CN114908149A - 一种无需进行核酸提取的快速基因检测方法 - Google Patents

一种无需进行核酸提取的快速基因检测方法 Download PDF

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CN114908149A CN202210608214.1A CN202210608214A CN114908149A CN 114908149 A CN114908149 A CN 114908149A CN 202210608214 A CN202210608214 A CN 202210608214A CN 114908149 A CN114908149 A CN 114908149A
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract

本发明公开了一种无需进行核酸提取的快速基因检测方法，涉及核酸检测技术领域，包括以下步骤：将样本加入到裂解液中，充分混合释放样本中的核酸；取试剂A加入到反应管中，取裂解样本加入到反应管中，混匀；将上述反应管放入设备中按照PCR程序进行反应；在仪器上收集检测结果，得出基因检测结论。本发明通过采用特定的反应试剂A和裂解液，有效消除了裂解样本中各种对扩增结果有抑制作用物质的影响效果(不是消除该物质，而是消除影响)，即使不进行核酸提取，也可以以高准确率完成核酸检测，大量节省了核酸检测的时间(至少节省半小时以上)，使得核酸检测在现场检测和商用领域的应用具备了更多的可能性。

Description

一种无需进行核酸提取的快速基因检测方法
技术领域
本发明涉及核酸检测技术领域，具体涉及一种无需进行核酸提取的快速基因检测方法。
背景技术
核酸检测的物质是样本中携带的遗传物质，目前核酸检测被应用于多种遗传病的诊断以及判断样本是否被某种带有可被特异识别遗传物质的病毒感染。另外一种比较新的应用领域，是利用核酸检测，来确定被检测个体的某种特征或能力等。无论是商用还是医用，都需要核酸检测在较短的时间内检测完成得出结果。
传统的核酸检测方法，如芯片检测、DNA测序等，需要在中心实验室中进行，且需按照严格的实验步骤，耗时一般都超过12小时，有的甚至一周时间；而常规的qPCR技术也需要2小时左右才能完成检测，且需对样本进行DNA抽提、离心、震荡等步骤(这些步骤须借助额外的专用设备，如离心机等)。由于目前全球形势的紧迫性，人们对快速核酸检测关注度逐渐增加，也开发出了一些短时间内完成检测的方法，如环介导等温扩增(LAMP)技术等，但目前的核酸检测技术普遍存在以下问题中的部分或全部：一是检测时间长：测序或芯片测序需要12小时-1周的时间不等；常规的qPCR需要2小时左右；二是上述恒温扩增技术存在以下问题：1)准确率低，平均在80％左右，这样的准确率虽然对于普通性质的商业检测没有致命影响，但一旦用于传染病学检测，其误差就是无法容忍的；2)分辨率低，很难做到单碱基分辨率，一般在10bp以上；三是操作环境要求高：常规的测序和qPCR，由于需要对样本抽提、离心、纯化等步骤，需要在qPCR实验室中进行，且需接触相关的设备操作；四是人员要求高：由于在严苛的环境下操作，所以对操作人员有资质要求。
也就是说，现有技术中，并不存在一种真正快速准确的核酸检测方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种在提高检测速度的同时，还能够保证检测结果准确率的方法，具体方案如下：
一种无需进行核酸提取的快速基因检测方法，包括以下步骤：
S1、样本裂解：将样本加入到裂解液中，充分混合得到裂解样本；
S2、取试剂A加入到qPCR反应管中，取裂解样本加入到qPCR反应管中，混匀；
S3、扩增：所得qPCR反应管放入qPCR设备中按照PCR程序进行反应；
S4、在qPCR仪器上收集检测结果，得出基因检测结论。
优选地，S2所述试剂A包括Taq DNA Polymerase、Tris-HCl、MgSO4、dNTP。
进一步地，S2所述试剂A中各组分用量或浓度为：Taq DNA Polymerase：0.1-5U，优选地0.5-2U，最优选的0.8-1.5U；Tris-HCl：10-120mM，优选地20-80mM，最优选30-50mM；MgSO4：0.5-5mM，优选地1-4mM，最优选1.5-3.5mM；dNTP:0.02-0.5mM，优选地0.05-0.4mM，最优选0.08-0.35mM。
优选地，S2所述试剂A包括Taq DNA Polymerase、Tris-HCl、KCl、MgSO4、dNTP、BSA。
进一步地，S2所述试剂A中各组分用量或浓度为：Taq DNA Polymerase：0.1-5U，优选地0.5-2U，最优选的0.8-1.5U；Tris-HCl：10-120mM，优选地20-80mM，最优选30-50mM；KCl：60-200mM，优选地70-150mM，最优选80-120mM；MgSO4：0.5-5mM，优选地1-4mM，最优选1.5-3.5mM；dNTP:0.02-0.5mM，优选地0.05-0.4mM，最优选0.08-0.35mM；BSA:0.01mg/ml-5mg/ml，优选地0.05mg/ml-3mg/ml，最优选0.1mg/ml-2mg/ml。
优选地，S2所述试剂A用量为裂解样本质量的1％-2.5％wt。
优选地，S3所述PCR程序包括：95℃预变形2min，1个循环；95℃5s，60℃30-45s，40个循环。
优选地，S3所述PCR程中，qPCR在60℃阶段收集荧光信号。
优选地，上述收集荧光信号，收集的荧光扩增信号包括FAM、VIC和CY5，内参为ROX。
优选地，S3所述PCR程中，程序开始后升温速率为4-8℃/s，降温速率为4-8℃/s。
优选地，S1所述样本包括食品样本，灰尘、杂物等物品样本，以及口腔拭子、唾液、生物组织等样本。
优选地，S1所述充分混合，包括：剧烈摇晃5-10次或涡旋混合5-10s，静置5-10s后，再剧烈摇晃5-10次或涡旋混合5-10s。
优选地，S1所述裂解液，在水浴中加热到35-45℃后使用。
优选地，S1所述裂解液加入量，为没过样本为准，更优选其体积为样本体积的3-5倍。
优选地，S1所述裂解液，包括：SDS、三羟甲基氨基甲烷、DTC。
进一步地，所述裂解液各组分浓度为：SDS：0.1％-4％wt，优选0.3％-2％wt，最优选0.4％-1％wt；三羟甲基氨基甲烷：0.05M-1M，优选0.1M-0.8M，最优选0.2M-0.5M；DTC：10mM-500mM，优选20mM-300mM，最优选30mM-100mM。
有益效果
本发明的有益效果在于：
核酸检测目前基本是在中心实验室操作，应用场景受限，主要服务于医疗，在快速实时室外检测或商用领域收到较大的限制。
本发明为了突破中心实验室限制，突破检测时间限制，将核酸检测为更多的产业、场景服务，提供了上述方法，可实现以下效果突破：
1、检测周期短，在20-30分钟左右(<40分钟)完成；
2、检测分辨率高，单碱基分辨率的核酸检测:
3、准确率高，可达100％:
4、操作简单，无需中心实验室，且对操作人员要求低。
本发明通过采用特定的试剂A和裂解液，有效消除了裂解样本中各种对扩增结果有影响的物质的影响效果(不是消除该物质，而是消除影响)，即使不进行核酸提取，也可以以高准确率完成核酸检测，大量节省了核酸检测的时间(至少节省半小时以上)，使得核酸检测在现场检测和商用领域的应用具备了更多的可能性。
附图说明
图1-1至图1-4分别为实施例1列举4个样本的扩增曲线；
图2-1至图2-4分别为实施例2列举4个样本(所列举样本与实施例1相同)的扩增曲线；
图3-1至图3-6分别为实施例3列举的6个样本的扩增曲线；
图4-1至图4-6分别为实施例4列举的6个样本(所列举样本与实施例3相同)的扩增曲线；
图5-1至图5-6分别为实施例5列举的6个样本(所列举样本与实施例3相同)的扩增曲线。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
除非特别指出，以下实施例和对比例为平行试验，采用同样的处理步骤和参数。
准备：
裂解液a
裂解液各组分浓度为：SDS：0.1％wt；三羟甲基氨基甲烷：0.05M；DTC：10mM。
裂解液b
裂解液各组分浓度为：SDS：4％wt；三羟甲基氨基甲烷：1M；DTC：500mM。
裂解液c
裂解液各组分浓度为：SDS：1.5％；三羟甲基氨基甲烷：0.8M；DTC：200mM。
裂解液d
裂解液各组分浓度为：SDS：1％wt；三羟甲基氨基甲烷：0.5M；DTC：100mM。
裂解液e(对比)
裂解液各组分浓度为：SDS：5％wt；三羟甲基氨基甲烷：1.3M；DTC：600mM。
试剂A-1
试剂A中各组分用量或浓度为：Taq DNA Polymerase：0.1U；Tris-HCl：10mM；MgSO4：0.5mM；dNTP:0.02mM。
试剂A-2
试剂A中各组分用量或浓度为：Taq DNA Polymerase：5U；Tris-HCl：120mM；MgSO4：5mM；dNTP:0.5mM。
试剂A-3
试剂A中各组分用量或浓度为：Taq DNA Polymerase：0.1U；Tris-HCl：10mM；KCl：60mM；MgSO4：0.5mM；dNTP:0.02mM；BSA:0.01mg/ml。
试剂A-4
试剂A中各组分用量或浓度为：Taq DNA Polymerase：5U；Tris-HCl：120mM；KCl：200mM；MgSO4：5mM；dNTP:0.5mM；BSA:5mg/ml。
试剂A-5
试剂A中各组分用量或浓度为：Taq DNA Polymerase：1.8U；Tris-HCl：80mM；KCl：150mM；MgSO4：4mM；dNTP:0.4mM；BSA:3mg/ml。
试剂A-6(对比)
试剂A中各组分用量或浓度为：Taq DNA Polymerase：5U；Tris-HCl：130mM；MgSO4：7mM；dNTP:0.8mM。
试剂A-7(对比)
试剂A中各组分用量或浓度为：Taq DNA Polymerase：5U；Tris-HCl：130mM；KCl：250mM；MgSO4：7mM；dNTP:0.8mM；BSA:8mg/ml。
实施例：
一种无需进行核酸提取的快速基因检测方法，按照以下可选步骤、试剂组分及可选参数范围进行试验，不同试验可选择范围内不同步骤、试剂组分及可选参数范围的组合进行试验，针对特定基因可能存在最优的步骤、试剂组分及可选参数组合：
S1、样本裂解：将样本加入到裂解液中，充分混合得到裂解样本；
S2、取试剂A加入到qPCR反应管中，取裂解样本加入到qPCR反应管中，混匀；
S3、扩增：所得qPCR反应管放入qPCR设备中按照PCR程序进行反应；
S4、在qPCR仪器上收集检测结果，得出基因检测结论。
S2所述试剂A包括Taq DNA Polymerase、Tris-HCl、MgSO4、dNTP。
进一步地，S2所述试剂A中各组分用量或浓度为：Taq DNA Polymerase：0.1-5U，优选地0.5-2U，最优选的0.8-1.5U；Tris-HCl：10-120mM，优选地20-80mM，最优选30-50mM；MgSO4：0.5-5mM，优选地1-4mM，最优选1.5-3.5mM；dNTP:0.02-0.5mM，优选地0.05-0.4mM，最优选0.08-0.35mM。
S2所述试剂A包括Taq DNA Polymerase、Tris-HCl、KCl、MgSO4、dNTP、BSA。
S2所述试剂A中各组分用量或浓度为：Taq DNA Polymerase：0.1-5U，优选地0.5-2U，最优选的0.8-1.5U；Tris-HCl：10-120mM，优选地20-80mM，最优选30-50mM；KCl：60-200mM，优选地70-150mM，最优选80-120mM；MgSO4：0.5-5mM，优选地1-4mM，最优选1.5-3.5mM；dNTP:0.02-0.5mM，优选地0.05-0.4mM，最优选0.08-0.35mM；BSA:0.01mg/ml-5mg/ml，优选地0.05mg/ml-3mg/ml，最优选0.1mg/ml-2mg/ml。
S2所述试剂A用量为裂解样本质量的1％-2.5％wt。
S3所述PCR程序包括：95℃预变形2min，1个循环；95℃5s，60℃30-45s，40个循环。
S3所述PCR程中，qPCR在60℃阶段收集荧光信号。
上述收集荧光信号，收集的荧光扩增信号包括FAM、VIC和CY5，内参为ROX。
S3所述PCR程中，程序开始后升温速率为4-8℃/s，降温速率为4-8℃/s。
S1所述样本包括食品样本，灰尘、杂物等物品样本，以及口腔拭子、唾液、生物组织等样本。
S1所述充分混合，包括：剧烈摇晃5-10次或涡旋混合5-10s，静置5-10s后，再剧烈摇晃5-10次或涡旋混合5-10s。
S1所述裂解液，在水浴中加热到35-45℃后使用。
S1所述裂解液加入量，为没过样本为准，更优选其体积为样本体积的3-5倍。
S1所述裂解液，包括：SDS、三羟甲基氨基甲烷、DTC。
所述裂解液各组分浓度为：SDS：0.1％-4％wt，优选0.3％-2％wt，最优选0.4％-1％wt；三羟甲基氨基甲烷：0.05M-1M，优选0.1M-0.8M，最优选0.2M-0.5M；DTC：10mM-500mM，优选20mM-300mM，最优选30mM-100mM。
实施例1在上述范围内，其中一种针对特定基因MTHFR(C677T)基因的无需进行核酸提取的快速基因检测方法：
S1、样本裂解：将拭子样本加入到裂解液中，充分混合得到裂解样本；
S2、取试剂A加入到qPCR反应管中，向其中加入MTHFR C677T检测的引物探针，并取裂解样本加入到qPCR反应管中，混匀；MTHFR C677T引物探针序列如下：
F <u>GACCTGAAGCACTTGAAGGAGAA</u>
R <u>GGCTGACCTGAAGCACTTGAA</u>
P1 5'FAM-CTGCGGGAGCCGA-3'BHQ1
P2 5-HEX-TCTGCGGGAGTCG-3'BHQ1
S3、扩增：所得qPCR反应管放入qPCR设备中按照PCR程序进行反应；
S4、在qPCR仪器上收集检测结果，得出基因检测结论。
本实施例采用试剂A-2和裂解液d。
S2所述试剂A用量为裂解样本质量的1％wt。
所述混匀为涡旋混匀。
所述PCR程序包括：95℃预变形2min，1个循环；95℃5s，60℃30s，40个循环。
所述PCR程中，qPCR在60℃阶段收集荧光信号。
上述收集荧光信号，收集的荧光扩增信号包括FAM、HEX和，内参为ROX。
所述PCR程中，程序开始后升温速率为6℃/s，降温速率为6℃/s。
S1所述充分混合，包括：剧烈摇晃10次，静置5-10s后，再剧烈摇晃10次。
S1所述裂解液加入量，为没过样本为准，本实施例为2mL。
表1实施例1列举4个已知基因型样本的实际检测效果数据：
Figure BDA0003671141800000091
实施例1检测样本数1000，全部样本均为已知准确基因型的对照样本，检测结果全部正确，准确率为100％。本发明仅列举其中4个样本的具体检测结果，详见表1及图1-1至图1-4：其中采用了FAM/HEX两通道，当FAM通道有读数，HEX通道无读数(NA)时，判定基因型为CC，当FAM通道无读数(NA)，HEX通道有读数时，判定基因型为TT，当FAM通道有读数，HEX通道有读数时，判定基因型为CT。每个样本总耗时约24-25min。
实施例2在上述范围内，其中一种针对特定基因MTHFR(C677T)基因的无需进行核酸提取的快速基因检测方法：
S1、样本裂解：将拭子样本加入到裂解液中，充分混合得到裂解样本；
S2、取试剂A加入到qPCR反应管中，向其中加入MTHFR C677T检测的引物探针，并取裂解样本加入到qPCR反应管中，混匀；MTHFR C677T引物探针序列如下：
F <u>GACCTGAAGCACTTGAAGGAGAA</u>
R <u>GGCTGACCTGAAGCACTTGAA</u>
P1 5'FAM-CTGCGGGAGCCGA-3'BHQ1
P2 5-HEX-TCTGCGGGAGTCG-3'BHQ1
S3、扩增：所得qPCR反应管放入qPCR设备中按照PCR程序进行反应；
S4、在qPCR仪器上收集检测结果，得出基因检测结论。
本实施例采用试剂A-4和裂解液d。
S2所述试剂A用量为裂解样本质量的1％wt。
所述混匀为涡旋混匀。
所述PCR程序包括：95℃预变形2min，1个循环；95℃5s，60℃30s，40个循环。
所述PCR程中，qPCR在60℃阶段收集荧光信号。
上述收集荧光信号，收集的荧光扩增信号包括FAM、HEX和，内参为ROX。
所述PCR程中，程序开始后升温速率为6℃/s，降温速率为6℃/s。
S1所述充分混合，包括：剧烈摇晃10次，静置5-10s后，再剧烈摇晃10次。
S1所述裂解液加入量，为没过样本为准，本实施例为2mL。
表2实施例2列举4个已知基因型样本(样本与实施例1为相同样本)的实际检测效果数据：
Figure BDA0003671141800000111
实施例2检测样本数1000(样本与实施例1为相同样本)，全部样本均为已知准确基因型的对照样本，检测结果全部正确，准确率为100％。本发明仅列举其中4个样本的具体检测结果，详见表2及图2-1至图2-4：其中采用了FAM/HEX两通道，当FAM通道有读数，HEX通道无读数(NA)时，判定基因型为CC，当FAM通道无读数(NA)，HEX通道有读数时，判定基因型为TT，当FAM通道有读数，HEX通道有读数时，判定基因型为CT。每个样本总耗时约23-24min。从扩增曲线及具体Ct值可见，相同样本，同等条件下，实施例2的Ct值均小于实施例1，实施例2效果略优于实施例1，在试剂A中加入氯化钾以及BSA在一定程度上优化了检测效果。
实施例3在上述范围内，其中一种针对特定基因替换为Rnase P内参基因的无需进行核酸提取的快速基因检测方法：
S1、样本裂解：将唾液样本加入到裂解液中，充分混合得到裂解样本；
S2、取试剂A加入到qPCR反应管中，向其中加入Rnase P内参检测的引物探针，并取裂解样本加入到qPCR反应管中，混匀；
Rnase P内参检测的引物探针:
Rnase P-F GCAATATTTGCATGTCGCTATGT
Rnase P-R ATGGGAGTGGAGTGACAGGAC
Rnase P-P1 5'FAM-AGTTCTGTATGAGACCACTTTTTCC-3'BHQ1
S3、扩增：所得qPCR反应管放入qPCR设备中按照PCR程序进行反应；
S4、在qPCR仪器上收集检测结果，得出基因检测结论。
本实施例采用试剂A-2和裂解液d。
S2所述试剂A用量为裂解样本质量的2.5％wt。
所述混匀为涡旋混匀。
所述PCR程序包括：95℃预变形2min，1个循环；95℃5s，60℃30s，40个循环。
所述PCR程中，qPCR在60℃阶段收集荧光信号。
上述收集荧光信号，收集的荧光扩增信号包括FAM，内参为ROX。
所述PCR程中，程序开始后升温速率为8℃/s，降温速率为8℃/s。
S1所述充分混合，包括：剧烈摇晃10次。
S1所述裂解液加入量，为没过样本为准，本实施例为样本的3倍体积。
表3实施例3列举6个已知变异类型样本的实际检测效果数据：
Sample Ct Value
Buccal Cell-1 27.1
Buccal Cell-2 28.39
Buccal Cell-3 27.56
Buccal Cell-4 27.16
Buccal Cell-5 28.5
Buccal Cell-6 27.87
实施例3共检测样本数1200例，全部样本均为已知Rnase P基因能检测出来，检测结果全部正确，准确率为100％。本发明仅列举其中6个样本的具体检测结果，详见表3及图3-1至图3-6：信号通道有扩增曲线及对应的Ct值说明都能正确检测出来。每个样本总耗时约24-25min。
实施例4在上述范围内，其中一种针对特定基因Rnase P内参的无需进行核酸提取的快速基因检测方法：
S1、样本裂解：将唾液样本加入到裂解液中，充分混合得到裂解样本；
S2、取试剂A加入到qPCR反应管中，向其中加入Rnase P内参检测的引物探针，并取裂解样本加入到qPCR反应管中，混匀；
Rnase P内参检测的引物探针:
Rnase P-F GCAATATTTGCATGTCGCTATGT
Rnase P-R ATGGGAGTGGAGTGACAGGAC
Rnase P-P1 5'FAM-AGTTCTGTATGAGACCACTTTTTCC-3'BHQ1
S3、扩增：所得qPCR反应管放入qPCR设备中按照PCR程序进行反应；
S4、在qPCR仪器上收集检测结果，得出基因检测结论。
本实施例采用试剂A-4和裂解液d。
S2所述试剂A用量为裂解样本质量的2.5％wt。
所述混匀为涡旋混匀。
所述PCR程序包括：95℃预变形2min，1个循环；95℃5s，60℃30s，40个循环。
所述PCR程中，qPCR在60℃阶段收集荧光信号。
上述收集荧光信号，收集的荧光扩增信号包括FAM，内参为ROX。
所述PCR程中，程序开始后升温速率为8℃/s，降温速率为8℃/s。
S1所述充分混合，包括：剧烈摇晃10次。
S1所述裂解液加入量，为没过样本为准，本实施例为样本的3倍体积。
表4实施例4列举6个已知变异类型样本(列举样本与实施例3中所列举的相同)的实际检测效果数据：
Sample Ct Value
Buccal Cell-1 26.36
Buccal Cell-2 27.87
Buccal Cell-3 26.91
Buccal Cell-4 26.58
Buccal Cell-5 27.72
Buccal Cell-6 27.01
实施例4检测样本数1200(样本与实施例3为相同样本)，全部样本均为已知RnaseP基因能检测出来，检测结果全部正确，准确率为100％。本发明仅列举其中6个样本的具体检测结果，详见表4及图4-1至图4-6：信号通道有读数判定为样本存在拷贝数变异。每个样本总耗时约23-24min。从扩增曲线及具体Ct值可见，相同样本，同等条件下，实施例4的Ct值均小于实施例3，实施例4效果略优于实施例3，在试剂A中添加氯化钾和BSA，在一定程度上优化了检测效果。
实施例5在上述范围内，其中一种针对特定基因Rnase P内参基因的无需进行核酸提取的快速基因检测方法：
S1、样本裂解：将唾液样本加入到裂解液中，充分混合得到裂解样本；
S2、取试剂A加入到qPCR反应管中，向其中加入Rnase P内参检测的引物探针，并取裂解样本加入到qPCR反应管中，混匀；
Rnase P内参检测的引物探针:
Rnase P-F GCAATATTTGCATGTCGCTATGT
Rnase P-R ATGGGAGTGGAGTGACAGGAC
Rnase P-P1 5'FAM-AGTTCTGTATGAGACCACTTTTTCC-3'BHQ1
S3、扩增：所得qPCR反应管放入qPCR设备中按照PCR程序进行反应；
S4、在qPCR仪器上收集检测结果，得出基因检测结论。
本实施例采用试剂A-4和裂解液d。
S2所述试剂A用量为裂解样本质量的2.5％wt。
所述混匀为涡旋混匀。
所述PCR程序包括：95℃预变形2min，1个循环；95℃5s，60℃30s，40个循环。
所述PCR程中，qPCR在60℃阶段收集荧光信号。
上述收集荧光信号，收集的荧光扩增信号包括FAM，内参为ROX。
所述PCR程中，程序开始后升温速率为8℃/s，降温速率为8℃/s。
S1所述充分混合，包括：剧烈摇晃10次。
S1所述裂解液加入量，为没过样本为准，本实施例为样本的3倍体积。
S1所述裂解液，在水浴中加热到40℃后使用。
表5实施例5列举6个已知变异类型样本(列举样本与实施例3中所列举的相同)的实际检测效果数据：
Sample Ct Value
Buccal Cell-1 25.31
Buccal Cell-2 26.58
Buccal Cell-3 25.66
Buccal Cell-4 25.57
Buccal Cell-5 26.76
Buccal Cell-6 25.84
实施例5检测样本数1200(样本与实施例3为相同样本)，全部样本均为已知RnaseP基因能检测出来，检测结果全部正确，准确率为100％。本发明仅列举其中6个样本的具体检测结果，详见表5及图5-1至图5-6：信号通道有读数判定为样本存在拷贝数变异。每个样本总耗时约22-23min。从扩增曲线及具体Ct值可见，相同样本，同等条件下，实施例5的Ct值均小于实施例4，实施例5效果略优于实施例4，将裂解液加热后使用，在一定程度上优化了检测效果。
取10-1到10-88个梯度已知浓度Rnase P做样本，分别按实施例3-5方法进行qPCR反应(全部步骤)，各个浓度梯度样本在不同实施例中分别重复测定十次，样品组间及组内Ct值的变异系数皆小于2％。取单组数据，根据Log(样本模板拷贝数)与循环数Ct值的对应关系生成标准曲线，实施例3y＝-3.337x+27.89，R2＝0.997，实施例4y＝-3.591x+39.90，R2＝0.999，实施例5y＝-3.744x+43.36，R2＝0.999，将待测样本(另取已知浓度Rnase P)所得Ct值代入标准品曲线方程便可得出待测样本起始拷贝数，检测结果与已知拷贝数没有显著差异，线性及检测结果准确度方面，实施例5优于实施例4，实施例4优于实施例3。取大范围浓度梯度已知浓度Rnase P做样本，分别按照实施例3、4、5方法定量检测，以出现阳性预期曲线(且计算结果与已知拷贝数没有显著差异)所用模板量的最高稀释度计算检测方法灵敏度，实施例3、4、5检测限分别为8拷贝/μL、8拷贝/μL、7拷贝/μL。
对比例1：
与实施例1的区别在于：采用试剂A-6。
对比例2：
与实施例2的区别在于：采用试剂A-7。
对比例3：
与实施例2的区别在于：采用裂解液e。
对比例1-3与实施例1、2使用的为相同的1000组样本，实施例3-5使用的是另外相同的1200组样本。
经试验验证，采用试剂A-1与采用试剂A-2效果无显著差异也无明显变化趋势；采用试剂A-4效果略优于试剂A-3，采用试剂A-5效果略优于试剂A-4；采用试剂A-6(对比例1)在1000组相同样本中有9组样本检测结果错误，准确率降低；采用试剂A-7(对比例2)在1000组相同样本中有5组样本检测结果错误，准确率降低；采用裂解液b、c、d检测结果见无显著差异也无明显变化趋势，但扩增曲线略优于采用裂解液a，采用裂解液e(对比例3)在1000组相同样本中有3组样本检测结果错误，准确率降低，同时对比例3扩增曲线相同条件下Ct值大于实施例2，检测效果略差。
在以往的基因检测方法中，按照传统方法先进行一次提取样本中的DNA再测序，耗时超过12小时，而目前常规的qPCR也要2h左右，准确率通常在85％(89％)以下。我们采用本发明的方法进行了11个实验室常见基因检测试验(包括上述MTHFR(C677T)基因和RnaseP)，全部耗时约在22min-33min不等，且准确率均保证在100％，是一种适用于大规模快速基因检测的方法，具有广阔的应用前景。
以上对本发明优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明构思的前提下作出各种变化。

Claims (10)

1.一种无需进行核酸提取的快速基因检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、样本裂解：将样本加入到裂解液中，充分混合得到裂解样本；
S2、取试剂A加入到qPCR反应管中，取裂解样本加入到qPCR反应管中，混匀；
S3、扩增：所得qPCR反应管放入qPCR设备中按照PCR程序进行反应；
S4、在qPCR仪器上收集检测结果，得出基因检测结论。
2.根据权利要求1所述的无需进行核酸提取的快速基因检测方法，其特征在于：S2所述试剂A包括Taq DNA Polymerase、Tris-HCl、MgSO4、dNTP。
3.根据权利要求2所述的无需进行核酸提取的快速基因检测方法，其特征在于：S2所述试剂A中各组分用量或浓度为：Taq DNA Polymerase：0.1-5U；Tris-HCl：10-120mM；MgSO4：0.5-5mM；dNTP:0.02-0.5mM。
4.根据权利要求1所述的无需进行核酸提取的快速基因检测方法，其特征在于：S2所述试剂A包括Taq DNA Polymerase、Tris-HCl、KCl、MgSO4、dNTP、BSA。
5.根据权利要求4所述的无需进行核酸提取的快速基因检测方法，其特征在于：S2所述试剂A中各组分用量或浓度为：Taq DNA Polymerase：0.1-5U；Tris-HCl：10-120mM；KCl：60-200mM；MgSO4：0.5-5mM；dNTP:0.02-0.5mM；BSA:0.01mg/ml-5mg/ml。
6.根据权利要求1所述的无需进行核酸提取的快速基因检测方法，其特征在于：S2所述试剂A用量为裂解样本质量的1％-2.5％wt。
7.根据权利要求1所述的无需进行核酸提取的快速基因检测方法，其特征在于：S3所述PCR程序包括：95℃预变形2min，1个循环；95℃5s，60℃30-45s，40个循环。
8.根据权利要求1所述的无需进行核酸提取的快速基因检测方法，其特征在于：S3所述PCR程中，程序开始后升温速率为4-8℃/s，降温速率为4-8℃/s。
9.根据权利要求1所述的无需进行核酸提取的快速基因检测方法，其特征在于：S1所述裂解液，包括：SDS、三羟甲基氨基甲烷、DTC。
10.根据权利要求1所述的无需进行核酸提取的快速基因检测方法，其特征在于：所述裂解液各组分浓度为：SDS：0.1％-4％wt；三羟甲基氨基甲烷：0.05M-1M；DTC：10mM-500mM。
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