CN113549708A - 基于poct模式的新型冠状病毒covid-19快速检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于POCT模式的新型冠状病毒COVID‑19快速检测试剂盒。该试剂盒至少含有COVID‑19 1ab基因检测引物和探针(SEQ ID NO:1‑3)、COVID‑19N基因检测引物和探针(SEQ ID NO:4‑6)。此外还可包括裂解液、Tth酶体系、RNA酶抑制剂、标准阳性模板等。本试剂盒可实现即时检测,无需RNA提纯,可将样本直接加入试剂中进行RT‑PCR反应,大大降低了操作者感染病毒的风险;特别适合RNA含量较低样本的快速、准确检测,合成的带蛋白壳的RNA假病毒检测准确率达99.9%以上,检测灵敏度高,100分钟内可得检测结果,解决了传统RNA核酸病毒检测耗时长的问题。
Description
技术领域
本发明涉及核酸检测技术领域,具体地说,涉及一种基于POCT模式的新型冠状 病毒COVID-19快速检测试剂盒。
背景技术
新型冠状病毒(COVID-19)属于β属的冠状病毒,有包膜,颗粒呈圆形或椭圆 形,常为多形性,直径60-140nm。其基因特征与SARSr-CoV和MERSr-CoV有明显的 区别。研究显示,新型冠状病毒与蝙蝠SARS样冠状病毒同源性达85%以上。体外分 离培养时,COVID-19 96小时左右即可在人呼吸道上皮细胞内发现,而在Vero E6和 Huh-7细胞系中分离培养需约6天。
新型冠状病毒性肺炎的症状,在早期以干咳、发热和乏力为主,少数的患者会 出现有流鼻涕、打喷嚏或者是出现腹泻的现象。这种疾病病情发展非常快,一般在 一周左右如果没有得到控制的话,会出现有呼吸困难、呼吸窘迫综合征这一类的现 象,而且还会出现体温持续性升高,甚至达到39℃以上,表现出有头痛头晕,或者 是伴随有恶心呕吐、喉咙疼痛。在疾病的发展当中容易合并一些并发症,出现呼吸 窘迫综合征,出现难以纠正的代谢性酸中毒、出现凝血功能障碍这一类的情况,会 严重影响到生命。
新型冠状病毒在人与人之间的传播途径广,包括直接传播(咳嗽,打喷嚏和液 滴吸入传播)和接触传播(与口腔,鼻和眼粘膜接触)。COVID-19也可通过唾液直 接或间接传播。值得注意的是,2020年3月20日,Nature发表了题为《Covert coronavirus infectionscould be seeding new outbreaks》的报告,指出30%-60%的新冠感染者无症 状或者症状轻微,但他们传播病毒的能力并不低于重症患者——这些隐性感染者可 能会引发新一轮的疫情大爆发。该病毒传播途径广,传播速度快,潜伏期长。因此 引起了全世界的高度重视。到目前为止,还没有特异性的药物和疫苗对这种疾病进 行治疗和预防。
目前,诊断新冠肺炎的手段主要依靠核酸和抗体检测作为临床确诊的主要依据。新冠病毒核酸检测针对的位点主要包含病毒基因组中3段保守基因序列,即开放读码 框1ab(Open reading frame 1ab,ORF1ab)、核壳蛋白(Nucleocapsid protein,N)基 因以及包膜蛋白(Envelop,E)基因作为检测靶标。新冠病毒抗体检测针对的免疫球蛋 白包括IgM和IgG抗体。
传统的RNA病毒核酸检测样本需经RNA提纯步骤,这大大增加了操作者感染病 毒的风险。另外,传统的RNA病毒核酸检测样本需经RNA提纯、反转录和PCR多步 进行,耗时较长一般需要6-8小时才能出结果,临床使用不理想。因此这些常规的RNA 病毒核酸检测技术难以满足目前对新型冠状病毒COVID-19检测快速、准确的要求。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于POCT模式的新型冠状病毒COVID-19快速检测试 剂盒。
本发明的另一目的是提供一种基于POCT模式的新型冠状病毒COVID-19快速检 测方法。
为了实现本发明目的,第一方面,本发明提供一种新型冠状病毒COVID-19检测 引物,包括COVID-19 1ab基因检测引物和COVID-19N基因检测引物;COVID-19 1ab 基因检测引物包括如SEQ ID NO:1所示的上游引物和序列如SEQ ID NO:2所示的下游 引物,COVID-19N基因检测引物包括如SEQ ID NO:4所示的上游引物和序列如SEQ ID NO:5所示的下游引物。
第二方面,本发明提供与上述引物配套使用的探针,与COVID-19 1ab基因检测 引物配套使用的探针序列如SEQ ID NO:3所示,与COVID-19N基因检测引物配套使 用的探针序列如SEQ ID NO:6所示,SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:6所示探针的5′端分别 带有相同的荧光基团,3′端具有淬灭基团。
第三方面,本发明提供含有上述引物和/或探针的检测试剂或试剂盒。
第四方面,本发明提供一种基于POCT模式的新型冠状病毒COVID-19快速检测 试剂盒,包括SEQ ID NO:1-3所示引物和探针以及包括SEQ ID NO:4-6所示引物和探 针。该试剂盒无需核酸提取操作,可直接将粗样本加入反应液进行RT-PCR检测。所 述试剂盒还包含内参基因GAPDH检测引物和探针,其中,GAPDH检测引物包括序列 如SEQ ID NO:7所示的上游引物和序列如SEQ ID NO:8所示的下游引物;GAPDH检测 探针的序列如SEQ ID NO:9所示,探针的5′端具有荧光基团,3′端具有淬灭基团,且 该荧光基团不同于SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:6探针中使用的荧光基团。
优选地,SEQ ID NO:3所示探针的5′端荧光基团为FAM,SEQ ID NO:3所示探针 的3′端淬灭基团为BHQ1。
SEQ ID NO:6所示探针的5′端荧光基团为FAM,SEQ ID NO:6所示探针的3′端淬灭基团为BHQ1。
SEQ ID NO:9所示探针的5′端荧光基团为Texas Red,SEQ ID NO:9所示探针的3′端淬灭基团为BHQ2。
所述试剂盒还包括裂解液、Tth酶体系、RNA酶抑制剂、标准阳性模板等中的至 少一种。
其中,裂解液的成分为:十二烷基硫酸钠0.005%w/v、聚乙二醇辛基苯基醚0.01%w/v和Tris-HCl 30mM。
可选地,所述RNA酶抑制剂购自珠海宝锐生物科技有限公司,商品编号为AS05。
本发明中使用的Tth酶体系如下:5×Superstart Tth Premix-UNG(Probe qRT-PCR), 购自珠海宝锐生物科技有限公司。成分包括:RT-PCR buffer、dNTPs、MgCl2、UNG 酶、Mn2+、稳定剂、双功能活性的Tth酶。
第五方面,本发明提供用于检测新型冠状病毒COVID-19的qPCR反应体系,包括 用于检测COVID-19 1ab基因的qPCR反应体系以及用于检测COVID-19N基因的 qPCR反应体系。
用于检测COVID-19 1ab基因的qPCR反应体系包含:1.2×Tth酶体系,0.3U/μl RNA酶抑制剂,SEQ ID NO:1所示的上游引物、SEQ ID NO:2所示的下游引物各 0.7μM,SEQ IDNO:7所示的上游引物、SEQ ID NO:8所示的下游引物各0.3μM,SEQ ID NO:3所示的探针0.3μM,SEQ ID NO:9所示的探针0.2μM以及裂解液;所述裂解液 在体系中加入的浓度为1×。
用于检测COVID-19N基因的qPCR反应体系包含:1.2×Tth酶体系,0.3U/μl RNA 酶抑制剂,SEQ ID NO:4所示的上游引物、SEQ ID NO:5所示的下游引物各0.7μM, SEQ ID NO:7所示的上游引物、SEQ ID NO:8所示的下游引物各0.3μM,SEQ ID NO:6 所示的探针0.3μM,SEQ ID NO:9所示的探针0.2μM以及裂解液;所述裂解液在体系 中加入的浓度为1×。
第六方面,本发明提供基于POCT模式的新型冠状病毒COVID-19快速检测方法 (含非诊断目的),所述方法包括:采集两份病毒样本,一份加入到用于检测 COVID-19 1ab基因的qPCR反应体系中,另一份加入到用于检测COVID-19N基因的 qPCR反应体系中,将配制好的反应液分别置于PCR仪中运行以下程序进行裂解反应 和RT-PCR扩增,扩增结束后,分析扩增产物;其中,用于检测COVID-19 1ab基因的 qPCR反应体系以及用于检测COVID-19N基因的qPCR反应体系如前所述。
裂解反应和RT-PCR扩增的程序为:50℃2min;90℃3min;60℃15min;95℃ 1min;95℃15sec,55℃35sec,50个循环。
本发明中,病毒样本来自咽拭子、鼻腔拭子、肺泡灌洗液或病毒感染细胞后的 上清液分离培养物。可选地,病毒样本是用重庆京因生物科技有限责任公司自主研 发的一次性无菌取样拭子采取的咽部粘液或从咽拭子、肺泡灌洗液刮取/蘸取的样本。
借由上述技术方案,本发明至少具有下列优点及有益效果:
(一)本发明采用直扩的RT-PCR技术手段检测新型冠状病毒。作为早期初筛工 具,对疑似、发热及密切接触者进行早期核酸筛查,降低定点医院、发热门诊、新 型冠状病毒定点PCR实验室的工作压力及操作者感染病毒的风险。
(二)即时检测,无需提纯核酸,直接加入粗样本即可反应。检测系统的反应 液中含有裂解液组分,可直接裂解咽拭子样本细胞释放RNA,直接进行RT-PCR。所 有步骤均在独立的封闭式管内同时进行,无需专业核酸提取设备和专业测试人员。
(三)解决了传统RNA核酸病毒检测耗时长的问题。本试剂盒除取样外,所有 步骤一体化,只需100分钟左右即可得检测结果。
(四)检测探针采用了双猝灭技术,能大幅度降低检测试剂的背景信号,从而 大大增加了PCR反应的荧光强度。提高了探针的特异性和灵敏度,检测准确率达 99.9%以上。
(五)病毒核酸扩增体系中使用的Tth酶体系中含有UNG酶,大大降低了假阳性 结果的发生率。
附图说明
图1为本发明取样操作流程图;按照从a~d的顺序进行取样。
图2为本发明实施例1中以高浓度质粒为模板,两种试剂基底增量对比柱状图。 其中,**表示差异极显著(P≤0.01)。
图3为本发明实施例5中COVID-19 1ab基因反应液测试呈现阴性结果的扩增曲线图。
图4为本发明实施例5中COVID-19 1ab基因反应液测试呈现阳性结果的扩增曲线图。
图5为本发明实施例5中COVID-19N基因反应液测试呈现阴性结果的扩增曲线图。
图6为本发明实施例5中COVID-19N基因反应液测试呈现阳性结果的扩增曲线图。
具体实施方式
本发明提供一种基于POCT模式的新型冠状病毒COVID-19快速检测试剂盒及检 测方法。
本发明取样采用的工具是重庆京因生物科技有限责任公司自主研发的一次性无菌取样拭子,其采集端头与试剂管塞完全相同,保证了扩增过程中的密封性,且加 样操作方便快捷。
本发明试剂盒在反应体系中加入了细胞裂解液,可直接裂解细胞并释放出核酸,将样本核酸提取与RT-PCR反应在同一支试剂管里一步闭管完成。
本发明试剂盒在检测过程的操作上便捷新颖,只需加样上机,真正实现一步化(图1),100分钟即可出检测报告,解决了急诊患者治疗紧迫的问题。
本发明还配套了智能分析程序,可自动分析检测数据,即刻输出测试结果报告。
1、本发明试剂盒包含以下成分:
阳性质控品包括COVID-19ORF 1ab基因假病毒、COVID-19ORF N基因假病毒, 购自厦门致善生物科技股份有限公司;内参质粒为自行构建。构建方法是先在NCBI 上查找内参基因序列(GAPDH),然后在基因序列上找到引物序列的位置,截取一 段包含引物序列的基因序列,由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
2、PCR体系各成分及作用:
dNTPs:由四种脱氧核苷酸(包含dATP、dGTP、dCTP和dUTP)以相同比例混合而 成,是RNA反转录和DNA复制的原料;
引物:用于引导RNA反转录和DNA复制的起始序列;
RT-PCR反应缓冲液:为RNA反转录酶和DNA聚合酶提供合适的酶催化反应环 境,有助于酶的稳定;
Tth酶:用于单酶一步法RT-PCR,以RNA为模板,催化dNTPs聚合到引物3′端,沿 5’端到3’端方向合成cDNA,再以cDNA为模板,催化dNTPs聚合到引物3′端,沿5’ 端到3’端方向复制延伸;
3、PCR反应系统中各组分终浓度范围:
COVID-19 1ab基因反应液:
COVID-19N基因反应液:
其中,裂解液的成分为:十二烷基硫酸钠0.005%(w/v)、聚乙二醇辛基苯基醚0.01%(w/v)和 Tris-HCl 30mM。
引物和探针序列如下:
4、检测方法:
4.1取样前准备
1)采样者必须按要求至少穿2-3层一次性防护服、戴两层医用无菌手套和N95口罩,护目镜等,做好自身防护工作。
2)受检人半小时内不吃食物、不喝酒水饮料、不吸烟。
3)取样前深咳2-3次。
4)填写受检人基因检测信息表。
4.2取样与加样
取样工具为本公司自主研发的一次性无菌取样拭子。具体采样过程(图1):
1)被采样人员先用生理盐水漱口,被采集人员头部微仰,嘴张大,并发“啊”音, 露出两侧咽扁桃体,将拭子越过舌根,在被采集者两侧咽扁桃体轻轻来回擦拭至少3 次,然后再在咽后壁上下擦拭至少3次,取样完成后进行拭子样本灭活;
2)从试剂盒中取出反应液,拔掉试剂塞;
3)取下拭子端盖,该过程中注意勿接触取样端;
4)将取样端插入反应液中,按压使其与试剂管密封,避光暂存;
5)加样完成的试剂应尽快上机检测。
6)根据测试结果进行报告出具。
4.3上机
1)注意试剂上机顺序与登记信息一致。
2)试剂上机完成将盖板盖严。
3)按说明书提供反应程序运行设备。
RT-PCR反应程序:
4.4检测报告出具
4.4.1信息录入:
操作员登录到PCR分析软件,按界面指示正确录入病人信息。
4.4.2数据导入:
1)先在PCR检测设备上拷贝数据(选项→数据拷贝→选择数据→拷贝)
2)每一个检测数据文件夹中有50个循环图,任点击一个循环图自动运行
4.4.3报告导出:
数据导入后在病人列表选择病人、点分析数据可自动分析出结果。
4.4.4报告打印:
点击报告预览选项即可打印报告
4.5报告解读
按下表所述对报告进行解读:
两个基因检测全为阳性则认为阳性,全为阴性则认为阴性;任一基因显示内参 异常或者检测异常,则需要重新加样检测。结果显示如下:
注:G表示绿色(基因)通道,R表示红色(内参)通道;“ˉ”表示该通道无明显扩增曲线;“X”、“XX” 表示需要重新加样检测。
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,实施例均按照常规实验条件,如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001),或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1COVID-19 1ab基因检测探针双猝灭修饰后性能验证
COVID-19 1ab基因检测探针序列大小为28nt,初次测试结果显示,该探针初始 荧光信号高,造成背景信号高,信噪比低。经分析,这种情况应为探针序列较长引 起。故对该探针进行了双猝灭修饰,经测试,修饰后的探针初始荧光信号明显降低, 信噪比增高,试剂的灵敏度也得到大大提高。本实施例对双猝灭修饰Taqman探针和 未经双猝灭修饰的相同序列Taqman探针分别进行试剂配制,然后进行了对比测试。
具体操作如下:
向两个不同修饰探针所配制的试剂中,分别加入5uL高低两个浓度的COVID-191ab基因质粒作为模板(高浓度:105copies/mL;低浓度:1000copies/mL),每个浓 度重复4次。配方见表1-1,反应程序见表1-2。
表1-1 1ab基因反应液配方表
组分 | 终浓度 |
dH<sub>2</sub>O | - |
COVID-19 1ab基因上游引物 | 0.7μM |
COVID-19 1ab基因下游引物 | 0.7μM |
COVID-19 1ab基因探针 | 0.3μM |
Tth酶体系 | 1× |
RNA酶抑制剂 | 0.3U/μl |
表1-2 1ab基因反应液测试程序
实验结果显示,未经双猝灭修饰的探针在检测低浓度质粒时未出扩增曲线;在 检测高浓度质粒时,双猝灭探针配制试剂的初始荧光值极显著低于未经双猝灭修饰 探针配制试剂(P≤0.01),双猝灭探针配制试剂的荧光增量极显著高于未修饰探针配 制试剂的增量(P≤0.01),表明双猝灭探针有效的降低了试剂的基底,从而提高了荧 光增量及试剂灵敏度。当添加高浓度质粒后,两种试剂基底增量对比柱状图见图2。 实施例2裂解液各成分浓度优化及裂解性能测试
目前国家药品监督管理局已批准的用于检测新型冠状病毒核酸的试剂盒均需加入提纯后的RNA,该步骤必须在专业实验室使用专业的仪器设备进行,通过繁琐的 操作流程将病毒的RNA提取纯化,再加入试剂中进行RT-PCR反应,耗时耗力,且极 大程度的增加了操作人员感染新型冠状病毒的风险。为了克服上述不足,我们尝试 进行病毒核酸免提取,直接加样进行RT-PCR反应的试剂开发。考虑到直接加入咽部 样品后,RT-PCR反应会受到干扰或抑制,细胞裂解不充分,病毒核酸难以释放等影 响扩增效果的因素,我们尝试在RT-PCR反应液中加入一定浓度的自制细胞裂解液, 并进行了加与不加细胞裂解液的对比实验。操作如下:
考虑到临床样本获得的困难性及易传染性,先将5μL浓度为103copies/mL假病毒加入反应液,再将一次性无菌取样拭子沾取咽部粘液后加入反应液,以此来模拟临 床样本测试。
1、细胞裂解液的配制:配制1000μL的细胞裂解液,各成分及其终浓度如表2-1~表2-3所示,十二烷基硫酸钠(SDS)、聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)均购自上 海普洛麦格生物制品有限公司,初始浓度分别为0.1g/ml、1.0655g/ml;Tris-HCl缓冲 液(pH8.0)购自北京索莱宝科技有限公司,初始浓度为1M。
表2-1裂解液各成分浓度配比1
表2-2裂解液各成分浓度配比2
表2-3裂解液各成分浓度配比3
表2-1~表2-3中,裂解液各组分各配比均为在PCR反应体系中的最终浓度,由于此浓度非常小,配制少量此浓度裂解液加样时误差会增大,因此为了使配制的裂解 液浓度准确,使体系中各组分浓度扩大,假定上述配比下配制的裂解液最终浓度为1 倍(1×),则将浓度扩大到20倍(20×)配制。
2、以1ab基因为例,在1ab反应体系中分别加入上述12个配比配制的1×的裂解液,同时设置一组不加裂解液配制的反应体系作为对照,考察添加与不加裂解液对体系 测试结果的影响,若有显著影响,选择出裂解液各组分的最佳浓度。
以103copies/mL假病毒为模板,每个2体系重复3支。
1ab基因反应液配方见表2-4,反应程序按照Tth酶说明书推荐程序,具体见表2-5。
表2-4 1ab基因反应液配方表
组分 | 实验组 | 对照组 |
dH<sub>2</sub>O | - | - |
COVID-191ab基因上游引物 | 0.7μM | 0.7μM |
COVID-191ab基因下游引物 | 0.7μM | 0.7μM |
COVID-191ab基因探针 | 0.3μM | 0.3μM |
Tth酶体系 | 1× | 1× |
RNA酶抑制剂 | 0.3U/μl | 0.3U/μl |
裂解液 | 1× | - |
注:实验组中裂解液包括上述12种配比配制的裂解液。
表2-5RT-PCR反应程序
实验结果显示,当体系中加入上述12种配比的裂解液后,103copies/mL的假病毒均有扩增曲线;若体系中不加裂解液时,结果均检测失败,通过上述12种裂解液各 组分配比配制试剂测试结果发现,当体系中加入配比6配制的裂解液后,扩增一致性 最好,Ct最小,Ct均值为38.0左右。故确定裂解液各组分浓度为配比6所示。
通过向反应体系中添加裂解液,可有效提高检测结果的灵敏度。加入细胞裂解 液后,细胞被裂解并释放病毒RNA的能力大大增加,同时降低了咽部样品的杂质和 裂解物对RT-PCR体系的干扰。细胞裂解液的添加,一定程度上证明了直扩的可能性。
实施例3反应程序的优化
考虑到新型冠状病毒有包膜包裹,且包膜上存在棘突,再加上部分新型冠状病 毒存在于细胞内,因此要释放出病毒RNA必须同时裂解细胞膜和病毒包膜,因此, 裂解对新型冠状病毒的检测尤为重要,为使包膜充分裂解,在体系中加入细胞裂解 液的同时,尝试优化反应程序,进一步提高包膜的裂解效率。
延长有利于新型冠状病毒裂解并释放RNA的程序时间(即程序中蛋白质变性的 时间),以Tth酶说明书推荐反应程序为基础,以N基因为例,向每支反应液中加入5uL 浓度103copies/mL的假病毒,每个反应程序重复3支测试。反应结束后,比较不同裂 解时长下的反应Ct值,选择出较优的裂解时长。试剂配方见表3-1,反应程序优化见 表3-2。
表3-1 N基因反应液配方表
组分 | 浓度一 |
dH<sub>2</sub>O | - |
COVID-19N基因上游引 | 0.7μM |
COVID-19N基因下游引 | 0.7μM |
COVID-19N基因探针 | 0.3μM |
Tth酶体系 | 1× |
RNA酶抑制剂 | 0.3U/μl |
裂解液 | 1× |
表3-2反应程序
试验结果见表3-3。
表3-3 1ab基因反应液在四种反应程序下Ct统计表
重复1 | 重复2 | 重复3 | Mean±SD | |
时间1 | 38.4 | 38.5 | 38.3 | 38.4±0.10 |
时间2 | 37.9 | 37.9 | 38.0 | 37.9±0.06 |
时间3 | 38.1 | 37.9 | 38.0 | 38.0±0.1 |
时间4 | 38.6 | 38.4 | 38.8 | 38.6±0.2 |
实验结果显示,时间2和时间3的Ct值相对较小,且两者差异不明显,说明时间2和时 间3使裂解液充分发挥了作用,同时没有破坏Tth酶的活性。考虑到真实的阳性样本中的病毒裂解相对于假病毒更困难,故将该步时间最终确定为3min。时间1的Ct大的原因可能是蛋白质变性时间过短,在该过程中,裂解液没有完全发挥作用。时间4的Ct大的原因可 能是高温时间过久,引起了Tth酶的部分失活。以上结果表明,优化了反应程序后,确实 进一步提高了细胞的裂解效率,进一步确定用直扩体系检测新型冠状病毒的可行性。
实施例4反应体系各组分浓度的优化
1、病毒基因引物浓度的优化
根据Tth酶说明书推荐体系组分配比,对内参基因单独测试,当内参基因上游引物和下游引物在体系中的终浓度为0.3μM,探针浓度为0.2μM时,内参基因扩增曲线能达 到检测标准,故将体系中内参引物探针的浓度确定为上述浓度。后期重点优化病毒基 因引物探针浓度,主要优化方向是将病毒基因扩增信号最大化,将Ct最小化,故将探 针浓度直接确定为Tth酶说明书中推荐的最大探针浓度,即为0.3μm,在此基础上调整 检测病毒基因的引物浓度,比较不同测试的Ct值和增量的变化,选择出最佳的引物浓 度。考虑到该试剂盒为直扩试剂盒,故该实施例测试中,除了向反应液中加入5μL浓 度为104copies/mL的假病毒外,还加入了一次性口腔拭子沾取的咽部粘液。
1ab基因及N基因引物浓度梯度设置见表4-1、表4-2,反应程序见表4-3:
表4-1 1ab基因引物浓度梯度设置表
组分 | 优化一 | 优化二 | 优化三 |
水 | - | - | - |
内参(GAPDH)基因上游引物 | 0.3μM | 0.3μM | 0.3μM |
内参(GAPDH)基因下游引物 | 0.3μM | 0.3μM | 0.3μM |
内参(GAPDH)基因探针 | 0.2μM | 0.2μM | 0.2μM |
COVID-191ab基因上游引物 | 0.5μM | 0.7μM | 1.0μM |
COVID-191ab基因下游引物 | 0.5μM | 0.7μM | 1.0μM |
COVID-191ab基因探针 | 0.3μM | 0.3μM | 0.3μM |
Tth酶体系 | 1.0× | 1.0× | 1.0× |
裂解液 | 1× | 1× | 1× |
RNA酶抑制剂 | 0.3U/μl | 0.3U/μl | 0.3U/μl |
表4-2 N基因引物浓度梯度设置表
表4-3 1ab基因和N基因RT-PCR反应程序
试验结果见表4-4。
表4-4 1ab基因和N基因三种引物浓度Ct值统计表
考虑到用一次性无菌取样拭子沾取的咽部粘液中细胞个数及咽部粘液杂质数量有一 定的波动性,会引起内参Ct的波动,故在对比分析时,重点分析了病毒基因三种浓度的 Ct值。实验结果表明,1ab基因和N基因的引物浓度为0.7μM:0.7μM时,病毒基因Ct均最小。当引物浓度为0.5μM:0.5μM配制试剂的Ct值大于引物浓度为0.7μM:0.7μM配制的试 剂,可能原因是引物过少,引起试剂扩增效率低;引物浓度为1.0μM:1.0μM配制试剂的 Ct大于引物浓度为0.7μM:0.7μM配制的试剂,可能原因是引物过多,产生更多的二聚体 导致扩增效率变低。因此最终确定两种病毒基因的上下游引物浓度均为0.7μM。
2、酶体系的优化
确定体系中引物探针浓度配比后,对体系中酶的加入量进行优化,查看对试验 结果有无有意影响。1ab基因及N基因酶体系浓度梯度设置见表4-5、表4-6,反应程序 见表4-3,样本同引物优化所用样本。
表4-5 1ab基因酶浓度梯度设置表
组分 | 优化一 | 优化二 | 优化三 |
水 | - | - | - |
内参(GAPDH)基因上游引物 | 0.3μM | 0.3μM | 0.3μM |
内参(GAPDH)基因下游引物 | 0.3μM | 0.3μM | 0.3μM |
内参(GAPDH)基因探针 | 0.2μM | 0.2μM | 0.2μM |
COVID-191ab基因上游引物 | 0.7μM | 0.7μM | 0.7μM |
COVID-191ab基因下游引物 | 0.7μM | 0.7μM | 0.7μM |
COVID-191ab基因探针 | 0.3μM | 0.3μM | 0.3μM |
Tth酶体系 | 1.0× | 1.2× | 1.4× |
裂解液 | 1× | 1× | 1× |
RNA酶抑制剂 | 0.3U/μl | 0.3U/μl | 0.3U/μl |
表4-6 N基因酶浓度梯度设置表
组分 | 优化一 | 优化二 | 优化三 |
水 | - | - | - |
内参(GAPDH)基因上游引物 | 0.3μM | 0.3μM | 0.3μM |
内参(GAPDH)基因下游引物 | 0.3μM | 0.3μM | 0.3μM |
内参(GAPDH)基因探针 | 0.2μM | 0.2μM | 0.2μM |
COVID-19N基因上游引物 | 0.7μM | 0.7μM | 0.7μM |
COVID-19N基因下游引物 | 0.7μM | 0.7μM | 0.7μM |
COVID-19N基因探针 | 0.3μM | 0.3μM | 0.3μM |
Tth酶体系 | 1.0× | 1.2× | 1.4× |
裂解液 | 1× | 1× | 1× |
RNA酶抑制剂 | 0.3U/μl | 0.3U/μl | 0.3U/μl |
试验结果见表4-7。
表4-7 1ab基因和N基因三种酶浓度Ct值统计表
考虑到用一次性无菌取样拭子沾取的咽部粘液中细胞个数及咽部粘液杂质数量有一定的波动性,会引起内参Ct的波动,故在对结果比较分析时,重点分析了病毒 基因三种浓度的Ct值。通过实验结果发现,1ab基因的酶体系浓度为1.2×时,病毒基 因Ct均值和标准差均最小;N基因的酶体系浓度为1×和1.2×的Ct均值相较于酶体系 浓度为1.4×的体系Ct均值更小,但当酶体系浓度为1.2×时,标准差更小。因此推断 当酶体系浓度为1.2×时,两个基因反应液体系最优。因此,最终确定1ab基因和N基 因酶体系终浓度均为1.2×。
最终确定N基因反应液和1ab基因反应液的直扩体系配方见表4-8、表4-9:
表4-8 N基因反应液配方表
组分 | 终浓度 |
水 | - |
内参(GAPDH)基因上游引物 | 0.3μM |
内参(GAPDH)基因下游引物 | 0.3μM |
内参(GAPDH)基因探针 | 0.2μM |
COVID-19N基因上游引物 | 0.7μM |
COVID-19N基因下游引物 | 0.7μM |
COVID-19N基因探针 | 0.3μM |
Tth酶体系 | 1.2× |
裂解液 | 1× |
RNA酶抑制剂 | 0.3U/μl |
表4-9 1ab基因反应液配方表
组分 | 终浓度 |
水 | - |
内参(GAPDH)基因上游引物 | 0.3μM |
内参(GAPDH)基因下游引物 | 0.3μM |
内参(GAPDH)基因探针 | 0.2μM |
COVID-191ab基因上游引物 | 0.7μM |
COVID-191ab基因下游引物 | 0.7μM |
COVID-191ab基因探针 | 0.3μM |
Tth酶体系 | 1.2× |
裂解液 | 1× |
RNA酶抑制剂 | 0.3U/μl |
实施例5特异性测试
为了验证COVID-191ab基因和COVID-19N基因引物探针的特异性,通过NCBI软 件查找并分别合成了与COVID-191ab基因和COVID-19N基因同源性最高的一组序 列,来验证该试剂盒的检测特异性。其中COVID-191ab基因选择的同源序列来自于 蝙蝠冠状病毒,相似性为92%;COVID-19N基因选择的同源序列来自于蝙蝠SARS 病毒,相似性为92%。
实验设计:将两种合成的同源序列质粒分别稀释到106copies/mL,分别加入COVID-19 1ab基因测试反应液和COVID-19N基因测试反应液中,每个反应5ul,各 重复6支,同时加入阳性对照和空白。
结果显示,加入同源序列后,COVID-19 1ab基因反应液和COVID-19N基因反应 液均测试失败,阳性样本检测结果正确,空白试剂无扩增。说明COVID-19 1ab基因 和COVID-19N基因引物探针特异性良好。
图3为COVID-19 1ab基因反应液测试呈现阴性结果的扩增曲线图。
图4为COVID-19 1ab基因反应液测试呈现阳性结果的扩增曲线图。
图5为COVID-19N基因反应液测试呈现阴性结果的扩增曲线图。
图6为COVID-19N基因反应液测试呈现阳性结果的扩增曲线图。
实施例6灵敏度测试
考虑到不同患病人群病毒感染程度不同,因此需要对新型冠状病毒COVID-19核酸检测试剂盒进行灵敏度测试。考虑到假病毒相比于质粒与真实的新型冠状病毒结 构更接近,故在进行灵敏度测试时,以不同浓度的假病毒和一次性无菌取样拭子取 到的咽部粘液共同作为模板分别对COVID-19 1ab基因和COVID-19N基因进行测试。 两种基因设置假病毒浓度均分别为:105copies/mL、104copies/mL、103copies/mL、 500copies/mL。每个浓度每种试剂重复3支,实验结果见表6-1。
表6-1新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒灵敏度初测正确数统计
结果显示,当以模板浓度为105copies/mL、104copies/mL、103copies/mL时,两个位点测试试剂均检测正确,当以模板浓度为500copies/mL时,COVID-19 1ab基因3个 试剂有2个试剂测试失败,COVID-19N基因3个试剂有1个试剂测试失败。说明该试 剂盒对500copies/mL的假病毒检测能力差,故暂定该试剂盒的最低检测限为103 copies/mL。因初次检测数过少,怀疑未能真实的反应最低检测限,故对103copies/mL、500copies/mL的假病毒分别进行了10次重复测试。结果见表6-2。
表6-2新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒灵敏度复测正确率统计
通过新型冠状病毒COVID-19核酸检测试剂盒灵敏度复测结果可看出, COVID-191ab基因和COVID-19N基因以假病毒浓度为500copies/mL为模板时,均有 检测失败数据产生,以假病毒浓度为103copies/mL为模板时,结果均正确。
因此,本发明的新型冠状病毒检测试剂盒在符合检测准确率标准的前提下,确 定COVID-19 1ab基因和COVID-19N基因测试假病毒的最低检测限均为 103copies/mL。
实施例7抗干扰测试
根据《2019新型冠状病毒核酸检测试剂注册技术审评要点》,针对可能存在的干扰情况进行验证。特选择了该审评要点提出的可供选择的三种给药方式的药物,分 别是鼻腔喷剂盐酸羟甲唑啉喷雾剂、口腔吸入粉物剂扎那米韦吸入粉雾剂及服用药 物磷酸奥司他韦胶囊。三个被测人分别按药品说明书上推荐剂量和使用方法使用三 种药物,使用完之后立即用一次性无菌使用拭子沾取咽部粘液,每个人取样4支,共 12支。分别配制COVID-191ab基因测试反应液和COVID-19N基因测试反应液各20 支,两种基因测试反应液按以下加样方式重复2次:
孔位 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
样本 | 1+a | 1+a | 2+a | 2+a | 3+a | 3+a | 4+a | 4+a | 空白 | 空白 |
注:样本中的“1”代表使用了盐酸羟甲唑啉喷雾剂的咽部粘液样本;“2”代表使用了扎那米 韦吸入粉雾剂的咽部粘液样本;“3”代表使用了磷酸奥司他韦胶囊的咽部粘液样本;“4”代表未 使用任何药物的咽部粘液样本;“a”代表103copies/mL的假病毒。
结果显示使用了这3种药物后,两种基因反应液测试结果均正确,与未使用任何药物的咽部粘液样本测试结果比较差异不明显,说明该试剂盒抗干扰能力较优。
实施例8重复性测试
为了考察本方法对同一样本测试结果的分散性,用一次性无菌取样拭子沾取同一个人的咽部粘液,同时分别加入低浓度(2×103copies/mL)和高浓度(104 copies/mL)的假病毒,每种基因每种样本重复10次,查看该发明检测相同样本一致 性情况。具体实验分组见表8-1。
表8-1重复性测试实验分组表
实验分组 | 样本 | 重复次数 |
实验组1 | 1ab基因假病毒(2×10<sup>3</sup>Copies/mL)+咽部粘液 | 10 |
实验组2 | 1ab基因假病毒(10<sup>4</sup>Copies/mL)+咽部粘液 | 10 |
实验组3 | N基因假病毒(2×10<sup>3</sup>Copies/mL)+咽部粘液 | 10 |
实验组4 | N基因假病毒(10<sup>4</sup>Copies/mL)+咽部粘液 | 10 |
实验结果见表8-2、表8-3。
表8-2各实验组10次重复Ct值统计表
表8-3各实验组Ct均值、标准差、CV值统计
实验分组 | Mean | SD | CV |
组1 | 38.7 | 0.63 | 1.6% |
组2 | 35.5 | 0.24 | 0.7% |
组3 | 38.1 | 0.61 | 1.6% |
组4 | 35.6 | 0.41 | 1.2% |
结果显示,当1ab基因反应液和N基因反应液中加入低浓度的假病毒时,离散系 数(CV值)相较于体系中加入高浓度的假病毒测试的离散系数(CV值)大,分析可 能原因是该浓度接近试剂的最低检测限,模板量过少,引物结合到模板上的数量波 动性较大,从而引起试剂扩增结果的波动。但总体来看,两个浓度下,两种试剂的 CV值都小于2%,说明该试剂盒检测同一模板时,重复性好。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但 在本发明基础上,可以对之做一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易 见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明 要求保护的范围。
序列表
<110> 首都医科大学附属北京天坛医院 重庆市公共卫生医疗救治中心 重庆京因生物科技有限责任公司
<120> 基于POCT模式的新型冠状病毒COVID-19快速检测试剂盒
<130> KHP201111502.3
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgaccctgtg ggttttacac ttaa 24
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gattgtgcat cagctgactg aag 23
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccgtctgcgg tatgtggaaa ggttatgg 28
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggggaacttc tcctgctaga at 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cagacatttt gctctcaagc tg 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttgctgctgc ttgacagatt 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggacctgacc tgccgtctag 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtagcccagg atgcccttga 20
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cctccgacgc ctgcttcacc acct 24
Claims (10)
1.新型冠状病毒COVID-19检测引物,其特征在于,包括COVID-19 1ab基因检测引物和COVID-19N基因检测引物;COVID-19 1ab基因检测引物包括如SEQ ID NO:1所示的上游引物和序列如SEQ ID NO:2所示的下游引物,COVID-19N基因检测引物包括如SEQ ID NO:4所示的上游引物和序列如SEQ ID NO:5所示的下游引物。
2.与权利要求1所述引物配套使用的探针,其特征在于,与COVID-19 1ab基因检测引物配套使用的探针序列如SEQ ID NO:3所示,与COVID-19N基因检测引物配套使用的探针序列如SEQ ID NO:6所示,SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:6所示探针的5′端分别带有相同的荧光基团,3′端具有淬灭基团。
3.含有权利要求1所述引物和/或权利要求2所述探针的检测试剂或试剂盒。
4.基于POCT模式的新型冠状病毒COVID-19快速检测试剂盒,其特征在于,包括权利要求1所述引物和权利要求2所述探针。
5.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包含内参基因GAPDH检测引物和探针,其中,GAPDH检测引物包括序列如SEQ ID NO:7所示的上游引物和序列如SEQID NO:8所示的下游引物;GAPDH检测探针的序列如SEQ ID NO:9所示,探针的5′端具有荧光基团,3′端具有淬灭基团,且该荧光基团不同于权利要求2所述探针中使用的荧光基团。
6.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,SEQ ID NO:3所示探针的5′端荧光基团为FAM,SEQ ID NO:3所示探针的3′端淬灭基团为BHQ1;和/或
SEQ ID NO:6所示探针的5′端荧光基团为FAM,SEQ ID NO:6所示探针的3′端淬灭基团为BHQ1;和/或
SEQ ID NO:9所示探针的5′端荧光基团为Texas Red,SEQ ID NO:9所示探针的3′端淬灭基团为BHQ2。
7.根据权利要求4-6任一项所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括裂解液、Tth酶体系、RNA酶抑制剂、标准阳性模板中的至少一种;
其中,裂解液的成分为:十二烷基硫酸钠0.005%w/v、聚乙二醇辛基苯基醚0.01%w/v和Tris-HCl 30mM。
8.用于检测新型冠状病毒COVID-19的qPCR反应体系,其特征在于,包括用于检测COVID-19 1ab基因的qPCR反应体系以及用于检测COVID-19N基因的qPCR反应体系;
用于检测COVID-19 1ab基因的qPCR反应体系包含:1.2×Tth酶体系,0.3U/μl RNA酶抑制剂,SEQ ID NO:1所示的上游引物、SEQ ID NO:2所示的下游引物各0.7μM,SEQ ID NO:7所示的上游引物、SEQ ID NO:8所示的下游引物各0.3μM,SEQ ID NO:3所示的探针0.3μM,SEQID NO:9所示的探针0.2μM以及裂解液;所述裂解液在体系中加入的浓度为1×;
用于检测COVID-19N基因的qPCR反应体系包含:1.2×Tth酶体系,0.3U/μl RNA酶抑制剂,SEQ ID NO:4所示的上游引物、SEQ ID NO:5所示的下游引物各0.7μM,SEQ ID NO:7所示的上游引物、SEQ ID NO:8所示的下游引物各0.3μM,SEQ ID NO:6所示的探针0.3μM,SEQ IDNO:9所示的探针0.2μM以及裂解液;所述裂解液在体系中加入的浓度为1×;
其中,所述裂解液使用权利要求7中所述的裂解液。
9.非诊断目的基于POCT模式的新型冠状病毒COVID-19快速检测方法,其特征在于,所述方法包括:将采集的病毒样本分成两份,一份加入到用于检测COVID-191ab基因的qPCR反应体系中,另一份加入到用于检测COVID-19N基因的qPCR反应体系中,将配制好的反应液分别置于PCR仪中运行以下程序进行裂解反应和RT-PCR扩增,扩增结束后,分析扩增产物;其中,用于检测COVID-19 1ab基因的qPCR反应体系以及用于检测COVID-19N基因的qPCR反应体系同权利要求8中所述;
裂解反应和RT-PCR扩增的程序为:50℃2min;90℃3min;60℃15min;95℃1min;95℃15sec,55℃35sec,50个循环。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,所述病毒样本来自咽拭子、鼻腔拭子、肺泡灌洗液。
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---|---|---|---|---|
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Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109251973A (zh) * | 2018-02-14 | 2019-01-22 | 重庆京因生物科技有限责任公司 | 基于poct模式的hla-b*5801基因型快速检测试剂盒 |
CN110982943A (zh) * | 2020-03-03 | 2020-04-10 | 中山大学达安基因股份有限公司 | 一种新型冠状病毒rt-pcr检测方法及试剂盒 |
CN111020064A (zh) * | 2020-03-10 | 2020-04-17 | 中山大学达安基因股份有限公司 | 新型冠状病毒ORF1ab基因核酸检测试剂盒 |
-
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Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109251973A (zh) * | 2018-02-14 | 2019-01-22 | 重庆京因生物科技有限责任公司 | 基于poct模式的hla-b*5801基因型快速检测试剂盒 |
CN110982943A (zh) * | 2020-03-03 | 2020-04-10 | 中山大学达安基因股份有限公司 | 一种新型冠状病毒rt-pcr检测方法及试剂盒 |
CN111020064A (zh) * | 2020-03-10 | 2020-04-17 | 中山大学达安基因股份有限公司 | 新型冠状病毒ORF1ab基因核酸检测试剂盒 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
病毒病所: "新型冠状病毒核酸检测引物和探针序列", Retrieved from the Internet <URL:https://ivdc.chinacdc.cn/kyjz/202001/t20200121_211337.html> * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114908149A (zh) * | 2022-05-31 | 2022-08-16 | 因顿健康科技(苏州)有限公司 | 一种无需进行核酸提取的快速基因检测方法 |
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