CN101020898B

CN101020898B - 一种利用种蛋自身蛋壳开窗操作和孵化鸡胚的方法

Info

Publication number: CN101020898B
Application number: CN2007100342530A
Authority: CN
Inventors: 燕海峰; 朱立军; 肖兵南
Original assignee: HUNAN PROV RESEARCH INST OF ANIMAL HUSBANDRY AND VETERINARY
Current assignee: HUNAN PROV RESEARCH INST OF ANIMAL HUSBANDRY AND VETERINARY
Priority date: 2007-01-12
Filing date: 2007-01-12
Publication date: 2011-04-27
Anticipated expiration: 2027-01-12
Also published as: CN101020898A

Abstract

本发明公开了一种利用种蛋自身蛋壳开窗操作和孵化鸡胚的方法，包括种蛋开口、胚胎操作、封口和孵化，其特征在于，所述种蛋开口包括：将种蛋消毒后，用开蛋工具在种蛋的外壳上开多边形或圆形槽，分割开一个多边形或圆形切块，不切开内壳膜；将种蛋于无菌条件下用切割工具划开大部分槽的内壳膜，保留多边形的一边或圆的一小段弧的内壳膜，使切块连同其内侧的内壳膜沿多边形的一边或圆的一小段弧一侧的内壳膜呈铰链状翻起固定到外壳上，以备通过多边形或圆形窗口操作胚胎。本发明方法提供的种蛋开窗操作鸡胚的技术，制作方法较之前技术简单方便，可操作性强，而且孵化率高达50％以上。

Description

一种利用种蛋自身蛋壳开窗操作和孵化鸡胚的方法

技术领域

本发明涉及一种种蛋开窗操作和孵化鸡胚的技术，特别是一种利用种蛋自身蛋壳开窗操作和孵化鸡胚的技术。

背景技术

目前种蛋开窗操作鸡胚的技术主要应用于以下4个方面：1)以囊胚细胞为载体的禽类转基因技术；2)以原生殖细胞为载体的禽类转基因技术；3)利用多能细胞保存禽类种质资源技术；4)以鸡胚为动物胚胎发育研究模型，研究基因(或药物)功能。

怎样在一个鸡蛋中操作黄豆般大小的胚胎，方法要简单方便，同时要保证高的孵化率，一直是一个难题。目前按实验种蛋胚胎在蛋壳中孵化的方式，存在3类主要方法：(1)利用自身蛋壳；(2)利用代用蛋壳；(3)自身蛋壳与代用蛋壳相结合。第1类方法相对简单，但孵化率低；第2类方法孵化率较高，但制作过程复杂；第3类方法介于二者之间。

1)利用自身蛋壳方面：

Thoraval等(1994)报道了相关方法：未孵化种蛋用70％酒精擦拭消毒，在囊胚正上方，鸡蛋赤道面部位的蛋壳上开边长约为5cm的三角形窗口。用精细的微针将5μL细胞液注射入囊胚腔。窗口用切块封闭，同时再覆盖一层医用外科3M Steri Strip TM膜。在37.7℃，50％的湿度条件，每小时以90度角转蛋一次，孵化至出壳。该方法较简单，但当时的孵化率只有5％。

Kwon等2004和Koo等2004报道，新产蛋用70％酒精擦拭消毒，用一个精密的钻孔器在鸡蛋赤道面上开一个4.5×4.5mm²的口，用精致的镊子和外科手术刀去掉窗口内的小壳膜。用微注射针，将5μL含有浓缩病毒颗粒的DMEM培养基注射进入了囊胚腔中央部分。微注射针由耐热玻璃管拉成，尖端内径为80μm。注射完后，窗口用薄膜封口，孵化率为8.3％。

2)利用代用蛋壳方面：

周振明等2004报道(孵化率为35％～44％，样本少于20)：(1)代用蛋壳的准备：将比相应的种蛋重约20～30g的白壳双黄鸡蛋，消毒水浸洗，在其钝端用牙钻切一个直径约4cm的切口，弃去顶端和内容物。(2)用PBS(青霉素80万IU/L，链霉素100万IU/L)消毒冲洗2-3次备用。(3)通过背主动脉注射2μLDMEM的方法与上一操作方法相同，将微注射完毕的鸡胚轻轻打开转入代用蛋壳内，小心除去气泡。(4)清蛋白涂抹在代用蛋壳的边缘，用保鲜膜封口，钝端向上放入孵化器。(5)孵化至第18d，停止翻蛋转入37.5℃培养箱，相对湿度为60％～70％，孵化至出雏。(6)观察鸡胚，当雏鸡将喙伸入气室时用针在保鲜膜上刺几个小孔以利呼吸，当雏鸡的血管已干缩时，将保鲜膜揭去。用培养皿盖住，等待出雏，对弱雏进行适时助产。

3)自身蛋壳与代用蛋壳相结合方面：

Kamihira等2005报道：新产蛋在0-60h内，在37.8℃，65％的湿度条件，每15min以90度角转蛋一次。注射前，在种蛋锐端水平切去了一个直径35mm部分。病毒液以1.5-3.5μL的量注射到胚体或心脏。该实验蛋在2-3天内，在37.8℃，65％的湿度条件，每30min以90度角转蛋一次。以后胚再转移到代用蛋壳(代用蛋壳的准备：将另一蛋壳从钝端切去直径为45mm部分，胚转移到该壳中后，以25mg胚的浓度添加稀蛋清和乳酸钙悬液)。在37.8℃，65％的湿度条件，每小时以30度角转蛋一次，同时在孵化机中加入纯氧气。孵化率63％，每组样本数小于20。

郝志明等2006报道了对发育3d的胚胎操作实验，方法为：先用铅笔在大头顶端画一直径为1.0cm的圆圈，然后用手术刀片沿画线刻出划痕，去除蛋壳和壳膜，切口尽量平滑。取预先剥好的直径约为1.2cm的蛋壳皿(浸泡于加有青霉素和庆大霉素的生理盐水)，滤纸吸干后盖在胚蛋/种蛋的开口处，用特配的封口胶进行封口。孵化条件为：温度37.8℃，出雏温度37.0℃；相对湿度60％；人工翻蛋(6次/d)，转蛋角±45。每组样本数低于40，孵化率为33.3％～76.5％，但实验没有对照组数据。此外，作者在2005年报道用同样的方法对未孵化种蛋进行实验，孵化率竟然是0，这显然与国内外研究报道不符。

总的来说，目前以上研究方法还存在以下缺陷：制作方法复杂烦琐，无法批量制作，且经实验操作后种蛋成活率低(一般低于30％)，个别达到60％以上，但样本含量极少，可操作性不强。

发明内容

针对已有技术存在的上述缺陷，以及孵化率大幅度降低的原因不是微注射，而是种蛋开窗技术(Petitte et.al 1990)，本发明旨在提供一种种蛋自身蛋壳开窗操作和孵化鸡胚的技术，鸡胚的操作和孵化全部过程在其自身蛋壳中完成，在实验过程中不必转移胚胎，无需制作代用蛋壳，制作方法较之前技术简单方便，可操作性强，而且孵化率大幅度提高。

为实现上述发明目的，本发明提供一种利用种蛋自身蛋壳开窗操作和孵化鸡胚的方法，包括种蛋开口、胚胎操作、封口和孵化，所述种蛋开口包括：将种蛋消毒后，用开蛋工具在种蛋(1)的外壳(6)上开多边形或圆形槽(5)，分割开一个多边形或圆形切块(3)，不切开内壳膜(8)；将种蛋(1)于无菌条件下用切割工具划开大部分槽(2)的内壳膜，保留多边形的一边或圆的一小段弧(4)的内壳膜，使切块(3)连同其内侧的内壳膜(8)沿多边形的一边或圆的一小段弧(4)一侧的内壳膜呈铰链状翻起固定到外壳(6)上，以备通过多边形或圆形窗口(7)操作胚胎。

所述多边形或圆形槽(5)中多边形的一边或圆的一小段弧(4)的缝宽以翻起切块时不至于压坏外壳或扯断内壳膜为宜。

所述多边形的一边或圆的一小段弧(4)依赖临近一侧蛋壳上粘的双面胶固定在外壳(6)上。所述多边形或圆形切块(3)位置处于鸡蛋赤道面上。

所述切割工具采用10#解剖刀。

本发明所述方法的详细步骤包括：

1)种蛋开口：所述种蛋开口包括：用开蛋工具在鸡蛋赤道面部位开多边形或圆形切槽，首先切开外壳，不切开内壳膜，多边形或圆形切口保留内壳膜的一段槽的宽度以切块能翻起不扯断内壳膜和破坏切块为宜，可比槽的其它部分稍宽，同时在该宽槽一侧的外壳边缘粘上胶；将鸡蛋于无菌条件下用切割工具划开大部分槽下的内壳膜，将包含有外壳和内壳膜的切块沿宽槽，即多边形的一边或圆的一小段弧呈铰链状自由翻起，粘到外壳上，以备胚胎操作；

2)胚胎操作：通过窗口进行胚胎操作，将细胞液或其它物质注射入囊胚或发育一定时期的胚胎；

3)封口：剪比切块大的医用膜，以切块为中心直接贴上，稍用力抹平，再在医用胶带上涂上一层502胶水；

4)孵化：创口水平向上平放在蛋架上，转入孵化器内运行正常孵化程序。

本发明提供的种蛋开窗操作鸡胚的技术，制作方法较之前技术简单方便，可操作性强，而且孵化率高达50％以上。

附图说明

图1是本发明实施例中切开多边形或圆形切块(以三角形为例)的示意图

图2是本发明实施例中翻开多边形或圆形切块(以三角形为例)的示意图

在附图中：

1-种蛋 2-大部分槽 3-切块 4-多边形的一边或圆的一小段弧

5-槽 6-外壳 7-窗口 8-内壳膜

具体实施方式

以切块为三角形为例：

在无菌室外，用开蛋器在鸡蛋赤道面切边长约为5mm的三角形，仅切开外壳，不切开内壳膜，靠种蛋锐端切口缝宽大于其它两边的缝宽，同时在该宽缝下边缘粘约1mm²的双面胶，用于割开切块内壳膜后翻转切块并粘住。

将鸡蛋转入无菌室，用10#解剖刀，划开缝较窄的两边的内壳膜，用刀片将切块挑起，翻转约180度通过双面胶固定到种蛋壳上，用玻璃注射针通过窗口注射目的物质，对胚胎进行操作。

剪比三角形切块大的1.5cm规格宽的医用纸胶带，以切块为中心直接贴上，稍用力抹平，再在医用胶带上涂上一层502胶水后，采取正常孵化程序进行孵化。

参照如下表格，表1为对种蛋实施操作后的实验结果，表2为国内外同类水平：

表1

表2

*鸡蛋钝端开窗，破坏了种蛋天然气室，而且不能最近距离操作鸡胚

**难度极大根本无法批量制作(见背景技术详细说明)

Claims

1. 一种利用种蛋自身蛋壳开窗操作和孵化鸡胚的方法，包括种蛋开口、胚胎操作、封口和孵化，其特征在于，所述种蛋开口包括：将种蛋消毒后，用开蛋工具在种蛋(1)的外壳(6)上开多边形或圆形槽(5)，分割开一个多边形或圆形切块(3)，不切开内壳膜(8)；将种蛋(1)于无菌条件下用切割工具划开大部分槽(2)的内壳膜，保留多边形的一边或圆的一小段弧(4)的内壳膜，使切块(3)连同其内侧的内壳膜(8)沿多边形的一边或圆的一小段弧(4)一侧的内壳膜呈铰链状翻起固定到外壳(6)上，以备通过多边形或圆形窗口(7)操作胚胎。

2. 根据权利要求1所述利用种蛋自身蛋壳开窗操作和孵化鸡胚的方法，其特征在于，所述多边形或圆形槽(5)中多边形的一边或圆的一小段弧(4)的缝宽以翻起切块时不至于压坏外壳或扯断内壳膜为宜。

3. 根据权利要求1或2所述利用种蛋自身蛋壳开窗操作和孵化鸡胚的方法，其特征在于，所述多边形的一边或圆的一小段弧(4)依赖临近一侧的蛋壳上粘的双面胶固定在外壳(6)上。

4. 根据权利要求1或2所述利用种蛋自身蛋壳开窗操作和孵化鸡胚的方法，其特征在于，所述多边形或圆形切块(3)位置处于鸡蛋赤道面上。

5. 根据权利要求1所述利用种蛋自身蛋壳开窗操作和孵化鸡胚的方法，其特征在于，所述切割工具采用10#解剖刀。