KR102217158B1 - 미세생쥐 바이러스 검출을 위한 프라이머 및 TaqMan 프로브 세트 및 이를 이용한 미세생쥐 바이러스 검출 방법 - Google Patents

미세생쥐 바이러스 검출을 위한 프라이머 및 TaqMan 프로브 세트 및 이를 이용한 미세생쥐 바이러스 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미세생쥐 바이러스 검출을 위한 프라이머 세트, TaqMan 프로브 및 이를 이용한 미세생쥐 바이러스 검출 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 미세생쥐 바이러스 증폭이 가능한 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 TaqMan 프로브로 구성된 미세생쥐 바이러스 검출을 위한 프라이머 및 프로브 세트, 이를 이용한 미세생쥐 바이러스 검출용 키트 및 미세생쥐 바이러스 검출방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 미세생쥐 바이러스 검출을 위한 프라이머 및 프로브 세트를 이용하면 MVMi, MVMp, MVMm 및 MVMc를 포함하는 MVM을 모두 특이적으로 검출할 수 있는 것을 확인하였으며, 상업적으로 판매되는 미세생쥐 바이러스 검출용 키트에 비해 바이러스 검출 민감도가 우수한 것을 확인하였으므로, 미세생쥐 바이러스 검출을 위한 키트 및 방법에 유용하게 활용할 수 있다.

Description

미세생쥐 바이러스 검출을 위한 프라이머 및 TaqMan 프로브 세트 및 이를 이용한 미세생쥐 바이러스 검출 방법{Primer and TaqMan probe set for detection of Minute virus of Mice and Method for detection of Minute virus of Mice Using the Same}
본 발명은 미세생쥐 바이러스 검출을 위한 프라이머 및 TaqMan 프로브 세트 및 이를 이용한 미세생쥐 바이러스 검출 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 미세생쥐 바이러스 증폭이 가능한 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 TaqMan 프로브로 구성된 미세생쥐 바이러스 검출을 위한 프라이머 및 프로브 세트, 이를 이용한 미세생쥐 바이러스 검출용 키트 및 미세생쥐 바이러스 검출방법에 관한 것이다.
항체의약품, 유전자 재조합 단백질 치료제 등과 같은 세포배양 유래 생물의약품 생산을 위해 설치류 유래 세포주인 CHO(Chinese hamster ovary) 세포와 BHK(Baby hamster kidney) 세포가 주로 사용되고 있다. 이러한 세포들은 미세생쥐 바이러스(Minute Virus of Mice; MVM)에 쉽게 감염될 수 있으며, 생물 의약품 생산공정에서 이러한 세포주들이 오염된 사례가 보고된바 있다.
동물혈청 성분과 같은 오염된 생물학적 시약의 사용, 제제화 단계에서 오염된 부형제의 사용, 세포를 다루는 과정에서 오염된 시약의 사용 등으로 인해 생산공정에서 외래성 바이러스가 유입될 수 있으며, CHO 세포 배양과정에서 EHDV(epizootic hemorrhagic disease virus), MVM(minute virus of mice), Reo(Reovirus type 3) 등의 외래성 바이러스로 오염된 사례도 있다. 상기와 같은 바이러스는 외부로부터 유입된 비내인성 바이러스(non-endogenous virus; 배양도중 외부로부터 유입된 바이러스)로, 그 중 MVM은 파르보바이러스(parvovirus)과에 속하며 단일가닥 DNA(single-stranded DNA)로 구성된 5 kb 유전체를 갖고 있는 외피비보유 바이러스(non-enveloped virus)이다.
특히, MVM은 열, 유기용매, 계면활성제, 산과 알칼리, 건조 등 물리 화학적 처리에 매우 큰 저항성을 나타내어 세포배양 유래 생물의약품 생산 공정의 안전성 검증을 위한 모델 바이러스로 이용되고 있다. MVM의 자연계상의 숙주는 집쥐(Mus muscμLus)이며, 성체 쥐가 감염되었을 경우 무증상을 나타내나, 신생아 쥐나 햄스터가 감염되었을 경우 기형이 되거나 사망할 수 있다. MVM은 세포분화, 세포증식, 면역억제를 포함하는 생물학적 과정에 관여하며, 바이러스의 비구조적 단백질이 세포독성을 나타낸다고 보고된바 있다 (Erickson, G. A., et al., DevBiol. Stand., 75:173-175, 1991).
내인성 및 외래성 바이러스의 검출을 위해 in vitro 시험법, in vivo 시험법, 항체생산 시험법 등 많은 시험법이 사용되고 있으나, 이러한 생물학적 시험은 시간과 비용이 많이 드는 단점이 있다. 이에 비해 PCR 시험법은 적은 양의 DNA나 RNA를 증폭하여 바이러스를 검출할 수 있기 때문에 in vitro 시험법, in vivo 시험법, 항체생산 시험법과 같이 세포나 동물을 사용하는 생물학적 시험법들에 비해 민감도 높은 장점이 있으며, 또한 짧은 시간에 많은 시료를 분석할 수 있어 생물학적 시험법에 비해 시간과 경비를 절약할 수 있다. 또한, 바이러스 특이적 프라이머를 사용하여 바이러스 존재 유무를 검출하기 때문에 특이도가 매우 높다(이동혁 외, Kor . J. Microbiol . Biotechnol ., 36:12-20, 2008).
엔드 포인트 분석(End-point analysis)인 일반적인 PCR은 주로 증폭 반응 후의 산물을 아가로스 겔에서 분리하여 확인하며 대강의 양을 어림잡기 때문에 정량 분석의 방법으로 활용되는데 문제가 있으나, 실시간 중합효소연쇄반응(real-time polymerase chain reaction, real-time RCR, 이하 '실시간 PCR'로 표기함)은 실시간으로 증폭되는 DNA 또는 RNA의 양을 온라인으로 형광분석하여 정량할 수 있기 때문에, 오염된 소량의 바이러스를 정량 분석할 수 있다.
한편, TaqMan 프로브는 5′ 말단에 형광단(fluorophore) 및 3′ 말단에 소광제(quencher)가 붙어있는 특이적인 염기서열로 구성되어 있으며, 실시간 PCR 과정 중 신장(extension) 단계에서 5′→ 3′엑소뉴클레아제 활성(exonuclease activity)을 가지는 Taq DNA 중합효소(Taq DNA polymeras)에 의해 형광단 및 소광제가 떨어지면서 발광하게 된다. 이 과정에서 발광되는 형광량을 실시간으로 측정하여 증폭되는 핵산의 양을 정량할 수 있다.
본 발명에서는 CHO 세포주를 이용한 바이오의약품 제조 공정 중 세포주, 원료물질, 제조공정, 완제품에서 MVM을 정량적으로 검출하기 위해 예의 노력한 결과, MVMi, MVMp, MVMm 및 MVMc를 포함하는 MVM을 모두 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트 및 이를 바탕으로 특이적인 TaqMan 프로브(probe)를 디자인하여 실시간 PCR을 수행한 결과, 다양한 종류의 MVM를 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 미세생쥐 바이러스 미세생쥐 바이러스 증폭이 가능한 프라이머 세트 및 TaqMan 프로브를 포함하는 미세생쥐 바이러스 검출용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 미세생쥐 바이러스 검출용 조성물을 포함하는 미세생쥐 바이러스 검출용 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 미세생쥐 바이러스 검출용 조성물을 이용하는 미세생쥐 바이러스 검출 방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위해,
본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머 및 서열번호 9로 표시되는 프로브를 포함하는 미세생쥐 바이러스(Minute Virus of Mice; MVM) 검출을 위한 프라이머 및 프로브 세트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 프라이머 및 프로브 세트는 MVMi, MVMp, MVMm 및 MVMc로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 미세생쥐 바이러스를 검출할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 프로브는 5` 말단에 형광단(fluorophore)이 표지되고 3` 말단에는 소광제(quencher)가 표지될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 형광단은 FAM(carboxyfluorescein), JOE(2,7-dimethoxy-4,5-dichloro-6-carboxyfluoroscein), TAMRA(5-Carboxytetramethylrhodamine), Cy3(indocarbocyanine-3), Cy5(indocarbocyanine-5), Rox(6-Carboxy-X-rhodamine)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 소광제는 BHQ-1(Black Hole Quencher 1), BHQ-2(Black Hole Quencher 2), BHQ-3(Black Hole Quencher 3), TAMRA(5-Carboxytetramethylrhodamine), DDQ1(deep dark Quencher 1), DDQ2(deep dark Quencher 2)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 미세생쥐 바이러스 검출을 위한 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 미세생쥐 바이러스 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 키트는 DNA 중합효소, dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP) 혼합물, 완충액(buffer solution) 및 증류수를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 미세생쥐 바이러스 검출을 위한 프라이머 및 프로브 세트를 사용하여, 분리된 생물학적 시료의 미세생쥐 바이러스 유전자를 검출하는 단계를 포함하는 미세생쥐 바이러스 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 미세생쥐 바이러스 검출을 위한 프라이머 및 프로브 세트를 이용하면 MVMi, MVMp, MVMm 및 MVMc를 포함하는 MVM을 모두 특이적으로 검출할 수 있는 것을 확인하였으며, 상업적으로 판매되는 미세생쥐 바이러스 검출용 키트에 비해 바이러스 검출 민감도가 우수한 것을 확인하였으므로, 미세생쥐 바이러스 검출을 위한 키트 및 방법에 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 미세생쥐 바이러스에 대한 실시간 PCR 키트의 민감성을 확인한 데이터이다.
도 2는 본 발명의 미세생쥐 바이러스 검출을 위한 프라이머 및 프로브 세트를 이용하였을 때, 각 세포주에 따른 실시간 PCR 키트의 특이성을 확인한 데이터이다.
도 3은 본 발명의 미세생쥐 바이러스 검출을 위한 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 실시간 PCR 결과(a)와 상업적 키트(ViralSEQ® Mouse Minute Virus (MMV) Real-Time PCR kit)를 이용한 실시간 PCR 결과(b)를 나타낸 데이터이다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머 및 서열번호 9로 표시되는 프로브를 포함하는 미세생쥐 바이러스(Minute Virus of Mice; MVM) 검출을 위한 프라이머 및 프로브 세트에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 및 프로브 세트는 MVMi, MVMp, MVMm 및 MVMc로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 미세생쥐 바이러스를 검출하는 것을 특징으로 하나, 이에 한정되는 것은 아니며 다양한 변종의 미세생쥐 바이러스를 검출할 수 있다.
본 발명의 "프라이머(primer)"는 중합효소연쇄반응에서 이용되는 표적 핵산에 인접해 있는 5’말단 서열 및 3’말단 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 의미하며, 용어 "전방향 프라이머(forward primer)" 및 "역방향 프라이머(reverse primer)"는 중합효소연쇄반응에 의해 증폭되는 유전자의 일정 부위의 3’말단 및 5’말단에 각각 결합하는 프라이머를 의미한다.
본 발명의 "프로브"는 MVM에 상보적으로 결합할 수 있는 서열번호 9의 염기서열을 가지는 것으로서, 5’ 말단에는 형광단(fluorophore)이 표지되고, 3’ 말단에는 소광제(quencher)가 표지된다.
상기 형광단은 FAM(carboxyfluorescein), JOE(2,7-dimethoxy-4,5-dichloro-6-carboxyfluoroscein), TAMRA(5-Carboxytetramethylrhodamine), Cy3(indocarbocyanine-3), Cy5(indocarbocyanine-5), Rox(6-Carboxy-X-rhodamine)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 소광제는 BHQ-1(Black Hole Quencher 1), BHQ-2(Black Hole Quencher 2), BHQ-3(Black Hole Quencher 3), TAMRA(5-Carboxytetramethylrhodamine), DDQ1(deep dark Quencher 1), DDQ2(deep dark Quencher 2)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 구체적인 일구현예에서는, MVM 게놈서열중에서 MVMi, MVMp, MVMm 및 MVMc를 포함하는 MVM의 염기서열을 얼라인먼트(alignment)하여 일치하는 유전자를 토대로 다양한 프라이머 세트 및 TaqMan 프로브를 제작하였으며(표 1 및 표 2), 표 3에 나타난 바와 같이, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 세트만 다양한 변종의 MVM를 특이적으로 검출하는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명에서는 미세생쥐 바이러스 검출을 위해 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머 및 서열번호 9로 표시되는 프로브를 최종적으로 선별하였다.
본 발명은 다른 관점에서 상기 미세생쥐 바이러스 검출을 위한 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 미세생쥐 바이러스 검출용 키트에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 DNA 중합효소, dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP) 혼합물, 완충액(buffer solution) 및 증류수를 더 포함할 수 있다.
상기 키트는 샘플을 담는 구획된 캐리어 수단, MVM 검출용 프라이머 세트 및 프로브를 포함하는 용기, PCR 반응용 버퍼 및 DNA 중합효소를 함유하는 용기를 포함한 하나 이상의 용기를 포함할 수 있으며, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2에 기재된 염기서열, 기능적 조합 및 그 단편을 포함할 수 있고, 상기 프로브는 서열번호 9에 기재된 염기서열, 기능적 조합 및 그 단편을 포함할 수 있다. 상기 캐리어 수단은 병, 튜브와 같은 하나 이상의 용기를 함유하기에 적합하고, 각 용기는 본 발명의 방법에 사용되는 독립적 구성요소들을 포함하며, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자는 용기 중의 필요한 제제를 손쉽게 분배할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함할 수 있다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 미세생쥐 바이러스 검출을 위한 프라이머 및 프로브 세트를 사용하여, 분리된 생물학적 시료의 미세생쥐 바이러스 유전자를 검출하는 단계를 포함하는 미세생쥐 바이러스 검출 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 상기 미세생쥐 바이러스 검출 방법은
(a) 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출된 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머 및 서열번호 9로 표시되는 프로브를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계;를 포함하는 방법으로 수행할 수 있다.
상기 "시료(sample)"는 예를 들어 배양된 세포, 단백질, 핵산, 또는 이를 포함하는 생물학적 의약제, 동물 또는 인간의 뇌(brain), 눈(eye), 심장(heart), 장(intestine), 신장(kidney), 간(liver), 허파(lung), 근육(muscle), 비장(spleen), 또는 정소(testis)로부터 얻은 조직(tissue), 혈액(blood), 혈장(plasma), 혈청(serum), 뇨액(urine), 타액(saliva), 땀(sweat), 정액(semen) 또는 점액(mucus) 등의 체액(body fluid)일 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다.
상기 DNA(genomic DNA)를 추출하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법(Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2001)을 통해 이루어질 수 있으며 어느 하나의 방법에 제한되지는 않는다.
상기 (b) 단계는 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 실시간 중합효소 연쇄반응액을 제조하여 수행하는 것으로, 실시간 중합효소연쇄반응액은 상기 (a) 단계에서 시료로부터 추출한 DNA를 PCR의 주형 DNA로서 포함한다. 중합효소연쇄반응액은 DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), PCR 완충액(buffer) 및 DNA 중합 효소 조인자를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 (b) 단계의 실시간 중합효소연쇄반응액은 MgCl2를 추가로 포함할 수 있으며, 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면 실시간 중합효소연쇄반응액의 최종 농도가 1 mM 내지 10 mM이 되도록 MgCl2를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에서 중합효소연쇄반응 또는 실시간 중합효소 연쇄반응은 변성(denaturation) 단계, 결합(annealing) 단계 및/또는 신장(elongation) 단계를 포함하는 사이클이 수회 반복되어 행해진다. 상기 변성, 결합, 신장 단계에서의 온도 및 시간 조건은 당업자가 적합한 조건을 선택할 수 있으며 이에 한정되지는 않으나, 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 결합 온도는 60℃로 선택할 수 있다.
본 발명의 구체적인 다른 일구현예에서는, 상기 선별한 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 미세생쥐 바이러스 검출을 보다 더 효과적으로 수행하기 위해 실시간 PCR 최적화 조건을 수립하였다.
본 발명의 실시예 2 및 표 4 내지 표 7에 나타난 바와 같이, PCR master mix, PCR mixture 조성, 결합 온도(Annealing temperature) 및 변성 시간(Denaturation time)에 대해 최적 조건을 확립하고, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 미세생쥐 바이러스 검출용 실시간 PCR 키트를 제작하였다.
본 발명의 구체적인 또 다른 일구현예에서는, 상기 미세생쥐 바이러스 검출용 실시간 PCR 키트의 재형성 및 검출 한계를 확인한 결과, 표 8에 나타난 바와 같이, 변동계수(CV%)가 2.98 이하로 확인되었으며, 검출한계는 1×100 copies/㎕인 것을 확인되었다. 즉, 본 발명의 미세생쥐 바이러스 검출용 실시간 PCR 키트가 재현성과 검출한계가 우수하다는 것을 확인하였다.
본 발명의 구체적인 또 다른 일구현예에서는, 본 발명의 미세생쥐 바이러스 검출용 실시간 PCR 키트를 이용하여 상기 확립한 조건으로 PCR을 수행하였을 때, 미세생쥐 바이러스만을 선택적으로 정확하게 검출할 수 있는지 확인하기 위해 일반적으로 생물/생명공학의약품 생산 세포주로 알려진 CHO-K1, CHO-DG44, MDCK, Vero 세포주와 그 밖의 사람 및 동물 세포주인 A9, FRhk-4, C8166, MA104, MPK, EBTr 세포주를 대상으로 특이도 실험 및 완건성(robustness) 실험을 수행하였다. 그 결과, 도 2 및 표 9에 나타난 바와 같이, 총 10종의 세포주 모두 미세생쥐 바이러스가 검출되지 않은 것을 확인하였으며, 표 10에 나타난 바와 같이 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트는 완건성(robustness)이 있음을 확인하였다. 즉, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트가 실제 세포배양 유래 의약품 생산시 MVM 부정시험에 적용될 수 있는 것을 확인하였다.
본 발명의 구체적인 또 다른 일구현예에서는, 본 발명의 미세생쥐 바이러스 검출용 실시간 PCR 키트의 완성도를 확인하기 위해, 상업적으로 판매되는 미세생쥐 바이러스 검출용 실시간 PCR 키트(ViralSEQ® Mouse Minute Virus (MMV) Real-Time PCR Detection Kit)와 비교실험을 수행하였다. 그 결과, 도 3 및 표 11에 나타난 바와 같이, 본 발명의 키트가 상업적 키트에 비해 더 우수한 검출 효과 및 민감성을 가지는 것을 확인하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
미세생쥐 바이러스 검출용 프라이머/프로브 설계 및 선별
1-1: 프라이머 및 프로브 설계
MVMi, MVMp, MVMm 및 MVMc의 4가지 변종을 포함하는 MVM를 모두 증폭시킬 수 있는 프라이머를 설계하기 위해, NCBI 데이터베이스에 등록된 MVM 염기서열을 얼라인먼트(alignment)하여 일치하는 유전자를 기초로 Primer 3 소프트웨어 프로그램을 이용하여 프라이머 세트와 TaqMan 프로브를 설계하였다.
프로브 서열 5` 말단에는 형광단(fluorophore)인 FAM(carboxyfluorescein)을 3` 말단에는 소광제(quencher)인 BHQ-1(Black Hole Quencher 1)가 표지되도록 설계하였다. 설계된 프로브는 MVMi(GenBank: M12032.1), MVMp(GenBank: V01115.1), MVMm(GenBank: DQ196317.1) 및 MVMc(GenBank: U34256.1)의 4가지 변종을 포함하는 MVM DNA 서열의 얼라인먼트에서 미스매치(mismatche)를 가지는 부분을 모두 포함하기 위해 mixed base로 구성되었다. 하기 표 1에 설계된 프라이머 세트 및 프로브의 염기서열을 기재하였으며, 프라이머 및 프로브에 의한 MVM 유전자의 증폭 위치는 하기 표 2에 나타내었다.
미세생쥐 바이러스 검출용 프라이머 및 프로브
프라이머 세트 Sequences 서열번호
1 프라이머 세트 Forward ACC AAT CTA CCA TGG CAA GC 1
Reverse CCG CAA CAG GAG TAT TTG GT 2
2 프라이머 세트 Forward CAG CAA GCA GAT TGA ACC AA 3
Reverse CAA CCA AGC ACA AAT CAT GG 4
3 프라이머 세트 Forward CAT GAT TTG TGC TTG GTT GG 5
Reverse TGG CTG AGA GGC GTA CTT TT 6
4 프라이머 세트 Forward AGT TTG CCA TGC TAT TTG C 7
Reverse ACT GGT TTA CTT GCT GTC C 8
MVM 프로브 FAM-CCG AAA AGT ACG CCT CTC AG-BHQ1 9
미세생쥐 바이러스 검출용 프라이머 및 프로브의 증폭위치
GenBank No. MVMi
(M12032.1)		 MVMp
(V01115.1)		 MVMm
(DQ196317.1)		 MVMc
(U34256.1)
1 프라이머 세트 1889-1908
2103-2122		 1888-1907
2102-2121		 1774-1793
1988-2007		 1749-1768
1963-1982
2 프라이머 세트 1677-1696
1856-1875		 1676-1695
1855-1874		 1562-1581
1741-1760		 1537-1556
1716-1735
3 프라이머 세트 1857-1876 2020-2039 1856-1875
2019-2038		 1742-1761
1905-1924		 1717-1736
1880-1899
4 프라이머 세트 1389-1407 1606-0624 1388-1406
1605-1623		 1274-1292
1491-1509		 1249-1267
1466-1482
MVM 프로브 2017-2036 2016-2035 1902-1921 1877-1896
1-2: MVM의 배양과 정량
MVM(ATCC VR-1346)의 배양과 정량을 위해 A9 세포(ATCC CCL-1.4)를 사용하였다. A9세포를 10% FBS(Hyclone)를 첨가한 DMEM(Dulbecco's Modified Eagles Medium; Hyclone) 배지에 배양하였다. T-150 플라스크(flask)에 배양된 단층 세포에 각각의 바이러스를 감염시킨 후 주기적으로 세포병변효과(cytopathic effect: CPE)를 관찰하였다. CPE가 명백하게 관찰되면 동결과 해빙과정을 3회 반복하여 펠렛(pellet)을 파쇄한 후, 2,000 rpm에서 3분간 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 상등액을 0.45 μm 필터로 여과한 다음, 소분하여 -70℃에서 보관하였다.
MVM의 정량을 위해 감염성 있는 바이러스의 역가(titer)를 TCID50(50% tissue culture infectious dose)으로 나타내었다. MVM를 2% FBS가 포함된 DMEM 배지를 이용하여 7 배수 희석한 다음, 24 웰-플레이트에 0.25 mL씩 접종하였다. 음성대조군으로 세포배양 배지를 0.25 mL씩 접종하였으며, 그 후 35℃, 5% CO2 배양기에서 배양하면서 계속적으로 현미경으로 CPE를 관찰하였다.
1-3: 프라이머 및 프로브 선별
본 발명에서는 상기 표 1과 같이 제작한 프라이머 세트 중에서 최적의 프라이머 세트를 선별하기 위해, 실시간 PCR 시스템 기기(7500 Fast Real-Time PCR System, Thermo fisher scientific, 미국)를 이용하여 TaqMan 프로브 실시간 PCR 방법으로 검출 유효성을 비교하였다.
먼저, MVM의 DNA 추출은 Prep-sure™ Genomic DNA Extraction Kit(BioPS, 한국)를 사용하여 제조 회사의 방법에 따라 분리하였다. 그 다음, 추출한 MVM DNA 2 ㎕, 2 × Realtime PCR Master Mix (TOYOBO, 일본) 10 ㎕, 10 pmol 정방향 프라이머 1 ㎕, 10 pmol 역방향 프라이머 1 ㎕, 10 pmol TaqMan 프로브 0.5 ㎕, 뉴클레아제-프리 증류수(Nuclease-Free Water) 5.5 ㎕를 첨가하고 최종부피를 20 ㎕로 맞추어 실시간 PCR을 수행하였다. 핵산증폭 반응은 95℃에서 2분동안 전-배양(pre-incubation)시킨 후, 변성(denaturation) 95℃에서 30초, 결합(annealing) 60℃에서 30초의 조건으로 하여 40 사이클 수행하였다.
각 프라이머 세트의 검출 유효성 확인
Primer set selection (Ct value)
TCID50/mL 1 x 104 1 x 103 1 x 102 1 x 101 1 x 100 Negative control
1 primer set 24.94 24.64 29.33 29.30 32.60 32.12 37.11 35.26 35.51 N/A N/A N/A
2 primer set 25.88 26.48 29.82 30.76 33.54 33.25 36.57 32.81 37.06 37.73 36.67 36.43
3 primer set 24.23 24.28 28.39 28.52 32.28 31.75 34.74 34.91 35.74 35.35 35.07 36.73
4 primer set 24.64 24.84 28.58 28.83 31.43 32.71 35.42 35.37 35.98 35.33 N/A 36.79
Values indicate threshold cycle (Ct) value
N/A, Not Applicable; real-time PCR signals were not detected
상기 표 3에 나타난 바와 같이, MVM 농도(Titer, TCID50)에 따른 각 프라이머 세트의 Ct값을 비교한 결과, 모든 프라이머 세트는 101 TCID50/㎖까지 검출가능 하였지만, 1 프라이머 세트를 제외하곤 음성 대조군(negative control)에서 Ct값이 검출되었다. 이 결과를 토대로 1 프라이머 세트를 선정하였다.
실시간 PCR 최적 조건 확립
2-1: PCR master mix 선별
상기 선별한 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 미세생쥐 바이러스 검출을 보다 더 효과적으로 수행하기 위해 실시간 PCR 최적조건을 확립하고자 하였다.
먼저, PCR master mix를 선별하기 위해 시중에 판매중인 5종의 PCR master mix의 검출 유효성을 비교하였다. 5종의 PCR master mix는 다음과 같으며, 각각의 5종의 PCR master mix 별로 혼합액을 만들어서 준비하였다.
1) 2 × Realtime PCR Master Mix (TOYOBO, 일본),
2) 2 × Premix Ex Taq™ (Probe qPCR, TAKARA, 일본),
3) 2 × AccuPower® DualStar™ qPCR PreMix (BIONEER, 한국),
4) 2 × Multi-Star Real-Time PCR Master Mix (For Probe, BIOFACT, 한국),
5) TOPreal™ qPCR 2 × PreMIX (Enzynomics, 한국).
추출한 MVM DNA 2 ㎕, 2 × PCR master mix 10 ㎕, 10 pmol 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 믹스 1 ㎕, 10 pmol TaqMan 프로브 0.5 ㎕, 뉴클레아제-프리 증류수(Nuclease-Free Water) 6.5 ㎕를 첨가하고 최종부피를 20 ㎕로 맞추어 실시간 PCR을 수행하였다. 핵산증폭 반응은 50℃에서 4분, 95℃에서 10분동안 전-배양(pre-incubation)시킨 후, 변성(denaturation) 95℃에서 30초, 결합(annealing) 60℃에서 30초의 조건으로 하여 40 사이클 수행하였다.
PCR master mix 종류에 따른 검출 유효성 확인
PCR master mix selection (Ct value)
TCID50/mL 1 x 103 1 x 102 1 x 101 1 x 100 Negative control
Realtime PCR Master Mix 26.17 26.19 29.82 29.84 32.88 32.90 37.81 35.92 N/A N/A
Premix Ex Taq™ 27.47 27.84 30.87 31.08 33.86 33.51 38.42 38.05 N/A N/A
AccuPower® DualStar™ qPCR PreMixr set 24.28 23.06 27.75 28.36 30.16 31.74 33.72 33.94 35.07 36.73
Multi-Star Real-Time PCR Master Mix 25.46 25.23 28.60 28.53 32.63 32.52 36.54 37.56 N/A N/A
TOPreal™ qPCR 2 × PreMIX 34.83 35.01 39.19 38.93 N/A N/A N/A N/A N/A N/A
Values indicate threshold cycle (Ct) value
N/A, Not Applicable; real-time PCR signals were not detected
상기 표 4에 나타난 바와 같이, MVM 농도(Titer, TCID50)에 따른 각 PCR master mix의 Ct값을 비교한 결과, 외산 PCR master mix와 비교했을시에 국산 PCR master mix중에는 Multi-Star Real-Time PCR Master Mix (For Probe, BIOFACT, 한국)가 동등이상의 결과를 보여줬으며, 다른 두 제품은 음성 대조군(negative control)에서 Ct값이 검출되거나, 낮은 민감도를 보였다.
상기 결과를 토대로 PCR master mix로는 확보가 편한 국산으로 정하였으며, Multi-Star Real-Time PCR Master Mix를 선정하였다.
2-2: PCR Mixture 조성 선별
3가지의 조성으로 PCR Mixture를 준비하여 조성별 유효성을 비교하였다.
각각의 3가지의 조성은 다음과 같으며, 나머지 첨가물을 동일하게 MVM DNA 2 ㎕, 2 × PCR master mix 10 ㎕씩 첨가하고 뉴클레아제-프리 증류수(Nuclease-Free Water)를 이용하여 최종부피를 20 ㎕로 맞추었다.
1) 10 pmol 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 믹스 2 ㎕에 10 pmol TaqMan 프로브 1 ㎕,
2) 10 pmol 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 믹스 1.5 ㎕에 10 pmol TaqMan 프로브 1.5 ㎕,
3) 10 pmol 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 믹스 2.5 ㎕에 10 pmol TaqMan 프로브 0.5 ㎕.
핵산증폭 반응은 95℃에서 10분동안 전-배양(pre-incubation)시킨 후, 변성(denaturation) 95℃에서 30초, 결합(annealing) 60℃에서 30초의 조건으로 하여 40 사이클 수행하였다.
PCR Mixture 조성에 따른 검출 유효성 확인
PCR Mixture condition selection (Ct value)
TCID50/mL 1 x 103 1 x 102 1 x 101 1 x 100 Negative control
Primer mix 2 ㎕
Probe 1 ㎕		 24.45 24.63 28.41 28.51 31.63 31.42 35.56 34.89 N/A N/A
Primer mix 1.5 ㎕
Probe 1.5 ㎕		 24.86 24.94 28.37 28.76 31.58 31.64 34.95 35.26 N/A N/A
Primer mix 2.5 ㎕L
Probe 0.5 ㎕		 25.14 24.71 28.67 28.19 31.96 31.36 35.83 35.89 N/A N/A
Values indicate threshold cycle (Ct) value
N/A, Not Applicable; real-time PCR signals were not detected
상기 표 5에 나타난 바와 같이, MVM 농도(Titer, TCID50)에 따른 각 PCR Mixture 조성의 Ct값을 비교한 결과, 3가지의 PCR Mixture 조성에 따른 Ct값은 매우 유사하게 확인되어, 2번 조성인 10 pmol 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 믹스 1.5 ㎕에 10 pmol TaqMan 프로브 1.5 ㎕로 선정하였다.
2-3: 결합(annealing) 온도 설정
상기 실시예 1, 실시예 2-1 및 2-2의 결과에 따라 선별한 프라이머 세트와 PCR Mixture 조성을 기본으로 결합 온도별 유효성을 비교하였다. 결합 온도는 56℃, 58℃, 60℃로 설정하여 비교 실험하였다. 핵산증폭 반응은 95℃에서 10분동안 전-배양(pre-incubation)시킨 후, 변성(denaturation) 95℃에서 30초, 결합(annealing) 각각 56℃, 58℃, 60℃에서 30초의 조건으로 하여 40 사이클 수행하였다.
결합 온도에 따른 검출 유효성 확인
Annealing temperature selection (Ct value)
TCID50/mL 1 x 103 1 x 102 1 x 101 1 x 100 Negative control
Annealing temperature 56℃ 24.01 24.01 28.08 28.08 31.64 31.58 35.49 35.41 N/A N/A
Annealing temperature 58℃ 24.55 24.34 28.14 28.07 31.29 31.62 34.78 34.78 N/A N/A
Annealing temperature 60℃ 24.86 24.94 28.37 28.76 31.58 31.64 34.95 35.26 N/A N/A
Values indicate threshold cycle (Ct) value
N/A, Not Applicable; real-time PCR signals were not detected
상기 표 6에 나타난 바와 같이, MVM 농도(Titer, TCID50)에 따른 결합 온도별 Ct값을 비교한 결과, 3가지 결합 온도에 따른 Ct값은 매우 유사하게 확인되어, 결합 온도는 60℃로 선정하였다.
2-4: 변성(denaturation) 단계 반응 시간 설정
상기 실시예 1, 실시예 2-1 및 2-2의 결과에 따라 선별한 프라이머 세트와 PCR Mixture 조성을 기본으로 변성 단계의 반응 시간별 유효성을 비교하였다. 변성 시간은 10초, 20초, 30초로 설정하여 비교 실험하였다. 핵산증폭 반응은 95℃에서 10분동안 전-배양(pre-incubation)시킨 후, 변성(denaturation) 95℃에서 각각 10초, 20초, 30초, 결합(annealing) 60℃에서 30초의 조건으로 하여 40 사이클 수행하였다.
변성 단계 반응 시간에 따른 검출 유효성 확인
Denaturation time selection (Ct value)
TCID50/mL 1 x 103 1 x 102 1 x 101 1 x 100 Negative control
Denaturation time
10 sec		 25.71 25.41 29.16 29.34 32.12 31.95 35.00 N/A N/A N/A
Denaturation time
20 sec		 24.95 25.28 28.60 28.32 32.12 32.17 35.43 35.12 N/A N/A
Denaturation time
30 sec		 24.86 24.94 28.37 28.76 31.58 31.64 34.95 35.26 N/A N/A
Values indicate threshold cycle (Ct) value
N/A, Not Applicable; real-time PCR signals were not detected
상기 표 7 및 도 1에 나타난 바와 같이, MVM 농도(Titer, TCID50)에 따른 결합 온도별 Ct값을 비교한 결과, 3가지 변성 시간에 따른 Ct값은 매우 유사하게 확인되어, 변성 시간은 30초로 선정하였다.
상기 표 4 내지 표 7에 나타난 바와 같이, PCR master mix, PCR mixture 조성, 결합 온도(Annealing temperature) 및 변성 시간(Denaturation time)에 대해 최적 조건을 확립하고, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 미세생쥐 바이러스 검출용 키트를 제작하였다.
MVM 검출용 키트를 이용한 재현성 및 검출 한계 실험
본 발명에서는 MVM 검출용 키트의 재현성 및 검출 가능한 핵산의 최소량을 의미하는 검출한계를 확인하였다.
MVM 플라스미드 DNA를 제작하고 copies/㎕로 정량하여 양성 대조군(positive control)로 사용하였으며, MVM 플라스미드 DNA를 각각 1×102 copies/㎕, 1×101 copies/㎕, 1×100 copies/㎕로 연속적으로 희석하여 수행하였다. 최소한 3개의 연속 희석한 패널을 독립적으로 준비하여 각 희석 배수 당 24회 반복 검사를 실시하여 결과를 얻고 확보된 결과에 대하여 통계 분석을 실시하였다.
MVM 실시간 PCR 키트의 재현성 및 검출한계 확인
Run Copies/㎕ Limit of detection
1 × 102 1 × 101 1 × 100
1 31.79 31.47 31.33 34.10 31.30 34.61 36.51 36.28 35.33 100 copies/㎕
2 32.32 32.20 31.99 33.55 35.21 35.92 38.46 38.64 38.95 100 copies/㎕
3 30.43 30.21 30.09 33.50 33.74 33.79 36.99 37.21 37.18 100 copies/㎕
4 30.38 29.90 30.21 33.50 33.46 33.58 37.82 37.28 37.36 100 copies/㎕
5 30.50 30.18 30.05 33.62 33.78 33.60 37.07 37.25 37.52 100 copies/㎕
6 30.43 30.15 30.13 33.37 33.74 33.94 37.57 37.34 37.60 100 copies/㎕
7 30.38 29.98 29.80 33.56 33.73 33.50 37.08 36.99 36.20 100 copies/㎕
8 29.38 29.14 29.07 32.93 32.59 32.50 36.11 36.15 35.59 100 copies/㎕
SD 0.91 0.87 0.89
AVE 30.48 3.63 37.10
CV(%) 2.98 2.60 2.40
그 결과, 상기 표 8에 나타난 바와 같이, 변동계수(CV%)가 2.98 이하로 확인되었으며, 검출한계는 1×100 copies/㎕임을 확인하였다. 상기로부터 본 발명의 최적화된 실시간 PCR 방법이 재현성과 검출한계가 우수하다는 것을 확인하였다.
MVM 검출용 키트의 특이성 실험
본 발명에서는 다른 이물질이 존재하는 조건에서도 MVM 핵산만을 선택적으로 정확하게 검출해 낼 수 있는지 알아보기 위해, 특이성(Specificity) 실험을 수행하였다. 생물·생명공학의약품 생산 세포주인 CHO-K1, CHO-DG44, MDCK 및 Vero 세포주와 그 밖의 사람 및 동물 세포주인 A9, FRhk-4, C8166, MA104, MPK 및 EBTr 세포주를 대상으로 특이도 실험을 수행하였다. 이때, 모든 세포주는 1×106 cell/㎖에서 DNA를 추출하고 실시간 PCR을 수행하였다.
MVM 검출용 실시간 PCR 키트의 특이성 확인
Species Cell/mL Specificity
106
CHO-K1 N/A N/A N/A Y
CHO-DG44 N/A N/A N/A Y
MDCK N/A N/A N/A Y
Vero N/A N/A N/A Y
A9 N/A N/A N/A Y
FRhK-4 N/A N/A N/A Y
C8166 N/A N/A N/A Y
MA104 N/A N/A N/A Y
MPK N/A N/A N/A Y
EBTr N/A N/A N/A Y
Positive control
(MVM plasmid DNA)		 27.84 27.83 27.67 Y
Negative control N/A N/A N/A Y
N/A, Not Applicable; real-time PCR signals were not detected.
그 결과, 표 9 및 도 2에 나타난 바와 같이, 총 10종의 세포주 모두가 본 발명의 키트에 반응 하지 않는 것으로 나타났다. 상기로부터, 사람 세포주, CHO 세포주 및 CHO 세포 배양액에서 MVM 부정시험용으로 본 발명의 프라이머세트 및 프로브 및 이를 이용한 MVM 검출 방법을 실제공정에 적용할 수 있음을 확인하였다.
MVM 검출용 키트의 완건성 실험
본 발명의 MVM 검출용 키트의 완건성을 알아보기 위해, 무작위로 선정한 20개의 음성시료에 대하여 검출한계인 1×100 copies/μL의 3배에 해당하는 농도인 3×100 copies/㎕를 첨가한 후 MVM 검출용 키트를 이용하여 실시간 PCR을 수행하였다.
MVM 검출용 키트의 완건성 확인
Run Ct value
3×100 copies/㎕ Negative Control
1 33.60 NA
2 32.75 NA
3 33.11 NA
4 33.59 NA
5 33.58 NA
6 33.24 NA
7 32.49 NA
8 33.06 NA
9 33.72 NA
10 33.45 NA
11 33.94 NA
12 34.25 NA
13 33.39 NA
14 33.34 NA
15 32.71 NA
16 32.36 NA
17 33.49 NA
18 33.62 NA
19 33.72 NA
20 34.00 NA
SD of Ct 0.50
Mean of Ct 33.37
CV (%) 1.50
완건성 실험 결과, 상기 표 10에 나타난 바와 같이, 시험에 사용된 모든 시료에서 MVM 플라스미드 DNA가 검출되었으므로 완건성이 있음을 확인하였다.
본 발명의 MVM 검출용 키트 및 상업적 MVM 검출용 키트 비교
본 발명의 MVM 검출용 키트의 완성도를 알아보기 위해, 시중에 판매중인 ViralSEQ® Mouse Minute Virus (MMV) Real-Time PCR Detection Kit와 비교 실험을 수행하였다.
3개의 튜브에 MDCK 세포 900 ㎕를 넣은 후, 1×103 TCID50/㎖, 1×102 TCID50/㎖, 1×101 TCID50/㎖의 MVM 100 ㎕씩 각각 튜브에 첨가하였다. 그 후 각 키트를 이용하여 DNA를 추출하고 실시간 PCR은 7500 Fast Real-Time PCR 기기를 이용하여 진행하였다. 양성 대조군(Positive control)으로는 각 키트에 포함된 양성대조군과 1×103 TCID50/㎖의 MVM를 사용하였다.
본 발명의 MVM 검출용 키트 및 상업적 MVM 검출용 키트 비교 결과
Kit Sample name Ct value
MVM Real-Time PCR Kit 1×102 TCID50/㎖ 31.59 31.72 31.91
1×101 TCID50/㎖ 34.13 35.13 34.60
1×100 TCID50/㎖ 35.25 34.82 35.97
PC (plasmid DNA) 30.21 30.56 29.97
PC (TCID50/㎖) 28.65 28.75 29.16
NC N/A N/A N/A
ViralSEQ® Mouse Minute Virus (MMV) Real-Time PCR Detection Kit 1×102 TCID50/㎖ 32.64 32.68 32.53
1×101 TCID50/㎖ 36.49 36.70 36.69
1×100 TCID50/㎖ N/A N/A N/A
PC (plasmid DNA) 28.98 28.90 28.81
PC (TCID50/㎖) 28.86 28.04 28.88
NC N/A N/A N/A
N/A, Not Applicable; real-time PCR signals were not detected.
PC : Positive control, NC : Negative control.
비교 실험 결과, 상기 표 11 및 도 3에 나타난 바와 같이, 상업적 MVM 검출용 키트는 1×101 TCID50/㎖까지 검출이 가능한 것을 확인한 반면, 본 발명의 MVM 검출용 키트는 1×100 TCID50/㎖까지 검출이 가능한 것을 확인하였으므로, 본 발명의 키트가 상업적 키트에 비해 동등이상의 검출능력을 가지고 있는 것을 확인하였다.
<110> BioPS Co., Ltd. Hannam University Institute for Industry-Academia Cooperation Korea Research Institute of Chemical Technology <120> Primer and TaqMan probe set for detection of Minute virus of Mice and Method for detection of Minute virus of Mice Using the Same <130> 1065967 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer set 1_F <400> 1 accaatctac catggcaagc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer set 1_R <400> 2 ccgcaacagg agtatttggt 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer set 2_F <400> 3 cagcaagcag attgaaccaa 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer set 2_R <400> 4 caaccaagca caaatcatgg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer set 3_F <400> 5 catgatttgt gcttggttgg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer set 3_R <400> 6 tggctgagag gcgtactttt 20 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer set 4_F <400> 7 agtttgccat gctatttgc 19 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer set 4_R <400> 8 actggtttac ttgctgtcc 19 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MVM probe <400> 9 ccgaaaagta cgcctctcag 20

Claims (8)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 정방향 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 역방향 프라이머 및 서열번호 9로 표시되는 프로브를 포함하는 미세생쥐 바이러스(Minute Virus of Mice; MVM) 검출을 위한 프라이머 및 프로브 세트로,
    상기 미세생쥐 바이러스는 MVMi(GenBank: M12032.1), MVMp(GenBank: V01115.1), MVMm(GenBank: DQ196317.1) 및 MVMc(GenBank: U34256.1)로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 미세생쥐 바이러스 검출을 위한 프라이머 및 프로브 세트.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 프로브는 5` 말단에 형광단(fluorophore)이 표지되고 3` 말단에는 소광제(quencher)가 표지되는 것을 특징으로 하는 미세생쥐 바이러스 검출을 위한 프라이머 및 프로브 세트.
  4. 제3항에 있어서, 상기 형광단은 FAM(carboxyfluorescein), JOE(2,7-dimethoxy-4,5-dichloro-6-carboxyfluoroscein), TAMRA(5-Carboxytetramethylrhodamine), Cy3(indocarbocyanine-3), Cy5(indocarbocyanine-5), Rox(6-Carboxy-X-rhodamine)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 미세생쥐 바이러스 검출을 위한 프라이머 및 프로브 세트.
  5. 제3항에 있어서, 상기 소광제는 BHQ-1(Black Hole Quencher 1), BHQ-2(Black Hole Quencher 2), BHQ-3(Black Hole Quencher 3), TAMRA(5-Carboxytetramethylrhodamine), DDQ1(deep dark Quencher 1), DDQ2(deep dark Quencher 2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 미세생쥐 바이러스 검출을 위한 프라이머 및 프로브 세트.
  6. 제1항, 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 미세생쥐 바이러스 검출을 위한 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 미세생쥐 바이러스 검출용 키트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 키트는 DNA 중합효소, dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP) 혼합물, 완충액(buffer solution) 및 증류수를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 미세생쥐 바이러스 검출용 키트.
  8. 제1항, 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 미세생쥐 바이러스 검출을 위한 프라이머 및 프로브 세트를 사용하여, 분리된 생물학적 시료의 미세생쥐 바이러스 유전자를 검출하는 단계를 포함하는 미세생쥐 바이러스 검출 방법.
KR1020190087713A 2019-07-19 2019-07-19 미세생쥐 바이러스 검출을 위한 프라이머 및 TaqMan 프로브 세트 및 이를 이용한 미세생쥐 바이러스 검출 방법 KR102217158B1 (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Zhan 등, Biologicals, Vol 30, No. 4, 페이지 259-270 (2002.12.30.)*

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