CN102203264A - 用于在昆虫细胞中外源蛋白质表达的昆虫衍生启动子 - Google Patents
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Abstract
用于在昆虫细胞中外源蛋白质表达的昆虫衍生启动子。在本发明中已经从昆虫(粉纹夜蛾)分离了调控多核苷酸序列，其驱动重要的昆虫蛋白质(hexamerin)在幼虫特定的演化阶段表达。所述调控多核苷酸序列促进外源基因在杆状病毒系统中比常规的多角体蛋白启动子更强的表达。另外，相对于生物技术工业中使用的常规杆状病毒，本发明的新的幼虫起源启动子与pL启动子的组合提高杆状病毒表达水平最高达到61％-375％(取决于侵染时间)。启动子pB2还驱动基因比多角体蛋白启动子更早表达，该特征对于正确的蛋白质折叠及翻译后修饰而言是重大优点。
Description
技术领域
本发明可以涉及生物技术领域。本发明涉及源自昆虫中hexamerin家族基因的调控多核苷酸序列(如启动子)，和它们用于在昆虫细胞和昆虫幼虫中外源蛋白质表达的用途，例如使用杆状病毒表达载体。
背景技术
杆状病毒-昆虫细胞表达系统是通用的和广泛地用来产生异源的(天然的和重组)蛋白质。这个系统被普遍地接受作为最强的和通用的系统之一以生产任何尺寸的重组蛋白质。它基于两个主要的特性：获得高含量的蛋白质表达和恰当的蛋白质折叠以变得生物活性，同时出现哺乳动物细胞的重要的翻译后修饰。另外，这个系统的开发时间较短，重组病毒的遗传稳定性非常高。杆状病毒基因组包含两个强的启动子，称为多角体蛋白启动子(pL)和启动子p10(p10蛋白质)，其中多角体蛋白启动子(pL)是高等生物中已知的最强启动子。pL启动子可用于控制几乎任何基因的表达。与基于转化动物细胞或转基因动物的任何其他先进生产系统相比，更快速和更便宜地设计杆状病毒用于蛋白质生产。尽管如此，先前的市售可得的启动子具有一些缺点，如它们促进基因表达的时期非常晚。那时，细胞机制被大大影响，并且随后在昆虫细胞中表达的异源蛋白质的产率可能被影响，由于不完全的加工和聚集。这些限制可以是由于寄主细胞因子随着病毒感染进行而恶化。为了解决那样问题，本发明建议使用具有稳定的表达的早期启动子，其至少与多角体蛋白启动子一样强，作为非常令人感兴趣的选择以抵消寄主细胞分解的影响，同时获得异源蛋白质的高表达水平。本发明希望强调这样的事实：幼虫(不成熟的)向成虫(成熟)形式的转变是通过在各种组织(昆虫变形发育)中激活和抑制许多基因实现的。在变形相关蛋白质中，存在被称为hexamerin的家族，其在最后的龄虫期间以非常高的水平表达。这些蛋白质主要是血淋巴储存蛋白质，其在后幼虫发育期间被使用。在五龄期的最初48小时期间能够观察到hexamerin的最高水平，其为该时期后的大约4倍(图1)。在本发明中已经开发了用于外源蛋白质表达的启动子家族，其脱离了编码上述幼虫蛋白质家族的序列。因此，本发明提供了启动子pB1(SEQ ID NO：1)和pB2(SEQ ID NO：2)，其与现有技术中使用的启动子相比更早期和更强。在本发明中已经分离了在特定的进展幼虫阶段驱动重要昆虫蛋白质表达的启动子。它们来自编码幼虫中蛋白质hexamerin的序列，并且可以用于构造任何表达载体(如杆状病毒表达载体)以便在多种昆虫细胞中表达异源蛋白质，优选来自草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)的sf9或sf21细胞。与构成这些新的启动子类似的调节序列已经在鳞翅目幼虫中被鉴定，但之前还未曾用于杆状病毒表达系统。
发明内容
简要说明
由此，本发明提供了来自调节hexamerin家族基因表达的序列的调控多核苷酸序列，如pB1(SEQ ID NO 1)和/或pB2(SEQ ID NO 2)。这些蛋白质在五龄期期间显示出最高的表达，在该幼虫发育期的最初48小时候以非常高的百分比，呈现出在短时期内非常快速的积聚(图1)。这些特征暗示这些蛋白质的表达是由强的启动子驱动的，这些启动子可用于形成更有效率的杆状病毒或任何其它表达载体，并且因此用于优化异源蛋白质的表达。在杆状病毒表达系统情况下，一旦蛋白质集中在分泌途径中，则启动子的早期活性是特别相关的，如果其他方式的话，则会受到细胞翻译后机制和分泌机制在杆状病毒感染的非常晚期改变的影响。
本发明的启动子的序列来自调节hexamerin家族基因(BJHSPl和BJHSP2)表达的序列，但是具有一些不包含在所述hexamerin家族基因原始调控核苷酸序列中的突变。所述·分离自粉纹夜蛾(Trichoplusiani)(T.ni)幼虫并通过质谱分析鉴定为在80KDa的带中(图2)。一旦蛋白质被鉴定，则分离编码它们的基因以及包含它们的各自启动子的上游序列。用于扩增各原始的启动子的引物在该专利中被指定。特征为SEQ ID NO：3和4的引物用于扩增原始的启动子，其最终起源于启动子pB1(SEQ ID NO：1)。特征为SEQ ID NO：3和4的引物5和6的引物用于扩增原始的启动子，其最终起源于启动子pB2。
本发明的启动子的主要优点，具体地pB2，是这样的启动子，与现在在杆状病毒表达系统中使用的已知的非常晚期启动子相比，它们产生更早和更强的目标蛋白质的表达。
在优选实施方案中，本发明还包括本发明的启动子pB1和pB2(优选pB2)与任何其它启动子例如pL或p10(优选pL)的组合。令人惊讶地，当进行这样的组合时，实现了协同作用。当测试包括pLpB2启动子的杆状病毒表达载体时，相对于仅仅使用pL启动子，目标蛋白质的表达水平被提高最高达到61％-375％(取决于侵染时间)。这个实施方案对本发明来说是非常重要的，因为现在启动子pL通常用于生物技术工业。
在其它优选的实施方案中，本发明还涉及本发明的启动子(pB1和pB2)的组合：pB1-pB1、pB2-pB2和pB1-pB2。
在哺乳动物细胞中没有检测到本发明的启动子的活性。因而，本发明还提供了两个安全的启动子用于开发杆状病毒重组体。
因此，本发明阐明(参见发明的详细说明)调控多核苷酸序列(启动子)，比现有技术中所涉及的那些更有效，可以衍生自任何位于编码hexamerin家族蛋白质的基因可读框上游的多核苷酸序列。因此，源自位于编码hexamerin家族蛋白质的基因的可读框上游任何多核苷酸序列的任何调控多核苷酸序列都包括在本发明的目标中。
仅用于本发明的目的，定义下列术语：
-调控多核苷酸序列：是通常位于允许基因转录的基因上游(朝有义链5′区域)的DNA区域。
-载体表达：″载体″用于在细胞内部传递外源的遗传物质。这个载体包含必要的调节序列以驱动克隆基因或基因的转录和翻译，由此转录和克隆DNA。杆状病毒表达载体优选用于本发明。
-杆状病毒：是传染性的病毒家族用于无脊椎动物，主要地感染昆虫和节肢动物。
-重组DNA：它是一种人造的DNA形式，通过组合或插入一个或多个DNA链被构建，由此组合通常不会出现在一起的DNA。重组DNA是通过添加相应的DNA入现有生物基因组内而产生的。重组蛋白质：通过重组DNA编码的蛋白质。
-早期表达：这个术语是指启动子开始表达目标蛋白质的时间。在本发明中，该时间起始于感染后16小时。
-更强的表达：这个术语是指任何目标蛋白质的表达，其水平与通过常规的杆状病毒启动子p10或pL所实现的表达水平相当或者更高。
-目标蛋白质：可以用于人和动物的蛋白质，其可以具有工业的、商业的或治疗的应用。
-生物工厂：遗传修饰或未遗传修饰的细胞或生物，其可以产生工业规模比例的蛋白质，具有许多应用包括治疗目的(抑制剂、酶、抗体、抗原等)或商业用途的主要或次级产品。
-部分片段：这个表达是指任何源自本发明的调控多核苷酸序列的部分片段，具有相同改进的性质：与现有技术的那些相比更早或者更强。
附图说明
图1：在粉纹夜蛾的首先四个进展阶段显示缺少80kDa带，其在后面被称为hexamerin(A)，在第五幼虫龄中的2天后出现了该带(B)。图C显示在第五幼虫龄的最初6天，密度测定法量化这个带。
图2：质谱分析鉴定80KDa带的方案。
图3：产生的表达载体，其仅携带启动子pB1序列或pB2结合pL序列(pLpB2)。
图4：昆虫sf21细胞和昆虫幼虫，其在不同的时期感染重组体杆状病毒后，表达绿色荧光蛋白(GFP)在不同的启动子控制下(pB1、pB2、pL和pLpB2)。在该图中，描述了感染72小时后的幼虫。
图5：通过利用不同的启动子插入杆状病毒载体(pB1、pB2、pL和pLpB2)在不同的感染后时间表达GFP(16-72h)和通过蛋白质印迹检测(A)。通过GFP带密度测定法(B)或通过细胞提取物的荧光(C)量化重组蛋白质。
具体实施方式
本发明提供调控多核苷酸序列如启动子序言和pB1和pB2，其特征分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，且来源于位于昆虫幼虫中编码hexamerin家族蛋白质的基因可读框上游的多核苷酸序列。本发明进一步设计使用这样的调控多核苷酸序列用于构造昆虫表达载体如杆状病毒和用于在细胞中优选昆虫细胞表达异源蛋白质。启动子pB1和pB2的序列分别来自T.ni hexamerin BJHSPl和BJHSP2，其在五龄期以高水平表达，并且在该时期的最初48小时期间以非常高的转录活性表达(图1)。
pB1序列包括1057个核苷酸(SEQ ID NO 1)，且源自编码BJHSPl蛋白质起始密码子的基因上游的5′区，BJHSPl是可以由保幼激素抑制的碱性蛋白1。通过使用两个特定的引物从T.ni基因组DNA扩增该序列：SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。然后，将该片段克隆在pGEM-Teasy商业载体中(Promega)。
pB2序列包括1041个核苷酸(SEQ ID NO 2)，且源自编码B JHSP2蛋白质起始密码子的基因上游的5′区，B JHSP2是可以由保幼激素抑制的碱性蛋白2。通过使用两个特定的引物从T.ni基因组DNA扩增该序列：SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。然后，将该片段克隆在pGEM-Teasy商业载体中(Promega)。
用BamHl和Sphl酶从pGEM-Teasy提取pB1和pB2序列，并且克隆至pFasTBac双向商业质粒(INVITROGEN)的那些位点中。这个pFasTBac双向载体被所提到的酶打开，其除去了杆状病毒启动子序列(获得的载体被命名为：pFBpB1和pFBpB2)。所有它们都呈现出了克隆位点以引入目标cDNA。这些用于形成重组体杆状病毒，其能够感染和在昆虫细胞和昆虫幼虫中复制。另外，通过用限制性内切酶Notl和Pstl(两个限制性位点来自pGemT easy载体)消化来提取pB2序列，并且克隆至pFasTBac1商业载体(INVITROGEN)相同的位点内，并且在pL启动子序列之后。获得的载体被命名为：pFBpLpB2。
因此，本发明的第一实施方案是指用于产生表达调控多核苷酸序列的方法：SEQ ID NO：1(pB1)和SEQ ID NO：2(pB2)。所述方法包括分离位于编码hexamerin家族蛋白质的基因的可读框上游任何多核苷酸序列的任何调控多核苷酸序列。一旦调控多核苷酸序列被测序，则它们通过传统手段被扩增。
在本发明的优选实施方案中，hexamerin可读框的上游多核苷酸序列属于昆虫，优选粉纹夜蛾。
本发明的第二实施方案是指调控多核苷酸序列：SEQ ID NO：1(pB1)、SEQ ID NO：2(pB2)，或其任何部分片段，其特征为包含源自位于编码hexamerin家族蛋白质的基因的可读框上游的任何调控核苷酸区域的任何序列。这些启动子序列呈递调控DNA基序，涉及转录活性的调节。因此，这些序列可以通过激素在幼虫发育期间调节，但其他信号也可能潜在地在细胞培养以及在表达载体上下文中。
在优选实施方案中，本发明的调控多核苷酸序列：SEQ ID NO：1(pB1)和SEQ ID NO：2(pB2)与任何其它调控多核苷酸序列组合，优选启动子pL(蛋白质polyedrin的启动子)或p10(蛋白质p10的启动子)，得到不同的组合：pLpB2、pLpB1、p10pB2和p10pB1。本发明提供了非常强的启动子序列，当pL序列(polyedrin启动子)与pB2序列组合时。
在其它优选实施方案中，本发明的调控多核苷酸序列：SEQ ID NO：1(pB1)和SEQ ID NO：2(pB2)被组合得到不同的组合：pB1pB2、pB1pB1(至少重复两次)和pB2pB2(至少重复两次)。
已经显示，串联定位的启动子提高了重组蛋白表达在细菌和植物中的效率(H′ichev AA等人，Genetika.198723：197-201；Kay R等人，Science.1987 Jun 5；236(4806)：1299-1302.)。
本发明的第三实施方案是指使用任何上述的调控多核苷酸序列用于构造表达载体，优选杆状病毒或质粒。
本发明的第四实施方案是指表达载体，其特征在于包括任何上述说明的调控多核苷酸序列和至少编码目标蛋白质的序列。在优选实施方案中，在载体是杆状病毒或质粒。
本发明的第五实施方案是指被表达载体转染的细胞，或者被重组病毒感染用作前一段落所述的载体。在优选实施方案中，细胞是昆虫细胞，优选来自草地夜蛾的sf9或sf21。
本发明的第六实施方案是指昆虫幼虫，其被上述的表达载体转化、转染或感染。
本发明的第七实施方案是指用于在昆虫细胞或昆虫幼虫中利用上述的表达载体产生重组蛋白质的方法，以及通过传统手段提取和纯化目标重组蛋白质。
本发明的第八实施方案是指使用所述表达载体用于产生重组蛋白质。
本发明的第九实施方案是指使用所述细胞用于产生重组蛋白质。
本发明的最后的实施方案是指使用所述昆虫幼虫作为生物工厂用于产生重组蛋白质。
根据布达佩斯条约的微生物保存
在2008年7月2日，这些质粒被保藏在西班牙典型培养物保藏中心(CECT)；University of Valencia，Spain，其保藏号：CECT 7431。
实施例
通过以下实施例充分阐明本发明，这些实施例不应该被解释为对本发明范围的限制。相反地，必须清楚地理解其它实施方案、改变和其等同可以被使用，这是本说明书可以暗示本领域技术人员的，而且不会离开本发明的主旨和/或所附权利要求的范围。
本发明的实施例表明与使用常规的启动子相比，蛋白质表达发生在感染后的更早期时间。此外，对于pB2和pLpB2启动子序列，与现有技术中获得的那些启动子(启动子pL)相比，表达水平在感染后时间早期和晚期都更高。
实施例1：通过本发明的昆虫启动子表达绿色荧光蛋白(GFP)
克隆GFP
通过Sphl限制性内切酶从pFBpLGFP质粒提取GFP，并克隆入pFBpB1或pFBpB2质粒的Sphl限制性位点内。获得的供体-表达质粒分别被命名为pFBpBIGFP和pFBpB2GFP。在所有情况中，都除去pL序列，因而GFP表达仅仅由于不同昆虫启动子自身的活性(图3)。
另一方面，两侧为Not I和PstI限制性位点的pB2启动子被连接至也被相同限制性内切酶打开的pFBpLGFP。所获得的供体-表达质粒被命名为pFBpLpB2GFP，并且所包含的GFP编码基因在双重启动子pL和pB2的控制下(图3)。
GFP-杆状病毒表达载体的构建
通过自动测序对所得到的质粒进行鉴定，并且用于产生重组杆状病毒、BocpB2GFP，BacpB1GFP和BacpLpB2GFP，使用
杆状病毒表达载体(Invitrogen，USA)，按照制造商的指导。简言之，将所得到的供体表达-质粒用于转化DHlOBacTM大肠杆菌(E.coli)细胞以易位进入重组杆粒。将1μg的每种杆粒用于转染1x 106 Spodoptera fnigiperda sf21细胞，使用
Reagent。在27摄氏度接种72小时后，获得Pl病毒储液。根据制造商的指导，扩增杆状病毒。将sf21昆虫细胞在BD BaculoGoldTM TNM-FH Insect Medium(BD Biosciences)上进行培养，其中BD BaculoGoldTM TNM-FH Insect Medium(BD Biosciences)补充了50mg/mL庆大霉素。根据相同的规程使用pFBpLGFP质粒获得了之前在我们实验室产生的杆状病毒BacpLGFP。
昆虫接种
随后以0.1cfu的感染复数感染细胞，并将细胞在感染后16、24、48或72小时通过在2000rpm下离心5分钟进行沉淀。
并且在感染后不痛时间在荧光显微镜中对感染的细胞进行拍照，照片显示在图4中。显著的是，与pL启动子相比，pB2和pLpB2启动子序列的早期(感染后16小时开始)活性以及二者的强度要更高，甚至在感染的后期(感染后48h和72小时)。pB1启动子还呈现出活性，尽管不如pB2或pL启动子强。
昆虫生长条件和接种
将五龄期粉纹夜蛾幼虫在腹足附近(朝向体腔)注射重组体杆状病毒，使用104-105pfu/幼虫剂量。感染的幼虫被保持在28摄氏度的生长箱中，并在72小时时收集。图4的下图显示pB1(低)、pB2和pL和pB2启动子的组合呈现出在昆虫幼虫中的活性，通过在幼虫组织中表达GFP蛋白质。蛋白质提取物的制备
将来自P6孔板的沉淀细胞(2x106细胞/孔以0.1pfu/孔感染)重悬浮在30μl 150mM NaCl，1％NP-40，0，1％SDS，50rnM Tris pH 8，蛋白酶抑制剂(
Roche)，2-巯基乙醇(RIPA缓冲液)中，在冰上保持30分钟，并且通过在4摄氏度，2000g下离心5分钟以除去细胞碎片。
蛋白质提取物的分析
在12％SDS(w/v)聚丙烯酰胺凝胶上分离40μg全部可溶性蛋白(TSP)。将蛋白质用考马斯亮蓝G-250(BioRad)染色，或者转移至硝化纤维膜上(Hybond C，GE Healthcare)，在PBS中用0.1％(v/v)吐温20(PBS-T)和4％脱脂乳(PBS-TM)封闭过夜，且与稀释1∶1000的GFP一抗(Chemicon)和在PBS-TM中稀释1∶500的肌动蛋白一抗(Sigma)孵育1小时。在PBS-T中清洗10分钟两次后，将膜与在PBS-TM中1∶2000稀释的过氧化物酶-偶联抗小鼠IgG或抗兔IgG(GE Healthcare)孵育1小时。在洗涤之后，使用Advanced ECL系统(GE Healthcare)根据制造商的知道检测特定的信号。
通过蛋白质印迹进行分析，得到图5的结果。再次证实pB2和pLpB2启动子显示了比pL启动子更早和更强的活性(图5)。通过使用TINA 2.0程序和使用肌动蛋白带归一化结果，测量GFP的特定带的密度。
荧光测定法检验
在485nm激发后使用GENIOS荧光计测量在535nm的40μgTSP的发射光。每个提取物通过测量3次，获得每个数值。结果显示在图5C中。再次明确观察到了pL序列置于pB2启动子5′上游的协同效应，与仅pL启动子相比，蛋白质产量提高61％至375％，依赖于感染后时间(图5)。
Claims (31)
1.用于开发表达调控多核苷酸序列的方法，其包括：
a)分离任何包括它们的相应调控多核苷酸序列的多核苷酸序列，其位于编码hexamerin家族蛋白质的基因的可读框上游；和
b)通过传统手段扩增步骤a)的调控多核苷酸序列。
2.根据权利要求1的方法，其特征为最终开发的调控多核苷酸序列特征为SEQ ID NO：1(pB1)和SEQ ID NO：2(pB2)。
3.根据权利要求1或2的方法，其特征为所述扩增是通过使用引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4用于开发pB1和通过使用引物SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6用于开发pB2而进行的。
4.根据权利要求1的方法，其特征为所述调控多核苷酸序列属于昆虫幼虫。
5.根据权利要求4的方法，其特征为所述昆虫幼虫是粉纹夜蛾。
6.调控多核苷酸序列，其来源于位于编码hexamerin家族蛋白质的基因可读框上游的任何多核苷酸序列。
7.根据权利要求6的调控多核苷酸序列，其特征为其为启动子。
8.根据权利要求6或7的调控多核苷酸序列，其选自SEQ ID NO：1(pB1)、SEQ ID NO：2(pB2)，或其任何部分片段，其来源于位于编码hexamerin家族蛋白质的基因的可读框上游的任何调控核苷酸区域的任何序列。
9.调控多核苷酸序列，其特征为包括权利要求6-8任一项的调控多核苷酸序列以及任何其它调控多核苷酸序列的序列。
10.根据权利要求9的调控多核苷酸序列，其中所述其他调控多核苷酸序列是蛋白质多角体蛋白的启动子或蛋白质p10的启动子。
11.根据权利要求9或10的调控多核苷酸序列，其特征为包括pB2序列(SEQ ID NO：2)及蛋白质多角体蛋白的启动子序列。
12.根据权利要求9或10的调控多核苷酸序列，其特征为包括pB1序列(SEQ ID NO：1)及蛋白质多角体蛋白的启动子序列。
13.根据权利要求9或10的调控多核苷酸序列，其特征为包括pB2序列(SEQ ID NO：2)及蛋白质p10的启动子序列。
14.根据权利要求9或10的调控多核苷酸序列，其特征为包括pB1序列(SEQ ID NO：1)及蛋白质p10的启动子序列。
15.调控多核苷酸序列，其特征为包括权利要求8中其任何序列的组合。
16.根据权利要求15的调控多核苷酸序列，其特征为包括pB1序列(SEQ ID NO：1)及pB2序列(SEQ ID NO：2)。
17.根据权利要求15的调控多核苷酸序列，其特征为包括pB1序列(SEQ ID NO：1)，所述pB1序列至少重复两次。
18.根据权利要求15的调控多核苷酸序列，其特征为包括pB2序列(SEQ ID NO：2)，所述pB2序列至少重复两次。
19.权利要求6-18的调控多核苷酸序列用于构造表达载体的用途。
20.根据权利要求19的用途，其中所述表达载体是病毒，优选杆状病毒。
21.根据权利要求19的用途，其中所述表达载体是质粒。
22.表达载体，其特征为包括权利要求6-18的任何调控多核苷酸序列及至少编码目标蛋白质的序列。
23.根据权利要求22的表达载体，其特征为其为病毒，优选杆状病毒。
24.根据权利要求22的表达载体，其特征为其为质粒。
25.由权利要求22-24的表达载体转化或转染的细胞。
26.根据权利要求25的细胞，其特征为它们是昆虫细胞优选来自Spodoptera frugiperda的sf9或sf21。
27.昆虫幼虫，其被权利要求22-24的表达载体转染、感染或转化。
28.用于生产重组蛋白质的方法，其包括用权利要求22-24的表达载体接种或转染昆虫细胞或昆虫幼虫，以及通过传统手段提取和纯化目标重组蛋白质。
29.权利要求22-24用于生产重组蛋白质的用途。
30.权利要求25或26的细胞用于生产重组蛋白质的用途。
31.权利要求27的昆虫幼虫作为生物工厂用于生产重组蛋白质的用途。
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