CN107384919B - 一种抑制核型多角体病毒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抑制核型多角体病毒的方法。本发明的方法通过利用CRISPR/Cas9技术定点靶向核型多角体病毒基因组，对其进行切割以破坏其闭合环状双链基因组DNA的完整性或其关键基因功能的正常行使，从而达到清除病毒，阻止病毒复制的效果。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种抑制核型多角体病毒的方法。
背景技术
杆状病毒(baculovirus)是一类囊膜包被的闭合、环状、双链、超螺旋DNA病毒，因包埋在多角体中的病毒粒子成杆状而得名。杆状病毒专一性寄生于节肢动物，其寄生的昆虫种类达600多种，包括鳞翅目、膜翅目、双翅目和鞘翅目等7个目。根据杆状病毒多角体蛋白所组成的包涵体的形态、包涵体在细胞中的分布以及病毒诱导的细胞病理学特征，可将杆状病毒科分为两个病毒属：核型多角体病毒属(Nucleopolyhedrocirus，NPV)和颗粒体病毒属(Granuleovirus，GV)。核型多角体病毒属的特点是在感染细胞核内形成结晶蛋白包涵体，呈多角体，每个多角体内包埋着许多病毒粒子。根据囊膜内核衣壳数目的多少，NPV属分为单粒包埋型多角体病毒(SNPV)和多粒包埋型多角体病毒(MNPV)。核型多角体病毒经口或伤口感染，多在寄主的血、脂肪、气管和皮肤等细胞的细胞核内发育。经口进入虫体的病毒被胃液消化，游离出杆状病毒粒子，通过中肠上皮细胞进入体腔，侵入细胞，在细胞核内增殖，之后再侵入健康细胞，直到昆虫致死。
基于核型多角体病毒能够感染鳞翅目昆虫，在本领域中，其已被加工成病毒杀虫剂，应用于杀灭有害昆虫。
然而，鳞翅目昆虫中，也存在一些具有高的经济价值的昆虫，如家蚕。以蚕丝为基础的桑蚕产业是国民经济的重要组成部分。家蚕以桑叶为食料，茧可缫丝，丝是珍贵的纺织原料，主要用于织绸，是优良的纺织原料，在军工、交电等方面也有广泛用途。蚕的蛹、蛾和蚕粪也可以综合利用，是多种化工和医药工业的原料，也可以作植物的养料。栽桑、养蚕、缫丝、纺织、服装、销售，桑蚕产业链中吸纳了众多的劳动者；桑蚕产业链的上下游的健康发展，对于解决就业问题有重要意义。养蚕居于桑蚕产业链的最上游，培育优良的家蚕品种以及减少家蚕病害是十分重要的任务。家蚕核型多角体病毒(Bombyx morinucleopolyhedrovirus，BmNPV)是家蚕的重要病原体，常常引起蚕业上很大的经济损失。到目前为止，蚕病上主要有微粒子病和病毒病两大问题未能彻底解决，因病毒性疾病所造成的损失，约占总蚕病损失的70～80％，而家蚕核型多角体病毒病是养蚕生产上最常见的、危害最严重的一类蚕病，俗称脓病，每年因该病引起蚕业15％左右的经济损失。家蚕患此病的后期，常流出脓汁，内含大量的多角体病毒。BmNPV侵染家蚕具有发病突然，爆发规模大，影响时间长等特点。家蚕抗BmNPV的基础研究虽然取得一定的成效，但仍未能从根本上解决家蚕抗BmNPV问题，目前生产上对于由BmNPV病毒引起的蚕病仍无有效的应对措施。
因此，本领域还必须进一步寻找有效的抗NPV的方法，以保护有益昆虫如家蚕抵御病毒的侵害。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抑制核型多角体病毒的方法。
在本发明的第一方面，提供一种抑制核型多角体病毒的方法，所述的方法包括：以核型多角体病毒的ie-1基因和me53基因作为靶标，利用CRISPR/Cas系统介导的基因组编辑方法切割病毒基因组，从而抑制核型多角体病毒。
在一个优选例中，所述的方法中，以核型多角体病毒的ie-1基因中GTGAACCAACCATCGGCAGC(即SEQ ID NO:4中第1-20bp)和GAGTCAAATATTAAAGTATT(即SEQ IDNO:5中第1-20bp)作为切割的靶标；和以核型多角体病毒的me53基因中GCAAAGTGTTTGAAATAATT(即SEQ ID NO:6第1-20bp)和GTGCACCAGACCCGACGCGG(即SEQ IDNO:7第1-20bp)作为切割的靶标。
在另一优选例中，所述的核型多角体病毒是家蚕核型多角体病毒。
在本发明的另一方面，提供一种核酸构建体，所述核酸构建体包括操作性连接的：Cas9表达盒，sgRNA表达盒；其中，所述的sgRNA表达盒包括：靶向核型多角体病毒的ie-1基因的sgRNA表达盒，以及靶向核型多角体病毒的me53基因的表达盒。
在一个优选例中，所述的核酸构建体中，所述的靶向核型多角体病毒的ie-1基因的sgRNA表达盒包括：含有SEQ ID NO:4所示序列的sgRNA表达盒以及含有SEQ ID NO:5所示序列的sgRNA表达盒；所述的靶向核型多角体病毒的me53基因的表达盒包括：含有SEQ IDNO:6所示序列的sgRNA表达盒以及含有SEQ ID NO:7所示序列的sgRNA表达盒。
在另一优选例中，所述的核酸构建体中，所述的靶向核型多角体病毒的ie-1基因的sgRNA表达盒中，以U6-2小核RNA基因的启动子作为启动子。
在另一优选例中，所述的核酸构建体中，所述的靶向核型多角体病毒的me53基因的sgRNA表达盒中，以U6-2小核RNA基因的启动子作为启动子。
在另一优选例中，所述的核酸构建体中，所述的Cas9表达盒中，采用IE1启动子作为启动子；较佳地，还采用SV40作为终止子。
在另一优选例中，所述的核酸构建体中，还包括pBac5’末端和pBac3’末端。
在另一优选例中，所述的核酸构建体中，还包括报告基因的表达盒；例如，所述的报告基因是EGFP或GFP。较佳地，以IE1作为启动子，采用SV40作为终止子。
在本发明的另一方面，提供所述的核酸构建体的用途，用于制备具有抑制核型多角体病毒的能力的昆虫。
在一个优选例中，所述的昆虫是野生型时能被核型多角体病毒感染的昆虫。
在另一优选例中，所述的昆虫包括(但不限于)：家蚕。
在本发明的另一方面，提供一种制备具有抑制核型多角体病毒的能力的昆虫的方法，所述方法包括：将所述的核酸构建体转入昆虫的体内，从而获得具有抑制核型多角体病毒的能力的昆虫。
在一个优选例中，所述的方法包括：(1)提供一种核酸构建体，其包括操作性连接的：Cas9表达盒，sgRNA表达盒；其中该sgRNA表达盒包括：靶向核型多角体病毒的ie-1基因的sgRNA表达盒，以及靶向核型多角体病毒的me53基因的表达盒；(2)将(1)的核酸构建体转入昆虫体内，获得转基因昆虫，该转基因昆虫具有抑制核型多角体病毒的能力。
在一个优选例中，所述方法中，所述的靶向核型多角体病毒的ie-1基因的sgRNA表达盒包括：含有SEQ ID NO:4所示序列的sgRNA表达盒以及含有SEQ ID NO:5所示序列的sgRNA表达盒；
所述的靶向核型多角体病毒的me53基因的表达盒包括：含有SEQ ID NO:6所示序列的sgRNA表达盒以及含有SEQ ID NO:7所示序列的sgRNA表达盒。
在另一优选例中，所述的方法中，所述的昆虫是能被核型多角体病毒感染的昆虫；较佳地为家蚕。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、特异性靶向BmNPV基因组的转基因载体元件图。pXL-BacII-IE1-EGFP-IE1-Cas9_4×sgRNA转基因载体包含Cas9表达元件(IE1-Cas9)、sgRNA表达元件(4×U6-sgRNA)以及IE1-EGFP元件作为荧光筛选标记。
图2、转基因家蚕有效实现抵抗BmNPV。三龄起蚕在添食BmNPV(106OBs/头蚕)完毕，并转移到新鲜无毒桑叶上60小时后(感染后60小时)，对照组非转基因家蚕大部分都出现BmNPV感染症状(图2左)，而实验组转基因家蚕几乎全部眠起，处于健康状态(图2右)。对照组病蚕体壁紧张发亮，呈乳白色，行动活泼，不能入眠(图2左)，发病更早的一部分家蚕已经体皮破裂，流脓而死。转基因起蚕皮肤松弛，蚕体色正常，口器变大而灰白色，食桑旺盛(图2右)。
图3、CRISPR/Cas9介导的BmNPV基因组突变检测。A为非删除突变；B为小片段删减突变；C为大片段删除突变。
具体实施方式
本发明提供了一种提高昆虫对于核型多角体病毒(NPV)的抗性的方法，该方法利用CRISPR/Cas9技术定点靶向病毒基因组，对其进行切割以破坏其闭合环状双链基因组DNA的完整性或其关键基因功能的正常行使，从而达到清除病毒，阻止病毒复制的效果。
如本文所用，所述的“操作性连接”或“可操作性相连”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。
如本文所用，所述的“元件”是指一些对于蛋白的表达有用的一系列功能性的核酸序列，本发明中，所述的“元件”被系统地构建以形成一种核酸构建体。所述的“元件”的序列可以是本发明中所提供的那些，也包括它们的变体，只要这些变体基本上保留了所述“元件”的功能。
如本文所用，所述的“表达盒”是指包含有表达目的基因所需的所有必要元件的基因表达系统，通常其包括以下元件：启动子、目的基因序列，终止子；此外还可选择性包括信号肽编码序列等。这些元件是操作性相连的。
如本文所用，所述的昆虫是具有工业生产价值或具有经济价值的昆虫。较佳地，所述的昆虫是鳞翅目昆虫；较佳地为鳞翅目蚕蛾科昆虫。
本发明中，所述的“单导向RNA(single-guide RNA，sgRNA)”长度约为100个核苷酸。为了形成功能性的DNA靶向复合物，Cas9需要两种不同的RNA转录物——crRNA(CRISPRRNA)和tracrRNA(trans-activating crRNA)。然而，这样的双RNA可以重新装配成一种单导向RNA(sgRNA)，其包含的序列足以引导Cas9，介导靶DNA双链断裂。内切核酸酶Cas9与sgRNA协同作用定位在PAMs保守序列限定的位点，裂解切割入侵DNA。
本发明人研究了基于CRISPR/Cas9系统的抑制核型多角体病毒、特别是抑制家蚕核型多角体病毒的策略，理论上只需要将病毒基因组切断即可实现病毒的抑制，但是本发明人在实践中发现，核型多角体病毒具有一定的基因修复的功能，因此需要考虑开发能够确保使病毒基因组片段难以修复和包装、从而被宿主细胞降解的方法。
针对家蚕核型多角体病毒，本发明人前期考察和试验了很多病毒基因作为抑制靶标的可能性和效果，最终选择了病毒基因ie-1和me53作为靶标。ie-1基因在病毒入侵之后的早期即开始转录，IE1蛋白与病毒DNA合成有关，同时该蛋白还具有转录调控功能。me53基因是高度保守的杆状病毒基因，在病毒入侵到宿主细胞后的早期即开始转录翻译，ME53蛋白与病毒DNA复制、核衣壳组装和出芽病毒的组装有关。同时对两个靶基因进行切割，相较于单个基因的切割，抑制效果更为理想。
作为本发明的优选方式，针对病毒基因ie-1，本发明人设计了两个靶区段作为切割的目标；并且，针对me53基因，本发明人也设计了两个靶区段作为切割的目标。如此设计而获得的基于CRISPR/Cas系统的核酸构建体，当转化昆虫而获得转基因昆虫后，该昆虫当受到核型多角体病毒感染时，将对病毒基因组的4处产生切割，多重断裂使病毒基因组被正确修复和包装的能力大大降低。因此，本发明的基于CRISPR/Cas9的多重切割策略对核型多角体病毒有极大的杀伤作用。
作为本发明的进一步的优选方式，以核型多角体病毒的ie-1基因中GTGAACCAACCATCGGCAGC(即SEQ ID NO:4中第1-20bp)和GAGTCAAATATTAAAGTATT(即SEQ IDNO:5中第1-20bp)作为切割的靶标；并且，以核型多角体病毒的me53基因中GCAAAGTGTTTGAAATAATT(即SEQ ID NO:6第1-20bp)和GTGCACCAGACCCGACGCGG(即SEQ IDNO:7第1-20bp)作为切割的靶标。经过试验验证发现，以上述位点作为设计sgRNA的靶序列，所获得核酸构建体在转化昆虫后，具有良好的抑制病毒的效果。
本发明的一种核酸构建体的构建方式如图1所示，其中包括：Cas9表达盒，sgRNA表达盒；作为一种优选方式，所述的sgRNA表达盒：靶向核型多角体病毒的ie-1基因的sgRNA表达盒，以及靶向核型多角体病毒的me53基因的表达盒，各表达盒通过Goden-gate组装法进行连接。
此外，为了便于筛选转基因昆虫，还可以在所述的核酸构建体中加入报告基因的表达盒，从而通过鉴定荧光的有无来确定是否成功获得了转基因的昆虫。
除了本发明中所特别描述的，构建CRISPR/Cas系统所需的其它必要元件均可以采用本领域技术人员熟悉的元件。鉴于CRISPR/Cas系统已经是已知的技术，本领域技术人员能够根据公知技术来获得其它必要元件。目前，也已经能够通过商购的途径获得包含有常规CRISPR/Cas系统所必要的元件的表达构建物(表达质粒)，以及一些辅助质粒。
本发明还提供了利用本发明的方法获得的转基因的昆虫。将所获得的转基因昆虫与生产品系杂交，可进一步获得具有抗病毒能力的子代，这也被包含在本发明中。
在本发明的具体实施例中，提供了一种提高家蚕核型多角体病毒NPV抗性的方法，将CRISPR/Cas9技术与转基因技术相结合，在家蚕基因组内整合了靶向病毒基因组的元件，实现在病毒入侵家蚕后，迅速破坏病毒基因组，阻断病毒复制增殖，进而实现家蚕抗BmNPV的目的。所获得的转基因家蚕能够在BmNPV污染的环境中顺利存活，实现有效地抵抗BmNPV。将该转基因家蚕与生产品系杂交，有望在生产上得到应用。
本发明将CRISPR/Cas9技术与转基因技术相结合，在家蚕基因组内整合了定点靶向病毒基因组的元件，对病毒基因组进行有效切割以破坏其闭合环状双链基因组DNA的完整性或其关键基因功能的正常行使，从而达到清除家蚕体内的入侵病毒，阻止病毒在家蚕体内复制的效果。本发明中的转基因家蚕比通过RNA干涉方法实现抗病毒的转基因家蚕品系具有更强的BmNPV抗性；喂食理化药物的方法对于家蚕细胞有显著毒害作用，严重影响到家蚕的经济性状，难以投入生产，而通过本发明中的方法对于家蚕经济性状的影响较小，有望应用于生产。总之，该方法突破传统RNA干涉和喂食理化药物等方法的局限性，显著提高了受病毒感染家蚕的存活率，成功实现了家蚕有效抗击病毒的目的。将该转基因家蚕与生产品系杂交，将对促进蚕业生产健康发展大有裨益。
本发明的方法突破了传统RNA干涉、化学药物和过表达抗性基因等方法的局限性，显著提高了受病毒感染的昆虫的存活率，有效地提高了昆虫抗击病毒的能力。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、靶标基因的选择与sgRNA的设计
家蚕核型多角体病毒的基因组大小从80-180kb不等，大约编码89-181种蛋白。本发明人前期考察和试验了很多BmNPV的基因作为靶标的可能性和效果，最终选择了病毒的ie-1基因(SEQ ID NO:2)和me53基因(SEQ ID NO:3)作为靶标，以它们作为靶标的病毒抑制效果最为优异。
针对这两个靶标基因，各设计2条sgRNA。如此设计，可预期CRISPR/Cas系统将对病毒基因组的4处产生切割。
相关的sgRNA靶点如下(有下滑线的序列为靶向序列，加粗显示的序列为PAM序列(Protospacer Adjacent Motif))：
实施例2、载体的构建
本发明利用的pXL-BacII-IE1-EGFP注射转座子载体是piggyBac衍生来的(参见Zeng et al.,Insect Biochemistry and Molecular Biology,2016)；pcDNA3.1-Cas9质粒来自ViewSolid公司，内含Cas9基因模板(SEQ ID NO:1，其中，ATG为起始密码子，TGA为终止密码子，在终止密码子前有核定位信号)。
分别以pXL-BacII-IE1-EGFP和pcDNA3.1-Cas9质粒为IE1启动子和Cas9基因的扩增模板。依次通过亚克隆将IE1启动子序列和Cas9基因的ORF序列分别连接到pXL-BacII-IE1-EGFP载体中，得到pXL-BacII-IE1-EGFP-IE1-Cas9载体。
本发明人选择家蚕U6-2小核RNA(small nuclear RNA)基因的启动子作为转录sgRNA的启动子，使用引物从家蚕P50基因组中扩增出长度为467bp的U6-2启动子。将相关sgRNA序列克隆连接到U6-2启动子的+1位上。U6-2启动子扩增引物序列为：
U6-2_F：5’-AGGTTATGTAGTACACATTG-3’(SEQ ID NO:8)；
U6-2_R：5’-ACTTGTAGAGCACGATATTTTG-3’(SEQ ID NO:9)。
sgRNA框架序列具体如下(20bp“G...N”序列代表sgRNA靶点序列(如实施例1中的4个靶点序列))：
GNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT(SEQ ID NO:10)。
构建好的U6-sgRNA片段被连接到pMD18-T载体中，并测序验证无误。通过Golden-gate方法，一次性将4个表达sgRNA的模块(从5’→3’，sgRNA串联次序依次为：ie1-sgRNA_1、ie1-sgRNA_2、me53-sgRNA_1、me53-sgRNA_2，每一sgRNA操作性连接一个U6启动子)经组装克隆到pXL-BacII-IE1-EGFP-IE1-Cas9转基因质粒中，经测序验证正确，从而成功构建了pXL-BacII-IE1-EGFP-IE1-Cas9_4×sgRNA质粒，该质粒的示意图如图1。
实施例3、转基因家蚕品系的构建
本实施例中，可表达Piggybac转座酶的质粒PHA3PIG(参见Tamura et al.,NatureBiotechnology,2000)被用作辅助质粒产生转座酶，注射质粒DNA的纯化试剂盒用Qiagen公司的Plasmid Midi kit试剂盒纯化。
将前述构建的pXL-BacII-IE1-EGFP-IE1-Cas9_4×sgRNA质粒分别与转座酶mRNA及Helper质粒混合均匀。收集新产2小时以内的Nistari品系家蚕卵，整齐摆放在玻璃板上，并使用胶水将其固定，采用甲醛熏蒸消毒5min。进行显微注射，注射方法参照Kanda&Tamura(1991)描述的方法，注射后的蚕卵用无毒胶封口以防止污染。将注射过的胚胎置于25℃恒温环境中孵育，9～11天后收蚁蚕(G0代)。饲养注射过的家蚕至成虫阶段，使其相互自交，剩余的成虫与野生型成虫杂交。待交配完毕，使雌蛾在蛾圈中产卵。待G1代胚胎发育至8～9天时，胚胎完全变黑，在荧光显微镜下筛选阳性转基因个体(产生绿色荧光)。
阳性转基因个体至成虫阶段，将其与野生型成虫进行杂交，产生大批量G2代家蚕转基因个体，用于生测实验。
实施例4、病毒接种和死亡率分析
将300头三龄起转基因家蚕均分5组(每组60头)，饥饿处理12小时后，分别用不同剂量的病毒饲喂(107OBs/头、106OBs/头、105OBs/头、104OBs/头和0OBs/头)。对照组的300头野生型Nistari家蚕做同样处理。
病毒的接种方式如下：将新鲜桑叶剪成1cm×1cm的方块。将1×109OBs/ml BmNPV病毒原液梯度稀释成4个浓度的病毒悬液，分别为1×109OBs/ml、1×108OBs/ml、1×107OBs/ml和1×106OBs/ml。取10μl的BmNPV OBs悬浮液涂抹在每片小方块桑叶上，放入24孔板(1片桑叶/孔)饲喂家蚕。因此，以上4个梯度的病毒悬液接种剂量分别为：107OBs/头、106OBs/头、105OBs/头、104OBs/头。空白对照用10μl灭菌水涂抹的方块桑叶饲喂家蚕(0OBs/头)。
死亡率分析：待蚕完全吃光桑叶后(约24小时)，转移至大盒子中用新鲜不添毒桑叶饲养。逐日观察，统计死亡数目。死蚕立即移走，防止其他蚕因二次感染病毒而死亡。生测实验的死亡率从感染后第一天开始统计逐日统计，直至羽化为止。用SPSS(StatisticalProduct and Service Solutions)进行死亡率的统计与分析。
生测实验结果如图2，三龄起蚕在添食BmNPV(106OBs/头蚕)完毕60小时后，对照组野生型家蚕大部分都出现BmNPV感染症状(图2左)，而实验组转基因家蚕几乎全部眠起，处于健康状态(图2右)。对照组病蚕体壁紧张发亮，呈乳白色，行动活泼，不能入眠(图2左)，发病更早的一部分家蚕已经体皮破裂，流脓而死。转基因家蚕皮肤松弛，蚕体色正常，口器变大而灰白色，食桑旺盛(图2右)。
用SPSS进行野生型家蚕和转基因家蚕半致死剂量(LD50)统计与分析。LD50的计算使用感染后第7天的死亡率数据。结果如表1所示。
表1、野生型和转基因家蚕半致死剂量(LD50)的比较
由表1可见，野生型家蚕食用少量BmNPV病毒即可发生死亡，而转基因家蚕则可以耐受高剂量的病毒。
BmNPV基因组突变检测(图3)：分别提取野生型家蚕体内的病毒基因组和转基因家蚕体内的病毒基因组。用BmNPV-ie1-F：5’-GTGTTCGCCATTAGGGCAGTA-3’(SEQ ID NO:11)和BmNPV-ie1-R：5’-GCGCACCAACTCCCATTGTT-3’(SEQ ID NO:12)引物扩增靶标基因ie1序列，克隆测序比对，检测病毒ie-1基因突变情况；用BmNPV-me53-F：5’-GGTCTACCTCTAACAGCGTCG-3’(SEQ ID NO:13)和BmNPV-me53-R：5’-TAAAGCCTCTCGATGGCTGA-3’(SEQ ID NO:14)引物扩增靶标基因me53序列，克隆测序比对，检测me53基因突变情况；用引物BmNPV-me53-F：5’-GGTCTACCTCTAACAGCGTCG-3’(SEQ ID NO:15)和BmNPV-ie1-R：5’-GCGCACCAACTCCCATTGTT-3’(SEQ ID NO:16)扩增me53和ie-1及两基因之间的序列，克隆测序比对，来检测大片段删除突变。
结果如图3A-C，可见所建立的CRISPR/Cas9能够介导BmNPV基因组发生突变。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (14)
1.一种非疾病诊断治疗目的的抑制核型多角体病毒的方法，其特征在于，所述的方法包括：以核型多角体病毒的ie-1基因和me53基因作为靶标，利用CRISPR/Cas系统介导的基因组编辑方法切割病毒基因组，从而抑制核型多角体病毒；其中，以核型多角体病毒的ie-1基因中GTGAACCAACCATCGGCAGC和GAGTCAAATATTAAAGTATT作为切割的靶标；以核型多角体病毒的me53基因中GCAAAGTGTTTGAAATAATT和GTGCACCAGACCCGACGCGG作为切割的靶标；所述的核型多角体病毒是家蚕核型多角体病毒。
2.一种抑制昆虫的核型多角体病毒感染的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体包括操作性连接的：Cas9表达盒，sgRNA表达盒；
其中，所述的sgRNA表达盒包括：靶向核型多角体病毒的ie-1基因的sgRNA表达盒，以及靶向核型多角体病毒的me53基因的表达盒；
其中，所述的靶向核型多角体病毒的ie-1基因的sgRNA表达盒靶向ie-1基因中SEQ IDNO: 4所示序列和SEQ ID NO: 5所示序列；所述的靶向核型多角体病毒的me53基因的表达盒靶向me53基因中SEQ ID NO: 6所示序列和SEQ ID NO: 7所示序列。
3.如权利要求2所述的核酸构建体，其特征在于，所述的靶向核型多角体病毒的ie-1基因的sgRNA表达盒中，以U6-2小核RNA基因的启动子作为启动子。
4.如权利要求2所述的核酸构建体，其特征在于，所述的靶向核型多角体病毒的me53基因的sgRNA表达盒中，以U6-2小核RNA基因的启动子作为启动子。
5.如权利要求2所述的核酸构建体，其特征在于，所述的Cas9表达盒中，采用IE1启动子作为启动子。
6.如权利要求5所述的核酸构建体，其特征在于，还采用SV40作为终止子。
7.权利要求2-6任一所述的核酸构建体的用途，用于制备具有抑制核型多角体病毒的能力的昆虫。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的核型多角体病毒是家蚕核型多角体病毒。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的昆虫是能被核型多角体病毒感染的昆虫。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的昆虫是家蚕。
11.一种制备具有抑制核型多角体病毒的能力的昆虫的方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求2-6任一所述的核酸构建体转入昆虫的体内，从而获得具有抑制核型多角体病毒的能力的昆虫。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的方法包括：
(1) 提供一种核酸构建体，其包括操作性连接的：Cas9表达盒，sgRNA表达盒；其中该sgRNA表达盒包括：靶向核型多角体病毒的ie-1基因的sgRNA表达盒，以及靶向核型多角体病毒的me53基因的表达盒；其中，所述的靶向核型多角体病毒的ie-1基因的sgRNA表达盒靶向ie-1基因中SEQ ID NO: 4所示序列和SEQ ID NO: 5所示序列；所述的靶向核型多角体病毒的me53基因的表达盒靶向me53基因中SEQ ID NO: 6所示序列和SEQ ID NO: 7所示序列；
(2) 将(1)的核酸构建体转入昆虫体内，获得转基因昆虫，该转基因昆虫具有抑制核型多角体病毒的能力。
13.如权利要求11-12任一所述的方法，其特征在于，所述的昆虫是能被家蚕核型多角体病毒感染的昆虫。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述的昆虫为家蚕。
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| CN102433340A (zh) * | 2011-11-25 | 2012-05-02 | 西南大学 | 家蚕核型多角体病毒抗性关键基因BmPGRP2及其应用 |
| CN105132460A (zh) * | 2015-09-29 | 2015-12-09 | 西南大学 | Cas9介导的家蚕基因编辑载体和应用 |
-
2016
- 2016-05-16 CN CN201610324239.3A patent/CN107384919B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102433340A (zh) * | 2011-11-25 | 2012-05-02 | 西南大学 | 家蚕核型多角体病毒抗性关键基因BmPGRP2及其应用 |
| CN105132460A (zh) * | 2015-09-29 | 2015-12-09 | 西南大学 | Cas9介导的家蚕基因编辑载体和应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Autographa californica Multiple Nucleopolyhedrovirus me53 (ac140) Is a Nonessential Gene Required for Efficient Budded-Virus Production;Jondavid de Jong等;《JOURNAL OF VIROLOGY》;20090831;第83卷(第15期);7440-7448 * |
| Establishment of a highly efficient virus-inducible CRISPR/Cas9 system in insect cells;Zhan-Qi Dong等;《Antiviral Research》;20160312;第130卷;50-57 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN107384919A (zh) | 2017-11-24 |
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