CN104082237B - 一种用于转基因禽制备的有效种蛋孵化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于转基因禽制备的有效种蛋孵化方法。该方法是将种蛋的气室端处的蛋壳在孵化前开孔后透明胶带封口，孵化箱中竖直孵化53小时后，打开封口，室温下鸡胚背主动脉血管转基因注射后用封口膜再次封口，并放到孵化箱中孵化直至出雏。本发明方法从根本上克服了传统方法中的复杂且困难的操作过程，低效的孵化率。本发明方法步骤简单，可操作性强，适用于其他禽类开窗法转基因操作后的种蛋孵化。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于转基因禽制备的有效种蛋孵化方法。
背景技术
转基因禽技术可以制备输卵管生物反应器以生产昂贵的药物蛋白，创造巨大的经济效益；进行转基因育种，如抗病育种等，以大大加速常规育种进程；改善鸡的生产性能；研究基因在发育生物学中的功能等。因此，转基因禽具有巨大的经济价值和应用前景。
近年来有很多关于转基因鸡的研究报道，但是没有得到广泛应用的主要原因之一就是没有找到一种高效率的转基因注射后禽类胚胎孵化的技术方法。提高转基因注射鸡胚孵化率最好的方法就是在种蛋原壳中孵化，因为在自然条件下，鸡胚是在蛋壳内完成整个发育过程直至出雏的。因此，如何将外源基因导入不同发育阶段的鸡胚并孵出鸡来已成为该项技术的瓶颈。目前，鸡胚体外培养法包括无壳培养法、换壳培养法和原壳培养法3种，其中原壳培养法相对简单易行，孵化效果最好。而原壳培养法依据开口位置的不同，又可分为赤道面开窗法、锐端开窗法和气室端(钝端)开窗法。Bednarczyk等报道赤道面开窗法的孵化率为9.8％左右，(钝端)气室端的孵化率在41％。曹志贱等报道锐端开窗的孵化率为64％，但锐端开窗不易看到胚胎，不利于胚胎操作。
国内外多数报道的使用开窗法进行转基因鸡操作，其主要过程是将新鲜种蛋水平放置一段时间后，使得胚下腔浮到种蛋的最高点，然后开直径0.5cm的孔，对鸡胚X期胚盘注射基因，然后用封口膜封口，放到孵化箱中按照常规方法继续孵化。这种方法存在寻找胚下腔困难，操作复杂，孵化率很低(10％左右)的不足，其原因主要是：一是选择鸡胚X期胚盘进行转基因注射操作容易损伤胚盘，二是开口部位对种蛋产生致命损伤，破坏了蛋壳、外壳膜和内壳膜，孵化过程中出现蛋清外溢的现象，严重降低了孵化率。
发明内容
本发明的目的是报道一种用于转基因禽制备的有效种蛋孵化方法。该方法特别适合应用于转基因禽的制备，整个操作过程极其简单，转基因注射后的胚胎孵化率显著提高。
一种用于转基因禽制备的有效种蛋孵化方法：找出种蛋的气室端的位置并标记，在蛋壳的气室端位置上开一个圆孔，揭开圆孔处的蛋壳和外壳膜，再用透明胶带封住圆口，开口处竖直朝上孵化53小时后，打开封口，使用玻璃针经背主动脉血管进行转基因注射操作，然后再用封口膜封口，放到孵化箱中孵化直至出雏。
本发明还具有如下特征：
1、所述种蛋用牙科钻在蛋壳的气室端位置上磨出1-1.5cm的圆孔。
2、所述的种蛋开口竖直朝上孵化53小时后，使用内径为10μm、20°倾斜角的玻璃针经背主动脉血管注射脂质体包埋的质粒。
3、所述的竖直孵化温度为37.8℃，湿度为75％，翻蛋角度为15°。
4、所述禽为鸡。
本发明方法利用种蛋自身的结构特点和鸡胚发育的特点，创造性地通过在孵化期间对转基因操作前后种蛋孵化的简单处理，避免了胚胎发育期间与封口部位直接接触，使得内壳膜的损伤降到最低，保护了转基因注射操作后鸡胚的自身结构，适应了鸡胚自然发育的要求，直接提高了转基因操作后鸡胚的孵化率。因此，本发明方法从根本上克服了传统方法的复杂操作过程和低效孵化率的缺陷，有操作简单，易于推广的优点，具有很高的应用价值。
具体实施方式
实施例1
一种用于转基因鸡制备的有效种蛋孵化方法，首先通过照蛋器确定并用铅笔画出整个鸡蛋的气室端位置，在蛋壳的气室端位置上用牙科钻磨出1-1.5cm的圆孔，揭开圆孔处的蛋壳和外壳膜，用透明胶带封口，开口处竖直朝上孵化，孵化的温度为37.8℃，湿度为75％，翻蛋角度为15°，竖直孵化53小时后，使用内径为10μm、20°倾斜角的玻璃针经背主动脉血管注射脂质体包埋的质粒，然后用封口膜封口，放到孵化箱中孵化直至出雏。
实施例2
表一开口大小和位置不同对孵化率的影响
备注：开口时期均为种蛋的X期，封口方法均为封口膜。
表二封口材料不同对孵化率的影响
| 组别 | 正常种蛋 | 封口膜封口 | 透明胶带封口 | 蛋壳封口 |
| 孵化数 | 30 | 30 | 30 | 30 |
| 出雏数 | 28 | 23 | 19 | 18 |
| 孵化率 | 93％ | 77％ | 63％ | 60％ |
备注：各组均为X期种蛋的气室端开口。
表三注射的胚胎时期对孵化率的影响
备注：胚下腔为X胚盘时期；封口材料是封口膜。血管注射采用本发明所描述的开口、封口和孵化方法。optiMEM为稀释包埋质粒的溶液。
表四血管注射前打开鸡胚内壳膜的方式对孵化率的影响
备注：开口为气室端，开口大小为直径1.5CM，透明胶带封口后孵化到53h，鸡胚背主动脉血管转基因注射后，封口膜封口，孵化至出雏。
报道的赤道面开窗法转基因操作后的种蛋在孵化过程中出现7天内死胚高峰期，其根本原因是：在翻蛋的过程中，开口部位即蛋壳与封口物质之间的夹缝容易将胚胎夹在其中，即如果将内壳膜揭开暴露全部发育过程中的胚胎然后用封口膜封口，那么蛋清与封口膜会直接接触，在高温高湿和翻蛋的孵化环境下，蛋清连同发育过程中的胚胎会经常接触开口部位与封口膜，当再次翻蛋时容易使发育的胚胎破损，导致胚胎大量死亡。
本发明的发明人发现，本发明所描述的开窗法转基因操作后，于种蛋气室端再封口，其实质就是在做人工气室。另外，53h鸡胚血管转基因注射后用封口膜封口，孵化效果要好于其他物质封口。
实施例3
本发明的发明人基于以上发现，并结合禽类胚胎的发育过程，创造性地提供了一种从根本上克服操作复杂且孵化低效的转基因禽制备的种蛋孵化方法：在揭开种蛋气室端的蛋壳和撕开外壳膜后，透明胶带封口竖直孵化53小时后，打开封口暴露出内壳膜后能够模糊的看到鸡胚的心脏在跳动，用Tip小枪头轻轻挑开心脏跳动附近的部位暴露出背主动脉，在实体显微镜或解剖镜下进行转基因质粒的注射，然后再用封口膜封口，孵化箱中孵化至出雏。
Claims (1)
1.一种用于转基因鸡制备的有效种蛋孵化方法，方法如下：找出种蛋的气室端的位置并标记，用牙科钻在蛋壳的气室端位置上磨出1-1.5cm的圆孔，揭开圆孔处的蛋壳和外壳膜，用透明胶带封住开口，开口处朝上竖直孵化53小时后，之后打开封口，其特征在于，用Tip小枪头轻轻挑开心脏跳动附近的部位暴露出背主动脉，在实体显微镜或解剖镜下进行转基因质粒的注射，然后用封口膜封口，放到孵化箱中孵化直至出雏；所述的竖直孵化的温度为37.8℃，湿度为75％，翻蛋角度为15°。
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