KR20110081810A - 곤충 세포에서의 외래 단백질 발현을 위한 곤충-유래 프로모터 - Google Patents
곤충 세포에서의 외래 단백질 발현을 위한 곤충-유래 프로모터 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 곤충 세포에서 외래 단백질 발현을 위해 곤충에서 유래된 프로모터에 관한 것이다. 유충의 특정 진화 단계에서 주요 곤충 단백질(헥사메린) 발현을 유래하는 조절 폴리뉴클레오티드 염기서열은 곤충(양배추은무늬밤나방)에서부터 분리된다. 상기에서 언급한 조절 폴리뉴클레오티드 염기서열은 상기 배큘로 시스템에서 종래의 폴리헤드린 프로모터에 비해 더 강한 외래 유전자 발현을 촉진한다. 게다가, 본 발명의 유충에서 유래한 새로운 프로모터와 pL 프로모터의 재조합은 배큘로바이러스 발현 수준을 생명공학 산업에서 사용된 종래의 배큘로바이러스에 대하여 61~375 %(감염 후 시간에 따라)까지 증가시켰다. 프로모터 pB2 또한 폴리헤드린 프로모터보다 더 빠른 시간에 유전자 발현을 유래하며, 이러한 점은 올바른 단백질 접힘 및 번역 후의 변형을 위한 큰 이점이다.
Description
본 발명은 생명공학 분야에 포함될 수 있다. 상기 발명은 곤충의 헥사메린 패밀리 유전자에서 유래된 조절 폴리뉴클레오티드 염기서열(프로모터와 같은) 및 곤충 세포 및 곤충 유충에서의 외래 단백질 발현을 위한 용도, 예를 들면 배큘로바이러스(baculovirus) 발현 벡터의 이용에 관한 것이다.
곤충의 배큘로바이러스 세포 발현 시스템은 용도가 다양하고, 이종 기원의 단백질(자생 및 재조합에 의한) 제조에 넓게 이용된다. 상기 시스템은 일반적으로 임의의 크기의 단백질 재조합 제조에 있어서 가장 강력하고 다용도의 하나로 인식된다. 상기 시스템은 높은 수준의 단백질 발현 달성 및 포유류 세포의 주요 번역 후 변형이 일어나는 동안 상기 단백질이 생물체에 작용하게 되는 올바른 접힘의 두 가지 주요 특성에 기반을 둔다. 게다가 상기 시스템의 발생 시간은 짧고 재조합 유전자의 안정성은 매우 높다. 상기 배큘로바이러스 게놈은 상위 유기체에서 가장 강력한 프로모터로 알려진 폴리헤드린(polyhedrin) 프로모터(pL) 및 p10 프로모터(p10 단백질)를 포함하고 있다. 상기 pL 프로모터는 사실상 임의의 유전자의 발현을 조절하는데 사용된다. 단백질 제조를 위한 배큘로바이러스는 변형된 동물 세포 또는 유전자 이식 동물에 기반을 둔 어느 다른 발달된 제조 시스템보다 더욱 빠르고 경제적이다. 그럼에도 불구하고 종래의 상업적으로 이용 가능한 프로모터는 유전자 발현을 촉진시키는 단계가 매우 느리다는 단점을 가지고 있다. 그와 동시에 세포조직이 크게 영향을 받고, 곤충 세포에서 발현된 이종기원 단백질 분야에서는 불완전한 과정과 응집 때문에 제 기능을 하지 못한다. 이러한 제한은 바이러스 감염 과정으로서 숙주세포인자의 악화 때문이다. 이러한 문제점을 해결하기 위해 본원 발명은 숙주세포 저하 효과 상쇄와 동시에 이종기원 단백질의 높은 발현수준을 달성하기 위한 매우 흥미로운 선택으로서, 적어도 폴리헤드린 프로모터만큼 강력하고 안정 발현을 하는 빠른(earlier) 프로모터의 용도를 제안한다. 본 발명의 목적은 유충(미숙)에서 성충(성숙)으로의 전이는 다양한 조직(곤충 변성 발생)에서 다수 세포의 활성화와 억제에 의해 달성된다는 사실에 주의를 상기시키는는 것이다. 변태와 연관된 단백질 중에서 마지막 유생기 동안 매우 높은 수준으로 발현되는 헥사메린(hexamerin)이라고 알려진 패밀리가 있다. 이러한 단백질은 대부분 후기 유생기 발생 동안에 사용되는 혈액림프 저장 단백질이다. 제 5 유생기 초기 48시간 동안의 헥사메린의 최고 수준은 그 기간이 지난 후보다 약 4배로 관찰 될 수 있다(도 1). 본 발명에서 외래 단백질 발현에 사용되는 패밀리 프로모터는 상기에서 언급한 패밀리 유충단백질을 암호화한 염기서열에서 출발하는 동안 발생된다. 그러므로 본 발명은 종래 사용되었던 프로모터와 비교하여 더 빠르고 강력한 pB1(SEQ ID NO:1)및 pB2(SEQ ID NO:2) 프로모터를 제공한다. 특정 유충 진화단계에서 주요 곤충 단백질의 발현을 유래하는 프로모터는 본 발명에서 분리되었다. 상기 프로모터는 유충의 헥사메린 단백질을 암호화한 염기서열에서 비롯되고, 몇몇의 곤충 세포 바람직하게는 도둑나방(Spodoptera frugiperda)의 sf9 또는 sf21 세포에서 이종 기원의 단백질을 발현시키기 위한 임의의 발현 벡터 (배큘로바이러스 발현 벡터와 같은)를 구성하는데 사용될 수 있다. 이러한 새로운 프로모터를 구성하기위한 유사한 조절 염기서열은 이미 나비목 유충(lepidoptera larvae)에서 특정됐으나, 종래의 배큘로바이러스 발현 시스템에서는 전혀 사용되지 않았다.
도 1 : 양배추은무늬밤나방 유충의 처음 4개의 진화단계 (A) 및 제 5 유생기의 2일 이후에 존재(B)로서 헥사메린을 확인할 수 있는 80 kDa 밴드의 부재를 보여준다. 패널 C는 제 5 유생기의 처음 6일 동안 상기 띠의 농도계측 물량을 보여준다.
도 2 : 80 kDa 밴드의 확인을 분석하는 질량분석기의 도면.
도 3 : 운반된 프로모터 염기서열 pB1 또는 pB2 단독 또는 pL과 결합한 pB2 염기서열(pLpB2)을 수반하는 발생된 발현 벡터.
도 4 : 서로 다른 시기에 재조합 배큘로바이러스에 감염된 후 서로 다른 프로모터(pB1, pB2, pL, 및 pLpB2)를 조절함으로써 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 곤충 sf21 세포 및 곤충 유충. 도 4는 감염 72시간 후에 그려진 유충이다.
도 5 : 서로 다른 감염 후 시간(16～72 시간)에서 배큘로바이러스 벡터(pB1, pB2, pL, 및 pLpB2)에 삽입된 서로 다른 프로모터의 사용에 의한 GFP 발현 및 웨스턴 브랏(western blot)(A)에 의해 감지된 GFP 발현. 재조합 단백질은 GFP 밴드의 농도계측(B) 또는 세포 추출물의 형광 분석 형광법(C)에 의해 수량화된다.
도 2 : 80 kDa 밴드의 확인을 분석하는 질량분석기의 도면.
도 3 : 운반된 프로모터 염기서열 pB1 또는 pB2 단독 또는 pL과 결합한 pB2 염기서열(pLpB2)을 수반하는 발생된 발현 벡터.
도 4 : 서로 다른 시기에 재조합 배큘로바이러스에 감염된 후 서로 다른 프로모터(pB1, pB2, pL, 및 pLpB2)를 조절함으로써 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 곤충 sf21 세포 및 곤충 유충. 도 4는 감염 72시간 후에 그려진 유충이다.
도 5 : 서로 다른 감염 후 시간(16～72 시간)에서 배큘로바이러스 벡터(pB1, pB2, pL, 및 pLpB2)에 삽입된 서로 다른 프로모터의 사용에 의한 GFP 발현 및 웨스턴 브랏(western blot)(A)에 의해 감지된 GFP 발현. 재조합 단백질은 GFP 밴드의 농도계측(B) 또는 세포 추출물의 형광 분석 형광법(C)에 의해 수량화된다.
발명의 요약
따라서 본 발명은 헥사메린 패밀리 유전자 발현을 조절하는 염기서열로부터 비롯된 pB1(SEQ ID NO 1) 및/또는 pB2(SEQ ID NO 2)와 같은 조절 폴리뉴클레오티드 염기서열을 제공한다. 초기 48시간 후 매우 높은 비율을 보이는 제 5 유생기 동안에 매우 높은 상기 단백질의 발현을 보이는데, 상기는 짧은 시간동안 매우 빠른 축적을 보인다(도 1). 이러한 특성들은 이종기원 단백질 발현을 최적화하기 위하여 상기 단백질 발현이, 효과적인 배큘로바이러스 또는 임의의 다른 발현 벡터를 발생시키기 위해 사용되는 강력한 프로모터에서 유래한다는 것을 제안한다. 배큘로바이러스 발현 시스템의 경우에 있어서, 프로모터의 빠른 활동성은 특히 분비경로에 초점을 맞춘 단백질의 경우와 관련이 있다. 그렇지 않으면 배큘로바이러스 감염의 매우 늦은 단계에서 세포 번역 후 조직과 분비경로 모두의 변화에 의해 영향을 받을 수 있다.
본 발명의 프로모터 염기서열은 헥사메린 패밀리 유전자 (BJHSP 1 및 BJHSP 2) 발현을 조절하는 염기서열에서 비롯되나, 헥사메린 패밀리 유전자라고 불리는 원래의 조절 뉴클레오티드 염기서열로 구성되지 않은 약간의 돌연변이가 있다. 상기 헥사메린은 양배추은무늬밤나방 (Trichoplusia ni (F. ni )) 유충에서 분리되고 질량 스펙트럼 분석의 80 KDa 밴드에서 확인된다(도 2). 일단 단백질이 확인되면, 암호화된 유전자뿐만 아니라 그들 각각의 프로모터를 포함하는 염기서열 상류(upstream)도 분리된다. 각각 원래의 프로모터를 증폭시키는데 사용되는 프라이머는 본 특허에 명시되어 있다. SEQ ID NO:3 및 4에 의해 특정되는 프라이머는 결과적으로 프로모터 pB1(SEQ ID NO: 1)로부터 유래한 원래의 프로모터를 증폭시키는데 사용된다. SEQ ID NO: 5 및 6에 의해 특정되는 프라이머는 결과적으로 프로모터 pB2로부터 유래한 원래의 프로모터를 증폭시키는데 사용된다. 본 발명에 의한 프로모터, 특히 pB2의 주된 이점은 오늘날 배큘로바이러스 발현 시스템에서 사용되는 프로모터가 매우 느린 프로모터로 알려진 것과 비교해서 빠르고 강력한 관심 단백질의 발현을 생산한다는 점에 있다.
바람직한 구체 예에서, 본 발명은 또한 본 발명의 pB1 및 pB2 프로모터 (바람직하게는 pB2 프로모터)와 임의의 다른 프로모터 예를 들면 pL 또는 p10(바람직하게는 pL)의 조합을 포함한다. 놀랍게도 이러한 조합이 이행될 때 상승 작용이 달성된다. pLpB2로 구성된 배큘로바이러스 발현 벡터가 실험될 때, 관심 단백질의 발현 수준은 pL 프로모터를 단독으로 사용하는 것에 대하여 61～375% (감염시간에 의존하여) 증가한다. 상기 구체예는 오늘날에 바이오공학 산업에서 pL 프로모터가 전형적으로 사용되기 때문에 본 발명의 목적에 있어서 매우 중요하다.
바람직한 또 다른 구체 예에서, 본 발명은 또한 본 발명 프로모터(pB1 및 pB2)의 조합인 pB1-pB1, pB2-pB2, 및 pB1-pB2 에 관한 것이다. 본 발명의 활동성 없는 프로모터는 포유류의 세포에서 발견된다. 그리고 본 발명은 또한 재조합 배큘로바이러스의 발생을 위한 두 개의 안전한 프로모터를 제공한다.
그러므로 본 발명은 선행기술에서 구성되는 염기서열보다 효과적인 조절 폴리뉴클레오티드 염기서열(프로모터)이 헥사메린 패밀리 단백질을 암호화한 유전자의 오픈 리딩 프레임(the open reading frames) 상류에 위치한 임의의 폴리뉴클레오티드 염기서열로부터 유래할 수 있다는 것을 설명한다(발명의 상세한 설명을 보시오). 그러므로 헥사메린 패밀리 단백질을 암호화한 유전자의 오픈 리딩 프레임 상류에 위치하고, 임의의 폴리뉴클레오티드에서 유래한 임의의 조절 폴리뉴클레오티드 염기서열은 본 발명의 목적을 포함한다.
본 발명의 목적을 위한 용어 정의
·조절 폴리뉴클레오티드 염기서열은 일반적으로 유전자의 전사를 허용하는 유전자의 상류(전사가닥의 5´ 지역 앞)에 위치해 있는 DNA의 지역이다.
·벡터 발현 : 세포의 내부에 있는 외인성 유전자 물질을 운반하는데 사용되는 “운반체”. 상기 벡터는 복제된 유전자 또는 유전자의 전사와 번역을 유도하기 위해 필요한 조절 염기서열 및 이와 같이 전사되고 복제된 DNA를 포함한다. 바람직하게는 배큘로바이러스 발현 벡터가 본 발명에서 사용된다.
·배큘로바이러스는 주로 곤충 및 절지동물을 감염시키는 무척추동물을 위한 전염성 바이러스의 패밀리이다.
·재조합 DNA : 하나 이상의 DNA 가닥의 재조합 또는 삽입을 통해 조작되어 정상적으로는 서로 일어나지 않는 DNA 구성의 인공적인 DNA로 형성된다. 재조합 DNA는 유기체 게놈에 존재하고 있는 관련된 DNA의 추가에 의해 제조된다.
·재조합 단백질 : 재조합 DNA에 의해 암호화된 단백질.
·빠른( earlier ) 발현 : 이 용어는 프로모터가 관심 단백질의 발현을 시작하는 시간에 관한 것이다. 본 발명에서 상기 시간은 감염 16시간 후에 시작된다.
·강력한 발현 : 이 용어는 종래의 배큘로바이러스 프로모터 p10 또는 pL에 의하여 성취되는 발현 수준과 비교하여 동등하거나 더 높은 수준에서의 임의의 관심 단백질 발현에 관한 것이다.
·관심 단백질 : 인간 및 동물의 이익을 위해서 사용될 수 있고 산업적, 상업적 또는 치료 상의 응용이 가능한 단백질.
·바이오 공장 : 치료 상의 목적(억제제, 효소, 항체, 항원 등) 또는 상업적 이익의 1차 또는 2차 산물을 포함하는 다수의 응용과 함께 산업적 규모로 단백질을 제조할 수 있게 유전적으로 변형되거나 그렇지 않은 세포 또는 유기체.
·부분적인 단편( Partial fragment ) : 상기 발현은 선행기술에 비해 빠르고 강력하게 향상되고, 동일한 물성을 갖는 본 발명의 조절 폴리뉴클레오티드 염기서열로부터 유래한 임의의 부분적인 단편에 관한 것이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2에 의해 각각 특정되고, 곤충 유충에서 헥사메린 패밀리 단백질을 암호화한 유전자의 오픈 리딩 프레임 상류에 위치한 폴리뉴클레오티드 염기서열로부터 유래한 pB1 및 pB2 프로모터와 같은 조절 폴리뉴클레오티드 염기서열을 제공한다. 본 발명은 더 나아가 배큘로바이러스와 같은 곤충 발현 벡터 구성 및 세포, 바람직하게는 곤충세포에서 이종 기원의 단백질 발현을 위한 조절 폴리뉴클레오티드 염기서열의 용도에 관한 것이다. 제 5 유생기 동안 높은 수준으로 발현되고, 제 5 유생기 처음 48시간 동안 높은 전사활성을 가지는 pB1 및 pB2 프로모터의 염기서열은 각각 양배추은무늬밤나방 헥사메린 BJHSP1 및 BJHSP2 로부터 유래한다(도 1).
상기 pB1 염기서열은 1057 뉴클레오티드(SEQ ID NO 1)로 이루어져 있고, 유충 호르몬에 의해 억제할 수 있는 기본적인 단백질 1 인 상기 BJHSP1 단백질을 암호화한 유전자의 5´지역 상류의 개시코돈에서 유래한다. 상기 염기서열은 SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 4의 2개의 특정한 프라이머를 사용하여 양배추은무늬밤나방 게놈의 DNA로부터 증폭된다. 상기 단편은 그 다음에 pGEM-Teasy 상업적인 벡터(프로메가(Promega))에서 복제된다.
상기 pB2 염기서열은 1041 뉴클레오티드(SEQ ID NO 2)로 이루어져 있고, 유충 호르몬에 의해 억제할 수 있는 기본적인 단백질 2인 상기 BJHSP2 단백질을 암호화한 유전자의 5´지역 상류의 개시코돈에서 유래한다. 상기 염기서열은 SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO: 6의 2개의 특정한 프라이머를 사용하여 양배추은무늬밤나방 게놈의 DNA로부터 증폭된다. 상기 단편은 그 다음에 pGEM-Teasy 상업적 벡터(프로메가)에서 복제된다.
상기 pB1 및 pB2 염기서열은 BamHI 및 SphI 효소와 함께 pGEM-Teasy 로부터 추출되고, pFasTBac 이중 상업적 플라스미드(인비트로겐(INVITROGEN))의 상기 위치에서 복제된다. 상기에서 언급한 효소에 의해 개방된 상기 pFasTBac 이중 벡터는 제거된 배큘로바이러스 프로모터 염기서열을 가지고 있다(획득된 상기 벡터의 이름은 pFBpB1 및 pFBpB2). 상기 모두는 관심 cDNA를 도입하기 위해 복제지점을 제공한다. 상기 벡터들은 감염 시킬 수 있고 곤충 세포 및 곤충 유충에서 복제할 수 있는 재조합 배큘로바이러스를 발생시키기 위해 사용된다. 게다가 pB2 염기서열은 제한 효소인 NotI 및 PstI(pGemT 용이한 벡터로부터 유래한 제한효소자리)의 처리(digestion)로부터 추출되고, pL 프로모터 염기서열 후 상기 pFasTBac1 상업적 벡터(인비트로겐)의 동일한 자리에서 복제된다. 상기 획득된 벡터의 이름은 pFBpLpB2이다.
그러므로 본 발명의 첫 번째 구체예는 발현 조절 폴리뉴클레오티드 염기서열인 SEQ ID NO: 1(pB1) 및 SEQ ID NO: 2(pB2)의 발생 방법에 관한 것이다. 상기에서 언급한 방법은 헥사메린 패밀리 단백질을 암호화한 유전자의 오픈 리딩 프레임 상류에 위치한 임의의 폴리뉴클레오티드 염기서열의 분리를 포함한다. 일단 상기 조절 폴리뉴클레오티드 염기서열의 배열 순서가 밝혀지면, 종래의 수단으로 상기 염기서열을 증폭시킨다.
본 발명의 바람직한 구체예에서 상기 헥사메린 오픈 리딩 프레임 상류 폴리뉴클레오티드 염기서열은 곤충, 바람직하게는 양배추은무늬밤나방에 속한다.
본 발명의 두 번째 구체예는 SEQ ID NO: 1(pB1), SEQ ID NO: 2(pB2) 또는 헥사메린 패밀리 단백질을 암호화하는 유전자의 오픈 리딩 프레임 상류에 위치한 임의의 조절 뉴클레오티드 지역으로부터 유래한 그것의 임의의 부분적인 단편인 조절 폴리뉴클레오티드 염기서열에 관한 것이다. 상기 프로모터 염기서열은 전사 활동성 조절에 관련된 조절 DNA 모티브를 제시한다. 그러므로 상기 염기서열은 유충 발생 동안에 호르몬에 의해 조절될 수 있으나, 다른 신호에 의해서도 조절될 수 있고, 또한 잠재적으로 발현 벡터의 맥락에 있어서 세포배양에 의해서도 조절될 수 있다.
바람직한 구체예에서 본 발명의 조절 폴리뉴클레오티드 염기서열인 SEQ ID NO: 1(pB1) 및 SEQ ID NO: 2(pB2)는 p10 pLpB2, pLpB1, p10pB2, 및 p10pB1과 같은 서로 다른 조합을 증가시키기 위해 임의의 다른 조절 폴리뉴클레오티드 염기서열, 바람직하게는 pL (폴리헤드린 단백질의 프로모터) 또는 p10(p10 단백질의 프로모터) 프로모터와 함께 결합된다. 본 발명은 상기 pL 염기서열 (폴리헤드린 프로모터)이 pB2 염기서열과 결합될 때 매우 강력한 프로모터 염기서열을 제공한다.
바람직한 또 다른 구체예에서 pB1pB2, pB1pB1(적어도 두 번 반복되는), 및 pB2pB2(적어도 두 번 반복되는)와 같이 서로 다른 조합을 증가시키기 위해 본 발명의 조절 폴리뉴클레오티드 염기서열인 SEQ ID NO: 1(pB1) 및 SEQ ID NO: 2(pB2)는 그로부터 결합된다. 나란히 위치한 프로모터는 박테리아와 식물(ll'ichev AA et al., Genetika. 1987 23:197-201; Kay R et al., Science. 1987 Jun 5;236(4806):1299-1302)에서 재조합 단백질 발현율이 증가한다는 것을 보여준다.
본 발명의 세 번째 구체예는 발현 벡터, 바람직하게는 배큘로바이러스 또는 플라스미드를 구성하기 위한 상기에서 언급한 조절 폴리뉴클레오티드 염기서열의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 네 번째 구체예는 상기에서 언급한 임의의 조절 폴리뉴클레오티드 염기서열 및 적어도 관심 단백질을 암호화한 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 발현 벡터에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서 상기 벡터가 배큘로바이러스 또는 플라스미드이다.
본 발명의 다섯 번째 구체예는 상기 발현 벡터에 의해 변형되고 감염된 세포 또는 전 단락에서 언급한 벡터로서 사용되는 재조합 바이러스에 의해 감염된 세포에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서 상기 세포가 곤충 세포, 바람직하게는 도둑나방으로부터의 sf9 또는 sf21 이다.
본 발명의 여섯 번째 구체예는 상기에서 언급한 발현 벡터에 의해 변형되고 감염된 곤충 유충에 관한 것이다.
본 발명의 일곱 번째 구체예는 상기에서 언급한 발현 벡터와 곤충 세포 또는 곤충 유충의 재조합 단백질의 제조 방법 및 종래의 방법에 의한 재조합 관심 단백질의 추출 및 정제에 관한 것이다.
본 발명의 여덟 번째 구체예는 재조합 단백질을 제조하기 위한 언급된 발현 벡터의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 아홉 번째 구체예는 재조합 단백질을 제조하기 위한 언급된 세포의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 마지막 구체예는 재조합 단백질을 생산하기 위한 바이오 공장으로서 언급된 곤충 유충의 용도에 관한 것이다.
실시예
본 발명은 하기 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해될 수 있으며, 하기의 실시예는 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 이와는 반대로 본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 실시될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.
본 발명의 실시예는 단백질 발현은 종래에 사용된 프로모터와 비교해서 감염 후 빠른 시간에 일어난다. 게다가 pB2 및 pLpB2 프로모터 염기서열의 경우에 있어서, 발현 수준은 빠른 감염 후의 시간 및 느린 감염 후의 시간 모두에서 선행기술(pL 프로모터)의 발현 수준과 비교했을 때 더 높다.
실시예 1 : 상기의 녹색의 형광 단백질(GFP)는 본 발명의 곤충 프로모터에 의해 발현된다.
GFP
의 복제
SphI 제한 효소에 의해 pFBpLGFP 플라스미드에서 추출된 상기 GFP는 pFBpB1 또는 pFBpB2 플라스미드의 SphI 제한 자리에서 복제된다. 입수된 공여 발현 플라스미드는 각각 pFBpB1GFP 및 pFBpB2GFP로 표시된다. 상기 pL염기서열이 제거되는 모든 경우에 있어서, GFP 발현은 단지 서로 다른곤충 프로모터에 의한 서로 다른 곤충 프로모터 활동성때문이다(도 3).
반면에, NotI 및 PstI 제한 자리에 의해 옆에 배치된 상기 pB2 프로모터는 동일한 제한 효소로 열리는 pFBpLGFP로 묶여 진다. 상기 입수된 공여 발현 플라스미드는 pFBpLpB2GFP로 표시되고, 이중 프로모터인 pL 및 pB2의 조절을 받는 GFP 암호화 유전자를 포함한다(도 3).
상기
GFP
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배큘로바이러스
발현 벡터의 구성
상기 결과인 플라스미드는 자동화된 염기서열에 의해 특정되고, 제조업자의 지시에 따른 Bac-to-Bac® 배큘로바이러스 발현 시스템(Invitrogen, USA)을 이용한 BacpB2GFP, BacpB1GFP, 및 BacpLpB2GFP 재조합 배큘로바이러스의 발생에 사용된다. 간단히 말하면, 상기 결과인 공여 발현 플라스미드는 재조합 배크미드(bacmid)로의 전위를 위해 DHIOBac™ E.coli 세포를 이동시키는데 사용된다. 각 배크미드의 1㎍는 Cellfectin® 시약을 이용하여 1×106 도둑나방 sf21 세포를 감염시키는데 사용된다. pL 바이러스성 주(stock)는 27℃에서 배양 72시간 후에 얻어진다. 배큘로바이러스는 하기의 제조업자의 지시에 따라 증폭된다. 상기 sf21 곤충 세포는 50 ㎎/㎖ 겐타마이신(gentamycin)이 보충된 BD BaculoGold™ TNM-FH Insect Medium(BD Biosience)에서 배양된다. 종래에 우리 실험실에서 배양된 상기 BacpLGFP 배큘로바이러스는 pFBpLGFP 플라스미드를 이용하여 하기의 동일한 프로토콜에 의해서 획득된다.
곤충 세포 접종
세포는 0,1 pfu의 감염 다중도에 의해 감염되고, 세포는 5분간 2000 rpm의 원심분리법에 의해 감염 16 시간, 24 시간, 48 시간 또는 72 시간 후로 펠릿된다.
또한 형광 현미경으로 각기 다른 감염 후 시간의 감염된 세포의 사진을 찍고, 그 사진은 도 4에 나타내어진다. 상기 pB2 및 pLpB2 프로모터 염기서열의 빠른(감염 16 시간 후에 시작) 활동성 및 내구성은 감염 마지막 단계(감염 48 시간 및 72 시간 후) 조차도 상기 pL 프로모터와 비교해 볼 때 주목할 만하다. 상기 pB1 프로모터는 또한 상기 pB2 또는 pL 프로모터만큼 강력하지 못해도 활동성을 나타낸다.
곤충 성장 조건 및 접종
제 5 유생기의 양배추은무늬밤나방 유충은 104~105의 pfu/유충을 이용하여 복각(proleg) (체강(the body cavity) 앞으로) 근처에서 재조합 배큘로바이러스에 주입된다. 감염된 유충은 28℃의 성장실(growth chambers)에서 유지되고 72 시간에 수집된다. 도 4의 아래쪽 패널은 pB1(아래), pB2 및 pL 과 pB2의 재조합 프로모터가 유충 조직의 GFP 단백질 발현에 의해 곤충 유충에서 활동성을 나타낸다는 것을 보여준다.
단백질 추출 준비
P6 well plate(0,1 pfu/well로 감염된 2×106 cell/well)로 부터의 펠릿된 세포는 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 50 mM pH8 트리스(Tris), 프로테아제(protease) 억제제(complete®, Roche), 2-메르캅토에탄올(2-mercaptoethanol) (RIP 완충)의 30 ㎕에 떠 있고, 30분간 찬 상태를 유지하며, 4 ℃에서 5 분간 2000 g을 세포의 잔해를 제거하기 위해 원심분리법에 의해 투명하게 만든다.
단백질 추출 분석
전체 용해성 단백질(TSP)의 40 ㎍ 은 12% SDS(w/v) 폴리아크릴아마이드 젤에서 분리된다. 단백질은 쿠마시 브릴리언트 블루 G-250(Coomassie Brilliant Blue G-250) (BioRad)으로 착색되거나 니트로셀룰로스 멤브레인(Hybond C, GE Healthcare)으로 옮겨지고, 0.1%(v/v) 트윈 20(Tween 20) (PBS-T) 및 4% 탈지유(PBS-TM)를 함유한 PBS에서 밤새 차단되고, 1시간 동안 PBS-TM에서 1:1000으로 희석된 GFP 최초의 항체(Chemicon) 및 1:500으로 희석된 액틴(Actine) 최초 항체(Sigma)와 함께 배양된다. PBS-T에서 10분간 2 세척 후에, 멤브레인은 PBS-TM에서 1:2000로 희석된 페록시다아제(peroxidase)가 결합된 항 생쥐 IgG 또는 항 토끼 IgG(GE Healthcare)와 함께 1시간 동안 배양된다. 세척 후, 특정한 신호는 제조업자의 지시에 따라 향상된 ECL 시스템(Advanced ECL system) (GE Healthcare)을 이용하여 감지된다.
웨스턴 브랏(western blot)에 의해 수행된 분석은 도 5에서 보여진 결과를 낸다. 다시 pL프로모터에 비해 빠르고 강력한 활동성을 보이는 pB2 및 pLpB2 프로모터를 입증한다(도 5). GFP의 특정한 밴드의 농도계측은 TINA 2.0 프로그램 및 결과를 정상화하기 위한 액틴 밴드를 이용하여 측정된다.
형광측정법
시금
TSP의 40 ㎍ 방출은 GENIOS 형광계를 이용하여 485 ㎚에서 자극된 후 535 ㎚에서 측정된다. 각각의 값은 각각의 추출물을 세 번 측정하여 얻어진다. 결과는 도 5C에서 보여진다. 다시 상기 pB2 프로모터의 5´ 상류에 위치한 pL 염기서열의 상승적인 효과는 pL 프로모터 단독으로 사용될 때와 비교하여 감염 후 시간에 따른 61~375 % 단백질 생산의 증가와 함께 분명하게 관측된다(도 5).
<110> ALTERNATIVE GENE EXPRESSION, S.L. (ALGENEX)
<120> IINSECT-DERIVED PROMOTERS FOR FOREING PROTEINS EXPRESSION IN
INSECT CELLS
<130> PCT-02336
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<210> 1
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<212> DNA
<213> Trichoplusia ni
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gctaactgaa ttcttttgta tactaaataa tttcaccata aaatcggatt gaggaaggaa 180
aacgtgccaa tcgttatatt tatacatcgg actataggta aacagttata aataatgtat 240
gagggtattt tatgaggaat ctaacccagc tcaatatgta tggggttccg ccccactcgg 300
catgtaggca ggaactacag cggtcttgtg ggctaccatg gaacgaaaga cagtattaaa 360
acatatgtgc gaaatacaac tttagttcgt agacataaag acggtaatgc agtaatgtgc 420
cactgatgag cactcgccgg aacatggcta cgtcggtatc atttggaagc tgtttttcat 480
gtccaaatat gaaggcaaag taaaatatac ttccgcgacc ataaagagga aaagaaaagt 540
gcgcctcgta ttgtagatgg taaaacacgt cttttcataa tatgtactgc actgattgtt 600
ggagtatacg tttgcaacac gtgacaccat ttacaacaaa tactaaaaag agcactttta 660
ttgtgctaac acaaaaaaaa aacacaagag ttcagaaaac agacaagaaa aagcaaaaga 720
cgtctaaata acatacaaat ccagatgtca gacgcaaaat acaaattacg gtgttacagg 780
tgatatctca cgtctgcgag ataaagcagt tgttttactg caaacgaagg taataccagt 840
ggcgtagact agagcctcta gcttcgagag ggatcgcgaa gtattgggac tacctcacgc 900
caccggtaag ggcatcggtg cagcgagagg ttatcgccca atacaacaac aatgataatg 960
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Claims (31)
- a) 헥사메린 패밀리 단백질을 암호화하는 유전자의 오픈 리딩 프레임의 상류에 위치하고, 대응 조절 폴리뉴클레오티드 염기서열을 포함하는, 임의의 폴리뉴클레오티드 염기서열의 분리; 및
b) 종래의 방법에 의한 상기 단계 a)의 조절 폴리뉴클레오티드 염기서열의 증폭;
을 포함하는 발현 조절 폴리뉴클레오티드 염기서열의 발생 방법.
- 제1항에 있어서, 마지막으로 발생된 조절 폴리뉴클레오티드 염기서열이 SEQ ID NO: 1(pB1) 및 SEQ ID NO: 2(pB2)에 의해서 특정되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 증폭이, pB1을 발생시키기 위해 프라이머 SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 4를 사용하고, pB2를 발생시키기 위해 프라이머 SEQ ID NO: 5 및 SEQ ID NO: 6을 사용하여, 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 조절 폴리뉴클레오티드 염기서열이 곤충 유충의 일부인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 곤충 유충이 양배추은무늬밤나방 유충인 것을 특징으로 하는 방법.
- 헥사메린 패밀리 단백질을 암호화하는 유전자의 오픈 리딩 프레임의 상류에 위치한 임의의 폴리뉴클레오티드 염기서열로부터 유래한 조절 폴리뉴클레오티드 염기서열.
- 제6항에 있어서, 상기 조절 폴리뉴클레오티드 염기서열이 프로모터인 것을 특징으로 하는 조절 폴리뉴클레오티드 염기서열.
- 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 조절 뉴클레오티드 염기서열이 SEQ ID NO: 1(pB1), SEQ ID NO: 2(pB2) 또는 상기 헥사메린 패밀리 단백질을 암호화하는 유전자의 오픈 리딩 프레임의 상류에 위치한 임의의 폴리뉴클레오티드 염기서열로부터 유래한 그것의 임의의 부분 단편으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조절 뉴클레오티드 염기서열.
- 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항의 임의의 조절 폴리뉴클레오티드 염기서열 및 임의의 다른 조절 폴리뉴클레오티드 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조절 폴리뉴클레오티드 염기서열.
- 제9항에 있어서, 상기 다른 조절 폴리뉴클레오티드 염기서열이 단백질 폴리헤드린의 프로모터 또는 단백질 p10의 프로모터인 것을 특징으로 하는 조절 폴리뉴클레오티드 염기서열.
- 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 pB2 염기서열(SEQ ID NO: 2) 및 상기 단백질 폴리헤드린의 프로모터의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조절 폴리뉴클레오티드 염기서열.
- 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 pB1 염기서열(SEQ ID NO: 1) 및 상기 폴리헤드린 단백질 프로모터의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조절 폴리뉴클레오티드 염기서열.
- 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 pB2 염기서열(SEQ ID NO: 2) 및 상기 p10 단백질 프로모터의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조절 폴리뉴클레오티드 염기서열.
- 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 pBl 염기서열(SEQ ID NO: 1) 및 상기 p10 단백질 프로모터의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조절 폴리뉴클레오티드 염기서열.
- 제8항의 결합된 임의의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 조절 폴리뉴클레오티드 염기서열.
- 제15항에 있어서, 상기 pB1 염기서열(SEQ ID NO: 1) 및 상기 pB2 염기서열(SEQ ID NO: 2)을 포함하는 것을 특징으로 하는 조절 폴리뉴클레오티드 염기서열.
- 제15항에 있어서, pB1 염기서열(SEQ ID NO: 1)이 적어도 두 번 반복되는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 조절 폴리뉴클레오티드 염기서열.
- 제15항에 있어서, 상기 pB2 염기서열(SEQ ID NO: 2)이 적어도 두 번 반복되는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 조절 폴리뉴클레오티드 염기서열.
- 발현 벡터를 구성하기 위한 제6항 내지 제18항 중 어느 한 항의 조절 폴리뉴클레오티드 염기서열의 용도.
- 제19항에 있어서, 상기 발현 벡터가 바이러스, 바람직하게 배큘로바이러스인 것을 특징으로 하는 용도.
- 제19항에 있어서, 상기 발현 벡터가 플라스미드인 조절 폴리뉴클레오티드 염기서열의 용도.
- 제6항 내지 제18항 중 어느 한 항의 임의의 상기 조절 폴리뉴클레오티드 염기서열 및 적어도 관심 단백질을 암호화한 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
- 제22항에 있어서, 상기 발현 벡터는 바이러스, 바람직하게는 배큘로바이러스인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
- 제22항에 있어서, 상기 발현 벡터는 플라스미드인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
- 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항의 발현 벡터에 의해 변환 또는 감염되는 것을 특징으로 하는 세포.
- 제25항에 있어서, 상기 세포는 곤충 세포, 바람직하게는 도둑나방으로부터의 sf9 또는 sf21인 것을 특징으로 하는 세포.
- 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항의 상기 발현 벡터로 변환되거나 감염되는 것을 특징으로 하는 곤충 유충.
- 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항의 상기 발현 벡터와 함께 곤충 세포 또는 곤충 유충의 주입 또는 트랜스펙션을 포함하고, 종래의 방법에 의한 상기 관심 재조합 단백질의 추출 및 정제를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질 제조 방법.
- 재조합 단백질을 제조하기 위한 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항의 상기 발현 벡터의 용도.
- 재조합 단백질을 제조하기 위한 제25항 또는 제26항의 상기 세포의 용도.
- 재조합 단백질을 제조하기 위한 바이오 공장으로서 제27항의 상기 곤충 유충의 용도.
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