MX2011002290A - Promotores obtenidos de insecto para expresion de proteinas heterologas en celulas de inseto. - Google Patents
Promotores obtenidos de insecto para expresion de proteinas heterologas en celulas de inseto.Info
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Abstract
Promotores obtenidos de insecto para expresión de proteínas heterólogas en células de insecto. Secuencias polinucleotídicas reguladoras que impulsan la expresión de las principales proteínas de insecto (hexamerinas) durante las fases de evolución específicas de las larvas, han sido aisladas, en la presente invención, a partir de insectos (Trichoplusia ni). Dichas secuencias polinucleotídicas reguladoras promueven una expresión más fuerte de genes heterólogos en el sistema de baculovirus que el promotor de polihedrina convencional. Adicionalmente, la combinación de los nuevos promotores de la invención, obtenidos de larvas, con el promotor pL aumentó los niveles de expresión de baculovirus hasta 61%-375% (dependiendo del tiempo de infección) con respecto a los baculoviurs convencionales usados en la industria de la biotecnología. El promotor p32 también impulsa la expresión génica en momentos más tempranos que el promotor de polihedrina, siendo esta característica una enorme ventaja para el correcto plegamiento de proteína y la modificación post-traduccional.
Description
PROMOTORES OBTENIDOS DE INSECTO PARA EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS HETERÓLOGAS EN CÉLULAS DE INSECTO
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se puede incluir en el campo de la biotecnología. La invención se refiere a secuencias polinucleotídicas reguladoras (tales como promotores) obtenidas de genes de la familia de las hexamerinas en insectos y su uso para la expresión de proteínas heterólogas en células de insecto y larvas de insecto, por ejemplo usando el vector de expresión de baculovirus .
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El sistema de expresión de baculovirus-células de insecto es versátil y se usa ampliamente para producir proteínas heterólogas (tanto nativas como recombinantes ) . Éste sistema se reconoce universalmente como uno de los más potentes y versátiles para producir proteína recombinante de cualquier tamaño. Se basa en dos características .principales : los niveles elevados de expresión de proteína conseguidos y el plegamiento correcto de las proteínas que se tienen que volver bioactivas, a la vez que ocurren modificaciones post-traduccionales importantes de células de mamífero. Adicionalmente, los tiempos de desarrollo de este sistema son más cortos y la estabilidad genética del virus recombinante es , muy elevada. El genoma de baculovirus contiene dos promotores de expresión fuerte denominados promotor de polihedrina (pL) , que es el promotor de expresión más fuerte conocido entre los organismos superiores y el promotor plO (proteína plO) . El promotor pL se puede usar para controlar la expresión de prácticamente cualquier gen. Es mucho más rápido y menos costoso modificar con ingeniería genética un baculovirus para la producción de proteínas que cualquier otro sistema de producción avanzado basado en células animales transformadas o animales transgénicos . Sin embargo, los promotores anteriores disponibles en el mercado tienen algunas desventajas, tales como la fase muy tardía en la que los mismos promueven la expresión génica. Para ese momento la maquinaria celular está afectada enormemente y entonces los rendimientos de proteínas heterólogas expresadas en células de insectos se pueden ver per udicados, debido al procesamiento incompleto y agregación. Estas limitaciones se pueden deber al deterioro de los factores de células hospedadoras a medida que avanza la infección viral . Para solucionar ese problema la presente invención sugiere el uso de promotores tempranos con expresión estable, que son al menos tan fuertes como el promotor de polihedrina, como una opción muy interesante para compensar los efectos de la degradación de la célula hospedadora y, al mismo tiempo, para conseguir niveles de expresión elevados de proteínas heterólogas . La presente invención desea llamar la atención al hecho de que la transición de la forma de larva (inmadura) a la forma adulta (madura) se consigue mediante la activación y supresión de varios genes en diversos tejidos (desarrollo metamórfico de insecto) . Entre las proteínas asociadas a metamorfosis existe una familia conocida como hexamerinas que se expresan a nivel muy elevado durante el último estadio. Estas proteínas son mayormente proteínas de almacenamiento de hemolinfa que se usan durante el desarrollo post-larval. El nivel más elevado de las hexamerinas se puede observar durante las primeras 48 horas del quinto estadio aproximadamente a cuatro veces más después de ese periodo (Figura 1) . Se ha desarrollado una familia de promotores a usar para la expresión de proteínas heterólogas, que se origina de las secuencias que codifican la familia de proteínas de larvas mencionadas anteriormente, en la presente invención. Por lo' tanto, la presente invención proporciona los promotores pBl (SEC ID N2 : 1 ) y pB2 (SEC ID Ne : 2), que son más tempranos y de expresión más fuerte en comparación con los promotores usados en el estado de la técnica. Los promotores que pueden activar la expresión de proteínas de insecto importantes en fases de evolución de larva específicas se han aislado en la presente invención. Los mismos se originan de la secuencia que codifica las proteínas hexamerinas en larvas y se pueden usar para construir cualquier vector de expresión (tales como vectores de expresión de baculovirus) a fin de expresar proteínas heterólogas en varias células de insecto, preferiblemente células sf9 o sf21 de Spodoptera frugiperda. Ya se han caracterizado secuencias reguladoras similares a las que constituyen estos nuevos promotores en larvas de lepidópteras , pero nunca se han usado antes en el sistema de expresión de baculovirus.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Breve descripción de la invención
Por tanto, la presente invención proporciona secuencias poliriucleotídicas reguladoras, tales como pBl (SEC ID Ns : 1) y/o pB2 (SEC- ID Ne : 2), que se originan a partir de las secuencias que regulan la expresión del gen de la familia de las hexamerinas. Estas proteínas muestran la expresión más elevada durante el quinto estadio, a un porcentaje muy elevado después de las primeras 48 horas de este período de desarrollo de larva, presentando una acumulación muy rápida en un periodo de tiempo corto (Figura 1) . Estas características sugieren que la expresión de estas proteínas está activada por promotores de expresión fuerte que- se podrían usar para generar baculovirus más eficaces o cualquiera de otros vectores de expresión y, por lo tanto, para optimizar la expresión de proteínas heterólogas. En el caso de los sistemas de expresión de baculovirus, una actividad más temprana del promotor es especialmente relevante en el caso de proteínas focalizadas en rutas de secreción, que de otra manera se influirían por los cambios tanto en la maquinaria post-traduccional celular como en la ruta secretora en fases muy tardías de la infección por baculovirus .
Las secuencias de los promotores de la invención se originan de las. secuencias que regulan la expresión de genes de la familia de las hexamerinas (BJHSPl y BJHSP2) , pero que tienen algunas mutaciones que no están comprendidas en las secuencias de nucleótidos reguladoras originales de dichos genes de la familia de las hexamerinas . Dichas hexamerinas se aislaron a partir de larvas de Trichoplusia ni (T. ni) e identificaron en una banda de 80 KDa mediante análisis de espectrometría de masas (Figura 2) . Una vez que las proteínas se identificaron, los genes que codificaban las mismas se aislaron así como las secuencias cadena arriba que contienen sus promotores respectivos . Los cebadores usados para amplificar cada promotor original se especifican en esta patente. Los cebadores caracterizados por las SEC ID N9 : 3 y 4 se usaron para amplificar el promotor original que finalmente deriva en el promotor pBl (SEC ID Ne : 1) . Los cebadores caracterizados por las SEC ID N2 : 5 y 6 se usaron para amplificar el promotor original que finalmente deriva en el promotor pB2.
La ventaja principal de los promotores de la presente invención, específicamente pB2 , es que los mismos producen una expresión más temprana y . más fuerte de la proteína de interés en comparación con los promotores muy tardíos conocidos usados actualmente en los sistemas de expresión de baculovirus.
En una realización . preferida, la presente invención también incluye la combinación de los promotores de la invención pBl y pB2 (preferiblemente pB2) con cualquier otro promotor, por ejemplo pL o plO (preferiblemente pL) . De forma sorprendente, cuando se realizó una combinación de este tipo se consiguió un efecto sinérgico. Cuando se ensayó un vector de expresión de baculovirus que comprendía un promotor pLpB2 , los niveles de expresión de las proteínas de interés aumentaron hasta 61%-375% (dependiendo del momento de la infección) con respecto al uso del promotor pL en solitario. Esta realización es muy importante para el propósito de la presente invención debido a que el promotor pL, actualmente, se usa generalmente en la industria de la biotecnología.
En otra realización preferida, la presente invención también se refiere a la combinación del promotor de la invención (pBl y pB2 ) entre sí: pBl-pBl, pB2-pB2 y pBl-pB2.
No se detectó actividad de los promotores de la invención en células de mamífero. Entonces, la presente invención también proporciona dos promotores de seguridad para el desarrollo de baculovirus recombinantes .
Por lo tanto, la presente invención aclara (véase la descripción detallada de la invención) que se podrían obtener secuencias polinucleotídicas reguladoras (promotores) , más eficaces que las comprendidas en el estado de la técnica, a partir de cualquier secuencia polinucleotídica localizada cadena arriba de los marcos de lectura abiertos de los genes que codifican proteínas de la familia de las hexamerinas. Por lo tanto, cualquier secuencia polinucleotídica obtenida a partir de cualquier secuencia polinucleotídica localizada cadena arriba de los marcos de lectura abiertos de los genes que codifican proteínas de la familia de las hexamerinas se pueden incluir en el objeto de la presente invención.
Con el único propósito de la presente invención se definen los siguientes términos:
• Secuencia polinucleotídica reguladora: es una región de ADN localizada generalmente cadena arriba (hacia la región 5' de la cadena con sentido) de un gen que permite la transcripción del gen.
• Vector de expresión: "vehículo" usado para transferir material genético exógeno dentro de una célula. Este vector contiene las secuencias reguladoras necesarias para activar la transcripción y traducción de un gen ó genes clonados y, por tanto, transcribir y clonar ADN. Preferiblemente se usaron vectores de expresión de baculovirus en la presente invención.
• Baculovirus : es una familia de virus infecciosos para invertebrados, que infecta principalmente insectos y artrópodos .
• ADN recombinante : es una forma de ADN artificial que se modifica mediante ingeniería genética a través de la combinación o inserción de una o más cadenas de ADN, combinando de ese modo ADN que normalmente no aparecerían juntos. El ADN recombinante se produce a través de la adición de ADN pertinente en un genoma de organismo existente.
Proteínas recombinantes : proteína codificada por un ADN recombinante .
Expresión temprana: esta expresión se refiere al momento en el que los promotores comienzan a expresar las proteínas de interés. En la presente invención, este momento comienza 16 horas después de la infección.
Expresión más fuerte: esta expresión se refiere a la expresión de cualquier proteína de interés a niveles iguales o más elevados en comparación con el nivel de expresión conseguido por los promotores de baculovirus convencionales plO o pL.
Proteína de interés : proteínas que se pueden usar para el beneficio de seres humanos y animales y que pueden tener aplicación industrial, comercial o terapéutica.
Biofactoría : células u organismos modificados o no genéticamente, que pueden producir proteínas a una proporción de escala industrial con varias aplicaciones incluyendo propósitos terapéuticos (inhibidores, enzimas,, anticuerpos, antígenos, etc.) o productos primarios o secundarios de interés comercial.
• Fragmento parcial ; esta expresión se refiere a cualquier fragmento parcial obtenido a partir de las . secuencias polinucleotídicas reguladoras de la invención, que tienen las mismas propiedades mejoradas: son más tempranos y más fuertes en comparación con aquellos comprendidos en la técnica.
Descripción de las figuras
Figura 1: Muestra la ausencia de una banda de 80 kDa, que se identificará como hexamerinas más adelante, en las primeras cuatro fases de evolución de la larva de Trichoplusia ni (A) y su presencia 2 días después en el quinto estadio larval (B) . El panel C muestra la cuantificación de densitometría de esta banda durante los primeros 6 días del "quinto estadio larval.
Figura 2: Esquema de identificación de análisis de espectrometría de masas de la banda de 80. KDa.
Figura 3: Vectores de expresión generados que portan las secuencias promotoras pBl o pB2 en solitario o pB2 junto con la secuencia pL (pLpB2) .
Figura 4: Células sf21 de insecto y larvas de insecto que expresan la proteína fluorescente verde (GFP) bajo el control de diferentes promotores (pBl, pB2, pL y pLpB2) después de la infección con baculovirus recombinantes en momentos diferentes. En la figura se representan larvas después de 72 h de infección.
Figura 5: Expresión de GFP mediante el uso de diferentes promotores insertados en vectores de baculovirus ( Bl, pB2 , pL y pLpB2) en momentos diferentes después de la infección (16-72 h) y. detectados mediante transferencia de Western (A) . La proteína recombinante se cuantificó mediante densitometría de las bandas de GFP (B) o mediante fluorometría de extractos celulares (C) .
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona secuencias polinucleotídicas reguladoras, tales como los promotores pBl y pB2 caracterizados, respectivamente, mediante la SEC ID Ne:l y la SEC ID N2 : 2 y obtenidas a partir de secuencias polinucleotídicas localizadas cadena arriba de los marcos de lectura abiertos de los genes que codifican proteínas de la familia de las hexamerinas en larvas de insecto. La presente invención se refiere además al uso de unas secuencias polinucleotídicas reguladoras de este tipo para construir vectores de expresión de insecto tales como Baculovirus y para expresar proteínas heterólogas en ' células, preferiblemente células de insecto. Las secuencias de los promotores pBl y pB2 se originan de las hexamerinas de T.ni I
BJHSPl y BJHSP2 respectivamente, que se expresan a nivel elevado durante el quinto estadio y con actividad transcripcional muy alta durante las primeras 48 h de este período (Figura 1 ) .
La secuencia de pBl está comprendida por 1057 nucleótidos (SEC ID Ns : 1 ) y se obtiene a partir de la región 5 ' cadena arriba del codón de iniciación del gen que codifica la proteína BJHSPl que es la proteína Básica 1 que se puede suprimir mediante la hormona juvenil. La secuencia se amplificó a partir del ADN genómico de T.ni usando dos cebadores, específicos: SEC ID N2 : 3 y SEC ID Ns : 4 . Después el fragmento se clonó en el vector comercial pGEM-Teasy (Promega) .
La secuencia de pB2 está comprendida por 1041 nucleótidos (SEC ID N2 : 2) y se obtiene a partir de la región 5 ' cadena arriba del codón de iniciación del gen que codifica la proteína BJHSP2 que es la proteína Básica 2 que se puede suprimir mediante la hormona juvenil. La secuencia se amplificó a partir del ADN genómico T.ni mediante el uso de dos cebadores específicos: SEC ID N2 : 5 y SEC ID N2 : 6 . Después el fragmento se clonó en el vector comercial pGEM-Teasy (Promega) .
Las secuencias pBl y pB2 se extrajeron a partir de pGEM-Teasy con las enzimas BamHI y Sphl y se clonaron en esos sitios en el plásmido comercial dual pFasTBac (INVITROGEN) . A este vector dual pFasTBac abierto con las enzimas mencionadas se le eliminan las secuencias promotoras de baculovirus (los vectores obtenidos se denominaron: pFBpBl y pFBpB2) . Todos ellos presentan un sitio de clonación para introducir el ADNc de interés . Los mismos se usaron para generar los baculovirus recombinantes que son capaces de infectar y replicarse en células de insecto y larvas de insecto. Adicionalmente, se extrajo la secuencia pB2 mediante digestión con las enzimas de restricción Notl y PstI (ambos sitios de restricción originándose del vector pGEMT easy) y se clonaron en los mismos sitios en el vector comercial pFasTBacl (INVITROGEN), después de la secuencia promotora pL. El vector obtenido se denominó : pFBpLpB2.
Por lo tanto, la primera realización de la presente invención se refiere a un método para desarrollar secuencias polinucleotídicas reguladoras de expresión: SEC ID Ns : 1 (pBl) y SEC ID Na : 2 (pB2) . Dicho método comprende el aislamiento de cualquier secuencia polinucleotídica localizada cadena arriba de los marcos de lectura abiertos de los genes que. codifican proteínas de la familia de las hexamerinas . Una vez que las secuencias polinucleotídicas se secuenciaron, las mismas se amplificaron mediante medios convencionales .
En una realización preferida de la invención la secuencia polinucleotídica cadena arriba de los marcos de lectura abiertos de las hexamerinas pertenece a un insecto, preferiblemente Trichoplusia ni.
La segunda realización de la presente invención se refiere a secuencias polinucleotídicas reguladoras: SEC ID ¦ N2 : 1 (pBl), SEC ID Na : 2 (pB2) o cualquier fragmento parcial de las mismas, caracterizadas por comprender cualquier secuencia obtenida a partir de cualquier región de nucleótido regulador localizada cadena arriba de los marcos de lectura abiertos de los genes que codifican proteínas de la familia de las hexamerinas. Estas secuencias promotoras presentan motivos de ADN reguladores implicados en la modulación de la actividad transcripcional . Por lo tanto, estas secuencias se pueden regular mediante hormonas durante el desarrollo de la larva pero otras señales y también potencialmente en cultivos celulares en el contexto de vectores de expresión.
En una realización preferida las secuencias polinucleotídicas reguladoras de la invención: SEC ID Ne : 1 (pBl) y SEC ID Na : 2 (pB2) se combinan con cualquier otra secuencia polinucleotídica reguladora, preferiblemente el promotor pL (promotor de la proteína poliedrina) o plO (promotor de la proteína plO) dando origen a diferentes combinaciones: pLpB2 , pLpBl, pl0pB2 y plOpBl. La invención proporciona una secuencia promotora de expresión muy fuerte cuando la secuencia de pL (promotor de poliedrina) se combina con la secuencia pB2.
En otra realización preferida las secuencias polinucleotídicas reguladoras de la invención: SEC ID N2 : 1 (pBl) y SEC ID N2 : 2 (pB2) se combinan entre sí dando origen a diferentes combinaciones: pBlpB2 , pBlpBl (repetida al menos dos veces) y pB2pB2 (repetida al menos dos veces) . Se ha demostrado que los promotores localizados en tándem aumentan la eficacia de la expresión de proteína recombinante en bacterias y plantas (Il'ichev AA et al., Genetika. 1987 23: 197-201; Kay R et al., Science. 1987 Jun 5; 236(4806) : 1299-1302.) .
La tercera realización de la presente invención se refiere al uso de cualquiera de las secuencias polinucleotídicas reguladoras mencionadas anteriormente para construir vectores de expresión, preferiblemente un baculovirus o un plásmido .
La cuarta realización de la invención se refiere a vectores de expresión caracterizados por comprender cualquiera de las secuencias polinucleotídicas reguladoras explicadas anteriormente y al menos una secuencia que codifica una proteína de interés. En una realización preferida el vector es un baculovirus o un plásmido.
La quinta realización de la presente invención se refiere a células transformadas, transíectadas mediante el vector de expresión o infectadas con un virus recombinante usado como un vector como se ha descrito en el párrafo anterior. En una realización preferida las células son células de insecto preferiblemente sf9 o sf21 de Spodoptera frugiperda .
La sexta realización de la presente invención se refiere a larvas de insecto transformadas, transíectadas o infectadas con los vectores de expresión mencionados anteriormente.
La séptima realización de la presente invención se refiere a un método para producir proteínas recombinantes en células de insecto o larvas de insecto con los vectores de expresión mencionados anteriormente y la extracción y purificación de la proteína recombinante de interés mediante medios convencionales.
La octava realización de la presente invención se refiere al uso de dicho vector de expresión para producir proteínas recombinantes .
La novena realización de la presente invención se refiere al uso de dichas células para producir proteínas recombinantes .
La última realización de la presente invención se refiere al uso de dichas larvas de insecto como biofactoría para producir protéínas recombinantes .
Depósito de microorganismos de acuerdo con el tratado de Budapest
Los plásmidos se depositaron en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) ; Universidad de Valencia, España con el número de acceso CECT 7431, el 2 julio de 2008.
EJEMPLOS
Esta invención se ilustra mejor mediante los siguientes ejemplos, que no se deben interpretar como una limitación impuesta sobre el alcance de la misma. Por el contrario, se debe apreciar claramente que se pueden usar otras realizaciones, modificaciones y equivalentes de la misma que esta descripción puede sugerir a los expertos en la materia sin alejarse del ánimo de esta invención y/o del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
Los ejemplos de la presente invención muestran que la expresión de proteína tiene lugar en un momento después de la infección más temprano en comparación a cuando se usaron promotores convencionales. Adicionalmente, en el caso de las secuencias promotoras pB2 y pLpB2 , los niveles de expresión fueron más elevados en comparación con los conseguidos en el estado de la técnica (promotor pL) en momentos después de la infección tanto tempranos como tardíos .
Ejemplo 1: Los promotores de insecto de la invención expresan la proteína fluorescente verde (GFP) .
Clonación de la GFP
La GFP extraída del plásmido pFBpLGFP mediante la enzima de restricción Sph se clonó en el sitio de restricción de Sphl de los plásmidos pFBpBl o pFBpB2. Los plásmidos de expresión donadores obtenidos se denominaron pFBpBlGFP y pFBpB2GFP, respectivamente. En todos los casos se eliminó la secuencia pL, de forma que la expresión de GFP sólo se debió a la actividad de los diferentes promotores de insecto por sí mismos (Figura 3) .
Por otra parte, el promotor pB2 flanqueado por los sitios de restricción Notl y Ps ti se ligó en el pFBpLGFP también abierto por las mismas enzimas de restricción. Los plásmidos de expresión donadores obtenidos se denominaron pFBpLpB2GFP y contenían el gen codificante de GFP bajo el control del promotor doble pL y pB2 (Figura 3) .
Construcción de los vectores de expresión de Baculovirus- GFP .
Los plásmidos resultantes se caracterizaron mediante secuenciación automatizada y se usaron para generar los baculovirus recombinantes BacpB2GFP, BacpBlGFP y BacpLpB2GFP usando el sistema de expresión de Baculovirus Bac-to-Bac® (Invitrogen, USA) siguiendo las instrucciones del fabricante. En resumen, los plásmidos de expresión donadores resultantes se usaron para transferir células de E.coli DHlOBac™ para la transposición en el bácmido recombinante . Un µg de cada bácmido se usó para transfectar 1 x 106 células sf21 de Spodoptera frugiperda usando Reactivo Cellfectin®. La reserva viral Pl se obtuvo después de 72 h de incubación a 272C. El baculovirus se amplificó siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células de insecto sf21se cultivaron en Medio de Insecto T M-FH BD ' BaculoGold™ (BD Biosciences) complementado con 50 mg/ml de gentamicina. El baculovirus BacpLGFP, generado previamente en el presente laboratorio, se obtuvo siguiendo el protocolo idéntico mediante el uso del plásmido pFBpLGFP.
Inoculación de células de insecto
Después las células se infectaron a una multiplicidad de infección de 0 , 1 pfu y las células se sedimentaron 16 h, 24 h, 48 h o 72 h después de la infección mediante centrifugación a 2000 rpm durante 5 min.
Las células infectadas también se fotografiaron en diferentes momentos después de la infección en un microscopio de fluorescencia y las fotografías se muestran en la Figura 4. Es extraordinaria la actividad más temprana (comenzando 16 h después de la infección) de las secuencias promotoras pB2 y pLpB2 y también la fuerza de ambas cuando se comparan con el promotor pL, incluso en fases tardías de la infección (48 h y 72 , h después de la infección) . El promotor pBl presenta también actividad aunque no tan fuerte como los promotores pB2 o pL.
Condiciones de cultivo de insecto e inoculación
Se inyectaron baculovirus recombinantes a las larvas de quinto estadio de Trichoplusia ni cerca de las patas falsas (delante de la cavidad corporal) usando una dosis de 104-105 pfu/larva. Las larvas infectadas se mantuvieron en cámaras de cultivo a 289C y se recogieron a las 72 h. El panel inferior de la Figura 4 muestra que los promotores pBl (bajo) , pB2 y la combinación de pL y pB2 presentan actividad en larvas de insecto expresando la proteína GFP en los tejidos de las larvas .
Preparación de extractos de proteína
Células sedimentadas a . partir de una placa de 96 pocilios (2 x 106 células /pocilio se infectaron a 0,1 pfu/pocillo) se resuspendieron en 30 µ? de NaCl 150 mM, 1% de NP-40, 0,1% de SDS, Tris 50 mM pH 8, inhibidores de proteasa (complete®, Roche) , 2-mercaptoetanol (tampón RIPA) , se mantuvieron en hielo durante 30 min y se aclararon mediante centrifugación a 2000 g durante 5 min a 4aC para retirar los detritos celulares.
Análisis de extractos de proteína
40 µg de proteínas solubles totales (PST) se separaron en geles de poliacrilamida SDS 12% (p/v) . Las proteínas se tiñeron con Azul Brillante de Coomassie G-250 (BioRad) o se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Hybond C, GE Healthcare), se bloquearon durante una noche en PBS con 0,1% (v/v) de Tween 20 (PBS-T) y 4% de leche desnatada (PBS-TM) y se incubaron durante 1 h con anticuerpo primario de GFP (Chemicon) diluido 1:1000 y anticuerpo primario de Actina (Sigma) diluido 1:500 en PBS-TM. Después de 2 lavados de 10 min en PBS-T, las membranas se incubaron durante 1 h con una dilución 1:2000 de anti-lgG de ratón conjugado con peroxidasa o anti-IgG de conejo (GE Healthcare) diluido en PBS-TM. Después del lavado, la señal específica se detectó usando el sistema Advanced ECL (GE Healthcare) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
El análisis realizado mediante transferencia de Western produjo los resultados mostrados en la Figura 5. De nuevo se demostró que los promotores pB2 y pLpB2 mostraron una actividad más tempana y más fuerte que el promotor pL (figura 5) . La densitometría de las bandas específicas de GFP se midió usando el programa TINA 2.0 y usando la banda de actina para normalizar los resultados.
Ensayos de fluorometría
La emisión de 40 µg de PST se midió a 535 nm después de excitarse a 485 nm usando un fluorómetro GENIOS. Cada valor se tomó midiendo tres veces cada extracto. Los resultados se muestran en la Figura 5C . De nuevo se observó claramente un efecto sinérgico de la secuencia pL localizada 5' cadena arriba del promotor pB2 , con aumentos de producción de proteína que variaban de 61 a 375% dependiendo del tiempo después de la infección con respecto al promotor pL en solitario (Figura 5) .
Claims (19)
1. Método para desarrollar secuencias polinucleotídicas reguladoras de expresión que comprende: a) Aislamiento y amplificación de la SEC ID Ns:2 (pB2 ) , localizada cadena arriba de las fases de lectura abiertas de los genes que codifican las proteínas de la familia hexamerina mediante medios convencionales. b) Combinación de la SEC ID Ne:2 (pB2) con el promotor de la proteína poliedrina (pL) .
2. Método, de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que la amplificación de la SEC ID N2 : 2 (pB2) se realiza usando los cebadores SEC ID N2 : 5 y SEC ID N2 : 6.
3. Método, de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que las secuencias polinucleotídicas reguladoras pertenecen a larvas de insecto.
4. Método, de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado por que las larvas de insecto son de Trichoplusia ni.
5. Secuencia polinucleotídica reguladora caracterizada por comprender la secuencia de pB2 (SEC ID Na : 2) y la secuencia del promotor de la proteína polihedrina (pL) .
6. Secuencia polinucleotídica reguladora, de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizada por comprender la secuencia de pB2 (SEC ID N2 : 2) repetida al menos dos veces.
7. Uso de las secuencias polinucleotídicas reguladoras de las reivindicaciones 5 ó 6 para la construir vectores de expresión .
8. Uso, de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el vector de expresión es un virus, de prefereriblemente un baculovirus .
9. Uso, de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el vector de expresión es un plásmido.
10. Vector de expresión caracterizado por comprender las secuencias polinucleotídicas reguladoras de las reivindicaciones 5 ó 6 y al menos una secuencia que codifica una proteína de interés .
11. Vector de expresión, de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado por que el mismo es un virus, preferiblemente un baculovirus .
12. Vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado por que el mismo es un plásmido.
13. Células transformadas o transíectadas mediante el vector de expresión de las reivindicaciones 10 a 12.
14. Células, de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizadas por que las mismas son células de insecto preferiblemente sf9 o sf21 de Spodoptera frugiperda.
15. Larvas de insecto transfectadas , infectadas o transformadas con el vector de expresión de las reivindicaciones 10 a 12.
16. Método para la producir proteínas recombinantes que comprende la inoculación o la transfección de las células de insecto o larvas de insecto con el vector de expresión de las reivindicaciones 10 a 12 y la extracción y purificación de la proteína recombinante de interés mediante medios convencionales . ·
17. Uso del vector de expresión de las reivindicaciones 10 a 12 para la producir proteínas recombinantes .
18. Uso de las células de las reivindicaciones 13 ó 14 para la producir proteínas recombinantes .
19. Uso de las larvas de insecto de la reivindicación 15 como un biofactor para producir proteínas recombinantes .
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