CN114231666B - 快速检测家蚕核型多角体病毒的探针、试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种本发明公开了一种快速检测家蚕核型多角体病毒的探针，能够通过RAA技术来快速检测家蚕核型多角体病毒；还公开了快速检测家蚕核型多角体病毒的试剂盒，检测快速，灵敏度高；还公开了快速检测家蚕核型多角体病毒的试剂盒的检测方法，减少了试剂混合加样步骤，操作方便，节省时间。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种快速检测家蚕核型多角体病毒的探针、试剂盒及检测方法。
背景技术
家蚕核型多角体病是最古老的病毒性蚕病，在蚕的各个龄期和各发育阶段都有发生。目前检测家蚕是否带有核型多角体病的常用方法是PCR核酸扩增技术，荧光定量PCR技术，但是PCR核酸扩增技术存在检验设施条件高的问题，荧光定量PCR技术存在检测繁琐的问题。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种快速检测家蚕核型多角体病毒的探针，探针的核苷酸序列为：TCAAAAACGAAGAGCGGTTGACTA/i6FAMdT/[THF]GC/iBHQ1dT/AAGAAAAACGA；
本发明的另外一个目的是提供一种快速检测家蚕核型多角体病毒的试剂盒，检测快速，灵敏度高；
本发明还有一个目的是提供一种所述的快速检测家蚕核型多角体病毒的试剂盒的检测方法减少了试剂混合加样步骤，操作方便，节省时间。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种快速检测家蚕核型多角体病毒的探针，探针的的核苷酸序列为：TCAAAAACGAAGAGCGGTTGACTA/i6FAMdT/[THF]GC/iBHQ1dT/AAGAAAAACGA。
快速检测家蚕核型多角体病毒的试剂盒，包括：上游引物、下游引物、探针。
优选的是，所述上游引物的核苷酸序列为：CTCAGAATGTGGATAATGTAAAAGGTCA；所述下游引物的核苷酸序列为：ACTAGCGTCTACATCTTTAATCTCGCCAGA。
优选的是，所述上游引物、所述下游引物和所述探针为混合均匀的冻干粉。
快速检测家蚕核型多角体病毒的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
S1、将待测物研磨粉碎或匀浆破碎，加入裂解液静置裂解后，取上清液，得待测液；
S2、取三份试剂盒，将每份试剂盒中的所有试剂混合均匀，得三份预混物；
S3、向每份预混物中加入buffer A，待混合均匀后，其中一份中加入待测液，得检测组，另外两份分别加入与所述待测液相同量的阳性DNA对照模板和阴性对照模板，分别得阳性对照组和阴性对照组；
S4、向所述检测组、所述阳性对照组和所述阴性对照组中均加入buffer B，震荡混匀后，离心，将所述检测组、所述阳性对照组和所述阴性对照组中的溶液离心至试管底部，分别得到待检测的检测组、待检测的阳性对照组和待检测的阴性对照组；
S5、将所述待检测的检测组、所述待检测的阳性对照组和所述待检测的阴性对照组均放入带有荧光检测功能的仪器中，设定程序39.2℃，检测15-20min。
优选的是，步骤S3中所述buffer A为20％PEG，步骤S4中所述buffer B为醋酸镁。
优选的是，所述阴性对照模板为20％PEG。
优选的是，所述阳性DNA对照模板为插入EB1基因片段的重组质粒。
优选的是，所述阳性DNA对照模板的模板为30000拷贝/μL。
本发明至少包括以下有益效果：
第一、本发明基于RAA技术，提供了快速检测家蚕核型多角体病毒的探针，能够通过RAA技术来快速检测家蚕微孢子虫。
第二、本发明提供了快速检测家蚕核型多角体病毒的试剂盒，检测快速，灵敏度高。
第三、本发明提供了快速检测家蚕核型多角体病毒的试剂盒的检测方法，减少了试剂混合加样步骤，操作方便，节省时间。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明的其中一种技术方案筛选正向引物F1与反向引物R1-R8配对筛选引物组的检测曲线图；
图2为本发明的其中一种技术方案筛选正向引物F2与反向引物R1-R8配对筛选引物组的检测曲线图；
图3为本发明的其中一种技术方案筛选正向引物F3与反向引物R1-R8配对筛选引物组的检测曲线图；
图4为本发明的其中一种技术方案筛选正向引物F4与反向引物R1-R8配对筛选引物组的检测曲线图；
图5为本发明的其中一种技术方案筛选正向引物F5与反向引物R1-R8配对筛选引物组的检测曲线图；
图6为本发明的其中一种技术方案筛选正向引物F6与反向引物R1-R8配对筛选引物组的检测曲线图；
图7为本发明的其中一种技术方案所述的筛选正向引物F7与反向引物R1-R8配对筛选引物组的检测曲线图；
图8为本发明的其中一种所述的阳性标准品的DNA浓度提高后F3+R3、F3+R4、F3+R8三对引物的稳定性的检测曲线图；
图9为本发明的其中一种所述的阳性标准品的DNA浓度提高后F5+R6、F6+R1两对引物的稳定性的检测曲线图；
图10为本发明的其中一种所述的阳性标准品的DNA浓度提高后F7+R4、F7+R5两对引物的稳定性的检测曲线图；
图11为7对引物组同时检测阳性、阴性标准品的对比情况曲线图；
图12为引物组F3+R4组合的测试情况曲线图；
图13为BmNPV ie-1基因RAA荧光检测试剂盒检测家蚕个体BmNPV带毒情况图。
其中，图13中，图A：添食BmNPV及健康的家蚕；图B：电动研磨制样；图C：研磨组织裂解5min；图D：制备反应体系；图E：加入RAA荧光检测仪；图F：输出检测结果(T1：阳性对照,曲线颜色橙色；T2：阴性对照，曲线颜色红色；T3-5，健康蚕组织液样本，曲线颜色分别是黄绿色、深蓝色、青色；T6-8，BmNPV添食36h的蚕组织液样本，曲线颜色分别是紫色、黄色、浅蓝色)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
<实施例>
1、探针和引物的合成
由于探针序列长度需要介于40-50bp之间，同时淬灭基团和荧光基团分别连接在一对胸腺嘧啶核苷酸上，这对寡聚T中间被1-5个碱基隔开，杂合1-5个碱基中有一个碱基被四氢呋喃取代，在BmNPV ie-1基因全长1755bp中进行预设计，探针起始于1469-1508bp共计40bp，淬灭基团和荧光基团分别连在1493与1497位置，第149位胸腺嘧啶被四氢呋喃取代，形成所需检测探针(BmNPV-probe)，BmNPV-probe的核苷酸序列为：TCAAAAACGAAGAGCGGTTGACTA/i6FAMdT/[THF]GC/iBHQ1dT/AAGAAAAACGA，以此为基点设计出56对引物进一步筛选匹配度，设计出的引物如表1所示。
表1：RAA引物序列
| 引物 | 核苷酸序列 |
| BmNPV-F1 | GAACAGTATTTGACTCAGAATGTGGATAAT |
| BmNPV-F2 | ATTTGACTCAGAATGTGGATAATGTAAAAG |
| BmNPV-F3 | CTCAGAATGTGGATAATGTAAAAGGTCA |
| BmNPV-F4 | GAATGTGGATAATGTAAAAGGTCACAATT |
| BmNPV-F5 | GATAATGTAAAAGGTCACAATTTTATAGTA |
| BmNPV-F6 | AAGGTCACAATTTTATAGTATTGTCTTTCA |
| BmNPV-F7 | AATTTTATAGTATTGTCTTTCAAAAACGAA |
| BmNPV-R1 | TATTTTTGAATTACTTGACTAGCGTCTACA |
| BmNPV-R2 | TTGAATTACTTGACTAGCGTCTACATCTT |
| BmNPV-R3 | CTTGACTAGCGTCTACATCTTTAATCTCG |
| BmNPV-R4 | ACTAGCGTCTACATCTTTAATCTCGCCAGA |
| BmNPV-R5 | CGTCTACATCTTTAATCTCGCCAGAAATC |
| BmNPV-R6 | TCTACATCTTTAATCTCGCCAGAAATCCAA |
| BmNPV-R7 | ACATCTTTAATCTCGCCAGAAATCCAATA |
| BmNPV-R8 | TTTAATCTCGCCAGAAATCCAATAAAACTC |
2、引物的筛选
2.1筛选引物用试剂盒具体包括：RAA冻干粉具体包括25μL重组聚合酶、10μL待测上游引物F、10μL待测下游引物R、0.6μL探针、20.4μL纯化水。
2.2将抽提得到的DNA为试验的阳性标准品，对阳性标准品分别使用上述反应体系反应测试，反应程序39.2℃1min，39.2℃30s每检测循环，共计检测40个循环。
2.3对表1中的引物进行组合配对，其中F1分别与R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8进行组合配对，F2分别与R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8进行组合配对，F3分别与R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8进行组合配对，F4分别与R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8进行组合配对，F5分别与R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8进行组合配对，F6分别与R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8进行组合配对，F7分别与R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8进行组合配对；将组合配对的引物通过2.1的试剂盒进行检测，检测包括以下具体步骤：
S1、当待测物为家蚕血液时，取50μL家蚕血，向其中加入2倍体积的裂解液混匀，裂解5-10min后，再次震荡混匀，然后稍作静置取其上清液，得待测液；如果待测物为蚕蚕组织，则先震荡破碎，然后加入10倍体积的裂解液混匀，裂解5-10min后，再次震荡混匀，静置30s后，取上清液，得待测液；
S2、对于每一份引物组合取三份试剂盒，将每份试剂盒中的所有试剂混合均匀，得三份预混物；
S3、向每份预混物中加入42.5μL buffer A即42.5μL 20％PEG，待混合均匀后，其中一份中加入5μL样本DNA模板液，得检测组，另外两份分别加入与所述待测液相同量的阳性30000拷贝/μL插入EB1基因片段的重组质粒和20％PEG，分别得阳性对照组和阴性对照组；
S4、向所述检测组、所述阳性对照组和所述阴性对照组中均加入2.5μL buffer B，震荡混匀后，离心，将所述检测组、所述阳性对照组和所述阴性对照组中的溶液离心至试管底部，分别得到待检测的检测组、待检测的阳性对照组和待检测的阴性对照组；
S5、将所述待检测的检测组、所述待检测的阳性对照组和所述待检测的阴性对照组均放入带有荧光检测功能的仪器中，设定程序39.2℃，检测15-20min；
其中，当阳性对照组检测出峰时间≤15min(Ct值大于等于30)为有效结果；阴性对照组无扩增曲线；检测样本有典型的扩增曲线，出峰时间≤18min(Ct值小于等于36)为阳性，出峰时间大于18min为阴性。
通过上述具体检测步骤，对2.2引物的组合配对进行检测，检测结果如图1-7所示，选择其中出峰时间早且峰值较高的引物组，分别为F1+R3、F1+R5、F1+R7、F1+R8、F2+R3、F2+R7、F2+R8、F3+R3、F3+R4、F3+R6、F3+R8、F4+R3、F4+R8、F5+R6、F5+R7、F6+R1、F6+R4、F6+R6、F6+R7、F7+R3、F7+R4、F7+R5、F7+R6这23组，将此7组进行进一步的分析。
2.4当阳性标准品的DNA浓度提高为1×104个拷贝时，对上述23组引物再次进行S1-S5步骤的检测，得到的结果如图8-10所示，F3+R3、F3+R4、F3+R8、F5+R6、F6+R1、F7+R5、F7+R4这7组，有较好的稳定性。
2.5取第二次筛选出的7对引物，DNA浓度为1×104个拷贝，阳性标准品重复测试3个，每组加一个阴性对照，结果见11-12，最优的引物组合为F3+R4。
3、家蚕个体检验BmNPV实例
选取添食BmNPV 36h后的带毒个体和健康蚕个体各3条进行对比测试(图13A)，然后加入5倍体积的裂解液进行研磨制样(图13B、C)，然后按照试剂盒使用说明依次在预混冻干粉离心管中加入42.5μL buffer A、5μL模板溶液(阳性对照、阴性对照、家蚕组织研磨裂解液)、2.5μL buffer B，然后迅速震荡混合并瞬时离心(见图13D)，图13E为制备好的样本上机检测，图13F结果显示蚕添食36h后全部检出病毒，为阳性反应，所有对照的健康蚕显示为阴性。值得注意的是，样本加入反应体系并未纯化，且有明显可见的色素和组织残渣，尤其是BmNPV感染的家蚕样本，结果显示依然可以检测病毒，说明该反应体系有很高的稳定性。
通常家蚕感染BmNPV后约84-90h发病，在发病之前并无显著症状，但通过本发明检测可以将BmNPV感染检出时间点大大提前，并实现该病的早期诊断，为有效防控该病赢得更多的时间。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (2)
1.快速检测家蚕核型多角体病毒的试剂盒，其特征在于，包括：上游引物、下游引物、探针；
所述探针的核苷酸序列为：TCAAAAACGAAGAGCGGTTGACTA/i6FAMdT/[THF]GC/iBHQ1dT/AAGAAAAACGA；
所述上游引物的核苷酸序列为：CTCAGAATGTGGATAATGTAAAAGGTCA；所述下游引物的核苷酸序列为：ACTAGCGTCTACATCTTTAATCTCGCCAGA。
2.如权利要求1所述的快速检测家蚕核型多角体病毒的试剂盒，其特征在于，所述上游引物、所述下游引物和所述探针为混合均匀的冻干粉。
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