CN101810148A - 牙鲆优良品种的杂交育种方法 - Google Patents

Abstract

一种牙鲆优良品种的杂交育种方法，采用人工选择、杂交、生长性能评定和抗感染能力测定等技术建立了牙鲆高产杂交品种的培育方法。主要包括抗感染杂交亲本的筛选和快速生长杂交亲本的筛选、不同国家来源牙鲆的杂交、杂交苗种生长性能和抗感染能力的测定等。该方法具有针对性强、效率高、效果明显以及易于操作等特点，杂交牙鲆鱼苗的生长速率较普通牙鲆鱼苗提高了30％左右，成活率比普通牙鲆鱼苗提高了30％以上。该技术为海水鱼类高产抗感染品种培育开辟了新的技术途径，是一种能在鱼类良种培育中应用的高产优良品种培育方法，适宜在养殖鱼类上推广应用，对提高鱼类养殖产量具有重要意义和应用价值。

Description

牙鲆优良品种的杂交育种方法

技术领域：

本发明属于水产养殖技术，是一种能在鱼类高产抗感染良种培育中应用的杂交育种方法。

背景技术：

牙鲆(Paralichthys olivaceus)广泛分布于中国、日本以及韩国海域。是我国海水养殖鱼类的主导品种之一，在我国北方及东南沿海广泛进行工厂化养殖和网箱养殖，其产值在水产业中占有相当大的比重。目前国内牙鲆育苗厂家遍布山东、河北、辽宁、浙江、福建等沿海省市，特别是近几年牙鲆养殖业从山东逐渐扩展到福建，成为一个以北方为主、南方为辅的全国性海水鱼类养殖主导品种。近年来，国内牙鲆鱼苗的年产量约在4000万尾，成鱼养殖产量为30000吨以上，年产值20多亿元。但是，随着牙鲆养殖业的快速发展，一些问题相继出现，例如，近亲交配现象日趋严重，导致牙鲆种质退化、生长速度降低、抗病力下降，病害发生日趋严重。在苗种培育中白化病、肠道白浊、鳗弧菌病、纤毛虫感染等疾病严重影响了牙鲆苗种的正常培育，使牙鲆苗种养成率较低。每年由于病害造成鲆鲽鱼类养殖业经济损失20多个亿。同时，国内牙鲆育苗基地的亲鱼均存在野生亲鱼补充不及时，亲鱼老化、近亲交配等问题。由于近亲交配导致牙鲆生长速度减慢、繁殖性能和存活率降低；同时近交还能导致基因频率的变化和稀有基因的丢失，导致遗传多样性降低，损害育种的遗传基础(李思发等，2005)。生长变慢以及病害频发已成为限制我国牙鲆养殖业可持续发展的瓶颈因子。另外，牙鲆多代人工繁殖苗种的高温耐受力不强，夏天难以在南方的池塘和海上网箱度夏，也影响了牙鲆在东南沿海省市的进一步推广和养殖。因此，牙鲆养殖业的发展迫切需要培育高产抗病的优良品种。

杂交是指不同种类之间或者同一种类的不同地理群体之间进行交配培育后代的方式。由于两个亲本之间在遗传距离上相差较远、因而杂交的后代，即杂交子一代在生长性能和抗病原微生物感染能力等方面通常优于双亲，这种现象就称为杂交优势。杂交育种是作物育种中最重要的方法之一，迄今为止，在一些粮食作物中已经通过不同种类杂交培育出了一些在生长性能上具有明显优势的杂交品种，例如杂交水稻和玉米等。而有关海水鱼类杂交品种培育及通过杂交技术提高生长和抗感染能力的研究，目前国内外尚未见报道。

国内近几年在牙鲆遗传育种研究方面，主要开展了人工雌核发育培育单性苗种的研究工作(王新成等，1997；王晓清等，2006；杨景峰等2009)，同时，还开展了一些分子标记筛选和遗传多样性评价、种质鉴定以及抗病相关MHC基因标记筛选等方面的研究工作，如邹曙明等(2000)采用RAPD技术对牙鲆和大菱鲆养殖群体遗传结构进行的检测分析；尤峰等(2001)采用同工酶技术对山东近海牙鲆和养殖牙鲆的遗传多样性进行了分析；Liu等(2005a，b)利用微卫星标记和AFLP技术评价牙鲆养殖群体和野生群体的遗传结构，表明养殖群体的遗传多样性具有一定程度的下降；陈微等(2005)开展了牙鲆微卫星标记筛选和遗传多样性的分子研究；张玉喜等(2006)分析了牙鲆抗病鱼和不抗病鱼的MHC基因多态性，初步筛选到抗病相关的MHC基因型。但有关通过不同国家来源的牙鲆进行杂交培育高产抗感染新品种的研究，目前尚未见报道。

发明内容：

本发明的目的是为了建立高产抗感染杂交牙鲆新品种培育方法，为海水鲆鲽鱼类高产抗感染良种培育提供技术方法，解决海水鲆鲽鱼类缺乏高产抗感染优良品种培育方法的问题，为海水鱼类养殖业提供高产抗感染杂交优良品种培育的技术手段。

本发明其技术内容如下：本发明建立了牙鲆高产杂交品种培育的技术方法，主要包括：一、杂交亲本的筛选；二、杂交；三、杂交苗种生长性能评定；四、杂交苗种抗感染能力测定。

一、杂交亲本的筛选：包括：1、抗感染杂交亲本的筛选，2、快速生长杂交亲本的筛选；

1、抗感染杂交亲本的筛选，如下2种方法可用其中一种进行抗感染亲本的筛选：

(1).自然选择抗感染亲本：在每年夏季高温季节，调查牙鲆养殖场的鱼苗患病和存活情况，选择病害发生严重的池塘，收集池塘中因为水温高导致病原菌感染发病后存活下来的鱼苗，一般选择70-80％以上的鱼苗死亡、而只有约20-30％的鱼苗存活下来的鱼苗；将这些鱼苗培育成亲鱼，达到性成熟，作为杂交的牙鲆抗感染群体；抗感染群体的养殖和繁殖按照常规方法进行。

(2)、通过病原菌感染选择抗感染亲本：采用人工培养的病原菌弧菌感染牙鲆鱼苗或鱼种，病原弧菌的培养按常规方法进行；感染采用鱼体浸泡法进行，将病原菌培养物稀释成75、150、300、600和1200倍等不同浓度，然后将750-1500尾鱼苗浸泡在含有不同浓度病原菌的海水中，感染3-8小时后，将鱼苗转到新鲜海水中养殖观察；感染10-30天后计算不同浓度组鱼苗的存活率，收集存活率达20-30％的感染组中的存活鱼苗，培育为亲鱼，用作杂交的抗感染亲本。

2、快速生长杂交亲本的筛选：

收集来自中国黄海和韩国、日本国的牙鲆鱼苗，选择不同来源鱼苗中规格比较整齐、体质健壮的鱼苗进行培育和筛选，当鱼苗生长至9-12厘米时，从5000-10000尾鱼苗中按1％选出个体大的50-100尾鱼苗进行养殖，将这些鱼苗培育成熟，作为杂交的快速生长亲本。

二、杂交：

利用获得的抗感染亲本和/或快速生长杂交亲本，通过中国牙鲆-韩国牙鲆、中国牙鲆-日本牙鲆和韩国牙鲆-日本牙鲆等不同交配方式进行杂交；将中国牙鲆抗感染群体的雄鱼或雌鱼分别与不同国家的有快速生长能力的雌鱼或雄鱼进行配对繁殖建立杂交组合，或将韩国牙鲆与日本牙鲆交配建立杂交组合；在杂交鱼苗临近孵化出膜时，将其转移到育苗缸中进行苗种培育，每缸培育一个组合；每立方米水体培育3000-5000尾仔鱼。

三、杂交苗种生长性能的评定：

当杂种鱼苗生长至9-12厘米时，随机取200-300尾鱼，每个杂交组合采样40-60尾鱼苗测量体长和体重，作为放养时的体长和体重，将不同杂交组合放在规格相同的水泥池进行分池养殖，或者对不同组合进行标记后放在同一水泥池中进行养殖；在养殖8-15个月后收集各杂交组合鱼苗进行体长和体重测量，每个组合的鱼苗全部测完或采样40-60尾鱼苗进行测量，计算各个组合体长、体重的平均数，利用日增重率(养殖期间增加的重量/实际养殖时间)评价不同杂交组合的生长性能。日增重率越高，生长速度越快，将生长快速的杂交组合选择出来作为高产杂交优良品种进行养殖和推广。

四、杂交苗种抗感染能力测定：采用如下方法进行杂交苗种的抗感染能力测定：

通过病原菌胁迫测定杂交苗种的抗感染能力：当杂交组合鱼苗培育到9-12厘米时，从各组合中选取100-150尾鱼苗放在含有鳗弧菌的海水中进行胁迫，将培养好的病原弧菌菌液用生理盐水稀释成浓度为15-20OD的菌液，将上述菌液用120-240倍的海水稀释，将50-75尾不同杂交组合鱼苗放在上述含菌液的海水中浸泡3-8小时，然后将鱼苗转到新鲜海水中培育，在感染后10-20天内计算各杂交组合鱼苗的存活率，根据存活率高低确定各杂交组合鱼苗的抗感染能力；将存活率在60％以上的组合定为抗感染能力强的杂交组合，在25-59％之间的组合定为抗感染能力中等杂交组合，在24％以下的组合确定为抗感染能力差的组合；将抗感染能力强的杂交组合选择出来，作为抗感染杂交优良品种进行养殖和推广。

经过上述人工选择、杂交、生长性能评定以及抗感染能力测定培育的杂交牙鲆高产苗种具有稳定的快速生长和抗感染性状，可以作为高产抗感染优良品种进行大量繁殖和推广应用。

本发明与已有技术对比其特点是：

1、本发明采用群体选育、种内杂交、生长速率评定以及抗感染能力测定等技术，以牙鲆为材料首次建立了我国高产牙鲆新品种杂交育种方法，培育出生长速度快、抗感染能力强的杂交牙鲆优良品种，生长速率较普通牙鲆提高30％以上。

2、本发明首先采用群体选育技术从高温胁迫下患病后存活的牙鲆鱼苗中筛选出抗感染力强的鱼作为抗感染群体，随后，收集了不同国家的不同地理群体，采用种内杂交技术将抗感染群体与不同地理群体进行交配建立杂交组合，然后采用生长速率评定技术从大量的杂交组合中筛选出快速生长的杂交组合，同时，采用人工感染技术评价不同杂交组合的抗病性能，并从大量的杂交组合中筛选出抗鳗弧菌感染能力强的杂交组合。

3、本发明具有操作简单、效率高、效果明显等特点，培育出的高产抗感染牙鲆杂种鱼苗不仅生长速率较对照组提高了30％左右，而且养殖成活率也提高了30％以上。通过推广牙鲆高产杂交苗种，可以将牙鲆的养殖产量提高30％左右，推广后每年将增加产值10多亿元。

4、本发明建立的高产杂交牙鲆优良品种培育方法为鱼类高产抗逆品种培育开辟了新的技术途径，适宜在所有养殖鱼类上进行推广应用，对养殖鱼类高产抗病良种培育具有重要意义和应用价值，在不同鱼类推广应用后必将产生巨大的经济和社会效益。

具体实施方式：

近几年来，我们以来自不同国家的不同地理群体牙鲆为材料，采用群体选育、杂交、生长性能评定和抗感染能力测定等技术，创建了一套高产杂交牙鲆新品种培育的技术方法，采用该方法培育出了生长速度快、抗感染能力强的杂交牙鲆优良品种，并进行了示范推广。

下面以杂交牙鲆优良品种培育为例，对本发明的技术内容进行详细叙述：

本发明其技术内容如下：主要包括：一、杂交亲本的筛选；二、杂交；三、杂交苗种生长性能评定；四、杂交苗种抗感染能力测定。

一、杂交亲本的筛选：包括：1、抗感染杂交亲本的筛选，2、快速生长杂交亲本的筛选。

1、抗感染杂交亲本的筛选，如下2种方法可用其中一种进行抗感染亲本的筛选：

(1).自然选择抗感染杂交亲本：每年夏季7-10月份山东、辽宁、河北、浙江和福建等沿海省市海水温度较高，病原微生物也较多，牙鲆苗种极易出现各种疾病，特别是鳗弧菌等细菌性疾病，常常导致养殖的牙鲆鱼苗大批死亡，但有些抗逆能力强的鱼苗存活下来。因此，在7-10月份高温季节，调查牙鲆养殖场的海水温度和鱼苗患病以及存活情况，在确认某个养殖池塘的鱼苗是因为水温高导致鳗弧菌感染发病后存活下来的鱼苗，就将他们收集起来，一般应选择那些70-80％以上的鱼苗死亡、而只有约20-30％的鱼苗存活下来的才收集起来进行培养；将这些鱼苗培育成亲鱼，达到性成熟，作为牙鲆抗感染群体；抗感染群体一般应由至少50尾以上个体组成。抗感染群体的养殖和繁殖按照常规方法进行。近几年来，共调查了山东、福建沿海地区的4个牙鲆养殖场，收集到在高温季节患鳗弧菌病后存活的牙鲆鱼苗300多尾，经过一年的养殖后，又有一些鱼苗相继死去，最后选择了近200尾体质好的鱼作为中国牙鲆抗感染群体进行培养和繁殖。

(2)、通过病原菌感染选择抗感染能力强的亲本：采用人工培养的病原菌弧菌感染牙鲆鱼苗或鱼种，病原弧菌的培养按常规方法进行；感染采用鱼体浸泡法进行，将病原菌培养物稀释成75、150、300、600和1200倍等不同浓度，然后将750-1500尾鱼苗浸泡在含有不同浓度病原菌的海水中，感染3-8小时后，将鱼苗转到新鲜海水中养殖观察；感染10-30天后计算不同浓度组鱼苗的存活率，收集存活率达20-30％的感染组中的存活鱼苗，培育为亲鱼，用作杂交的抗感染亲本。本发明中采用这种人工感染方法获得抗感染中国牙鲆鱼苗100多尾，其中50多尾培育成亲鱼，用作中国抗感染群体。

2、快速生长杂交亲本的筛选：

收集来自中国黄海和韩国、日本国的牙鲆鱼苗，选择不同来源鱼苗中规格比较整齐、体质健壮的鱼苗进行培育和筛选，当鱼苗生长至9-12厘米时，从5000-10000尾鱼苗中按1％选出个体大的50-100尾鱼苗进行养殖，将这些鱼苗培育成熟，作为杂交的快速生长亲本。

本发明中，我们从黄海水域收集的牙鲆野生鱼苗中筛选出体质健壮、生长快的鱼苗100多尾，培育至性成熟，称为黄海群体，从韩国引进了牙鲆鱼苗，并从中筛选出150尾培育至性成熟，建立了韩国牙鲆群体，从日本引进了日本牙鲆鱼苗培育至性成熟，并从日本牙鲆后代鱼苗中筛选出快速生长个体100多尾，建立了日本牙鲆群体。上述各群体牙鲆鱼生长到体长为50～80cm，体重为1.5～4.5kg，达到性成熟。

二、杂交：

利用获得的抗感染亲本和/或快速生长杂交亲本作为基础群体，通过中国牙鲆-韩国牙鲆、中国牙鲆-日本牙鲆和韩国牙鲆-日本牙鲆等不同交配方式进行杂交。即将中国牙鲆抗感染群体的雄鱼或雌鱼分别与不同国家的有快速生长能力的雌鱼或雄鱼进行配对繁殖建立杂交组合，或将韩国牙鲆与日本牙鲆交配建立杂交组合。杂交时，从抗感染亲本和快速生长亲本中选取达性成熟的亲鱼，利用来自1尾雄鱼的精液和来自1尾雌鱼的卵子进行授精，将受精卵孵化成鱼苗，这样长成的鱼苗即为一个杂交组合。本发明中主要采用牙鲆抗感染群体的雄鱼或雌鱼分别与不同国家的牙鲆雌鱼或雄鱼进行配对繁殖建立杂交组合；同时，也将来源于韩国和日本的牙鲆亲鱼进行交配，建立杂交组合。牙鲆精卵的采集和人工授精按常规方法进行。将来自一尾雄鱼和一尾雌鱼交配产生的受精卵(即一个杂交组合)放在一个置于水泥池中的网箱中进行孵化，每个杂交组合的受精卵放一个网箱。在杂交鱼苗临近孵化出膜时，将其转移到育苗缸中进行苗种的培育，一般每立方米水体培育3000-5000尾仔鱼，牙鲆鱼苗的培育和管理按照常规方法进行。

本发明于2007-2010年4月中、下旬进行牙鲆杂交育种工作。在此期间，选取能挤出卵子的雌鱼和能挤出精液的雄鱼作为亲本进行杂交。采用中国抗感染群体x韩国群体或日本群体、韩国群体x日本群体；韩国群体x黄海野生群体等交配策略建立杂交组合，近几年来，利用抗感染群体雄鱼和雌鱼分别与韩国群体、日本群体雌鱼和雄鱼进行交配授精，共建立了不同杂交组合30多个。将上述杂交组合按照常规方法进行培养，随后进行生长性能和抗感染能力的评价。

三.杂交牙鲆鱼苗生长性能评定：

当杂交牙鲆鱼苗生长至9-12厘米时，从每个杂交组合中随机取200-300尾鱼苗，将不同杂交组合放在规格相同的水泥池进行分池养殖，或者对不同组合进行标记后放在同一水泥池中进行养殖。鱼苗的养殖和日常管理按常规方法进行。在养殖9-13个月收集各杂交组合鱼苗进行体长和体重测量。每个组合的鱼苗全部测完或采样40-60尾鱼苗进行测量，计算各个组合体长、体重的平均数。利用日增重率(养殖期间增加的重量/实际养殖时间)评价不同家系的生长性能。日增重率越大，其生长速度越快、生长性能越好。通过这种方法就可以筛选出生长性能好的杂交组合。

按照上述方法，本发明对23个牙鲆杂交组合进行了生长性能评定。经过11-13个月的养殖后，鲆杂1号、鲆杂2号、鲆杂3号、鲆杂4号和鲆杂5号等5个杂交组合的日增重率分别为：0.57、0.52、0.52、0.51和0.51，明显高于2个对照组的日增重率(0.33和0.34)，同时也高于其它杂交组合(见表1)，这5个杂交组合的生长速率比对照组以及其它杂交组合快30％-50％。由此可见，鲆杂1号、鲆杂2号、鲆杂3号、鲆杂4号和鲆杂5号等5个杂交组合是具有生长优势的杂交组合，与对照组相比，显示出明显的杂交优势，可以作为高产杂交良种进行推广应用。

表1：牙鲆不同杂交组合鱼苗生长性能评定

杂交      母本      父本     全长      体重       养殖    日均增重

组合      来源      来源     (平均值)  (平均值)   时间    率(AGR)¹

鲆杂1号   韩-55     日-12    28.40     218.08     380     0.57

鲆杂2号   韩-1      中抗-19  26.38     177.64     343     0.52

鲆杂3号   韩-16     日-2     27.6      197.23     80      0.52

鲆杂4号   韩-5      中抗-36  26.52     175.92     343     0.51

鲆杂5号   韩-156    黄海-14  26.39     171.48     336     0.51

鲆杂6号   中抗-5    韩-136   25.06     162.02     343     0.47

鲆杂7号   2007-50   韩-94    24.97     150.96     327     0.46

鲆杂8号   2007-19   韩-26    24.02     133.09     297     0.45

鲆杂9号   2007-51   韩-90    24.35     148.86     331     0.45

鲆杂10号  2007-51   韩-62    24.7      148.71     331     0.45

鲆杂11号  2007-68   韩-144   24.73     146.56     331     0.44

鲆杂12号  中抗-119  黄海-14  24.94     147.47     336     0.44

鲆杂13号  中抗-24   韩-8     25.4      156.67     380     0.41

鲆杂14号  韩-3      中抗19   25.56     150.41     380     0.39

鲆杂15号  韩-2      中抗-22  24.10     135.00     343     0.39

鲆杂16号  2007-50  韩-42    23.08  114.71    294    0.39

鲆杂17号  中抗-6   韩-91    23.86  138.64    373    0.37

鲆杂18号  中抗-8   韩-35    24.28  128.50    343    0.37

鲆杂19号  韩-101   中抗-22  23.75  126.13    343    0.37

鲆杂20号  中抗-3   韩-92    22.05  115.45    336    0.35

鲆杂21号  中抗-4   韩-95    23.96  129.51    373    0.35

鲆杂22号  中抗-17  韩-96    23.92  124.30    373    0.33

鲆杂23号  日-31    韩-194   21.89  100.21    343    0.29

对照1     黄海     黄海     21.59  96.53     289    0.33

对照2     中抗     中抗     22.6   119.31    347    0.34

注：表中‘中抗’为中国抗感染群体。

四)、杂交牙鲆鱼苗抗感染能力测定：

当杂交鱼苗培育到9-12厘米时，从各杂交组合中选取100-150尾鱼苗放在含有病原弧菌的海水中进行感染，将培养好的鳗弧菌菌液用生理盐水稀释成浓度为15-20OD(分光光度计测定的光吸收值)的菌液，将上述菌液用120-240倍的海水稀释，将50-75尾不同杂交组合鱼苗放在上述含菌液的海水中浸泡3-8小时，然后将鱼苗转到新鲜海水中培育，感染时水温控制在22-24℃；重复实验1次。每个组合感染用鱼养殖在1-1.5m³的玻璃钢水槽中。感染后，每天观察记录各个组合的状态及鱼苗死亡数量，并测量死亡个体的全长体重。在感染后的10-20天内计算各杂交组合鱼苗的存活率，根据存活率高低确定各组合鱼苗的抗感染能力。将存活率在60％以上的组合定为抗感染能力强的杂交组合，在25-59％之间的组合定为抗感染能力中等杂交组合，在24％以下的组合确定为抗感染能力差的组合。

按照上述标准，本发明从20多个杂交组合中，经过感染实验筛选出抗感染能力强的组合2个，分别命名为鲆杂3号和鲆杂4号，其感染后存活率分别为72.8％和61.8％，明显高于2个对照组的存活率(18.1％和20.8％)，也明显高于其它杂交组合的存活率(见表2)。其中，鲆杂3号组合的父本为日本群体2号个体，母本则为韩国群体的16号个体；鲆杂4号组合的父本为中国抗感染群体36号个体，母本为韩国群体的5号个体。结合不同杂交组合的生长性能评价结果，表明鲆杂3号和鲆杂4号两个杂交组合的生长优势非常明显，因此，这2个杂交组合兼具快速生长和抗感染能力强2个杂交优势，是具有重要应用价值和推广前景的杂交新品种，可以在海水养殖业中进行推广应用。

表2：牙鲆不同杂交组合鱼苗抗感染能力测定

杂交组合   母本      父本      感染后平均存活率(％)

鲆杂2号    韩-1      中抗-19   18.8

鲆杂3号    韩-16     日-2      72.8

鲆杂4号    韩-5      中抗-36   61.8

鲆杂6号    中抗-5    韩-136    26.3

鲆杂7号    2007-50   韩-94     17.0

鲆杂9号    2007-51   韩-90     12.8

鲆杂10号   2007-51   韩-62     23.1

鲆杂11号   2007-68   韩-144    23.2

鲆杂13号   中抗-24   韩-8      28.1

鲆杂14号   韩-3      中抗19    20.5

鲆杂15号   韩-2      中抗-22   3.3

鲆杂16号   2007-50   韩-42     30.6

鲆杂17号   中抗-6    韩-91     7.2

鲆杂18号   中抗-8    韩-35     19.2

鲆杂19号   韩-101    中抗-22   2.8

鲆杂20号   中抗-3    韩-92     6.3

鲆杂21号   中抗-4    韩-95     16.5

鲆杂22号   中抗-17   韩-96     9.7

鲆杂23号   日-31     韩-194    7.1

对照组1    黄海      黄海      18.1

对照组2    中抗      中抗      21.8

注：表中‘中抗’为中国抗感染群体。

五)、高产杂交牙鲆鱼苗示范养殖实施例：

2009年在山东海阳黄海水产有限公司生产牙鲆杂交鱼苗60万尾，这些苗种分别在山东莱州、山东威海、烟台和辽宁营口等地进行对比养殖实验。现将在其中几个养殖场进行的生产性对比养殖试验结果总结如下；

1).山东莱州明波水产有限公司生产性对比试验：2009年10月，该公司从海阳市黄海水产有限公司购入黄海所培育的杂交牙鲆苗种6000多尾，同时放养规格基本相同的当地普通牙鲆苗种。经过6个月的培育，在2010年4月8日进行测定，杂交牙鲆鱼苗平均体长达到309毫米，平均体重达到280克；而牙鲆对照组体长平均为282毫米，平均体重为222克。由此可见，采用本发明技术培育出的杂交牙鲆优良品种体重比对照组高27％以上，表现出明显的生长优势。

2).辽宁营口水产养殖有限公司生产性对比养殖实验：2009年7月该公司引进黄海所在海阳黄海水产有限公司培育的杂交牙鲆苗种20000尾进行养殖试验，同时采用当地培育的相同规格的牙鲆苗种进行对比。经过4个多月的对比养殖后，测量杂交牙鲆和对照牙鲆的体长和体重，发现杂交牙鲆平均体重为375±15克，而对照牙鲆平均体重为280±20克，杂交牙鲆体重比对照牙鲆高34％，即杂交牙鲆比对照牙鲆生长快34％。同时还发现，杂交牙鲆苗种的存活率比对照组成活率提高20％。由此证明，采用本发明技术培育的杂交牙鲆优良品种表现出明显的生长和抗病优势。

3)山东威海石岛大鱼岛养殖场生产性对比养殖试验：2009年7月该公司从海阳黄海水产有限公司引进黄海所培育的牙鲆杂交苗种10万尾进行养殖试验，杂交苗规格为7-8厘米，在威海海域的深海网箱中进行养殖，同时采用当地培育的相同规格的牙鲆苗种进行对比。经过4个多月的养殖后测量杂交牙鲆和对照牙鲆的体长和体重，发现杂交牙鲆体重达到350克左右，而对照牙鲆体重为270克左右，表明杂交牙鲆体重比对照牙鲆高30％左右；同时还发现，杂交牙鲆苗种的存活率比对照组高35％左右。

Claims (1)

1.一种牙鲆优良品种的杂交育种方法，其特征在于它的内容包括四个方面：(1)、杂交亲本的筛选；(2)、杂交；(3)、杂交苗种生长性能评定；(4)、杂交苗种抗感染能力测定；

(1)、杂交亲本的筛选：包括：A、抗感染杂交亲本的筛选，B、快速生长杂交亲本的筛选：

A、抗感染杂交亲本的筛选，如下2种方法可用其中一种进行抗感染亲本的筛选：

a.自然选择抗感染亲本：在每年夏季高温季节，调查牙鲆养殖场的鱼苗患病和存活情况，选择病害发生严重的池塘，收集池塘中因为水温高导致病原菌感染发病后存活下来的鱼苗，一般选择70-80％以上的鱼苗死亡、而只有约20-30％的鱼苗存活下来的鱼苗；将这些鱼苗培育成亲鱼，达到性成熟，作为杂交的牙鲆抗感染群体；抗感染群体的养殖和繁殖按照常规方法进行：

b、通过病原菌感染选择抗感染亲本：采用人工培养的病原菌弧菌感染牙鲆鱼苗或鱼种，病原弧菌的培养按常规方法进行；感染采用鱼体浸泡法进行，将病原菌培养物稀释成75、150、300、600和1200倍等不同浓度，然后将750-1500尾鱼苗浸泡在含有不同浓度病原菌的海水中，感染3-8小时后，将鱼苗转到新鲜海水中养殖观察；感染10-30天后计算不同浓度组鱼苗的存活率，收集存活率达20-30％的感染组中的存活鱼苗，培育为亲鱼，用作杂交的抗感染亲本；

B、快速生长杂交亲本的筛选：

收集来自中国黄海和韩国、日本国的牙鲆鱼苗，选择不同来源鱼苗中规格比较整齐、体质健壮的鱼苗进行培育和筛选，当鱼苗生长至9-12厘米时，从5000-10000尾鱼苗中按1％选出个体大的50-100尾鱼苗进行养殖，将这些鱼苗培育成熟，作为杂交的快速生长亲本；

(2)、杂交：

利用获得的抗感染亲本和/或快速生长杂交亲本，通过中国牙鲆-韩国牙鲆、中国牙鲆-日本牙鲆和韩国牙鲆-日本牙鲆等不同交配方式进行杂交；将中国牙鲆抗感染群体的雄鱼或雌鱼分别与不同国家的有快速生长能力的雌鱼或雄鱼进行配对繁殖建立杂交组合，或将韩国牙鲆与日本牙鲆交配建立杂交组合；在杂交鱼苗临近孵化出膜时，将其转移到育苗缸中进行苗种培育，每缸培育一个组合；每立方米水体培育3000-5000尾仔鱼；

(3)、杂交苗种生长性能的评定：

当杂种鱼苗生长至9-12厘米时，随机取200-300尾鱼，每个杂交组合采样40-60尾鱼苗测量体长和体重，作为放养时的体长和体重，将不同杂交组合放在规格相同的水泥池进行分池养殖，或者对不同组合进行标记后放在同一水泥池中进行养殖；在养殖8-15个月后收集各杂交组合鱼苗进行体长和体重测量，每个组合的鱼苗全部测完或采样40-60尾鱼苗进行测量，计算各个组合体长、体重的平均数，利用日增重率，即养殖期间增加的重量/实际养殖时间，评价不同杂交组合的生长性能；日增重率越高，生长速度越快，将生长快速的杂交组合选择出来作为高产杂交优良品种进行养殖和推广；

(4)、杂交苗种抗感染能力测定：

通过病原菌胁迫测定杂交苗种的抗感染能力：当杂交组合鱼苗培育到9-12厘米时，从各组合中选取100-150尾鱼苗放在含有鳗弧菌的海水中进行胁迫，将培养好的病原弧菌菌液用生理盐水稀释成浓度为15-20OD的菌液，将上述菌液用120-240倍的海水稀释，将50-75尾不同杂交组合鱼苗放在上述含菌液的海水中浸泡3-8小时，然后将鱼苗转到新鲜海水中培育，在感染后10-20天内计算各杂交组合鱼苗的存活率，根据存活率高低确定各杂交组合鱼苗的抗感染能力；将存活率在60％以上的组合定为抗感染能力强的杂交组合，在25-59％之间的组合定为抗感染能力中等杂交组合，在24％以下的组合确定为抗感染能力差的组合；将抗感染能力强、生长速度又快的杂交组合选择出来，作为高产抗感染杂交优良品种进行养殖和推广。