CN103947607A - 一种草鱼抗细菌性败血症品系的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种草鱼抗细菌性败血症品系的构建方法：a）选择亲鱼，对亲鱼进行PIT电子标记，待其性腺成熟后注射激素催熟，自然受精，自受精卵孵化至夏花、鱼种培育、1龄鱼、2龄鱼培育均饲养在同一池塘中；b）分别在夏花和2龄鱼阶段用致病菌人工感染子代，感染后观察19-23天，剩余个体作为抗病群体；c）采用亲子鉴定方法对获得的抗病群体进行后裔鉴定，从亲鱼中挑选出抗病力强的亲鱼，第二年对获得的抗病力强的亲鱼配组繁殖，建立草鱼抗细菌性败血症品系。本发明的方法避免了环境效应，能确保筛选所获得的抗病亲本是真正遗传优良的亲本，保证了培育的抗病品系具备优异的抗病能力，同时该方法更加易于操作，适用于大规模的抗病育种。

Description

一种草鱼抗细菌性败血症品系的构建方法

技术领域

本发明涉及水产遗传育种领域，具体地说，涉及一种草鱼抗细菌性败血症品系的构建方法。

背景技术

草鱼是草食性鱼类，也是我国优良的传统淡水渔业和淡水养殖的主要对象，草鱼养殖在我国已有1700多年的历史。2012年，我国草鱼产量为444多万吨，占我国淡水养殖鱼类总产量的20%（渔业统计年鉴，2012），在世界淡水养殖鱼类中产量排名第一位。但草鱼易受病害的危害，包括寄生虫、细菌、病毒等，每年给草鱼养殖业带来了巨大的经济损失。

细菌性败血症也称为细菌性出血病、爆发性出血病，最早发现于20世纪70年代末至80年代初，是由致病性嗜水气单胞菌（A.hydrophila）引起的急性转染病，从夏花鱼种到成鱼均可感染，严重地阻碍了草鱼养殖业的发展。为了控制这个疾病，已经使用了药物治疗、接种疫苗等传统的方法，但由于药物和疫苗种类的数量有限，导致传统的方法有其局限性。长远来说，通过选育出抗病或抗逆性强的草鱼新品种（系）来增强草鱼抵抗疾病传染的能力，这才是一种非常重要的途径。

综上所述，开展草鱼抗细菌性败血症品种（系）选育是养殖产业进一步发展需要解决的关键技术之一。

中国专利文献CN201110292533.8，公开日2012.04.11，公开了一种鱼类新品系快速选育方法，包括以下步骤：a．亲鱼的选择：在所有亲鱼中，选出活泼、遗传性好、体重大于平均体重15～20%的亲鱼，作为进行繁殖的亲本；b．亲本标记：对每尾亲本进行个体标记，每尾亲本具有独立的标记号；c．构建家系：亲本性腺成熟后，对亲本人工注射激素溶液，雌雄亲本采用人工授精获得受精卵，对所得受精卵分别单独孵化、培育，建立家系；d．家系培育：每个家系都分别饲养，培育至40～50克时，不同家系中的每尾子代进行个体标记，每尾子代本具有独立的标记号，所有子代混养在同一个池塘中；e．确定优势亲本组合：将亲本子代培育至商品鱼，比较各个家系中亲本子代的生长状况，确定生长状况高于平均生长状况的家系为优势家系；根据各优势家系中子代的标记号确定亲本来源及亲本标记号；f．建立新品系：第二年用优势家系中的亲本繁殖，繁育的子代鱼苗即为快速生长新品系。通过采用以上技术方案，可在较短时间内选育出生长优势相对比较明显的新品系，此项技术适用于四大家鱼、鲟科鱼类等性成熟时间比较长的鱼。然而，虽然该专利文献公开了适用于性成熟时间比较长的鱼的新品系的繁殖方法，但是其仅仅公开了技术路线，并没有公开特定鱼类新品系的选育方法。另一方面，本专利申请的发明人认为，品系选育过程中环境条件对选育效果影响较大，是不可忽略的，将家系分开培育在不同的环境下直到培育至40～50克时，才注射PIT电子标记进行同池养殖对生长性状进行选育，并不能确保所得优势家系是遗传优良的家系，后续所确定的亲本来源也并不一定就是基因最为优良的亲本。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种草鱼抗细菌性败血症品系的构建方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种草鱼抗细菌性败血症品系的构建方法，包括以下步骤：

a）选择亲鱼，对亲鱼进行标记，待亲鱼性腺成熟后人工注射激素溶液催熟，自然受精获得受精卵，自受精卵孵化至夏花、鱼种培育、1龄鱼、2龄鱼培育均饲养在同一池塘中；

b）分别在夏花和2龄鱼阶段采用致病性嗜水气单胞菌人工感染子代，感染后观察19-23天，剩余个体作为抗病群体；

c）采用亲子鉴定方法对步骤b）获得的抗病群体进行后裔鉴定，从亲鱼中挑选出抗病力强的亲鱼，第二年对获得的抗病力强的亲鱼进行配组繁殖，建立草鱼抗细菌性败血症品系。

步骤a）所述的“对亲鱼进行标记”是对亲鱼进行PIT电子标记。

步骤a）所述的“自然受精”是将亲鱼放置在产卵池中，采用冲水的方式模拟自然环境，让亲鱼进行产卵受精。

步骤a）所述的激素是促黄体素释放激素类似物LRH-A和地欧酮DOM的混合物。

步骤b）中所述的人工感染的方法具体是每尾子代草鱼注射0.1mL 3×10⁶CFU/ml的致病性嗜水气单胞菌菌液。

步骤b）中感染后观察21天，剩余个体作为抗病群体。

本发明优点在于：本专利申请的发明人充分认识到环境效应对品种选育的重要影响，将分子标记辅助育种与传统选育方法相结合，在同一环境下人工感染致病菌，同时在养殖时从孵化到人工感染都在同一环境（同一池塘）下培育，然后采用亲子鉴定的方法建立家系，从而能有效地减小环境的影响，避免了环境效应，确保筛选的抗病亲本是真正遗传优良的亲本，保证了培育的抗病品系具备优异的抗病能力。这与现有技术中先建立家系并培育在不同环境下，然后再进行标记和筛选的方法相比，效果更明显。且本发明构建抗病品系过程中，子代草鱼为亲鱼自然受精获得，也进一步克服了人为等因素的影响。另外，本发明的方法中，致病菌感染浓度恰当，子代草鱼抗病群体筛选时间合理，标记方法简单，在同一池塘饲养，均使得抗病品系的培育过程更加快捷，操作更简单，适用于有较大规模的良种场或国家良种基地进行草鱼的抗病育种。

具体实施方式

下面对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1

1）从国家级“四大家鱼”原种场包括江苏邗江长江系家鱼原种场、江西瑞昌长江四大家鱼原种场和湖北石首老河长江四大家鱼原种场收集原种120组草鱼亲鱼。采用从广东洪腾购买的PIT电子标记，给每尾亲鱼注射了电子标记，扫描后获得了一个标记号，以便配对繁殖时识别亲鱼来源。另外剪取每条鱼的鳍条。从中优选出行动活泼、遗传性能好的亲鱼，50组作为备选亲鱼。经过1年亲鱼培育挑选出20组性腺发育良好的亲鱼。性腺成熟后，人工注射激素溶液（促黄体素释放激素类似物LRH-A和地欧酮DOM的混合物，其使用剂量为LRH-A2 5μg/Kg+DOM 3mg/Kg）催熟。将所有繁殖亲鱼放置在产卵池中，采用冲水的方式模拟自然环境，让其进行产卵受精。自然受精后，自孵化至夏花、鱼种培育、1龄鱼、2龄鱼培育，饲养在同一池塘中。

2）夏花和2龄鱼阶段人工感染

①夏花生长阶段：按照每亩10万尾水花发塘，培育至夏花阶段，随机挑选4000尾，采用人工感染嗜水气单胞菌，菌株感染浓度为3×10⁶CFU/ml，每尾注射0.1mL，感染观察21天后，剩余个体作为抗病群体。21天后，存活498尾，剪取每尾鱼的鳍条组织固定于无水乙醇中。

②2龄鱼阶段：根据草鱼细菌性败血症发病情况，在7月份随机挑选1500尾草鱼，采用人工感染嗜水气单胞菌，菌株感染浓度为3×10⁶CFU/ml，每尾注射0.1mL，感染观察21天后，剩余个体作为抗病群体。21天后，存活315尾，剪取每尾鱼的鳍条组织固定于无水乙醇中。

3）采用亲子鉴定方法，对存活的498尾夏花和315尾2龄鱼进行微卫星标记遗传分析（具体方法参考文献：Jianjun Fu, et al. Multiplex microsatellite PCR sets for parentage assignment of grass carp (Ctenopharyngodon idella). Aquaculture international, 2013, 21:1195-1207.）后，建立抗病家系25个，筛选出8组抗病力强的亲鱼作为备用亲鱼。然后第二年利用筛选出的8组抗病力强的亲鱼配组、育苗，建立草鱼抗病品系。

4）将建立的抗病品系和野生群体的抗病力进行比较，方法如下：随机选取抗病品系和野生群体各600尾12月龄草鱼，注射PIT电子标记后每个群体平均分成三份，放养于3个塑料桶中，每个塑料桶400尾，暂养一周后，对1200尾草鱼注射嗜水气单胞菌，浓度为3×10⁵CFU/ml，观察21天，记录抗病品系与野生群体的存活率，结果见表1，发现抗病品系比野生群体的存活率提高了17.4%。

表1 抗病品系和野生群体的存活率比较

对比例1

1）从国家级“四大家鱼”原种场包括江苏邗江长江系家鱼原种场、江西瑞昌长江四大家鱼原种场和湖北石首老河长江四大家鱼原种场收集原种120组草鱼亲鱼。采用从广东洪腾购买的PIT电子标记，给每尾亲鱼注射了电子标记，扫描后获得了一个标记号，以便配对繁殖时识别亲鱼来源。另外剪取每条鱼的鳍条。从中优选出行动活泼、遗传性能好的亲鱼，50组作为备选亲鱼。经过1年亲鱼培育挑选出20组性腺发育良好的亲鱼。性腺成熟后，人工注射激素溶液（促黄体素释放激素类似物LRH-A和地欧酮DOM的混合物，其使用剂量为LRH-A2 5μg/Kg+DOM 3mg/Kg）催熟。将所有繁殖亲鱼放置在产卵池中，采用冲水的方式模拟自然环境，让其进行产卵受精。自然受精后，对所得受精卵分别单独孵化、培育，建立家系。每个家系都分别饲养，培育至夏花时，对不同家系中的每尾子代进行个体标记，每尾子代具有独立的标记号，所有子代混养在同一个池塘中。

2）夏花和2龄鱼阶段人工感染

①夏花生长阶段：随机挑选4000尾，采用人工感染嗜水气单胞菌，菌株感染浓度为3×10⁶CFU/ml，每尾注射0.1mL，感染观察21天后，剩余个体作为抗病群体。21天后，存活463尾，剪取每尾鱼的鳍条组织固定于无水乙醇中。

②2龄鱼阶段：根据草鱼细菌性败血症发病情况，在7月份随机挑选1500尾草鱼，采用人工感染嗜水气单胞菌，菌株感染浓度为3×10⁶CFU/ml，每尾注射0.1mL，感染观察21天后，剩余个体作为抗病群体。21天后，存活359尾，剪取每尾鱼的鳍条组织固定于无水乙醇中。

3）采用亲子鉴定方法，对存活的463尾夏花和359尾2龄鱼进行微卫星标记遗传分析（具体方法参考文献：Jianjun Fu, et al. Multiplex microsatellite PCR sets for parentage assignment of grass carp (Ctenopharyngodon idella). Aquaculture international, 2013, 21:1195-1207.）后，建立抗病家系23个，筛选出7组抗病力强的亲鱼作为备用亲鱼。然后第二年利用筛选出的7组抗病力强的亲鱼配组、育苗，建立草鱼抗病品系。

4）将建立的抗病品系和野生群体的抗病力进行比较，方法如下：随机选取抗病品系和野生群体各600尾12月龄草鱼，注射PIT电子标记后每个群体平均分成三份，放养于3个塑料桶中，每个塑料桶400尾，暂养一周后，对1200尾草鱼注射嗜水气单胞菌，浓度为3×10⁵CFU/ml，观察21天，记录抗病品系与野生群体的存活率，结果见表2，发现抗病品系比野生群体的存活率提高了9.0%，与实施例1抗病品系的存活率相比，差异显著（P<0.05）。

表2 抗病品系和野生群体的存活率比较

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种草鱼抗细菌性败血症品系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

a）选择亲鱼，对亲鱼进行标记，待亲鱼性腺成熟后人工注射激素溶液催熟，自然受精获得受精卵，自受精卵孵化至夏花、鱼种培育、1龄鱼、2龄鱼培育均饲养在同一池塘中；

b）分别在夏花和2龄鱼阶段采用致病性嗜水气单胞菌人工感染子代，感染后观察19-23天，剩余个体作为抗病群体；

c）采用亲子鉴定方法对步骤b）获得的抗病群体进行后裔鉴定，从亲鱼中挑选出抗病力强的亲鱼，第二年对获得的抗病力强的亲鱼进行配组繁殖，建立草鱼抗细菌性败血症品系。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a）所述的“对亲鱼进行标记”是对亲鱼进行PIT电子标记。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a）所述的“自然受精”是将亲鱼放置在产卵池中，采用冲水的方式模拟自然环境，让亲鱼进行产卵受精。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a）所述的激素是促黄体素释放激素类似物LRH-A和地欧酮DOM的混合物。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b）中所述的人工感染具体是每尾草鱼注射0.1mL 3×10⁶CFU/ml的致病性嗜水气单胞菌菌液。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b）中感染后观察21天，剩余个体作为抗病群体。