CN113693030A - 一种将昆虫外源共生菌Wolbachia人工转染至柑橘木虱中的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种将昆虫外源共生菌Wolbachia人工转染至柑橘木虱中的方法。主要步骤为：首先制备粘贴板：将无底纸的永久性双面涂胶透明胶带粘到载玻片上，稍微压紧。其次在体视镜下把新鲜的烟粉虱卵挑出，排列于粘贴板上并用卤代烃油700封住，把柑橘木虱低龄若虫腹面朝上粘贴在同一块粘贴板上。然后在烟粉虱产卵后3h的烟粉虱卵的卵柄处，抽取卵质，注射入柑橘木虱低龄若虫腹面胸板与腹板间。注射完毕后，将柑橘木虱若虫接到干净的九里香嫩梢上培养。本发明针对烟粉虱卵及其内共生菌沃尔巴克氏菌的分布特点，建立有效的注射方法，能够提高显微注射后柑橘木虱体内外源共生菌沃尔巴克氏菌的含量，方便卵质的抽取及注射。
Description
技术领域
本发明属于昆虫学与微生物学研究领域，具体涉及一种将昆虫外源共生菌Wolbachia人工转染至柑橘木虱中的方法。
背景技术
在自然界中，昆虫与细菌共生是一种普遍存在的现象，目前大约有66％以上的昆虫体内都含有共生菌，其中，共生于昆虫细胞内的细菌被称为“内共生菌”(endosymbionts)。已有研究表明，内共生菌协同参与了其宿主众多的生命活动，包括向其宿主提供食物中缺乏的营养物质、通过胞质不亲和(cytoplasmic incom patibility,CI)等功能调控宿主生殖方式、增强宿主的环境适应性、改变宿主对病原菌或寄生蜂的免疫力与抵抗力等，对宿主与其它生物间的生态互作与种群进化起着重要的作用。
在众多的内共生菌中，沃尔巴克氏菌(Wolbachia)是研究较为深入且具有明显生殖调控功能的共生菌，且自然界中有40～60％的节肢动物都感染有Wolba chia，Wolbachia可以通过胞质不亲和、杀雄、雌性化、孤雌生殖等作用方式调控宿主的生殖。胞质不亲和的机制之一是，如果雄虫含有某个株系的Wolbachia，而雌虫没有，则雌雄交配后后代不能发育存活。Wolbachia调控的胞质不亲和现象可用“修饰—营救”(modificationrescue)模型解释，目前已有与Wolbachia诱导宿主胞质不亲和相关的功能基因被报道。
柑橘木虱(Diaphorinacitri)属半翅目木虱科，若虫分为低龄(1～3龄)和高龄(4～5龄)。柑橘木虱主要为害芸香科植物，以柑橘属植物受害最为严重，若虫吸取植物嫩梢汁液，嫩梢受害严重时凋萎、新梢畸变，逐渐枯死；更为重要的是，柑橘木虱是目前已知柑橘黄龙病田间重要的传播媒介昆虫。因此，有效防控黄龙病的传播媒介—柑橘木虱，是控制柑橘黄龙病在不同地区乃至不同国家之间传播蔓延的最关键环节。鉴于目前，柑橘木虱成虫已对多种常用化学药剂产生了严重抗性，创新研发柑橘木虱的绿色防控技术与产品，开展柑橘木虱的高效绿色可持续防控，对于防控柑橘黄龙病的传播、蔓延与危害具有重要的科学意义、经济与生态效益。
烟粉虱(Bemisiatabaci)属于半翅目粉虱科小粉虱属，是世界范围内最具危害性的农业害虫之一。烟粉虱在我国有很多种生物型，其中属于入侵且危害严重的有2种生物型，分别是MEAM1型和MED型；而我国土著型包括AsiaII7型、AsiaII1型等。前期研究表明，入侵型的烟粉虱体内都没有Wolbachia感染，而在本土AsiaII7型体内，Wolbachia的感染率接近100％，且具有较强的CI功能。
近年来，利用昆虫内共生菌，尤其是Wolbachia，开展医学昆虫(蚊子)与农业害虫(木虱、粉虱和稻飞虱等刺吸式昆虫)生殖调控等方面的研究正成为国内外昆虫—共生菌研究领域的热点。因此，筛选具有CI功能的外源Wolbachia，对柑橘木虱进行外源Wolbachia显微注射，利用其生殖调控功能开展柑橘木虱的种群调控是具有良好应用前景的技术之一。
烟粉虱卵内的共生菌Wolbachia的含量会随着时间的推移发生改变，共生菌Wolbachia也并不是均匀分布在在卵内的各个位置。烟粉虱卵的显微注射方法不能参照常规显微注射方法进行。例如中国专利CN108849765A公开了一种稻飞虱卵的显微注射和人工孵化方法，该方法仅适用于将其他物质显微注射于稻飞虱卵中，并不适用于烟粉虱卵及其他显微注射操作。而烟粉虱卵的卵壳在显微注射灯的烤灼下也会随时间变硬，影响显微注射操作。因此迫切需要针对烟粉虱卵及其内共生菌Wolbachia的分布特点，建立有效的注射方法。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的上述不足，提供一种将昆虫外源共生菌Wolbachia人工转染至柑橘木虱中的方法。本发明的转染方法采用显微注射技术，并且确定了烟粉虱卵中沃尔巴克氏菌(Wolbachia)的抽取时间和位置及维持卵新鲜建立有效的显微注射方法。将烟粉虱卵内具有CI功能的Wolbachia，作为外源共生菌显微注射进柑橘木虱体内，为利用Wolbachia的CI功能调控柑橘木虱种群的生殖提供相应的技术。
本发明的第一个目的是提供一种昆虫外源共生菌的显微注射方法。
本发明的第二个目的是提供昆虫外源共生菌的显微注射方法的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
一种将昆虫外源共生菌Wolbachia人工转染至柑橘木虱中的方法，Wolbachia感染的烟粉虱产卵后3～9h，用显微注射针从烟粉虱卵柄处吸取卵质，再把卵质注射到柑橘木虱若虫中。
本发明研究发现，烟粉虱产卵后3～9h，初产的烟粉虱卵没有发育完成，卵壳比较软易于进行显微注射操作，如果孵化时间过长，卵壳变硬，就难以用显微注射针抽取卵质，而此时共生菌Wolbachia在主要分布在卵柄处，因此选择烟粉虱产卵后3～9h从卵柄处获取卵质；另外，作为选择柑橘木虱若虫作为受体是因为将烟粉虱卵质注射入柑橘木虱卵内，目前难以保证卵的正常孵化，而成虫免疫系统较若虫完善，不利于Wolbachia定殖。本发明针对烟粉虱卵及其内共生菌Wolbachia的分布特点，建立有效的注射方法，能够提高显微注射后柑橘木虱若虫体内外源共生菌Wolbachia的含量，增加柑橘木虱成活率。
优选地，所述Wolbachia感染的烟粉虱为AsiaⅡ7型烟粉虱。
优选地，所述吸取卵质的时间为烟粉虱产卵后3h。
优选地，所述柑橘木虱若虫的注射位置为柑橘木虱若虫的腹面。
优选地，所述吸取卵质的量为4～40nL。
优选地，所述柑橘木虱若虫的注射位置为柑橘木虱若虫的腹面。
优选地，柑橘木虱若虫的注射位置为柑橘木虱若虫的腹面的胸板与腹板之间，该位置较软，显微注射针容易扎进去，方便进行显微注射操作。
优选地，所述烟粉虱卵的固定方法为将烟粉虱卵排列于粘贴板的双面胶上，并用油封住；所述柑橘木虱若虫的固定方法为将柑橘木虱若虫腹面朝上，粘贴在与固定烟粉虱卵相同粘贴板上。油封住卵能减缓卵壳在显微镜灯的烤灼下变硬，保持卵的新鲜，维持卵的渗透压。
优选地，烟粉虱卵的卵柄朝向为显微镜注射方向，柑橘木虱若虫的尾部与烟粉虱卵的卵柄朝向一致。
优选地，所述粘贴板的制备方法为：用无底纸的永久性双面胶透明胶带粘到载玻片上。这种双面胶粘性比普通双面胶粘性低，有利于把注射后的柑橘木虱若虫取下来，而粘性太强在柑橘木虱若虫取下过程中容易死亡。
优选地，所述油为卤代烃油700。选用封卵的油不能太稠或者太稀，一方面不合适的油会溶解双面胶上的胶质，影响粘性，显微注射时卵会移动，不利于显微注射；另一方面，卵的渗透压会受到油的影响，不合适的油会影响卵的活力，不利于吸取新鲜的卵质进行显微注射。
注射完成后，将柑橘木虱若虫用毛刷扫下并接到干净的九里香嫩梢上，在26℃室内饲养。
作为一种优选的可实施方式，本发明还提供一种将昆虫外源共生菌Wolbachia人工转染至柑橘木虱中的方法，首先，制备供体虫卵和受体若虫粘贴板：将无底纸的永久性双面涂胶透明胶带粘到载玻片上，稍微压紧。其次，在体视镜下从棉花叶背面把新鲜的烟粉虱卵挑出来，整齐排列于粘贴板的双面胶上并用卤代烃油700封住，再把柑橘木虱低龄若虫腹面朝上粘贴整齐在同一块粘贴板上。然后，在烟粉虱产卵后3h的烟粉虱卵的卵柄处，利用显微注射针吸取4～40nL卵质后，注射入柑橘木虱低龄若虫腹面胸板与腹板之间。注射完毕后，将柑橘木虱若虫用小毛刷轻轻扫下并接到干净的九里香嫩梢上培养。
本发明还请求保护所述方法在利用沃尔巴克氏菌的胞质不亲和功能调控柑橘木虱种群生殖的应用。
与现有技术相比，本发明针对烟粉虱卵及其内共生菌Wolbachia的分布特点，建立有效的显微注射方法，能够提高显微注射后柑橘木虱若虫体内外源共生菌Wolbachia的含量，提高柑橘木虱成活率，方便卵质的抽取及注射。本发明提供的是一种适用于研究外源内共生菌对受体昆虫生物学特性影响的显微注射方法，可用于受体昆虫生殖调控等领域的研究，也可为对受体昆虫开展基因编辑等研究提供实施途径。
附图说明
图1为柑橘木虱显微注射位点示意图。
图2为吸取烟粉虱卵的卵质示意图。
图3为烟粉虱产卵后3～9h，沃尔巴克氏菌(Wolbachia)在卵中的分布。
图4为烟粉虱产卵后12～24h，沃尔巴克氏菌(Wolbachia)在卵中的分布。
图5为烟粉虱产卵后36～72h，沃尔巴克氏菌(Wolbachia)在卵中的分布。
图6为烟粉虱产卵后96～120h，沃尔巴克氏菌(Wolbachia)在卵中的分布。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1显微注射方法
1.制备供体昆虫烟粉虱卵及受体昆虫柑橘木虱若虫粘贴板，具体制备方法如下：
(1)将载玻片清洗干净，用75％酒精喷洒后擦干净，以对载玻片消毒；
(2)将无底纸的永久性双面涂胶透明胶带粘到载玻片上，稍微压紧；这种双面胶粘性比普通双面胶粘性低，有利于把注射后的柑橘木虱若虫取下来，而粘性太强在柑橘木虱若虫取下过程中容易死亡。
2.烟粉虱卵及柑橘木虱若虫的收集和处理。
(1)取产卵期AsiaⅡ7型烟粉虱成虫25头，接入夹有棉花叶片的叶片笼中，产卵2小时，将烟粉虱成虫吸走然后取出叶片；
(2)在体视镜下用镊子或者昆虫针从棉花叶背面把新鲜的烟粉虱卵轻轻挑出来，整齐排列于粘贴板的双面胶上，卵柄粘贴方向为朝向显微注射针头，之后用卤代烃油700将烟粉虱卵封住；
油封住卵能减缓卵壳在显微镜灯的烤灼下变硬，保持卵的新鲜，维持卵的渗透压；选用封卵的油不能太稠或者太稀，一方面不合适的油会溶解双面胶上的胶质，影响粘性，显微注射时卵会移动，不利于显微注射；另一方面，卵的渗透压会受到油的影响，不合适的油会影响卵的活力，不利于吸取新鲜的卵质进行显微注射；因此采用本发明的粘贴板及卤代烃油700可以显著提高显微注射的成功率；
(3)在同一块粘贴板上面把柑橘木虱低龄若虫腹面朝上粘贴整齐，柑橘木虱低龄若虫的尾部与烟粉虱卵的卵柄朝向一致。
3.烟粉虱卵共生菌的提取及柑橘木虱若虫的显微注射。
(1)进行显微注射前使用聚乙烯吡咯烷酮(PVP)液体润洗显微注射针，以防堵塞；
(2)在烟粉虱卵的卵柄附近，利用显微注射仪的针头吸取4～40nL卵质后，注射到柑橘木虱低龄若虫腹面胸板与腹板之间，注射情况见图1；
(3)卵的显微注射位置：卵柄附近；吸取卵质的具体情况见图2；
(4)显微注射：用5～10μm的显微注射针进行显微注射。使用NARISHIGE拉针仪制备显微注射针，参数为：Heat值为98℃，Magnet main值60，Magnet sub值20。
4.柑橘木虱若虫的饲养。
注射完毕后，把柑橘木虱若虫用小毛刷轻轻从粘贴板上轻轻刷下来，转移至干净的九里香嫩梢上26℃饲养。
实施例2荧光原位杂交技术研究Wolbachia在烟粉虱卵中的分布
1.实验方法
利用荧光原位杂交技术(FISH)研究共生菌沃尔巴克氏菌(Wolbachia)在烟粉虱产卵后，不同时间卵中的位置分布。
用Wolbachia 16S rRNA基因特异性荧光探针对烟粉虱卵内共生菌Wolbachia(W2-Cy3:5’-CTTCTGTGAGTACCGTCATTATC-3’)进行标记。
样本处理步骤如下：
(1)取产卵期AsiaⅡ7型烟粉虱成虫25头，接入夹有棉花叶片的叶片笼中，产卵2小时，将烟粉虱成虫吸走然后取出叶片，在体视镜下用镊子或者昆虫针从棉花叶背面把新鲜的烟粉虱卵轻轻挑出来；
(2)固定：随机挑选上一步的次生共生菌感染种群样本置于1.5mL离心管中，用ddH2O洗涤2次，加入Carnoy’s固定液(乙醇：氯仿：冰乙酸＝6：3：1)，将样品置于4℃条件过夜处理；
(3)漂洗：移除固定液，用50％乙醇漂洗样品3次，每次5min；
(4)脱色：移除漂洗液，加入6％过氧化氢乙醇脱色液，室温避光条件下脱色2d；
(5)杂交：移除脱色液，加入杂交缓冲液(20mMTris-HCl、PH 8.0、0.9MNaCl、0.01％SDS和30％甲酰胺)，同时加入10pmol/L Wolbachia特异性荧光探针，避光40℃水浴过夜处理；
(6)洗脱：移除杂交液，加入洗脱液(2×SSc和0.01％SDS)洗脱2次，每次10min；
(7)拍照：挑去烟粉虱卵样品装片，利用荧光倒置显微镜观察拍照。
2.实验结果
结果表明，烟粉虱产卵后3、6和9h时，共生菌Wolbachia在主要分布在卵柄处，而且荧光强度随着时间而降低，具体可见图3。烟粉虱产卵后12～24h时，共生菌Wolbachia从卵柄处转移至卵柄基部位置，且共生菌在卵基部分布范围逐渐增大，呈圆形，具体可见图4。烟粉虱产卵后36～120h时，共生菌Wolbachia从卵柄基部开始向卵端部移动，然后再从卵端部向卵基部移动，最终定殖在卵中部位置，具体可见图5和图6。烟粉虱产卵后3h时，共生菌Wolbachia在卵柄处达到峰值。且初产的烟粉虱卵没有发育完成，卵壳比较软易于进行显微注射操作，如果孵化时间过长，卵壳变硬，就难以用显微注射针抽取卵质。
因此烟粉虱产卵后3～9h是抽取卵质较佳的时间，而烟粉虱产卵后3h是用显微注射仪针头在烟粉虱卵抽取卵质的最佳时间，抽取卵质的最佳位置为卵柄。选用该时间和位置抽取卵质，卵质内可含有较多共生菌Wolbachia，显微注射后，柑橘木虱若虫体内的共生菌Wolbachia的含量也相对较多。且初产的烟粉虱卵没有发育完成，卵壳比较软易于进行显微注射操作。
实施例3
与实施例1相同的操作将磷酸缓冲液(PBS)显微注射进入柑橘木虱若虫体内。共注射5次，每次注射柑橘木虱若虫的个数为40个左右。旋动注射器旋钮(旋动一小格为20nL，旋动1/5小格即可)，将磷酸缓冲液(PBS)进入柑橘木虱若虫体内，每只若虫注射约4～6nL的PBS，结束注射后将注射器移至下一只柑橘木虱若虫。注射完毕后统计柑橘木虱若虫的存活情况，具体数值见表1。
表1注射磷酸缓冲液(PBS)的柑橘木虱若虫的存活情况
采用相同的操作将烟粉虱卵的卵质显微注射入柑橘木虱若虫体内。共注射5次，每次注射柑橘木虱若虫的个数为40个左右。注射完毕后统计柑橘木虱若虫的存活情况，具体数值见表2。
表2注射烟粉虱卵的卵质的柑橘木虱若虫的存活情况
可见注射卵质的柑橘木虱与对照磷酸缓冲液的柑橘木虱存活率差异不显著，本发明的显微注射方法与结果是可靠的。另外，在相同条件下，选择了柑橘木虱虫卵和柑橘木虱若虫作为供受体进行注射，是因为将烟粉虱卵质注射入柑橘木虱卵内，目前难以保证卵的正常孵化，而成虫免疫系统较若虫完善，不利于Wolbachia定殖，所以选择柑橘木虱若虫作为受体进行注射。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种将昆虫外源共生菌Wolbachia人工转染至柑橘木虱中的方法，其特征在于，Wolbachia感染的烟粉虱产卵后3～9h，用显微注射针从烟粉虱卵柄处吸取卵质，再把卵质注射到柑橘木虱若虫中。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述Wolbachia感染的烟粉虱为AsiaⅡ7型烟粉虱。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述吸取卵质的时间为烟粉虱产卵后3h。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述吸取卵质的量为4～40nL。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述柑橘木虱若虫的注射位置为柑橘木虱若虫的腹面。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，柑橘木虱若虫的注射位置为柑橘木虱若虫的腹面的胸板与腹板之间。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述烟粉虱卵的固定方法为将烟粉虱卵排列于粘贴板的双面胶上，并用油封住；所述柑橘木虱若虫的固定方法为将柑橘木虱若虫腹面朝上，粘贴在与固定烟粉虱卵相同粘贴板上。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述油为卤代烃油700。
9.权利要求1～8任一所述方法在利用沃尔巴克氏菌的胞质不亲和功能调控柑橘木虱种群生殖的应用。
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