin 18-45, Hamburger I

15 og Hamilton [1951]). I

Adskillige fremgangsmåder til korttidsdyrkningen af embryoner i fase II (New, I

1966) og til langtidsdyrkningen af mere udviklede embryoner (Dunn, Fitzharris og I

Barnett, 1981; Ono og Wakasugi, 1984; Rowlett og Simkiss, 1985, 1987) er til- I

20 gængelige. Nogle omfatter transplantation af embryonet fra blommen, medens

andre omfatter overførelse af embryonet og den intakte blomme til en dyrknings- I

beholder. Den sidstnævnte fremgangsmåde tilvejebringer de mest favorable be- I

tingelser for langtidsdyrkning og anvendes udelukkende i det foreliggende dyrk- I

ningssystem. I

25 I

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til in wtro-dyrkning af et I

aviært embryon frem til blastodermdannelse, hvilken fremgangsmåde er ejen- I

dommelig ved, at et befrugtet æg, der har en omgivende kapsel af vægtfyldigt I

albumin, dyrkes delvis neddykket i dyrkningsmedium, hvor mediet generelt er i

30 niveau med kimskiven. Kimskiven vil sædvanligvis være øverst, men under albu- I

minkapselniveauet. I

Det befrugtede æg kan opnås kirurgisk fra hønen. Hvis kirurgiske teknikker an ven- I

des, tages ægget fortrinsvis fra magnummidten, fx fra 50 til 150 mm fra isthmu- I

35 sen. Det har vist sig at være fordelagtigt at udtage et befrugtet æg fra dette om- I

DK 175847 B1 3 råde af magnaet, idet det befrugtede æg dér synes at have en optimal tykkelse af den omgivende kapsel af vægtfyldigt albumin.

Dyrkningsmediet kan være flydende albumin, der kan fortyndes med vand og/eller 5 en saltopløsning. Det foretrækkes sædvanligvis at dyrkningen indledes med fortyndet albumin (fx 3:2) med saltopløsning og derefter (fx efter 1 dag), at albuminet fortyndes med saltopløsning (fx 2:1).

En fremgangsmåde ifølge dette aspekt af opfindelsen udføres fortrinsvis i en lukket 10 beholder. Beholderen kan være fremstillet af et impermeabelt materiale såsom glas, der kan være forseglet med en film, der har lav gaspermeabilitet, såsom SARAN WRAP (varemærke). Et hvilket som helst andet materiale med SARAN WRAP'S passende egenskaber kan anvendes. Materialets egnethed til anvendelse som forsegling kan måles indirekte ved at måle carbondioxid- og/eller vanddamp-15 permeabilitet; carbondioxidpermeabilitet kan måles ved at analysere albuminets pH-stigning efter 24 timers inkubation ved 38°C i i andre henseender impermeable beholdere. Albuminet bør indledningsvis behandles med carbondioxidgas for at sænke pH’en 1,0. pH-stigningen i løbet af 24 timer kan være fra 0,5 til 1,0, fx fra 0,6 til 0,8, i carbondioxid-permeabilitetstesten. Vanddamppermeabiliteten kan 20 være fra 1,0 til 10, fx 2 til 5, mg/cm2/24 timer.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan efterfølges af andet trin som omfatter, at et aviært embryon dyrkes under embryonmorfogenese, hvilken fremgangsmåde omfatter, at et embryon inkuberes i et dyrkningsmedium i en lukket beholder, der 25 er fyldt til randen med væske, hvor beholderen og forseglingen er væskeperme-able, men delvist gaspermeabel.

Dyrkningsmediet er fortrinsvis flydende albumin, der kan være opsamlet fra frisk-lagte æg.

30

Den delvist gaspermeabfe beholder kan omfatte en æggeskal (sædvanligvis sammen med den indre skalmembran) og kan være forseglet med en delvist gaspermeabel forsegling. Det bør bemærkes, at æggeskallen og den indre skalmembran er delvis gaspermeabel.

! 35

DK 175847 B1 I

Den ene ende af ægget er fjernet. Ved det foreliggende aspekt er det fortrinsvis

den spidse ende, der fjernes, fx med et 32 mm hul. Dette sikrer tilstedeværelsen af I

et luftrum mellem den ydre skalmembran og den indre skalmembran; dette fore- I

kommer at være fordelagtigt, idet luftrummet ekspanderer under dyrkningen for at

5 godtgøre det vand, der mistes ved fordampning. I

Hvis der anvendes en forsegling til at lukke et æg, fra hvilket den spidse ende er I

blevet fjernet, kan ægget dyrkes i en stort set vandret position, når forseglingen er I

på den ene side. Forseglingen bør holdes solidt på plads imod æggeskallen. I

10 I

Forseglingen er fortrinsvis i form af en film. Forseglingen kan være af et plast- I

materiale, fx polyethylen. Det har vist sig at kommercielt tilgængelige klæbefilm I

("clingfilm") danner en passende forsegling, især når de anvendes i to lag. Et I

hvilket som helst andet materiale, der har klæbefilmens passende egenskaber, kan

15 anvendes. I

Det foretrækkes i særdeleshed, at de dyrkede embryoner underkastes blid til mo- I

derat omrystning. Afbrudt eller kontinuert vugning, fx gennem en vinkel på 90° i I

cyklusser på én time eller andre sammenlignelige intervaller foretrækkes. I

20 I

En fremgangsmåde ifølge dette aspekt af opfindelsen vil sædvanligvis begynde ca. I

1 dag efter befrugtning (dvs. omkring det normale læggetidspunkt) og kan vare i 2 I

eller flere dage, fx op til 8. Det foretrækkes imidlertid, at en fremgangsmåde ifølge I

dette aspekt af opfindelsen kun fortsættes i størrelsesorden 3 eller 4 dage, før em- I

25 bryonet overføres til en fremgangsmåde ifølge et tredje trin. I

Som angivet ovenfor kan fremgangsmåden også omfatte et tredje trin til in vitro- I

dyrkning af et aviært embryon under den embryone vækstfase, hvilken fremgangs- I

måde omfatter, at embryonet dyrkes i en lukket beholder, hvor der er et luftrum I

30 over embryonet, hvor luftrummet er adskilt fra den ydre atmosfære med delvist I

gaspermeabel forsegling. I

De foretrukne træk ved forseglingen er de samme som nævnt ovenfor. I

5 DK 175847 B1

Gaspermeabiliteten kan måles (fx for carbondioxid og/eller vanddamp) som beskrevet ovenfor. En pH-stigning på fra 0,5 til 1,5 er generelt anvendelig, hvor det foretrukne interval er fra 0,5 eller 0,7 til 1,0 eller 1,3, fx ca. 0,9. Vanddamp-permeabilitet kan være fra 5 eller 10 til 30 eller 40 mg/cm2/24 timer.

5

Beholderen er fortrinsvis en del af et æg, som normalt vælges fra den samme art, som den, der dyrkes. Der foretrækkes derfor til kyllingeembryoner et hønseæg.

Det har vist sig at være særligt hensigtsmæssigt at fjerne den stumpe ende fra et helt æg; et hul med en diameter på 40 mm centreret på æggets akse har vist sig 10 at være særligt velegnet.

Hullet i den stumpe ende af ægget forsegles med den delvist gaspermeable forsegling. Forseglingen kan bringes til at adhærere til æggeskallen ved hjælp af albumin. Permeabilitetskarakteristikaene er fortrinsvis i lighed med dem, der fås 15 fra et naturligt æg.

Der kan være dyrkningsmedium i nogle udførelsesformer af dette aspekt af opfindelsen, især hvis tidligere dyrkningsstadier er blevet foretaget in vitro, men fremgangsmåden kan udøves uden dette, fx når de tidligere dyrkningsstadier er 20 blevet udført naturligt. Kulturmediet, når det forekommer, vil normalt omfatte albumin, enten ufortyndet eller i en fortyndet form, hensigtsmæssigt inter-uterinvæske.

Når der anvendes hønseæg, foretrækkes det, at dybden af rummet mellem 25 embryonet og forseglingen er fra 5 til 15 mm, fx ca. 10 mm.

Det foretrækkes at omryste det inkuberede embryon blidt, i det mindste indledningsvist. Blid omrystning kan opnås ved afbrudt vugning, fx gennem en vinkel på 30°. Almindelig inkubationstemperatur, fx ca. 38°C, kan opretholdes.

30

Det tredje trin i in v/tro-dyrkningsfremgangsmåden er egnet til anvendelse fra ca. dag 4 (regnet fra befrugtning) til udklækning, der normalt finder sted omkring dag 22. Det foretrækkes imidlertid, at der ikke er nogen omrystning de sidste få dage (fx 13) af det embryone liv. Derudover foretrækkes det, at forseglingen perforeres 35 kort tid før (fx 1-2 dage før) det estimerede udklækningstidspunkt for at lade en

I DK 175847 B1 I

I 6 I

I vis mængde luft komme ind i beholderen. Yderligere luft kan lades ind senere, fx I

I ved at fjerne forseglingen og eventuelt dække hullet i æggeskallen (når ægget H

I udgør beholderen) med en fast skive, der kan være en petriskål. H

I 5 Det foretrækkes, at skiftet sker mellem 2 og 5, fx 4, dage efter befrugtning. I

I Under anvendelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen til dyrkning af et aviært I

I embryon op til blastodermdannelse efterfulgt af det andet og tredje trin til dyrkning H

I under den embryoniske morfogenese og de embryoniske vækststadier er det mu- I

I 10 ligt at dyrke et aviært embryon in vitro fra befrugtning til udklækning. I

I Det vil sædvanligvis foretrækkes, at recipientæggene i det andet trin, hvis æg an* I

I vendes som beholdere, er lidt større end donoræggene, fx med en mængde pi 1-2 I

I ml. Hvis æg anvendes som beholdere i det tredje trin, er recipientæggene fortrins- I

15 vis væsentligt (fx ca. 18 ml) større end de, der anvendes i det umiddelbart forud- I

I gående trin. I

I For bedre at kunne forstå den foreliggende opfindelse og for at vise, hvorledes den I kan anvendes, vil forskellige udførelsesformer nu beskrives under henvisning til de

I 20 følgende tegninger, hvor: I

I Fig. 1 viser en oversigt over dyrkningssystemer for kyllingeembryoner, hvor udvik- I

I lingsperioderne, der er dækkede af individuelle og forbundne systemer, er anført; I

I 25 Fig. 2 illustrerer et nylagt hønseægs struktur (fra Dawes, 1975); I

I Fig. 3 er et diagram af et dyrkningssystem til fase III (dag 4 til udklækning); I

I Fig. 4 er et diagram af et dyrkningssystem til fase II (dag 1 til dag 4 eller dag 9); I

I 30 og I

Fig. 5 er et diagram af et dyrkningssystem til fase I (befrugtet æg til dag 1). I

I Der vil nu blive givet forskellige eksempler på opfindelsen. I eksemplerne anvendes I

I 35 de følgende materialer, medmindre andet er angivet. I

7 DK 175847 B1

De dyrkede embryoners overlevelsesgrad er angivet i tabel 1.

TABEL 1 5

Overlevelsesgrader af kyllingeembryoner, der er dyrket i specificerede tidsperioder i dyrkningssystemer, der er egnede til bestemte udviklingsfaser fra 2 timer efter befrugtning (dag 0) 10 Antal overlevende

Dyrknings- Antal dyrkede embryoner eller Udviklingsperiode systemer embryoner kyllinger (%) 15 Dag 4 til udklækning III 69 25 (36)

Dag 1 til dag 8 II 47 35 (74)

Dag 1 til udklækning II til III 59 16 (27)

Dag 0 til dag 7 I til II 35 23 (67)

Dag 0 til udklækning I til II til III 96 8 ( 8) 20

Dyr.

Læggehøns af en kommerciel Warrens-stamme (Isa Brown) blev opbevaret i individuelle bure og holdt i en 14 timers lys/24 timer-cyklus. 28-32 uger gamle, når de 25 i lange perioder lagde 1 aeg/dag, blev de kunstigt insemineret med friskisoleret sæd fra Rhode-Island-Red-hanekyllinger.

Frugtbarhed blev regelmæssigt efterprøvet ved visuel inspektion af ikke-inkube-rede æg og blev fundet at være bedre end 90%. I befrugtede æg ses kimområdet 30 som en hvid ring (3-4 mm i diameter), der indeslutter et semi-transparent område, og i ubefrugtede æg fremstår det som en vakuoleret skive (2-3 mm i diameter).

Æg.

Æg lagt i de forudgående 24 timer af læggestammen blev anvendt som embryon-35 kilde til dyrkningssystemer II og III (eksempler 1-3). Frisklagte æg (befrugtede og

DK 175847 B1 I

ubefrugtede) fra denne stamme blev også anvendt som albuminkilde til dyrk- H

ningsmediet. Flydende albumin blev opsamlet fra æggets indre og ydre albuminlag H

(fig. 2) og blev anvendt inden for den samme dyrkningsdag. Recipientskaller til I

dyrkningssystem II (eksempler 2-5) var fra læggestammen. De større skaller, der I

5 blev anvendt som dyrkningskar i system III (eksempler 1, 3, 5) var fra toblomme- I

de æg fra en kommerciel slagtekyllingestamme fra et lokalt hønseri (D.B. Marshall, I

Whitburn, West Lothian), som blev anvendt til dyrkning inden for en periode på 1-2 I

uger fra lægning. I

10 Indpakningsfilm. I

To slags plastindpakning blev anvendt til forsegling af dyrkningskarrene. SARAN H

WRAP (Dow Chemical Company) har lav gaspermeabilitet (Dunn, Fitzharris & I

Barnett, 1981) og var mest egnet til system I. Klæbefilm (et hvilket som helst I

mærke bortset fra at de, der mangler PVC-additiver, foretrækkes) er delvis perme- I

15 able over for gasser (Dunn et al., 1981) og blev anvendt til systemer II og III. Per-

meabilitetstests blev udført på de indpakningsfilm, der anvendes for tiden, under H

de betingelser, der anvendes til inkubation af de dyrkede embryoner. C02-permea- H

biliteten blev bestemt indirekte ved at måle dyrkningsmediets pH-stigning (flyden-

de albumin:saltopløsning, 2:1) i glaskrukker (60 ml; diameter 40 mm) indehol- I

20 dende 25 ml medium og forseglet med indpakningsfilm. Dyrkningsmediet blev ind- H

ledningsvis gasset med C02 for at sænke pH’en til en passende værdi. Med SARAN H

WRAP (1 lag) steg pH'en med gennemsnitligt 0,7 enheder, fra pH 7,2-7,5 til pH I

7,8-8,2, i løbet af 24 timers inkubation ved 41,5°C og fugtighed 0. Med klæbe-film H

(2 lag) steg pH’en med gennemsnitligt 1,0 enhed, fra pH 7,2-7,5 til pH 8,3-8,5, i I

25 løbet af 24 timers inkubation ved 38°C og relativ fugtighed 45-55%. Permeabili- I

teten for vanddamp blev bestemt ved at måle vandtabet fra skåle (350 ml; dia- I

meter 104 mm) indeholdende 150 ml vand. Skålene blev forseglet med indpak- I

ningsfilm og inkuberet som beskrevet ovenfor. Med SARAN WRAP var middelper- I

meabiliteten 3,4 mg/cm2/24 timer (område, 3,2-3,8 mg). Med klæbefilm var mid- I

30 delpermeabiliteten 22 mg/cm2/24 timer (område, 15-28 mg). H

Inkubation. H

Et antal ventilerede, kabinetmodelsinkubatorer med automatiske omdrejnings- H

mekanismer (CURFEW Model 248) blev anvendt til dyrkning af embryonerne. Tem- H

35 peratur-, fugtigheds- og hældningsvinkelforhold for bakkerne i hver inkubator blev I

9 DK 175847 B1 indstillet for at opfylde behovene i bestemte perioder af embryonudvikling. Kulturerne blev overført fra én inkubator til den næste på passende tidspunkter og blev efterset med intervaller på ikke mindre end 2 eller 3 dage. I perioden forud for og umiddelbart efter udklækningen blev kulturerne placeret i en table-top, stillestå-5 ende luftinkubator (CURFEW Model 146), der var udstyret med et transparent låg for at tillade hyppig inspektion. Fugtigheden blev holdt på et givent niveau, målt med Fischer-hår-hygrometre (Gallenkamp) under anvendelse af skåle (2 liters kapacitet) med vand, der var placeret på inkubatorernes bund. Maskinerne blev renset og desinficeret månedligt med MILTON’s steriliserende væske (Richardson- 10 Vicks Ltd.).

Sterilitet.

Alle forsøg blev udført under semisterile betingelser. Albuminets bakteriostatiske egenskaber gjorde det unødvendigt at arbejde under strengt aseptiske betingelser.

15 Kort tid efter opsamling blev æg hurtigt renset med 70% alkohol og derefter overstrøget med 70% alkohol umiddelbart før brug. Alt udstyr, destilleret vand og saltopløsninger blev autoklaveret. Saltopløsningerne blev sterilfiltreret. Hvad angår indpakningsfilmen blev de yderste lag af filmrullen kasseret, derefter blev der udskåret stykker (100 mm2), der blev placerét mellem ark af sterilt papir. Dette 20 forsøgstrin, opsamling af albumin og fremstilling af kulturerne blev udført i ren-luftsluftkabinetter. Antibiotika (penicillin 100 pg/ml; streptomycin 100 μς/ιτιΙ) blev sat til det albumin, der blev anvendt til at lime klæbefilmlukningen til recipientskallerne i system III.

25 Eksempel 1

Dyrkning af embryoner fra udviklingsdag 4 til udklækning. Fremgangsmåde for dyrkningssystem III

30 Recipientskaller blev fremstillet ud fra toblommede æg. Rundt om æggets stumpe ende blev der udboret en cirkel med en diameter på 40 mm, og skallens top indeholdende luftcellen blev fjernet. Efter at indholdet var kasseret, blev skallen renset med destilleret vand, derefter genfyldt med vand for at forhindre dehydrering af den indre skalmembran. Recipientskallernes volumener strakte sig fra 65 til 75 ml.

35 3 dages inkuberede æg indeholdende embryoner i trin 15-20 blev slået i stykker,

DK 175847 B1 I

og indholdet blev hældt i en flad skål, der var foret med klæbefilm. Embryonerne H

blev overfort til recipientskallerne i klæbefilmposen, derefter blev klæbefilmen H

langsomt fjernet, idet embryonerne blev bevaret øverst. Denne overføringsmådes H

detaljer er illustreret i en rapport af Rowlett og Simkiss (1987). Skallen blev for- H

5 seglet med to lag klæbefilm, idet flydende albumin blev anvendt til at klæbe filmen H

til skallen (fig. 3). Rummet mellem embryonet og filmen havde en dybde på gen-

nemsnitlig 10 mm. H

Kulturerne blev inkuberet ved 38°C og blev ind imellem vugget igennem en vinkel H

10 på 30° i 5 dage, hvorefter de blev holdt i en stillestående stilling i 10 dage. 1 de H

sidste 3-4 dage blev de placeret i en stationær udklækningsinkubator ved 37°C. H

Den relative fugtighed var i området fra 45-60%. 1-2 dage før den estimerede H

udklækningstid, hvor næbbet var brudt gennem den chorioallantoine membran og H

havde gennemtrængt luftrummet, blev der lavet små perforationer i klæbefilmen. H

15 Klæbefilmen blev erstattet med et låg fra en petriskål adskillige timer før udklæk- H

ning. H

Udklækningsgraden var 36% (tabel 2), og 72% af udklækningerne forekom raske.

Deres middelvægt var 35 g sammenlignet med 46 g for kontrolkyllinger, der var H

20 udvokset i æg. Svæklingernes abnormaliteter omfattede ufuldstændigt tilbage- H

trukne æggeblommesække, ikke-helede navler og defekte lemmer. Klæbrige kyl- I

linger var almindelige, idet den tilstand var forbundet med nærværelsen af noget I

ikke-absorberet albumin i skallen. H

25 TABEL 2 I

Kyllingeembryoners overlevelsesgrader i intervaller efter overførelse til recipient- H

skaller på tredje dagen af inkubationen i ægget. Dyrkningssystem III.

DK 175847 B1 n

Antal inkubationsdage Antal levende Levende embryoner/ fra æglægning embryoner total kultur (%) 5 3 69 9 48 69 14 39 57 18 32 46 21 27 39 10 Udklækket 21-22 25+ 36 + Antallet af udklækkede kyllinger omfattende raske kyllinger og svæklinge.

15 Ono og Wakasugi (1984) anviste en skalteknik til dyrkning af vagtelembryoner stammende fra æg, der var inkuberet i 3 dage; de påviste, at æggeskallen var en essentiel kalciumkilde for embryonet. Rowlett og Simkiss (1985, 1987) tilpassede teknikken til tamhøns og opnåede en udklækningsgrad på 20%. Det lader til, at den chorioallantoine membrans funktion ved kalciumabsorption og gasudveksling 20 ikke blev svækket af stamme- eller artsforskelle mellem donorembryon og værtsskal.

Rotation af kulturerne under den første inkubationsdel er blevet anbefalet af Rowlett og Simkiss (1987). Selvom det er almindelig praksis at rotere hønseæg 25 under hele inkubationen, viste New (1957), at den kritiske periode er i den tredje til den ottende inkubationsdag. Ved en række forsøg er det nu blevet bekræftet, at drejning af kulturerne er nødvendig for at opnå en optimal udvikling, og det er vist, at denne bevægelse kun behøver at blive benyttet i løbet af kulturernes første 5 inkubationsdage (udviklingsdage 4-9). I de udførte forsøg gav udrejede kulturer en 30 udklækningsgrad på 18% (n=77) sammenlignet med en grad på 36% (tabel 2) for kulturer, der var blevet roteret i 5 dage og derefter holdt i en ubevægelig stilling. Forlængelse af rotationstidsrummet til 15 dage resulterede i dårligere udklækningsevne. Udklækningsgraderne, angivet som procentdel af levende embryoner på udviklingsdag 9, var 62% (n=33) for de kulturer, der kun var blevet roteret i de 35 første 5 dage, og 40% (n=71) for de kulturer, der var blevet roteret i 15 dage.

12 I

DK 175847 B1 I

Der blev anvendt klæbefilmsforseglinger til recipientskallerne i stedet for de løst- I

siddende låg, der anvendes af andre fagmænd. En fordel ved denne modifikation I

er, at standardinkubationsbetingelser for æg (et ventileret luftsystem, R.H. 50- I

5 60%) kan anvendes, således at det område, hvor chorioallantoinmembranen er I

forbundet med recipientskallen, er udsat for et normalt miljø. Ved høj fugtighed, I

større end R.H. 70%, blev udklækningsgraden reduceret til 10% (n=38). Klæbefil- I

men kan være virkningsfuld i regulering af miljøet i rummet oven over embryonet I

ved at begrænse gasudveksling og vandtab fra denne del. I æggets fuftcelle er I

10 vanddamptrykket højere end det omgivende tryk, og Opspændingen falder, mens I

C02-spændingen stiger med inkubationstiden (Wangensteen og Rahn, 1970/71). I

Indpakningsfilm, der er delvis gaspermeabel, har vist sig at tilvejebringe optimale I

betingelser for kyllingeembryoners udvikling i skalløse kulturer (Dunn et al., 1981). I

15 I forsøg med uforseglede skaller er kulturerne blevet inkuberet ved høj fugtighed, I

I vagtler i 1,5% C02 (Ono og Wakasugi, 1984) og kyllinger i luft (Rowlett og I

I Simkiss, 1987). Den sidstnævnte undersøgelse antyder, at opretholdelsen af et I

02/C02-differentiale med luft i dyrkningskarret er mindre betydningsfuld for normal I

udvikling af kulturen end undgåelse af vandtab fra den ubeskyttede chorioallan- I

I 20 toinmembran, der vender ud mod luftrummet. I nærværende eksempel anvendtes I

I et dobbelt lag klæbefilm, idet få embryoner overlevede til dag 19 i skaller, der var I

H forseglet med et enkelt filmlag, under visse omstændigheder. En anden fordel ved I

I klæbefilm er, at den er medvirkende til at reducere kontaminering med mikroorga- I

nismer. I

I 25 I

Eksempel 2 I

Dyrkning af embryoner fra udviklingsdag 1 til 9. I

Fremgangsmåde for dyrkningssystem II I

I 30 I

Æg, der var 3-4 g tungere end donoræggene, blev udvalgt til recipientskaller. Der I

blev boret et hul med en diameter på 32 mm i skallens spidse ende, og indholdet I

blev kasseret. Skallerne blev renset med destilleret vand, derefter genfyldt med I

vand for at forhindre udtørring af den indre skalmembran. Med en saks blev der I

H 35 lavet et hak i et ikke-inkuberet befrugtet ægs skal, med hånden blev skallen brudt I

13 DK 175847 B1 op og indholdet hældt i en glasskål (diameter 50 mm; volumen 60 ml). Det blev derefter overført til en recipientskal via et bæger (diameter 35 mm; volumen 70 ml). Denne fremgangsmåde sikrede, at der påførtes minimal skade på blastoder-met, blommen og den viskøse albuminkapsel. Skallerne blev fyldt til randen med 5 flydende albumin (1-5 ml), der var opsamlet fra frisklagte æg, og åbningen blev forseglet med et lag klæbefilm, idet der blev draget omsorg for at undgå indeslutning af luftbobler i præparationen. Klæbefilmen blev fastholdt i sin stilling af 2 ringe (nylon), der var placeret over hver af skal-enderne og sikret med elastikbånd, der sad rundt om et par små stifter (fig. 4). De rekonstruerede æg blev inku-10 beret på siden, og vugget afbrudt eller kontinuert gennem en vinkel på 90° i perioder på 1 time ved 38°C og relativ fugtighed på 30-50%. Kulturerne blev gennemlyst efter 7, 9 og 10 dages inkubation, og de overlevende embryoner blev geninkuberet. I 74% af kulturerne blev der på syvende inkubationsdag observeret embryoner udvisende normal udvikling (tabel 3). Dødelighed var høj i de følgende to 15 dage og kun ét embryon overlevede ud over den tiende dag. I alle præparationerne var luftcellen ved skallens stumpe ende ekspanderet for at erstatte det vandtab, der skyldtes fordampning.

TABEL 3 20

Overlevelsesgrader af kyllingeembryoner ved forskellige intervaller efter overførelse fra ikke-inkuberede æg til recipientskaller. Dyrkningssystem II

25 Antal inkubationsdage Antal levende Levende embryoner/ fra æglægning embryoner totale kulturer (%) 0 47 30 6 39 83 7 35 74 9 15 32

I DK 175847 B1 I

I i

I Callebaut (1983) har beskrevet en fremgangsmåde til dyrkning af vagtelembryoner I

I i recipientæggeskaller i 2-3 dage (data blev ikke opgivet). Teknikken bestod i at I

I overføre et befrugtet donorægs indhold til en tom værtsskal, derefter at forsegle I

I præparationen med en petriskål og smeltet paraffinvoks. For kyllingeembryoner er

5 denne fremgangsmåde blevet forbedret ved at anvende klæbefilm som forsegling I

I og at rotere præparaterne i løbet af inkubationen. I forsøg med stationære kulturer I

I var overlevelsesgraden 50% efter 7 dage, og disse embryoner var sædvanligvis

I retarderede i udviklingsmæssig alder. I forsøg på at fremdrive dag-1-embryoner i I

dyrkningssystemer 1 og III, der indeholdt et luftrum, viste det sig, at dødeligheden I

I 10 var stor i løbet af den anden til den tredje inkubationsdag. Dunn et al. (1981) har I

gjort lignende observationer i deres skalløse dyrkningssystemer. Uheldigt udvik- I

I lingsmæssigt udfald i disse systemer kan måske henføres til den kendsgerning, at I

blastodermet kun er dækket af et tyndt albuminlag. Romanoff (1943) har under- I

H streget betydningen af neddykning i flydende albumin for blastodermudviklingen i I

I 15 hele æggeblommer. Den kontinuerte badning af blastodermområdet med flydende I

albumin, en tilstand, der opnås i en skal, fra hvilken luft er udelukket, kan hjælpe I

med til dannelsen af den subblastoderme cavitet. Denne cavitet bliver fyldt med I

væske, der stammer fra albuminet, under den tidlige udvikling (New, 1956). I

Fremgangsmåden svækkes formodentlig i præparationer, der mangler tilstræk- I

I 20 kelige albuminmængder i nærheden af embryonet. I

Callebaut's (1983) dyrkningssystem for vagtelembryoner er blevet modificeret i I

dette eksempel, blandt andet ved at substituere petriskålen/paraffinvoksforseg- I

H lingen med klæbefilm, ved at rotere kulturerne i løbet af inkubationen og ved at I

I 25 tilpasse det til kyllingeembryoner. Modifikationerne forøgede kulturudviklingen med I

4 dage og resulterede i en høj overlevelsesgrad. I

I Eksempel 3 I

30 Dyrkning af embryoner fra udviklingsdag 1 til udklækning. I

Fremgangsmåder for dyrkningssystemer II til III I

Embryoner fra ikke-inkuberede æg blev dyrket i 3 dage som beskrevet i eksempel I

2 (fig. 4). Præparationerne blev derefter én efter én fjernet fra inkubatoren, der I

35 blev lavet et hak i skallen, og indholdet blev overført til en større skal som beskre- I

15 DK 175847 B1 vet i eksempel 1 (fig. 3). Forsøg på at fjerne den lille skals indhold gennem det eksisterende hul beskadigede ufravigeligt embryonet og de ekstraembryone membraner. Kulturerne blev inkuberet som beskrevet i eksempel 1.

5 Overlevelsesgraderne er angivet i tabel 4.

TABEL 4.

Overlevelsesgrader af kyllingeembryoner ved forskellige intervaller efter overførel-10 se fra ikke-inkuberede æg til små recipientskaller og efter 3 dage til større recipientskaller. Dyrkningssystemer II til 111.

Antal inkubationsdage Antal levende Levende embryoner/ fra æglægning embryoner totale kulturer (%) 15 _ 0 59 3 55 93 9 34 58 14 28 47 20 18 21 36 21 17 29

Udklækning 21-22 16+ 27 25 4 Antallet af udklækkede kyllinger omfatter raske fugle og svæklinge.

Tabene i den tidlige del af inkubationen blev opgjort som embryoner, der ikke udviklede sig i system II, og embryoner, der blev beskadigede under overførelsen til system III. Dødeligheden mellem den tredje og niende dag skyldtes sandsynligvis 30 også beskadigelse under overførelsen. Udklækningsgraden var 27% og, som beskrevet i eksempel 1, udviste ca. 20% af de udklækkede kyllinger ben- og blommesæksdefekter. Nogle nyfødte blev opfostret til modenhed og undersøgt for levedygtighed af gameterne. Udklækningsgraden for æg fra 2 forsøgshøns (æggeproduktionsgrader på henholdsvis 89% og 75%), kunstigt inseminerede fra Rhode-35 Island-Red-haner, var henholdsvis 63% og 80%. Udklækningsgraderne for æg fra

DK 175847 B1 I

Warren-høns, der var kunstigt inseminerede fra 2 forsøgshaner, var henholdsvis H

80% og 15%. To forsøgshøner lagde ikke æg.

I dyrkningssystem II gik udviklingen i stå ved udviklingsdag 8-10, og dette syntes I

5 at være forbundet med manglende kontakt mellem den chorioallantoine membran H

og den indre skalmembran. Ødelæggelsen af albuminstrengen i det rekonstruerede I

æg kan have påvirket æggeblommens flydeevne og dermed afstanden mellem de I

ekstraembryone membraner og skalmembranen, hvorved gasudvekslingsmekanis- I

men svækkes. For at overvinde dette problem blev embryonerne overført til et

10 system, i hvilket de vaskulære ekstraembryone membraner var i nærheden af I

luft/albumin-grænsefladen. Det mest hensigtsmæssige tidspunkt for overførelsen I

til dyrkningssystem III var hen mod den tredje inkubationsdags slutning, når ud- I

viklingen af vaskulaturet var undervejs, og de rekonstruerede bestanddele stadig M

var tilstrækkeligt robuste til at tåle behandlingen. Visse forsøg, i hvilke embryoner I

15 blev dyrket fra udviklingsdag 1 i stillestående skaller indeholdende et luftrum (fig. I

3), gav lave overlevelsesgrader og ingen udklækning (M. Naito, personlig kommu- I

nikation). I

Det trin, der forbinder system fase II med fase III, er en ny fremgangsmåde. Dette I

20 er første gang, at den succesfulde dyrkning af aviære embryoner fra blastoderm- I

trinnet (trin 1) til udklækning rapporteres. I

Eksempel 4 I

25 Dyrkning af befrugtede æg til dag 7. I

Fremgangsmåde for dyrkningssystemer 1 til II. I

Høner blev udtaget 2,75 timer efter det estimerede æglægningstidspunkt, idet man

havde sikret sig, at de lagte æg var befrugtede. På dette tidspunkt i den daglige I

30 forplantningscyklus har der fundet ægløsning sted for det næste æg, og det pas- I

serer gennem magnummet, hvor albuminet er aflejret. For at isolere embryonerne I

i æggelederen blev hønerne dræbt med en intravenøs injektion af natriumpento- I

barbiton (EXP1RAL, Ceva Ltd.), abdomenet blev rykket ud og penslet med 70%- I

alkohol. Den del af æggelederen, der indeholdt det befrugtede æg, blev taget ud af I

35 den abdominale cavitet, og det blev efter udskæring placeret i et sterilt kar inde- 17 DK 175847 B1 holdende papir, der var fugtet med saltvand. De fleste æg var placeret i en afstand på 50-150 mm fra grænsen mellem magnum og isthmus.

Der blev lavet en lang flænge i æggeledervæggen, og ægget gled ned i et glasbæ-5 ger (diameter 35 mm; volumen 70 ml), idet det blev undgået at skade den viskose albuminkapsel rundt om blommen. Æggene blev overført til glaskrukker (diameter 40 mm; volumen 60 ml) indeholdende ca. 5 ml dyrkningsmedium, og blommen blev manøvreret således, at kimskiven blev bragt øverst op. Der blev tilsat medium til et niveau, der var på linje med kimskiven, men under albuminkapslens overfla-10 de, og beholderen blev forseglet med SARAN WRAP, der var sikret med et elastikbånd (fig. 5). Det nødvendige totale mediumvolumen afhang af æggeblommens plus albuminkapslens størrelse og blev opgjort til 8-12 ml. For kulturer, i hvilke kimskiven lå ved siden af blommen, blev beholderne vippet for at sikre, at albuminkapslen oven over kimskiven ikke blev neddykket i medium. Præparaterne blev 15 inkuberet ved 41-42°C i 24 timer med en forsinkelse på ikke mere end 20 minutter mellem fjernelsen af ægget fra magnum og inkubation.

Dyrkningsmediet bestod af flydende albumin (2 dele), der var opsamlet fra frisk-lagte ægs indre og ydre albuminlag, og saltopløsning (1 del). Saltopløsningen inde-20 holdt 50 mM KHC03, 30 mM NaHC03, 10 mM KCI, 2,5 mM MgCI2.6H20, 0,7 mM CaCI2.2H20 og 11 mM glukose. Dyrkningsmediets pH blev sænket fra en startværdi på 8,4 til 7,2-7,4 ved omrøring i en C02-atmosfære og blev holdt på den lave værdi under de præparative fremgangsmåders forløb ved at opbevare mediet i forseglede beholdere.

25

Udviklingsstadiet efter 24 timer kan bedømmes groft ved visuel inspektion af kimområdet. Blastodermvækst og dannelse af en sub-blastoderm cavitet angives af en ugennemsigtig ring (3 mm i diameter), der omringer et semi-transparent område.

Til en præcis vurdering af udviklingsmæssig ydeevne blev præparaterne imidlertid 30 dyrket i yderligere 3-6 dage i system II.

Embryoner blev placeret i dyrkningssystemet for fase II som beskrevet i eksempel 2. Recipientskaller blev fremstillet fra æg, der var ca. 3-4 g tungere end de forudgående æg, der var lagt af donorhønsene. Kulturerne blev afkølet til omgivelses-35 temperatur og placeret i recipientskalleme, som derefter blev fyldt med dyrknings-

DK 175847 B1 I

medium (10-20 ml) og forseglet med klæbefilm (fig. 4). De rekonstruerede æg I

blev inkuberet på siden ved 38°C, R.H. 30-50%, med afbrudt vugning gennem H

en vinkel på 90“ i cyklusser på 1 time. Kulturerne blev fjernet fra skallerne til I

undersøgelse efter 7, 8 eller 9 inkubationsdage. I

Resultaterne er angivet i tabel 5. I

TABEL 5 I

10 Udvikling af befrugtede kyllingeæg isoleret fra magnum 2,75 timer efter de I

forudgående æg var lagt. Dyrkningssystemer I til II. I

15 Levedygtighed af embryoner på det

Antal embryoner angivne antal dages inkubation

Antal æg i trin 27-29 7 8 9 I

35 24 2/2 9/17 0/4 I

20 _ I

I Normale embryoner udvikledes til trin 27-29 i 67% af kulturerne. De overlevede I

ikke dette trin, idet de sædvanligt døde tidligt på den ottende inkubationsdag. I de I

tilbageværende kulturer var der enten ingen udvikling eller kun udvikling af et I

H 25 blastodermt cellelag eller et misdannet embryon (se tabeller 6, 7). I

I TABEL 6 I

Udvikling af befrugtede kyllingeæg dyrket i recipientskaller (system II) gennem I

30 hele inkubationen. Dyrkningssystemprøve for fase Γ. I

H 35 I

19 DK 175847 B1

Procentdel af kulturerne

Inkubation Levende Misdannede Blastoderm- Kim-5 Antal æg (dage) embryoner* embryoner vækst skiver 48 3-5 19 6 46 29 10 + I de første 24 timer blev de rekonstruerede æg placeret i forseglede plastposer og vugget gennem en vinkel på 90° i cyklusser på 1 time.

Derefter blev de inkuberet ved fremgangsmåden for system II.

15 * Embryonerne blev sat 12 eller flere timer tilbage i udviklingsmæssig alder.

TABEL 7

Udvikling af befrugtede kyllingeæg i dyrkningsmedium indeholdende flydende 20 albumin, ufortyndet eller fortyndet med saltopløsning eller vand alene. Dyrkningssystemprøver for faser I til II.

Procentdel af kulturerne 25 Antal Inkubation Normale Misdannede Biasto- Kim-

Medium æg (dage) embryoner+ embryoner derm vækst skiver

Ufortyndet 35* 6-7 51 17 29 3 30

Fortyndet: saltopløsning 90* 7-8 51 13 24 12 vand 17 7-8 59 18 0 23 35 ____

DK 175847 B1 I

Dødelighed var høj ved 7 dages inkubation i ufortyndet albumin H

og 8 dages inkubation i fortyndet albumin. H

5 * I disse præparater blev dyrkningsbeholdere for systemet for fase I

I forseglet med klæbefilm, og der blev placeret et lag klæbefilm H

direkte over albuminkapslen. I

Dyrkningssystemet for fase I var baseret på en række forsøg, der var H

10 konstrueret for at undersøge behovene for de første 24 timers udvikling. Forsøg I

blev udført på æg i forskellige trin efter befrugtningen og underkastet forskellige I

behandlinger før overførelse til standarddyrkningssystemet for fase II til yderligere I

udvikling og analyse. Aspekter af dyrkningssystemet, der blev undersøgt, var: I

tykkelsen af materiale, der lå over kimskiven, dyrkningsmediets sammensætning, I

15 gasudveksling og den rumlige placering af kimskiven. I

En vigtig faktor var tykkelsen af albumin oven over kimskiven. Æg, der var omslut- I

tet af relativt tynde albuminkapsler fra den forreste magnum eller i tykke albumin- H

kapsler fra den bageste magnum, gav lavere overlevelsesgrader end æg, der stam- I

20 mede fra den midterste del af magnum (50-150 mm fra isthmusen). Ægudvikling I

fra den midterste del af magnum blev standset, hvis albuminkapslen blev fjernet, I

idet kimskiven fik lov til at flyde op til mediets overflade. Udvikling blev også I

standset, hvis ægget, inklusive kapsel, blev neddykket i medium. I forsøg (tabel 6) I

med anvendelsen af system II (fig. 4) til dyrkningen af befrugtede æg var den I

25 mest sandsynlige årsag til uheldigt udviklingsmæssigt udfald neddykning af det I

indkapslede æg i dyrkningsmedium. I sådanne præparater, der var inkuberet med

den forseglede overflade øverst i de første 24 timer, varierede afstanden mellem H

kimskiven og klæbefilmsforseglingen og afhang af blommens flydedygtighed. I

30 Et nøjagtigt defineret dyrkningsmedium var ikke essentielt for udvikling i fase I.

Embryoner voksede godt i ufortyndet albumin i 6 dage til trin 25-26. Til udvikling I

ud over dette trin var det imidlertid nødvendigt at anvende fortyndet albumin I

(tabel 7). Sammensætning af saltopløsningen var baseret pi data givet af Beadle, I

Conrad og Scott (1938) og Leonard (1968) for forskelle i ionsammensætning i

35 albuminet fra æg i livmoderen før lægning og i albuminet fra lagte æg. Glukose I

DK 175847 B1 ! 21 i j blev tilsat i en koncentration, der svarer til livmodervæskens koncentration (Davidson og Draper, 1969) ved begyndelsen af ægdannelsens livmoderfase. I de rekonstruerede æg svarede den totale væskemængde (saltopløsning plus æglægningsvæske ("plumping fluid")) stort set til æglægningsvæskemængden i det lagte 5 æg. Æglægningsvæske indeholder ca. halvdelen af æggets albuminindhold, der varierer fra 36-40 ml i forskellige æg. Forsøg, i hvilke albumin i mediet alene blev fortyndet med destilleret vand, gav resultater, der svarer til de, der opnås under anvendelse af saltopløsning som fortynder (tabel 7). Derfor er vand en vigtig bestanddel i korttidsdyrkning til trin 29.

10

Det luftformige miljø i dyrkningsbeholderen og mediets tilhørende syre-baseba-lance nødvendiggjorde ingen præcis tilpasning til udvikling i æggelederfasen. I livmoderen fluktuerer albuminets pH mellem 7,15 og 7,4 (Sauveur og Mongin, ! 1971). I ægget stiger den til pH 8,4 inden for få læggedage, hvilket skyldes C02- i 15 udstrømningen gennem skallen (Dawes, 1975). I modsætning hertil er albuminets oxygenindhold i livmoderen lav, og i ægget ækvilibrerer det med luft inden for 2 timers inkubation (Wishart, personlig kommunikation). Til den bestemte dyrkningsmetode for fase I blev mediets pH rutinemæssigt indstillet på 7,2-7,4 med C02 for at være i overensstemmelse med in v/Vo-betingelseme; mediets oxy-20 genniveau var formodet at være det omgivende niveau. Beholderne blev forseglet med SARAN WRAP for at opretholde pH på under 7,8 og for at opretholde en fugtig atmosfære i kammeret.

Udviklingen blev ikke svækket ved dyrkning ved en højere pH, selv om der var en 25 svag reduktion i antallet af overlevende embryoner. Befrugtede æg blev placeret i recipientskaller, der var fyldt med medium, pH 7,4, til et niveau, der var på linje med kimskiven, og skallerne blev dækket med låg. De blev inkuberet i 10% C02 eller i luft, R.H. 80%, ved 42°C i 24 timer. Dyrkningsmediets pH steg gennemsnitligt henholdsvis 0,31 enheder og 1,15 enheder. Embryonerne blev derefter dyrket i 30 system II i yderligere seks dage. Normale embryoner udvikledes i 55% (n=33) af kulturer inkuberet i 10% C02 og i 41% (n=29) af kulturer inkuberet i luft.

Det er blevet foreslået, at bestemmelse af bilateral symmetri i udviklingens livmoderfase er påvirket af tyngdekraften (Kochav og Eyal-Giladi, 1971). Forsøg med 35 kimarealernes rumlige position har antydet, at der dannes embryone akser i em-

DK 175847 B1 I

bryoner, der er placeret på skrå og ikke i de, der er placeret horisontalt, under den H

kritiske bestemmelsesperiode (Olzanska, Sjolajska og Lassota, 1984). 1 nærværen- I

de arbejde blev der ikke fundet nogen beviser til støtte for disse erkendelser. Em- I

bryone akser blev dannet i 68% (n=34) af kulturer dyrket fra horisontale kimskiver I

5 og 74% (n=34) af kulturer dyrket fra skråtstillede kimskiver. H

Fremgangsmåden for fase I og dens binding med fremgangsmåden for fase II er H

fuldstændig ny. Dette er den første beskrivelse af vækst in vitro af aviære embry- I

oner fra befrugtede æg til trin 29, dvs. en periode, der dækker den første tredjedel I

10 af det embryone livsforløb. Der er to andre beskrivelser af dyrkning af albuminem- H

bryoner på hel blomme. Howarth (1971) har dyrket æg, der stammede fra ægge- H

lederens forreste område, til blastodermtrinnet {trin 1) med en overlevelsesgrad på I

60% (n=10). For at undgå at blommen flød op til overfladen, blev ægget, der på I

dette trin mangler en albuminkapsel, placeret i plastskaller, der var neddykket i H

15 bægere med flydende albumin. Kochav og Eyal-Giladi (1971) har dyrket livmoder- H

embryoner fra flercelletrinnet til 4-somit-trinnet (trin 8). 1 denne undersøgelse blev

skalmembranen fjernet, blommen og albuminet blev overført til et bæger med H

fysiologisk saltopløsning, og blommen blev opslæmmet af albuminstrengen for at I

tvinge kimområdet ind i en skrå position. I

20

Dyrkningsmetoden til udviklingen af befrugtede æg i en 7 dages periode tilveje- I

bringer et modelsystem til analyse af effekterne af eksperimentel indgriben i førde- I

lingstrin i en række udviklingsprocesser hos fugle. Nærværende opfindere har inji- I

ceret exogene gener i kimskivens cytoplasma og undersøgt deres skæbne i embry- I

25 onerne med intervaller på fra 2 timer til 7 dage. I

Eksempel 5 I

Dyrkning af befrugtede æg til udklækning. I

30 Fremgangsmåder for dyrkningssystemer I til II til III I

Æg, der er isoleret fra æggelederens midt-magnumområde, blev dyrket i 24 timer i systemet for fase I (fig. 5), overført til systemet for fase II (fig. 4) og inkuberet i 3 dage. Fremgangsmåderne er beskrevet i eksempel 4 med den modifikation, at 35 forholdene mellem flydende albumin og saltopløsning i dyrkningsmediet var 3:2 for 23 DK 175847 B1 i system I og 2:1 for system II. For at sikre at den nødvendige mængde dyrknings- I medium blev tilført embryonet til dets langtidsudvikling, havde de recipientskaller, der blev fremstillet til system II, et volumen, der var 1-2 ml større end volumenet af de forudgående æg, der var lagt af donorhønsene. Efter i alt 4 dages inkubation 5 blev embryonerne overført til systemet for fase III (fig. 3) som beskrevet i eksempel 3. Recipientskallerne, der var fremstillet til system III, havde i gennemsnit et 18 ml større volumen end de recipientskaller, der blev anvendt i system II. Volumenforskellen bestemte størrelsen af luftrummet i kammeret. Kulturerne blev inkuberet ved 38°C i 5 dage, i hvilket tidsrum de blev drejet gennem en vinkel på 10 30°, derefter i 10 dage i en stationær position og til slut placeret i en stationær udklækningsinkubator ved 36-37°C (tabel 8).

TABEL 8 15 Fremgangsmåde til inkubering af kyllingeembryoner fra befrugtede æg til Udklækning

Relativ 20 fugtighed

Successive Bevæget/ Temperatur (%) i inkubationsdage stationær Vinkel (°C) inkubator i .

25 0-1 Stationær - 41-42 O

1-4 Bevæget 90° 38 30-50 4-9 Bevæget 30° 38 30-50 9-19 Stationær - 38 40-55 19-22 Stationær - 36-37 40-60 i i 30 _

Resultaterne af 9 forsøg, i hvilke kulturerne fra den fjerde til den nittende dag blev inkuberet ved en relativ fugtighed, R.H. 30-55%, er anført i tabel 9.

35 i i I DK 175847 B1

TABEL 9 I

Overlevelses- og udklækningsgrader af befrugtede kyllingeæg ved forskellige dyrk- I

ningsintervaller. Dyrkningssystemer 1 til II til III. I

Antal Levende embryoner/ I

Inkubationsdage levende embryoner totale kulturer (%) 10 0 96 4 55 57 10 31 32 15 26 27 19 18 19 15 22 10 10

Udklækning 22-23 8+ 8 + Fem kyllinger var raske.

Tidlige tab blev registreret, på den fjerde dag, af embryoner, der ikke udviklede sig, og på den tiende dag af embryoner, der blev beskadigede under overførelsen fra system II til III. Embryoner, der var dyrket fra befrugtede æg, var skøre og mere udsat for beskadigelse end embryoner dyrket fra dag 1. Udklækningsgraden 25 var 8%, og ca. halvdelen af antallet af udklækkede kyllinger var raske. Ved en højere fugtighed, R.H. 50-60%, var udklækningsgraden tilsvarende (n=85), men kun én udklækket kylling var rask. Én svag kylling udklækkedes fra kulturer, som var inkuberet ved R.H. 60-75%.

30 I alt blev syv raske kyllinger udklækket fra dyrkede befrugtede æg, herunder én, der var dyrket ved en modificeret fremgangsmåde. To hanekyllinger overlevede frem til kønsmodenhed; én er frugtbar og giver en udklækningsgrad på 75% for æg fra inseminerede Warren-høns, og den anden er ufrugtbar. To 9 uger gamle hønniker skønnes at være raske. De resterende fugle overlevede i henholdsvis 1, 8 35 og 16 uger.

25 DK 175847 B1

Grunden til, at der anvendes 3 forskellige dyrkningssystemer i på hinanden følgende udviklingperioder, er blevet forklaret ovenfor. Det lader til, at overlaget ("superstrataet") spiller en afgørende rolle i embryonernes vækst. Det korrekte 5 forhold mellem embryonet og overlaget blev bestemt empirisk, og der blev foretaget hensigtsmæssige justeringer i konstruktionen af dyrkningskammeret for at tilpasse dette til de skiftende behov i embryonudviklingens forskellige faser. I fase I var et overskud af medium oven over embryonet skadeligt, og i fase II var det essentielt for vækst. Et overskud af medium var ikke skadeligt i fase III indtil dag 10 8, hvor udvikling blev stoppet, medmindre de vaskulære ekstraembryone membraner blev udsat for atmosfæren i kammeret.

Koblingen mellem systemer 1 til II til III for at styrke kyllingeembryonvæksten i dyrkning fra et trin kort efter befrugtning til udklækning er i sig selv en ny frem-15 gangsmåde. Dette er den første beskrivelse af et fuldstændigt dyrkningssystem for det aviære embryon (Perry, 1988).

Etableringen af et fuldstændigt in vitro-system til kyllingeembryonet har mange forskellige potentielle anvendelser inden for grundforskningsområder og anvendte 20 forskningsområder. Den tilvejebringer muligheden for at manipulere med de aviære æg, fx ved injektion af fremmede gener eller hele genomer, og for at undersøge effekterne af sådanne manipulationer hos den udklækkede kylling og muligvis i den kønsmodne fugl. Fremgangsmåderne giver også retningslinjer for at planlægge in v/fro-teknikker for æggelederembryoner i tidligere og mere avancerede trin 25 end de, der anvendes for tiden, med anvendelse inden for områderne in vitro-befrugtning og indsættelsen af formodede totipotente celler i embryonet.

En potentiel anvendelse er i fremstillingen af transgent fjerkræ. Modifikationer af faktorerne for vækst- og forplantningspræstation vil være gavnlig for fjerkræ-30 industrien. Derudover er indsættelsen af gener for nye proteiner i den aviære kimlinje en potentiel værdifuld teknik til fremstilling af biomedicinsk vigtige proteiner i albumin. Fjerkræs høje reproduktive kapacitet giver dem en fordel over for andre husdyr inden for dette teknologiske felt. En høne bliver kønsmoden på 6 måneder, og den er i stand til at producere omkring 300 æg i de første læggeår.

35

DK 175847 B1 I

Sammenfattende er adskilte dyrkningssystemer for de tre udviklingsfaser blevet H

beskrevet, hvor embryonerne overføres fra ét system til det næste, således at hele H

det embryone livsforløb daekkes. Den overordnede eksperimentelle konstruktion og H

rækkefølgen af teknikkerne er vist i diagrammatisk form i fig. 1. Den eksemplifice- H

5 rede fremgangsmåde for fase III er et adskilt system (eksempel 1). Den eksempli- H

ficerede fremgangsmåde for fase II overlapper den for fase III (eksempel II), men H

overførelse mellem disse systemer bør fortrinsvis foretages på et bestemt trin, på H

grund af embryonets med alderen stigende skørhed (eksempel 3). Fremgangsmå- H

den for fase I dækker en periode, der starter omkring 2 timer efter ægløsning, når H

10 albuminaflejringen er undervejs, og den mandlige og kvindelige prokerne undergår H

udvidelse (Perry, 1987). Det nødvendiggør kobling med fremgangsmåden for fase H

II til dens analyse (eksempel 4) og efterfølgende med fremgangsmåde for fase III H

til et fuldstændigt dyrkningssystem (eksempel 5). H

REFERENCER H

Beadle, B.W. , Conrad, R.M. og Scott, H.M. (1938). Composition of the H

2q uterine secretion of the domestic fowl. Poultry Sci. 17 : 498-504,

Callebaut, M. (1983). Autoradiographic demonstration of the penetra-tion of albumen-derived material through the vitelline membrane into the egg yolk, exterior to the avian blastoderm. Poultry Sci. 62 :

1657-1659. H

Crittenden, L.B. og Salter, D.W. (1986). Gene insertion and long-term goals. Avian Diseases. 30 : 4346.

Davidson, M.F. og Draper, M.H. (1969). The accumulation of glukose in the white of the egg of the hen. J. Physiol. 202 : 119-120p.

27 DK 175847 B1

Dawes, C.Η. (1975). Acid-base relationships within the avian egg.

Biol. Rev. 50 : 351-371.

Dunn, B.E., Fitzharris, T.P. og Barnett, B.D. (1981). Effects of varying chamber construction and embryo pre-incubation age on survi-5 val and growth of chick embryos in shell-less culture. AnaC. Rec.

199 : 33-43.

Freeman, B.M. og Messer, L.I. (1985). Genetic manipulation of the domestic fowl - a review. World's Poultry Science Journal 41 : 124-132.

10 Hamburger, V. og Hamilton, H.L. (1951). A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morph. 88 : 49-67.

Howarth, B. (1971). An examination of sperm capacitation in the fowl.

Biol. Reprod. 3 : 338-341.

Kochav, S. og Eyal-Giladi, H. (1971). Bilateral symmetry in chick 15 embryo determination by gravity. Science, 171 : 1027-1029.

Kochav, S., Ginsburg, M. og Eyal-Giladi, H. (1980). From cleavage to primitive streak formation a complementary normal table and a new look at the first stages of development of the chick. II. Microscopic anatomy and cell population dynamics. Dev. Biol. 79 : 296-308.

20 Leonard, E.M. (1968). The accumulation of minerals in the avian oviduct. Ph.D. Thesis, Univ. of Edinburgh.

New, D.A.T. (1956). The formation of the subblastodermic fluid in the hens, egg. J. Embryol. exp. Morph. 4 : 221-227.

New, D.A.T. (1957). A critical period for the turning of hens, eggs.

25 J. Embryol. exp. Morph. 5 : 293-299.

New, D.A.T. (1966). "The culture of vertebrate embryos". London :

Academic Press.

I DK 175847 B1 I

I 28 I

Olszanska, B., Szolajska, E. og LassoCa, Z. (1984). Effect of spati- I

al position of uterine quail blastoderms cultured in vitro on bi-

I lateral symmetry formation. Roux's Arch. Dev. Biol. 193 : 108-110. I

Ono, T. og Uakasugi, N. (1984). Mineral content of quail embryos I

I 5 cultured in mineral-rich and mineral-free conditions. Poultry Sci. I

I 63 : 159-166. I

I Perry, M.M. (1986a). Embryo manipulation in poultry. Proc. XXVII.

Br. Poultry Breeders' Roundtable. I

I Perry, M.M. (1986b). Embryo manipulation in poultry. Edinburgh I

I 10 Centre for Rural Economy. Annual report, 1985-86, 19-24. I

I Perry, M.M. (1987). Nuclear events from fertilisation to the early I

I cleavage stages in the domestic fowl. (Gallus domesticus). J. Anat. I

I 150, 99-109. I

I 15 Perry, M.M. (1988). A complete culture system for the chick embryo. I

I Nature. 331, 70-72. I

Romanoff, A.L. (1943). Cultivation of the early chick embryo in I

I vitro. Anat. Rec. 87 : 365-369. I

I Rowlett, K. og Simkiss, K. (1985). The surrogate egg. New Scientist, I

I 20 1469 : 42-44. I

I Rowlett, K. og Simkiss, K. (1987). Explanted embryo culture : in I

I vitro and in ovo techniques for domestic fowl. Br. Poultry Sci. 28 : I

I 91-101. I

I Sauveur, B. og Mongin, P. (1971). Etude comparative du fluide uteri- I

I 25 ne et de 1,albumen de l.oeuf in utero chez le poule. Ann. Biol. I

I ania. Bioch. Biophys. 11 : 213-224. I

I Wangensteen, O.D. og Rahn, H. (1970/71). Respiratory gas exchange by I

I the avian embryo. Respir. Physiol. 11, 31-45. I

Claims (11)

29 DK 175847 B1

1. Fremgangsmåde til in v/£ro-dyrkning af et aviært embryon op til blastoderm-dannelse, hvilken fremgangsmåde omfatter, at et befrugtet æg med en omgivende 5 kapsel af vægtfyldigt albumin dyrkes delvist neddykket i dyrkningsmedium, hvor mediet generelt er på linje med kimskiven.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den udføres i en impermeabel beholder, der er for-10 seglet med en filmforsegling med lav permeabilitet.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, hvor dyrkningsmediet er flydende albumin, som kan være fortyndet med vand og/eller en saltopløsning.

4. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, hvilken fremgangsmåde efterfølges af et andet trin, der omfatter, at embryonet dyrkes under den embryoniske morfogenese ved inkubation af et embryon i et dyrkningsmedium i en forseglet beholder fyldt til randen med væske, kendetegnet ved, at beholderen og forseglingen er væskeimpermeable, 20 men delvist gaspermeable.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, hvor dykningsmediet i det andet trin er flydende albumin.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 4 eller 5, hvor de dyrkede embryoner i det andet trin underkastes blid til moderat vugning.

7. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 4-6, hvilken fremgangsmåde yderligere omfatter et tredje trin til in v/tro-dyrkning af aviære embryoner 30 under den embryoniske vækstfase, hvilken fremgangsmåde omfatter, at et embryon inkuberes i en lukket beholder, hvor der er et luftrum over embryonet, hvilket luftrum er adskilt fra den ydre atmosfære med en delvist gaspermeabel forsegling. DK 175847 B1 I

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, hvor beholderen i det tredje trin er en del af et I æg· I

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, hvor ægget er er hønseæg, og dybden af rummet I 5 mellem embryonet og forseglingen er fra 5 til 15 mm. I

10. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 7-9, hvor det inkube- I rede embryon i det tredje trin omrystes blidt, i det mindste i starten. H DK 175847 B1 TIDSSKALA (DAGE) . befrugtning legnlng udklækning DYRKNINGS- _ ♦ -_,_:-,--t system ' 0 1 4 8 22 1. i 1 m ] I 111111111111111111111111111111111111^1 π I I , ..........,1· ···.................!„! \ 7 i » I ; I J I I I F/c. /. Fig. 1. Skema, der viser de kyllingeeobryone udvikllngstidsrum, der . dækkes af en serie af tre dyrkningssystemer, og det tids punkt, hvor embryonerne overføres mellem systemerne for at opnå fuldstændig dyrkningsudvikling. I DK 175847 B1 I I Ydre veskelag I I 7 /v,gtfyUlBt l.e A1Wn I I Blastoderm //. Indre vaskelag I \ _ J. — ^ ///j Chalazlferst lag I I Vltellln membran Chalaza I I ^ (albuminstreng) I I MM XYM ny Vi Λ I AV Luftrum I Il I i04ooooc

11 Blomme 11 i i · I V— Indre skalmembran I I ___Ydre skalmembran I I Fig.2. I I ^Ifi· 2. Diagram, der illustrerer de nylagte hønseægs struktur (fra I I Dawes, 1975). I I FASE III I I klabefilm . embryon luftrum I Γ - J 1 I péi^Bl^Élll I I ?? .ν^Αϊ' ;ίί t * vÆ ν-:Λ-^ ^ί;Λί· ί · j :::::: i/ I I ^!||v æW' dyrkningsmedium I I recipientskal il» ’ l I %iii!iiiir I I F/g.3. I Fig. 3. Dyrkningssystem III for kyllingens embryone vakstfase (4 I dage efter befrugtning til udklakning) . I FASE 11 DK 175847 B1 Η ^ N — enbryon i m \ihv klabef limsforsegling>. 5:/ I F ^i/ kapsel af . ’ :·! \ £:¾¾:¾- ΐΡΓ vmgtfyldigt albumin É |i| dyrkningsmedium---^ i!|i|j jj|^^ -recipientskal holdering---- elastikbÅnd F/g.4 Fig. 4. Dyrkningssystem II for kyllingens embryongenesefase (1 dag til 4 dage efter befrugtning). Dette system støtter udvikling i yderligere 3-4 dage Ind 1 den tidlige vakstfase. SARAN WRAP FASE 1 i —~i ^ kimskive dyrkningsmedium v ^ ^ IjL J| _ kapsel af !5|:|Κ Æt vagtfyldigt albumin r- r &ljlj:ji|ljl&5^ / iG. 0. Fig. 5. Dyrkningssystem I for cggelederfasen af kyllingeudvikling (2 timer til 1 dag efter befrugtning).