CN113549711A - 一种检测人博卡病毒全基因组的引物组合及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及一种检测人博卡病毒全基因组的引物组合及其检测方法。本发明提供一种用于人博卡病毒全基因组检测的引物组合，其包括12对引物，所述12对引物具有如SEQ ID NO.1‑24所示的核苷酸序列。上述引物组合能够覆盖人博卡病毒的全基因组序列约98％以上区域，具有人博卡病毒特异性，且对于不同的人博卡病毒具有通用性；上述引物组合可实现在一个PCR反应体系中进行多重PCR一步扩增人博卡病毒的全基因组，灵敏度高，可快速构建博卡病毒基因组文库，用于高通量测序。

Description

一种检测人博卡病毒全基因组的引物组合及其检测方法
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及一种检测人博卡病毒全基因组的引物组合及其检测方法。
背景技术
人博卡病毒(Bocavirus)是细小病毒科、细小病毒亚科成员，是一种无包膜的单链DNA病毒。人博卡病毒可引起儿童呼吸道感染和腹泻。
目前已有的关于博卡病毒的分子检测技术主要有两类：一类是通过荧光PCR，采用博卡病毒特异性引物及探针，检测样本中博卡病毒载量，该方法只能鉴定样本中是否含有博卡病毒，无法确定具体亚型；另一类是通过多重PCR扩增病毒某个基因(例如：NP1基因或VP1基因)或连接区域(如VP1-VP2基因及连接区域)，检测病毒约500-800bp区域，以确定具体亚型，该方法无法准确地鉴定病毒的亚型，也无法全面覆盖博卡病毒基因组，因此会遗漏非覆盖区域变异，影响检测结果，较难用于流行病学研究。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种检测人博卡病毒全基因组的引物组合。本发明的另一目的是提供检测人博卡病毒全基因组的方法。
本发明通过对GenBank数据库中155种博卡病毒全基因组序列进行分析和处理，选择其中对于人博卡病毒特异的、且在不同的人博卡病毒中保守性较高的区域设计能够基本覆盖人博卡病毒全基因组的引物。进一步地，本发明通过对引物序列进行筛选、优化，使得各引物对的扩增效率相当，减少多重PCR扩增时引物之间的相互影响，实现了覆盖人博卡病毒基因组98％以上区域的12对引物能够在同一个PCR体系中进行多重PCR扩增，靶向富集博卡病毒的全基因组，更为准确、高效地检测人博卡病毒的全基因组。
具体地，本发明提供以下技术方案：
本发明提供一种用于人博卡病毒全基因组检测的引物组合，其包括12对引物，所述12对引物具有如SEQ ID NO.1-24所示的核苷酸序列。
上述(1)中的12对引物依次为：序列如SEQ ID NO.1-2所示的引物对、序列如SEQID NO.3-4所示的引物对、序列如SEQ ID NO.5-6所示的引物对、序列如SEQ ID NO.7-8所示的引物对、序列如SEQ ID NO.9-10所示的引物对、序列如SEQ ID NO.11-12所示的引物对、序列如SEQ ID NO.13-14所示的引物对、序列如SEQ ID NO.15-16所示的引物对、序列如SEQID NO.17-18所示的引物对、序列如SEQ ID NO.19-20所示的引物对、序列如SEQ ID NO.21-22所示的引物对、序列如SEQ ID NO.23-24所示的引物对。
上述12对引物能够覆盖人博卡病毒基因组98％以上区域，且能够在同一PCR反应体系中进行多重PCR扩增，实现人博卡病毒基因组的快速富集和测序。
为方便后续文库构建时的Barcode引物扩增，可在上述12对引物的5’端添加能够与Barcode序列配对的通用序列。
作为本发明的一种实施方式，在正向引物的5’端添加序列如SEQ ID NO.25所示的通用序列，在反向引物的5’端添加序列如SEQ ID NO.26所示的通用序列。
在上述12对引物的基础上，本发明还提供另一种用于人博卡病毒全基因组检测的引物组合，其包括12对引物，所述12对引物为在具有如SEQ ID NO.1-24所示的核苷酸序列的引物组合的基础上，将其中一个或多个引物中的一个或多个碱基替换为简并碱基。
上述简并碱基具体可为：Y(C/T)、K(G/T)，R(A/G)、M(A/C)、S(G/C)、W(A/T)、H(A/T/C)、B(G/T/C)、V(G/A/C)、D(G/A/T)、N(A/T/G/C)、I(次黄嘌呤)。
本发明提供所述引物组合的如下任一种应用：
(1)在制备用于检测人博卡病毒的试剂盒中的应用；
(2)在制备用于人博卡病毒分型的试剂盒中的应用；
(3)在制备用于检测人博卡病毒基因组变异的试剂盒中的应用。
本发明提供一种试剂盒，其包含以上所述的引物组合。
除包含上述引物组合外，本发明所述的试剂盒还可包含其他用于PCR扩增或DNA测序的试剂，包括但不限于PCR反应缓冲液、Mg2+、dNTP、ddH2O、DNA聚合酶、PCR反应预混液等。
上述试剂盒可用于：(1)检测人博卡病毒，(2)用于人博卡病毒分型，(3)检测人博卡病毒基因组变异。
上述试剂盒中，12对引物可单独包装，也可配制为混合液。
当配制为混合液时，各引物的浓度可相等。
上述试剂盒中，12对引物在多重PCR反应体系中的工作浓度为9-11μM。优选均为10μM。
上述试剂盒在进行人博卡病毒检测时使用的多重PCR的反应程序包括：94-98℃、2-5min；94-98℃、10-40s，60℃、20-40s，72℃、3-5min，18-30个循环；72℃、2-5min。
优选地，多重PCR的反应程序包括：96℃、3min；96℃、30s，60℃、30s，72℃、4min，18个循环；72℃、2min。
本发明提供在人博卡病毒全基因组变异检测或人博卡病毒的流行病学分析中的应用。
上述全基因组变异检测、流行病学分析是非诊断、治疗目的的。
本发明提供一种检测人博卡病毒全基因组的方法，该方法以待测样本的DNA为模板，利用所述引物组合进行多重PCR扩增。
优选地，所述多重PCR扩增的反应体系中，所述12对引物的浓度为9-11μM。
优选地，所述多重PCR扩增的反应程序包括：94-98℃、2-5min；94-98℃、10-40s，60℃、20-40s，72℃、3-5min，18-30个循环；72℃、2-5min。
进一步优选地，所述多重PCR的反应程序包括：96℃、3min；96℃、30s，60℃、30s，72℃、4min，18个循环；72℃、2min。
上述检测人博卡病毒全基因组的方法还包括：将多重PCR扩增的产物纯化后，以纯化后的PCR产物为模板，利用Barcode引物进行扩增，将扩增产物经纯化后得到测序文库，再对测序文库进行测序。
以上所述的方法中，多重PCR扩增产物的纯化和文库的纯化可采用磁珠法进行。
以上所述的方法中，Barcode引物的扩增可采用以下程序：96℃、3min；96℃、30s、60℃、30s，72℃、30s，8个循环；72℃、2min。
在对测序文库进行测序后，对得到的测序数据进行分析组装，获得人博卡病毒的基因组序列。
本发明的有益效果在于：本发明提供的含有12对引物的引物组合能够覆盖人博卡病毒的全基因组序列约98％以上区域，具有人博卡病毒特异性，可以检测博卡病毒1型、博卡病毒2型、博卡病毒3型和博卡病毒4型，对于不同的人博卡病毒具有通用性，可用于人博卡病毒的流行病学进化分析；
本发明提供的含有12对引物可实现在一个PCR反应体系中进行多重PCR一步扩增人博卡病毒的全基因组，操作简单且节约成本；同时具有灵敏度高的优势，可以富集Ct值≤33样本的全基因序列，可以检测Ct值≤36样本的博卡病毒；
在富集得到的全基因序列的基础上，经过Barcode引物扩增可快速构建博卡病毒基因组文库，用于高通量测序；通过靶向富集博卡病毒的全基因组，经富集产物纯化、Barcode引物扩增、文库纯化，可以在3.5h内富集博卡病毒全基因组序列。
附图说明
图1为本发明实施例1中12对引物覆盖人博卡病毒全基因组序列的示意图。
图2为本发明实施例3中构建的测序文库的电泳检测结果。
图3为本发明实施例4中对于Ct值为17.9的待测样本的全基因组检测结果。
图4为本发明实施例4中对于Ct值为25.9的待测样本的全基因组检测结果。
图5为本发明实施例4中对于Ct值为33.4的待测样本的全基因组检测结果。
图6为本发明实施例6中各检测病毒的物种进化关系分析结果。
图7、图8、图9、图10、图11、图12、图13、图14、图15为本发明实施例6中34例临床样本与参考基因组的序列比对结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1覆盖人博卡病毒全基因组的引物组合的获得
1、引物设计
人博卡病毒的全基因组大小为5233bp，目前，GenBank数据库共收录了155种人博卡病毒的全基因组序列。通过对GenBank数据库中155种博卡病毒全基因组序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/labs/virus/vssi/#/virus？SeqType_s＝Nucleotide&VirusLineage_ss＝Human％20bocavir us,％20taxid:329641&Completeness_s＝complete)，基于对Mafft多序列比对工具优化，将155条全基因组序列进行全局比对，然后对基因组上每个位点不同碱基出现的频率进行统计，保留频率在0.1％-5％以上碱基，将155条序列合并为一条简并碱基序列。对该简并碱基序列进行分析和处理，选择其中在人博卡病毒中特异的、且在不同的人博卡病毒中保守性较高的区域设计引物覆盖人博卡病毒全基因组。
通过对引物序列进行优化、筛选，使得各引物对的自由能、扩增效率相当，引物均一性更好，减少多重PCR扩增时引物之间的相互影响，最终得到能够覆盖人博卡病毒基因组98％以上区域的12对引物，其在人博卡病毒基因组上的覆盖情况如图1所示。这12对引物能够在同一个PCR体系中同时进行高效的多重PCR扩增。
12对引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-24所示，具体如表1所示。
表1引物序列
序号 序列(5'-3') 序号 序列(5'-3')
bov_01f ggcgtcagtgctacaacgtc bov_01r gtaggtttgtctccccaagctc
bov_02f ctctgcaaggctgtctatatggcta bov_02r cagcccgttaacaagagtgtgac
bov_03f gcattacatcttacagcagacctga bov_03r cacagcacaaggcgtgacca
bov_04f tcacctttaccctggcacaacctt bov_04r agctgcaatttcttctggagtgat
bov_05f tgcggctccattaaaagaaagagtgat bov_05r atcaaagaaggcagaagtactcacag
bov_06f tccaagaagcgacgcataactattcc bov_06r actatcccagccaattttgttgtct
bov_07f atggtgtgggttctattggcattc bov_07r taatgccaccaagagaccagtcgtt
bov_08f gctgatcgtgctgctcaatctcat bov_08r cctcctccattggaaggaattatacttt
bov_09f aggcagctactttactgactcc bov_09r tcgctgttttcaagcatgaagaatggt
bov_10f atgtaatgccagaacttccttaccaa bov_10r agctggaggatcaaatccact
bov_11f cttctgacacagctgcatgga bov_11r tcgacttcccagacaatttcgc
bov_12f ccaccaggcacaattttcatcaa bov_12r tatagagtttcgcggttgcgtaagcaaa
2、引物合成：
在进行引物合成时，为便于后续Barcode引物扩增，在各正向引物的5’端添加序列COMMONF：TGTAAAACGACGGCCAGT；在各反向引物的5’端添加序列COMMONR：CAGGAAACAGCTATGACC。
实施例2人博卡病毒全基因组的多重PCR扩增
以人博卡病毒DNA为模板，利用实施例1中最终确定的12对引物进行多重PCR扩增，具体方法如下：
1、配制BG-BoV Panel：
将表1中的12对引物，按照1：1的摩尔比混合(各对引物中的正反向引物的摩尔比也为1:1)，得到用于多重PCR扩增的BG-BoV Panel。
2、多重PCR扩增
吸取10μl合格的人博卡病毒DNA样本(Ct≤33)，转移至新的200μl的PCR管中；按照表2所示的体系配制多重PCR反应体系，本实施例使用常规的多重PCR体系KAPA2G FastMultiplex Mix(购自KAPAbio)。
表2多重PCR反应体系
试剂 体积
KAPA2G Fast Multiplex Mix 10.0μl
BG-BoV Panel(12对引物的总浓度为10μM) 1.0μl
模板DNA 9μl
总体积 20μl
将上述多重PCR反应体系涡旋混匀，瞬时离心，置于PCR仪中，运行表3所示的反应程序，得到PCR扩增产物。
表3多重PCR反应程序
Figure BDA0003209554770000031
实施例3人博卡病毒全基因组的检测方法
本实施例提供一种人博卡病毒全基因组的检测方法，具体步骤如下：
1、第一步PCR：靶向富集人博卡病毒全基因组
(1)配制BG-BoV Panel：
将表1中的12对引物，按照1：1的摩尔比混合(各对引物中的正反向引物的摩尔比也为1:1)，得到用于多重PCR扩增的BG-BoV Panel。
(2)多重PCR扩增
吸取10μl合格的人博卡病毒DNA样本(Ct≤33)，转移至新的200μl的PCR管中；按照表2所示的体系配制多重PCR反应体系，本实施例使用常规的多重PCR体系KAPA2G FastMultiplex Mix(购自KAPAbio)。
将上述多重PCR反应体系涡旋混匀，瞬时离心，置于PCR仪中，运行表3所示的反应程序。
(3)反应结束后，将PCR产物进行下一步的纯化反应。
2、富集产物纯化：
(1)纯化前先将PCRcleanbeads、PGBuffer室温平衡30min以上，配制新鲜的80％酒精；
(2)向步骤1获得的20μl PCR合并产物中加入20μl室温平衡后的PCR cleanbeads磁珠，用移液器轻缓吸打混匀20次；
(3)室温孵育5min后，将PCR管置于磁力架上3min；
(4)移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，向管内加入180μl 80％乙醇溶液，静置30s；
(5)移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，向管内加入180μl 80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清，瞬时离心，使用10μl移液器移除底部残留乙醇溶液；
(6)室温静置3min，使残留乙醇彻底挥发；
(7)将PCR管从磁力架取下，加入9.0μl的Nuclease-freewater，移液器轻轻吸打重悬磁珠，避免产生气泡，室温静置2min，获得纯化后的产物，以此为模板进行第二步PCR扩增。
3、第二步PCR：Barcode引物扩增
(1)按照表4所示的反应体系配制第二步PCR反应体系，其中，每个样本添加不一样的BG-I7 Index(Barcode引物参照Illumina公开的Barcode引物合成)。
表4Barcode引物扩增反应体系
试剂 1×
第1轮PCR产物 9.0μl
KAPA2G Fast Multiplex Mix 10.0μl
BG-I5 Index(10μM) 0.5μl
BG-I7 Index(10μM) 0.5μl
总体积 20μl
(2)将PCR反应体系涡旋混匀，瞬时离心，置于PCR仪中，运行表5所示的反应程序，得到全基因组文库。
表5PCR反应程序
Figure BDA0003209554770000041
4、文库纯化：
(1)纯化前先将PCRcleanbeads室温平衡30min以上，配制新鲜的80％酒精；
(2)向步骤3得到的20μl PCR合并产物加入18μl室温平衡后的PCRcleanbeads磁珠，用移液器轻缓吸打混匀20次；
(3)室温孵育5min后，将PCR管置于磁力架上3min；
(4)移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，向管内加入180μl 80％乙醇溶液，静置30s；
(5)移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，向管内加入180μl 80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清，瞬时离心，使用10μl移液器移除底部残留乙醇溶液；
(6)室温静置3min，使残留乙醇彻底挥发；
(7)将PCR管从磁力架取下，加入32.5μl的Nuclease-freewater，移液器轻轻吸打重悬磁珠，避免产生气泡，室温静置2min；
(8)将PCR管重新置于磁力架上，静置3min；用移液器吸取30μl上清液，转移到新的1.5mL管内。
(9)取1μl文库样本使用琼脂糖凝胶进行文库片段长度检测，结果如图2所示，正常文库的靶片段分布区间在500bp-750bp之间。
5、文库质检
取1μl步骤4得到的纯化后的文库，使用
Figure BDA0003209554770000053
3.0Fluorometer(Qubitds DNA HSAssay Kit)进行文库浓度测定，记录文库浓度。
6、上机测序：
使用illumina Miseq测序平台，测序模式：PE300，进行测序。
7、数据分析组装：
通过FastQC对数据进行碱基质量分布Base content分布、GC content分布、Sequence base quality质控；
通过fastp，去除低质量数据，其中包括：测序接头污染、长度低于50bp的序列、平均质量值低于20的序列、N数量大于3的序列；
通过SPAdes v3.13.2软件对病毒基因组进行拼接。
实施例4灵敏度分析
对实施例1提供的12对引物的检测灵敏度进行分析，具体方法如下：
以不同Ct值的人博卡病毒DNA样本为模板，采用实施例1提供的12对引物，利用实施例3的人博卡病毒全基因组检测方法进行检测。不同Ct值样本的全基因组覆盖结果如图3、图4和图5所示。结果显示，实施例1提供的12对引物可以富集Ct值≤33的样本的全基因序列。
实施例5特异性和引物均一性分析
利用实施例3的方法以不同Ct值的人博卡病毒DNA样本(GenBank：JN387082.1)为模板进行检测，病毒样本PCR扩增均一性和测序数据特异性分析结果如表6所示。统计了测序Reads数、测序碱基数测序质量Q30％，将各样本的全基因组测序数据进行比对，统计能够Blast到博卡病毒的Reads数及其在测序总Reads数中的占比，不同Ct值都能获得较好特异性的有效数据，Ct值≤20，特异性占比≥90％，25＜Ct值≤30，特异性占比≥80％，30＜Ct值，特异性占比≥70％；将各样本的全基因组测序Reads与参考基因组比对，统计了能够覆盖参考序列1×和1000×比例，说明测序深度高，引物均一性较好，结果更准确。结果如表7所示，统计各样本不同属的博卡病毒的测序Reads数及不同属的博卡病毒Reads数在测序总Reads数中的占比，说明本发明的引物和检测方法的特异性较优。
表6病毒样本PCR扩增和测序数据特异性分析
Figure BDA0003209554770000051
表7测序数据Blast结果分析
Figure BDA0003209554770000052
Figure BDA0003209554770000061
实施例6实际临床样本分析
利用实施例3的方法，对34例临床样本进行多重PCR扩增和测序分析组装，将34例临床样本的基因组序列组装结果与参考基因组(KP710199.1,基因组长度:5299nt)比对，使用UPGMA方法绘制进化关系，分析全长5299bp的物种进化关系，结果如图6所示；使用WebLogo分析34例样本每个位点碱基出现的频率，结果如图7、图8、图9、图10、图11、图12、图13、图14、图15所示，结果表明，利用实施例3的检测方法得到的临床样本测序结果能够覆盖98％以上的人博卡病毒基因组，并且对不同型别均有较好的富集效果。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 上海伯杰医疗科技有限公司
<120> 一种检测人博卡病毒全基因组的引物组合及其检测方法
<130> KHP211117008.1
<160> 26
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggcgtcagtg ctacaacgtc 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtaggtttgt ctccccaagc tc 22
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctctgcaagg ctgtctatat ggcta 25
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cagcccgtta acaagagtgt gac 23
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcattacatc ttacagcaga cctga 25
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cacagcacaa ggcgtgacca 20
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcacctttac cctggcacaa cctt 24
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agctgcaatt tcttctggag tgat 24
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgcggctcca ttaaaagaaa gagtgat 27
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atcaaagaag gcagaagtac tcacag 26
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tccaagaagc gacgcataac tattcc 26
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
actatcccag ccaattttgt tgtct 25
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atggtgtggg ttctattggc attc 24
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
taatgccacc aagagaccag tcgtt 25
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gctgatcgtg ctgctcaatc tcat 24
<210> 16
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cctcctccat tggaaggaat tatacttt 28
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aggcagctac tttactgact cc 22
<210> 18
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tcgctgtttt caagcatgaa gaatggt 27
<210> 19
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
atgtaatgcc agaacttcct taccaa 26
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
agctggagga tcaaatccac t 21
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cttctgacac agctgcatgg a 21
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tcgacttccc agacaatttc gc 22
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ccaccaggca caattttcat caa 23
<210> 24
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tatagagttt cgcggttgcg taagcaaa 28
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tgtaaaacga cggccagt 18
<210> 26
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
caggaaacag ctatgacc 18

Claims (10)

1.一种用于人博卡病毒全基因组检测的引物组合，其特征在于，其包括12对引物，所述12对引物具有如SEQ ID NO.1-24所示的核苷酸序列。
2.一种用于人博卡病毒全基因组检测的引物组合，其特征在于，其包括12对引物，所述12对引物为在权利要求1所述的引物组合的基础上，将其中一个或多个引物中的一个或多个碱基替换为简并碱基。
3.权利要求1或2所述的引物组合的如下任一种应用：
(1)在制备用于检测人博卡病毒的试剂盒中的应用；
(2)在制备用于人博卡病毒分型的试剂盒中的应用；
(3)在制备用于检测人博卡病毒基因组变异的试剂盒中的应用。
4.试剂盒，其特征在于，包含权利要求1或2所述的引物组合。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中，所述12对引物在多重PCR反应体系中的工作浓度为9-11μM。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述多重PCR的反应程序包括：94-98℃、2-5min；94-98℃、10-40s，60℃、20-40s，72℃、3-5min，18-30个循环；72℃、2-5min。
7.权利要求1或2所述的引物组合或权利要求4～6任一项所述的试剂盒在人博卡病毒全基因组变异检测或人博卡病毒的流行病学分析中的应用。
8.一种检测人博卡病毒全基因组的方法，其特征在于，以待测样本的DNA为模板，利用权利要求1或2所述的引物组合进行多重PCR扩增。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述多重PCR扩增的反应体系中，所述12对引物的浓度为9-11μM；
和/或，所述多重PCR扩增的反应程序包括：94-98℃、2-5min；94-98℃、10-40s，60℃、20-40s，72℃、3-5min，18-30个循环；72℃、2-5min。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，将多重PCR扩增的产物纯化后，以纯化后的PCR产物为模板，利用Barcode引物进行扩增，将扩增产物经纯化后得到测序文库，再对测序文库进行测序。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114480735A (zh) * 2022-01-18 2022-05-13 上海伯杰医疗科技股份有限公司 一种肠道a组病毒全基因组测序的方法及其应用
CN114836573A (zh) * 2021-11-10 2022-08-02 江汉大学 一种麻疹病毒的mnp标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105219887A (zh) * 2015-11-09 2016-01-06 北京市农林科学院 用于分型检测猪博卡病毒的引物组、试剂盒及检测方法
CN105803114A (zh) * 2016-04-18 2016-07-27 浙江理工大学 猪博卡病毒检测和分型富集多重pcr快速诊断试剂盒
CN107354154A (zh) * 2017-07-28 2017-11-17 上海伯杰医疗科技有限公司 H9n2亚型禽流感病毒全基因组测序方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105219887A (zh) * 2015-11-09 2016-01-06 北京市农林科学院 用于分型检测猪博卡病毒的引物组、试剂盒及检测方法
CN105803114A (zh) * 2016-04-18 2016-07-27 浙江理工大学 猪博卡病毒检测和分型富集多重pcr快速诊断试剂盒
CN107354154A (zh) * 2017-07-28 2017-11-17 上海伯杰医疗科技有限公司 H9n2亚型禽流感病毒全基因组测序方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
修文琼;刘光华;康玉兰;沈晓娜;谢剑锋;王美爱;张文清;郑奎城;: "人博卡病毒全基因组序列测定与种系分析", 中国人兽共患病学报, no. 02 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114836573A (zh) * 2021-11-10 2022-08-02 江汉大学 一种麻疹病毒的mnp标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用
CN114836573B (zh) * 2021-11-10 2023-06-16 江汉大学 一种麻疹病毒的mnp标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用
CN114480735A (zh) * 2022-01-18 2022-05-13 上海伯杰医疗科技股份有限公司 一种肠道a组病毒全基因组测序的方法及其应用
CN114480735B (zh) * 2022-01-18 2024-04-09 上海伯杰医疗科技股份有限公司 一种肠道a组病毒全基因组测序的方法及其应用

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