CN106086074B - 一种延长家蚕杆状病毒表达系统宿主细胞存活期增加蛋白质表达量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术制药领域，涉及一种延长家蚕杆状病毒表达系统宿主细胞存活期增加蛋白质表达量的方法。以家蚕细胞为宿主的家蚕杆状病毒表达系统是一个裂解性表达系统，病毒感染后宿主细胞存活期很短，严重影响蛋白质表达量。本发明利用抗氧化剂葡萄籽原花青素处理病毒感染前的宿主细胞，使病毒感染后的宿主细胞存活期延长，蛋白质的表达水平提高，表达量增加，同时表达获得的蛋白质能够得到更加充分的修饰和加工，从而具有更好的生物活性，用该方法处理家蚕的幼虫和蚕蛹能够提高其外源蛋白质的表达水平。本发明为家蚕表达系统提高蛋白表达量提供了新的技术方法，其推广应用将在蛋白质表达产业中产生重大的研究和经济价值。

Description

一种延长家蚕杆状病毒表达系统宿主细胞存活期增加蛋白质 表达量的方法

技术领域

本发明属于生物技术制药领域，具体涉及一种延长家蚕杆状病毒表达系统宿主细胞存活期增加蛋白质表达量的方法。

背景技术

目前，在生物技术领域中，杆状病毒表达系统已成为一种外源蛋白表达的主流技术，特别是家蚕杆状病毒载体表达系统在生产重组蛋白过程中具有很多优势。

家蚕在中国药典中是一种药食两用的昆虫，采用家蚕作为表达载体利用杆状病毒表达外源蛋白(包括抗菌肽)具有独特的优势：①家蚕个体较大，大小适中，易于操作、控制，且生长期短，蛋白合成能力强，蚕丝成分主要就是蛋白质；家蚕幼虫和蛹，重组表达的蛋白量高出培养细胞表达量的10-100倍，这样就大大提高了药用蛋白生产的量；②蚕幼虫或者蛹的脂肪体组织具有合成和分泌脂蛋白和糖蛋白的功能，对外源蛋白可进行糖基化、磷酸化、精确的蛋白折叠及形成正确的二硫键，产物表现良好的生物学活性，发挥固有免疫作用的防御素(即一种抗菌肽其中含有较多二硫键)利用该表达系统具有更大的优势；③家蚕在我国的驯养已有几千年的历史，饲养经验丰富，原料成本低，用桑叶喂养的蚕仅0.05元/条左右，并且正在向人工饲料进行无菌化、低成本、大规模全年连续饲养的方向发展；④蚕蛹本身可以食用，中国古代养蚕并非取丝而是为了食用；蚕血淋巴中含有蛋白酶抑制物，对表达产物有稳定作用，表达的蛋白质可不需纯化，将蚕晒干或冷冻干燥后磨碎成粉，可直接添食，特别适于作为口服药物或饲料添加剂；⑤家蚕杆状病毒表达系统表达蛋白质，生产工艺流程不复杂，适合多种基因表达，产品更换容易，最快在15天就可以完成，同时产品的保密性强。

家蚕杆状病毒表达系统是生产重组蛋白的有力工具，能高水平表达重组蛋白，宿主细胞能够像哺乳动物细胞一样对表达的蛋白进行翻译后的加工和处理，表达产物具有很好的生物学活性，特别适于口服药用蛋白的生产。但杆状病毒感染易导致宿主细胞死亡，终止外源蛋白的表达，使目的蛋白的修饰和表达水平不能达到最佳状态，这不足之处在一定程度上限制了家蚕杆状病毒表达系统的应用。杆状病毒感染导致家蚕细胞死亡是一个复杂的过程，杆状病毒感染产生活性氧(ROS)是诱导细胞死亡的重要原因之一，杆状病毒感染昆虫细胞时随着氧化压力的诱导，增加脂质过氧化和蛋白质氧化水平，增加昆虫细胞对氧的吸收。

家蚕杆状病毒表达系统在表达外源蛋白时存在缺陷是因为该表达系统是一个裂解型病毒表达系统，易导致感染昆虫细胞裂解和死亡终止蛋白的生产。杆状病毒感染昆虫细胞后，昆虫细胞的存活期只有5-6d，由于细胞感染病毒后丧失了细胞活力，终止外源蛋白的表达，从而限制了重组蛋白的产量。在杆状病毒感染的后期表达的蛋白进行蛋白质的翻译后的加工，表达的蛋白才具有生物学活性，因此延长杆状病毒感染的宿主细胞生命期是一个提高外源蛋白产量和降低生产成本的有效策略，同时对保证表达蛋白的生物学活性具有重大的意义。

发明内容

解决的技术问题

以家蚕细胞为宿主的家蚕杆状病毒表达系统是一个裂解性表达系统，在病毒感染宿主细胞后宿主细胞裂解，导致存活期只有5-6天，严重影响蛋白质的表达量及生物活性。

技术方案

为解决上述问题，本发明提供了一种延长家蚕杆状病毒表达系统宿主细胞存活期增加蛋白质表达量的方法，利用葡萄籽原花青素在病毒感染前处理宿主细胞。

进一步的，本发明所述方法中，利用葡萄籽原花青素在病毒感染前24h处理宿主细胞，葡萄籽原花青素的添加浓度为0.01％-0.05％(v/v)，所述宿主细胞为家蚕BmM细胞。

进一步的，本发明所述方法中，所述家蚕杆状病毒为重组杆状病毒，该病毒是以载体质粒pET28a-GFP为模板克隆GFP基因，获得重组pFastbacDual-GFP载体，然后，重组pFastbacDual-GFP载体转化含有转座酶helper质粒和家蚕杆状病毒bacmid质粒的BmDH10Bac感受态细胞，获得重组bacmid-GFP，最后，重组bacmid-GFP转染家蚕BmM细胞。

进一步的，本发明所述方法中，所述家蚕杆状病毒的制备方法，包括以下步骤：

1)重组pFastbacDual-GFP载体的构建：以载体质粒pET28a-GFP为模板克隆GFP基因，进行PCR扩增，产物回收；用XhoⅠ和KpnⅠ双酶切胶回收产物和pFastbacDual载体，DNA纯化后用T4DNA连接酶连接，转化DH5α感受态细胞，培养后抽提质粒，酶切鉴定并测序；

2)重组bacmid-GFP的构建：将测序和酶切鉴定正确的pFastbacDual-GFP质粒转化含有转座酶helper质粒和家蚕杆状病毒bacmid质粒的BmDH10Bac感受态细胞，在转座酶的作用下，发生同源重组，通过蓝白斑筛选出阳性克隆，抽提重组bacmid的DNA，没有转化的家蚕杆状病毒bacmid的DNA作为对照，根据M13引物PCR的DNA片段大小鉴定重组bacmid-GFP的成功构建；

3)重组杆状病毒的获取和扩增：将鉴定正确的bacmid-GFP和对照的bacmid的DNA，用X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent转染六孔板中细胞密度为80％–90％的BmN细胞。

本发明通过抗氧化剂葡萄籽原花青素处理病毒感染的宿主细胞，使得病毒感染的宿主细胞生活期延长，蛋白质的表达水平提高，同时表达的蛋白能得到更充分的修饰和加工，从而具有更好的生物活性，用葡萄籽原花青素处理家蚕的幼虫和蚕蛹外源蛋白质能得到更高表达水平。

本发明以Bac-to-Bac/BmNPV杆状病毒表达系统表达绿色荧光蛋白作为目标蛋白，利用台盼蓝染色法检测抗氧化剂葡萄籽原花青素对感染细胞死亡的抑制作用，采用ELISA和western blot检测绿色荧光蛋白的表达水平。结果表明葡萄籽原花青素能部分阻止杆状病毒感染引起的细胞死亡，并通过抑制细胞的死亡增加绿色荧光蛋白的产量。

本发明采用在杆状病毒感染昆虫细胞之前用抗氧化剂处理昆虫细胞可抑制氧化压力诱导的细胞凋亡。葡萄籽原花青素(grape seed proanthocyanidins,GSP)是一种重要的抗氧化剂，对氧化压力诱导的细胞凋亡具有抑制作用。绿色荧光蛋白(greenfluorescence protein,GFP)是在活细胞中用来可视、监测和定量基因表达水平和产量的最方便的工具，本发明考虑GFP的上述特点和GSP抗氧化活性，发现GSP具有延长杆状病毒感染细胞生命期和活性进而增加绿色荧光蛋白产量的作用。

有益效果

本发明通过利用抗氧化剂葡萄籽原花青素处理病毒感染前的宿主细胞，使得病毒感染后的宿主细胞存活期延长，蛋白质的表达水平提高，表达量增加，同时表达获得的蛋白质能够得到更加充分的修饰和加工，从而具有更好的生物活性，用葡萄籽原花青素处理家蚕的幼虫和蚕蛹能够提高其外源蛋白质的表达水平。本发明为家蚕表达系统提高蛋白表达量提供了新的技术方法，本发明的推广应用将在蛋白质表达产业中产生重大的研究和经济价值。

附图说明

图1为重组质粒pFastDual-GFP的酶切和PCR鉴定。

图2为PCR鉴定重组bacimd-GFP(图中M：DNA标记；1：野生型bacmid；2：重组bacmid-GFP)。

图3为重组Bacmid-GFP转染家蚕卵巢细胞(图中A：正常细胞；B：转染细胞；C：荧光显微镜下的转染细胞)。

图4为重组GFP在BmN细胞中表达产物的SDS-PAGE和Western blot分析(图中M：蛋白标志物；1：野生型病毒感染96h后的BmN细胞；2：重组病毒感染84h后的BmN细胞；3：重组病毒感染96h后的BmN细胞；4：野生型病毒的Western blot检测带；5：重组病毒感染84h后GFP的Western blot检测带；6：重组病毒感染96h后GFP的Western blot检测带)。

图5为葡萄籽原花青素对病毒感染BmN细胞活性的影响。

图6为葡萄籽原花青素对GFP表达的影响。

具体实施方式

1.1.1载体、菌株和细胞

大肠杆菌(E.coli)DH5α菌种和载体pET28a-GFP由本实验室保存。pFastBacDual质粒载体、E.coli BmDH10Bac、家蚕BmN细胞系。

1.1.2试剂和酶

葡萄籽原花青素(≥95％)购自天津尖峰生物技术公司；DNA聚合酶、DNA限制性内切酶、T4DNA连接酶、ECL试剂盒、BCA蛋白质定量试剂盒、Anti-GFP单克隆抗体均购自上海生物工程有限公司；胎牛血清购自Gibco公司；X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent购自瑞士roche公司；TC-100细胞培养基购自德国AppliChem公司；台酚蓝细胞活性分析试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；GFP定量ELISA试剂盒购自Biovision公司；GFP基因引物：正链引物P1：5’-CCTCTCGAG(XhoI酶切位点)ATGGTGAGCAAGGG CGAGGAG-3’，反链引物P2：5’-GCGGGTACC(KpnI酶切位点)TTACTTGTACAGCT CGTCCATG-3’；M13引物：正链引物5’-GTTTTCCCAGT CACGAC-3’，反链引物5’-CAGGA AACAGCTATGAC-3’，由上海生物工程有限公司合成。

1.2方法

1.2.1重组pFastbacDual-GFP载体的构建

以载体质粒pET28a-GFP为模板克隆GFP基因。PCR扩增条件为94℃5min，94℃60s，56℃60s，72℃60s，30个循环，最后72℃10min。PCR产物用1％琼脂糖电泳胶回收。用XhoⅠ和KpnⅠ双酶切胶回收产物和pFastbacDual载体，DNA纯化后用T4DNA连接酶连接，转化DH5α感受态细胞，挑取转化子经37℃过夜培养后抽提质粒，酶切鉴定并测序。

1.2.2重组bacmid-GFP的构建

将测序和酶切鉴定正确的pFastbacDual-GFP质粒转化含有转座酶helper质粒和家蚕杆状病毒bacmid质粒的BmDH10Bac感受态细胞，在转座酶的作用下，发生同源重组，通过蓝白斑筛选出阳性克隆，抽提重组bacmid的DNA，没有转化的家蚕杆状病毒bacmid的DNA作为对照，根据M13引物PCR的DNA片段大小鉴定重组bacmid-GFP的成功构建。

1.2.3重组杆状病毒的获取和扩增

将鉴定正确的bacmid-GFP和对照的bacmid的DNA，用X-tremeGENE HP DNATransfection Reagent按照说明书的操作方法转染六孔板中细胞密度为80％–90％的BmN细胞，观察细胞形态的变化和绿色荧光120h后收集培养细胞液，1000r/min离心5min，得到的上清即为P1代病毒。取P1病毒连续感染BmN细胞代后获得P3代高滴度病毒，4℃或-80℃避光保存备用。

1.2.4GFP在家蚕细胞中表达的鉴定

取5μL的P3代病毒感染六孔板中的BmN细胞，在84h和96h分别收集细胞，1 000r/min离心，用冷的PBS洗细胞沉淀2次后，加适量的细胞裂解液裂解细胞，上清用于SDS-PAGE(12％分离胶)和Western blot进行检测。一抗为小鼠抗GFP单克隆抗体，二抗为辣根过氧化物酶标记的抗体，按照ECL试剂盒方法进行操作，根据条带鉴定绿色荧光蛋白的表达情况。

1.2.5BmN细胞接种病毒及接种病毒前用GSP处理BmN细胞

在病毒感染BmN细胞前24h，在培养细胞中分别加抗氧化剂GSP(其在培养基中浓度分别为0.01％(v/v)、0.03％(v/v)和0.05％(v/v)，在接种病毒前测得细胞的活力(≥90％)作为接种病毒用的细胞，然后，在每孔培养细胞密度(1×10⁶个/mL)接种5μL的P3代病毒用于下列实验。

1.2.6测定GSP处理后病毒感染的BmN细胞活性

BmN细胞活性活力的测定，分别在24h、48h、72h、96h、120h和144h时收集的细胞轻轻的反复吹打形成单个的细胞悬液，根据台酚蓝细胞活力分析试剂盒的操作方法，将悬浮细胞与台酚蓝混合，在显微镜下观察和计数，活细胞呈现无色，死细胞呈现蓝色，在三分钟内完成细胞计数，细胞存活率＝活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100。每个试验平行三组重复三次，求平均值。

1.2.7检测GSP处理后BmN细胞的GFP表达水平

杆状病毒感染病毒后在120h左右，外源蛋白的表达水平最高，在120h收集细胞，用细胞裂解液裂解细胞后，在4℃，12 000r/min，离心15min后取上清液根据BCA蛋白质定量试剂盒的操作方法，对家蚕细胞的总蛋白进行定量，再根据GFP蛋白定量ELISA试剂盒的操作方法，对GFP蛋白进行定量，以μg/mg表示GFP在总蛋白中的含量，确定GSP对GFP的表达水平的影响。每个试验平行三组重复，测得的三个数据用标准差(mean±SD)统计。

2结果

2.1重组pFastbacDual-GFP载体的构建

绿色荧光蛋白(GFP)基因共有714bp，编码238个氨基酸。重组pFastbacDual-GFP质粒经XhoⅠ和KpnⅠ双酶切后和PCR产物在700bp左右处有一相同的条带，证明基因已正确连接到载体pFastbacDual(如图1)，酶切正确的重组质粒，进行测序，测得的碱基序列与GenBank登录号GQ357182公开的序列一致，说明得到的基因在克隆过程没有发生突变序列是正确的。

2.2重组bacmid-GFP的鉴定

以野生型bacmid(对照)和重组bacmid-GFP为模板，M13上下游引物做PCR扩增，鉴定重组杆状病毒DNA。没有重组野生型bacmid扩增片段为300bp，成功重组的bacmid-GFP片段约为3 300bp(2 560bp+714bp)。如图2结果显示，没有重组的野生型bacmid在300bp附近呈现有目的条带，成功重组bacmid-EGFP在约3 300bp处呈现有目的条带，结果与预计一致，证明成功获得了重组bacmid-GFP。

2.3重组杆状病毒的获取

重组bacmid-GFP和野生型bacmid转染BmN细胞后，细胞在72h后呈现明显的病变，细胞由原来的梭形变成圆形，细胞停止生长，细胞核肿胀。在荧光显微镜下看到细胞呈现有绿色荧光。在转染120h后细胞全部浮起不再贴壁，并裂解(如图3)。此时收集到的上清液为P1代杆状病毒。

2.4重组GFP在BmN细胞中的表达

SDS-PADE结果显示，同野生型的病毒感染的细胞相比，绿色荧光蛋白在重组病毒感染的细胞中，并没有出现明显可区分的蛋白条带，原因是在27kDa处家蚕细胞正好有组成型高表达的蛋白，干扰了外源表达蛋白的观察。用抗GFP单克隆抗体进行western blot检测重组GFP在BmN细胞中表达时，用野生型病毒感染的BmN细胞作对照。结果显示，重组病毒感染的BmN细胞在27kDa处有预期大小的条带(见图4)。证明GFP在家蚕细胞中成功表达，GFP在病毒感染细胞后96h时比84h时的表达水平高。

2.5GSP对BmN细胞感染病毒后活性的影响

台酚蓝染色结果(见图5)可以看出，GSP有剂量依赖性在病毒感染120h前，对细胞存活率有较大的影响(P＜0.05)，在144h高浓度的GSP时细胞保持较高的存活率与对照组120h的存活率相当。证明GSP有延迟部分感染病毒细胞死亡的作用。

2.6GSP对BmN细胞表达GFP量的影响

病毒感染细胞在感染后96h左右，外源蛋白表达水平最高，在重组GFP病毒感染BmN细胞96h时，用定量ELISA方法测得GFP的表达水平占总蛋白的量，如图6发现GSP有浓度依赖性增加GFP在BmN细胞的表达水平，GSP高浓度组GFP表达的量明显高于对照组(P＜0.05)，与上面细胞的存活率有相关性。证明GSP通过抗氧化作用，延长细胞寿命，进而提高外源蛋白GFP的表达水平。

杆状病毒感染导致昆虫细胞死亡是一个复杂的生理过程。其中由病毒感染诱导的氧化压力导致脂质过氧化和线粒体膜的损伤就是其中的重要原因之一。本发明用具有抗凋亡和抗氧化作用的GSP处理培养的细胞，发现GSP确有浓度依赖性地部分阻止细胞死亡的作用，从图5和图6可以看出，在0.05％浓度的GSP处理细胞后，家蚕细胞的存活率在第6d与没有加GSP的第5d家蚕细胞的存活率相当，并且GFP的表达水平增加了近1.5倍。外源蛋白在家蚕幼虫或蛹中的表达水平是细胞的表达水平的10-100倍。在给家蚕幼虫或蛹接种重组杆状病毒的同时接种适量的抗氧化剂，以致能阻止杆状病毒感染诱导的氧化压力对生命活力的影响，部分延长生命周期，提高外源重组蛋白的生产量，将具有更加重要的实践价值。细胞氧化应激过程涉及一些蛋白酶和细胞信号转导过程，抑制这些蛋白酶的活性或阻断信号转导过程，其抗杆状病毒诱导的细胞凋亡的机制我们将做进一步的研究。总之，基于抗氧化机制，部分阻止杆状病毒诱导的细胞死亡，提高重组蛋白在家蚕或昆虫细胞中生产量，降低生产成本，是一个有效的途径和有价值的策略。

值得注意的是，以上所述，仅为本发明的优选实施方式，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，对本发明技术方案进行的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种延长家蚕杆状病毒表达系统宿主细胞存活期增加蛋白质表达量的方法，其特征在于：利用葡萄籽原花青素在病毒感染前处理宿主细胞，所述宿主细胞为家蚕BmN细胞。

2.根据权利要求1所述的延长家蚕杆状病毒表达系统宿主细胞存活期增加蛋白质表达量的方法，其特征在于：利用葡萄籽原花青素在病毒感染前24h处理宿主细胞，葡萄籽原花青素的添加浓度以v/v计为0.01％-0.05％。

3.根据权利要求1或2所述的延长家蚕杆状病毒表达系统宿主细胞存活期增加蛋白质表达量的方法，其特征在于：所述家蚕杆状病毒为重组杆状病毒，该病毒是以载体质粒pET28a-GFP为模板克隆GFP基因，获得重组pFastbacDual-GFP载体，然后，重组pFastbacDual-GFP载体转化含有转座酶helper质粒和家蚕杆状病毒bacmid质粒的BmDH10Bac感受态细胞，获得重组bacmid-GFP，最后，重组bacmid-GFP转染家蚕BmN细胞。

4.根据权利要求3所述的延长家蚕杆状病毒表达系统宿主细胞存活期增加蛋白质表达量的方法，其特征在于：所述家蚕杆状病毒的制备方法，包括以下步骤：

1)重组pFastbacDual-GFP载体的构建：以载体质粒pET28a-GFP为模板克隆GFP基因，进行PCR扩增，产物回收；用XhoⅠ和KpnⅠ双酶切胶回收产物和pFastbacDual载体，DNA纯化后用T4 DNA连接酶连接，转化DH5α感受态细胞，培养后抽提质粒，酶切鉴定并测序；

2)重组bacmid-GFP的构建：将测序和酶切鉴定正确的pFastbacDual-GFP质粒转化含有转座酶helper质粒和家蚕杆状病毒bacmid质粒的BmDH10Bac感受态细胞，在转座酶的作用下，发生同源重组，通过蓝白斑筛选出阳性克隆，抽提重组bacmid的DNA，没有转化的家蚕杆状病毒bacmid的DNA作为对照，根据M13引物PCR的DNA片段大小鉴定重组bacmid-GFP的成功构建；

3)重组杆状病毒的获取和扩增：将鉴定正确的bacmid-GFP和对照的bacmid的DNA，用X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent转染六孔板中细胞密度为80％–90％的BmN细胞。