CN105368874A - 表达乳铁蛋白转基因鸡及其实现方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种表达乳铁蛋白转基因鸡及其实现方法，为解决养殖成本高问题，是通过构建表达乳铁蛋白的慢病毒载体，再把这种慢病毒载体通过受精种蛋鸡胚盘注射后孵化或种公鸡睾丸注射后取精子人工受精生出的蛋进行孵化，获得的表达乳铁蛋白的转基因鸡。所述鸡胚盘注射获得表达乳铁蛋白的转基因鸡步骤为：1)受精种蛋初消毒、大头朝上放置；2)再消毒后顶端打小孔，剥开鸡蛋内膜，看见浮在蛋清上面的鸡胚；3)用注射器向鸡胚注入慢病毒载体；4)封口后，放入孵化箱孵化，孵出的小鸡部分带有表达乳铁蛋白的转基因鸡。具有能够为普通大众提供乳铁蛋白源和无需接种疫苗、抗病性强，显著降低养殖成本，易于实现，可操作性强的优点。

Description

表达乳铁蛋白转基因鸡及其实现方法

技术领域

本发明涉及一种转基因鸡，特别是涉及一种表达乳铁蛋白转基因鸡及其实现方法。

背景技术

乳铁蛋白最初由Sorensen等于1939年在动物乳中发现，并由Groves首先从牛乳中分离获得，因与铁结合形成的复合物呈红色，故称之为“红蛋白”。

1961年，Blanc和Isliker将从人乳中分离获得的此种蛋白正式命名为乳铁蛋白。乳铁蛋白是一种相对分子质量约为80000Da的铁结合性糖蛋白，广泛分布于哺乳动物乳汁，特别是初乳中和其他多种组织及其分泌液中，包括泪液、精液、胆汁、滑膜液等内、外分泌液和嗜中性粒细胞，为每天大量病源微生物入侵的黏膜系统提供了第一道也是最重要的防线。

人乳中乳铁蛋白浓度约为1.0-3.2mg/ml，是牛乳中的10倍(牛乳中含量为0.02-0.35mg/ml)，占普通母乳总蛋白的20％。在泌乳期间，乳铁蛋白含量随着泌乳时间的不同而发生变化，如人初乳中乳铁蛋白可达6-14mg/ml，常乳期降至1mg/ml。而在乳清蛋白产品中，其浓度可高达30～100mg/ml。乳铁蛋白之所以被重视乃是因为它可以夺走细菌生长所需的铁质而抑制细菌的生长，或破坏细菌细胞膜而具杀死细菌的效果。且可提升免疫力，抑制病毒所引起的感染，如肠病毒中的轮状细菌、肠细菌71型等等。美国食品药品管理局早巳允许乳铁蛋白作为食品添加剂用于运动、功能性食品。Lactoferrin(乳铁蛋白)withhypothiocyanite已经被欧洲药品管理局(EMEA)与美国食品药品管理局(FDA)评证为孤儿药品。

虽然2012年3月30日，我国《食品安全国家标准——食品营养强化剂使用标准》将乳铁蛋白列入GB14880-2012，认定为食品营养强化剂。但是，由于乳铁蛋白资源稀缺、价格高昂，远远不能被普通大众享用。

另外，目前养鸡都需要注射鸡疫苗和使用大量抗菌药物，不但增加成本、污染环境，而且还易使病菌变异，造成更大危害。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的上述缺陷，提供一种能够为普通大众提供乳铁蛋白源和无需接种疫苗、抗病性强的表达乳铁蛋白转基因鸡，本发明目的还在于表达乳铁蛋白转基因鸡的实现方法。

为实现上述目的，本发明表达乳铁蛋白转基因鸡是通过构建表达乳铁蛋白的慢病毒载体，再把这种慢病毒载体通过受精种蛋鸡胚盘注射后孵化或种公鸡睾丸注射后取精子人工受精生出的蛋进行孵化，获得的表达乳铁蛋白的转基因鸡。具有能够为普通大众提供乳铁蛋白源和无需接种疫苗、抗病性强，显著降低养殖成本的优点。

作为优化，所述构建表达乳铁蛋白的慢病毒载体为：1)分别调取pOVApormoter和LF基因；2)将pOVApormoter替换pLVX-IRES-ZsGreen1载体上的CMVpormoter，得到pOVA(pormoter)-MCS-IRES-ZsGreen1载体；3)将LF基因构建至pOVA(pormoter)-MCS-IRES-ZsGreen1慢病毒载体上，并使LF基因5’端连接kozak(GCCACC)，使最终骨架结构为pOVA(pormoter)-kozak-LF-IRES-ZsGreen1；4)慢病毒载体pOVA(pormoter)-LF和包装质粒共转染293T细胞进行慢病毒pOVA(pormoter)-LF基因的包装。

作为优化，所述步骤2)与步骤3)之间有测序验证步骤。

作为优化，所述鸡胚盘注射获得表达乳铁蛋白的转基因鸡步骤为：1)受精种蛋初消毒、大头朝上放置；2)再消毒后顶端打小孔，剥开鸡蛋内膜，看见浮在蛋清上面的鸡胚；3)用注射器向鸡胚注入慢病毒载体；4)封口后，放入孵化箱孵化，孵出的小鸡部分带有表达乳铁蛋白的转基因鸡。

作为优化，所述受精种蛋初消毒是取受精种蛋用1％新洁而灭消毒；所述大头朝上放置是大头朝上放置在蛋托上静置24小时；所述再消毒是在大头上用碘酊消毒，75％的酒精脱碘；所述顶端打的小孔直径是2至3mm；向鸡胚注入慢病毒载体数量为10-50微升；所述封口是用石腊封口。

作为优化，所述睾丸注射获得表达乳铁蛋白的转基因鸡是临注射前，将慢病毒浓缩液加入Polybrene至最终浓度3ug/ml混均待用；取4-15周龄公鸡进行全身麻醉，按体重肌肉注射公鸡，麻醉后，右侧肋骨处开切口，暴露两侧睾丸，分别随机点上述混均的注射病毒浓缩液，每侧睾丸注射4-5点，缝合创口，注射破伤风一次及青、链霉素一周，以防感染；

公鸡饲养一个月后，取鸡精液在荧光显微镜下进行观察，如果发现带有荧光的精子，用这种精子进行人工受精，生出的蛋进行孵化，孵出的小鸡部分带有表达乳铁蛋白的转基因鸡。

作为优化，所述公鸡进行全身麻醉是公鸡以速眠新II全身麻醉剂，按0.2mL/kg体重肌肉注射公鸡；所述右侧肋骨处开切口是右侧肋骨处开2-3cm切口；所述每侧睾丸注射4-5点是两侧共计注射约0.5mL。

用于实现本发明所述表达乳铁蛋白转基因鸡的方法是构建表达乳铁蛋白的慢病毒载体，把这种慢病毒载体通过受精种蛋鸡胚盘注射后孵化或种公鸡睾丸注射后取精子人工受精生出的蛋进行孵化，获得表达乳铁蛋白的转基因鸡。具有易于实现，可操作性强的优点。

作为优化，所述构建表达乳铁蛋白的慢病毒载体步骤为：1)分别调取pOVApormoter和LF基因；2)将pOVApormoter替换pLVX-IRES-ZsGreen1载体上的CMVpormoter，得到pOVA(pormoter)-MCS-IRES-ZsGreen1载体；3)将LF基因构建至pOVA(pormoter)-MCS-IRES-ZsGreen1慢病毒载体上，并使LF基因5’端连接kozak(GCCACC)，使最终骨架结构为pOVA(pormoter)-kozak-LF-IRES-ZsGreen1；4)慢病毒载体pOVA(pormoter)-LF和包装质粒共转染293T细胞进行慢病毒pOVA(pormoter)-LF基因的包装。

作为优化，所述步骤2)与步骤3)之间有测序验证步骤。

作为优化，所述鸡胚盘注射获得表达乳铁蛋白的转基因鸡步骤为：1)受精种蛋初消毒、大头朝上放置；2)再消毒后顶端打小孔，剥开鸡蛋内膜，看见浮在蛋清上面的鸡胚；3)用注射器向鸡胚注入慢病毒载体；4)封口后，放入孵化箱孵化，孵出的小鸡部分带有表达乳铁蛋白的转基因鸡。

作为优化，所述受精种蛋初消毒是取受精种蛋用1％新洁而灭消毒；所述大头朝上放置是大头朝上放置在蛋托上静置24小时；所述再消毒是在大头上用碘酊消毒，75％的酒精脱碘；所述顶端打的小孔直径是2至3mm；向鸡胚注入慢病毒载体数量为10-50微升；所述封口是用石腊封口。

作为优化，所述睾丸注射获得表达乳铁蛋白的转基因鸡是临注射前，将慢病毒浓缩液加入Polybrene至最终浓度3ug/ml混均待用；取4-15周龄公鸡进行全身麻醉，按体重肌肉注射公鸡，麻醉后，右侧肋骨处开切口，暴露两侧睾丸，分别随机点上述混均的注射病毒浓缩液，每侧睾丸注射4-5点，缝合创口，注射破伤风一次及青、链霉素一周，以防感染；

公鸡饲养一个月后，取鸡精液在荧光显微镜下进行观察，如果发现带有荧光的精子，用这种精子进行人工受精，生出的蛋进行孵化，孵出的小鸡部分带有表达乳铁蛋白的转基因鸡。

作为优化，所述公鸡进行全身麻醉是公鸡以速眠新II全身麻醉剂，按0.2mL/kg体重肌肉注射公鸡；所述右侧肋骨处开切口是右侧肋骨处开2-3cm切口；所述每侧睾丸注射4-5点是两侧共计注射约0.5mL。

经实验证明：本发明表达乳铁蛋白转基因鸡①具有广泛抗病能力，不用注射鸡疫苗，可以在养鸡业中广泛应用。②鸡肉内含乳铁蛋白，对人体健康有益。③产生的蛋和孵化后各期的鸡胚含有乳铁蛋白，可以提取应用，也可经过简单加工直接食用，提高免疫力，具有抗菌、抗病毒，预防和治疗肿瘤的作用。

采用上述技术方案后，本发明表达乳铁蛋白转基因鸡及其实现方法具有能够为普通大众提供乳铁蛋白源和无需接种疫苗、抗病性强，显著降低养殖成本，易于实现，可操作性强的优点。

具体实施方式

本发明表达乳铁蛋白转基因鸡及其实现方法是构建表达乳铁蛋白的慢病毒载体，把这种慢病毒载体通过鸡胚盘注射或睾丸注射，获得表达乳铁蛋白的转基因鸡。其中：

一、慢病毒载体的构建

1.分别调取pOVApormoter和LF基因；

2.将pOVApormoter替换pLVX-IRES-ZsGreen1载体上的CMVpormoter，得到pOVA(pormoter)-MCS-IRES-ZsGreen1载体；

3.测序验证；

4.将LF基因构建至pOVA(pormoter)-MCS-IRES-ZsGreen1慢病毒载体上，并使LF基因5’端连接kozak(GCCACC)，使最终骨架结构为pOVA(pormoter)-kozak-LF-IRES-ZsGreen1；

5.慢病毒载体pOVA(pormoter)-LF和包装质粒共转染293T细胞进行慢病毒pOVA(pormoter)-LF基因的包装，制备量为4ml；

二、鸡胚注射实例

1、取受精种蛋用1％新洁而灭消毒，放置在蛋托上静置24小时，大头放上。

2、在大头上用碘酊消毒，75％的酒精脱碘，在最顶端打一小孔，直径约2至3mm大小，剥开鸡蛋内膜，看见浮在蛋清上面的鸡胚。

3、用注射器向鸡胚注入10-50微升左右的慢病毒载体。

4、用石腊封口后，放入孵化箱孵化，孵出的小鸡部分带有表达乳铁蛋白的转基因鸡。

三、病毒睾丸注射实例

临注射前，病毒浓缩液加入Polybrene至最终浓度3ug/ml混均待用。取4-15周龄公鸡以速眠新II全身麻醉剂，按0.2mL/kg体重肌肉注射公鸡，麻醉后，右侧肋骨处开2-3cm切口，暴露两侧睾丸，分别随机点注射病毒浓缩液，每侧睾丸注射4-5点，注射约0.5mL，缝合创口，注射破伤风一次及青、链霉素一周，以防感染。

公鸡饲养一个月后，取鸡精在荧光显微镜下进行观察，如果发现带有荧光的精子，用这种精子进行人工受精，生出的蛋进行孵化，孵出的小鸡部分带有表达乳铁蛋白的转基因鸡。

四、转基因鸡的检测：孵出的小鸡经PCR检测，确定带有LF基因，这种鸡就是带有表达乳铁蛋白的转基因鸡。

经过实验证明：这种鸡①具有广泛抗病能力，不用注射鸡疫苗，可以在养鸡业中广泛应用。②鸡肉内含乳铁蛋白，对人体健康有益。③产生的蛋和孵化后各期的鸡胚含有乳铁蛋白，可以提取应用，也可经过简单加工直接食用，提高免疫力，具有抗菌、抗病毒，预防和治疗肿瘤的作用。

Claims (6)

1.一种表达乳铁蛋白转基因鸡，其特征在于是通过构建表达乳铁蛋白的慢病毒载体，再把这种慢病毒载体通过受精种蛋鸡胚盘注射后孵化或种公鸡睾丸注射后取精子人工受精生出的蛋进行孵化，获得的表达乳铁蛋白的转基因鸡。

2.根据权利要求1所述转基因鸡，其特征在于所述鸡胚盘注射获得表达乳铁蛋白的转基因鸡步骤为：1)受精种蛋初消毒、大头朝上放置；2)再消毒后顶端打小孔，剥开鸡蛋内膜，看见浮在蛋清上面的鸡胚；3)用注射器向鸡胚注入慢病毒载体；4)封口后，放入孵化箱孵化，孵出的小鸡部分带有表达乳铁蛋白的转基因鸡。

3.根据权利要求1所述转基因鸡，其特征在于所述睾丸注射获得表达乳铁蛋白的转基因鸡是临注射前，将慢病毒浓缩液加入Polybrene至最终浓度3ug/ml混均待用；取4-15周龄公鸡进行全身麻醉，按体重肌肉注射公鸡，麻醉后，右侧肋骨处开切口，暴露两侧睾丸，分别随机点上述混均的注射病毒浓缩液，每侧睾丸注射4-5点，缝合创口，注射破伤风一次及青、链霉素一周，以防感染；

公鸡饲养一个月后，取鸡精液在荧光显微镜下进行观察，如果发现带有荧光的精子，用这种精子进行人工受精，生出的蛋进行孵化，孵出的小鸡部分带有表达乳铁蛋白的转基因鸡。

4.用于实现权利要求1所述表达乳铁蛋白转基因鸡的方法，其特征在于构建表达乳铁蛋白的慢病毒载体，把这种慢病毒载体通过受精种蛋鸡胚盘注射后孵化或种公鸡睾丸注射后取精子人工受精生出的蛋进行孵化，获得表达乳铁蛋白的转基因鸡。

5.根据权利要求4所述方法，其特征在于所述鸡胚盘注射获得表达乳铁蛋白的转基因鸡步骤为：1)受精种蛋初消毒、大头朝上放置；2)再消毒后顶端打小孔，剥开鸡蛋内膜，看见浮在蛋清上面的鸡胚；3)用注射器向鸡胚注入慢病毒载体；4)封口后，放入孵化箱孵化，孵出的小鸡部分带有表达乳铁蛋白的转基因鸡。

6.根据权利要求4所述方法，其特征在于所述睾丸注射获得表达乳铁蛋白的转基因鸡是临注射前，将慢病毒浓缩液加入Polybrene至最终浓度3ug/ml混均待用；取4-15周龄公鸡进行全身麻醉，按体重肌肉注射公鸡，麻醉后，右侧肋骨处开切口，暴露两侧睾丸，分别随机点上述混均的注射病毒浓缩液，每侧睾丸注射4-5点，缝合创口，注射破伤风一次及青、链霉素一周，以防感染；

公鸡饲养一个月后，取鸡精液在荧光显微镜下进行观察，如果发现带有荧光的精子，用这种精子进行人工受精，生出的蛋进行孵化，孵出的小鸡部分带有表达乳铁蛋白的转基因鸡。