PL187218B1 - Sposób wytwarzania polipeptydu, polipeptyd pochodzący z gatunku alg morskich, rekombinowana cząsteczka DNA, komórka drobnoustroju, sposób wytwarzaniaproduktu spożywczego, sposób wytwarzania paszy zwierzęcej, sposób redukowania zawartości cukru w produkcie spożywczym, sposób wytwarzania produktu, sposób wytwarzania produktu pieczonego z ciasta, kompozycja polepszająca ciasto, sposób analizowania zawartości cukru w próbce, sposób wytwarzania laktonu - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania polipeptydu o aktywnosci oksydazy heksozowej, znamienny tym, ze obej- muje wyizolowanie kodujacego polipeptyd fragmentu DNA pochodzacego z gatunku alg morskich, wpro- wadzenie fragmentu DNA do odpowiedniego organizmu gospodarza, w którym fragment DNA jest pola- czony z odpowiednim sygnalem ekspresji dla tego fragmentu DNA, hodowanie organizmu gospodarza w warunkach prowadzacych do ekspresji polipeptydu o aktywnosci oksydazy heksozowej oraz odzyskanie polipeptydu z pozywki albo organizmu gospodarza, przy czym fragment koduje polipeptyd obejmujacy przynajmniej jedna sekwencje aminokwasowa wybrana z grupy skladajacej sie z: (i) Tyr-Glu-Pro-Tyr-Gly-Gly-Val-Pro (Identyfikator Sekw. Nr 1) , (ii) Ala-Ile-Ile-Asn-Val-Thr-Gly-Leu-Val-Glu-Ser-Gly-Tyr-Asp-X-X-X-Gly-Tyr-X-Val-Ser-Ser (Identy- fikator Sekw. Nr 2), (iii) Asp-Leu-Pro-Met-Ser-Pro-Arg-Gly-Val-IIe-Ala-Ser-Asn-Leu-X-Phe (Identyfikator Sekw. Nr 3), (iv) Asp-Ser-Glu-Gly-Asn-Asp-Gly-Glu-Leu-Phe-X-Ala-His-Thr (Identyfikator Sekw. Nr 4), (v) Tyr-Tyr-Phe-Lys (Identyfikator Sekw. Nr 5), (vi) Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Val-Ile-Asp-Val-Asn-Ala-Gly-Thr-X-Asp (Identyfikator Sekw. Nr 6), (vii) Leu-Gln-Tyr-Gln-Thr-Tyr-Trp-Gln-Glu-Glu-Asp (Identyfikator Sekw. Nr 7), (viii) X-Ile-Arg-Asp-Phe-Tyr-Glu-Glu-Met (Identyfikator Sekw. Nr 8), oraz (ix) którejkolwiek z sekwencji aminokwasowych od (i) do (viii) z delecja, addycja lub substytucja jednego lub wiecej aminokwasów, zasadniczo nie zmieniajaca aktywnosci peptydu oksydazy heksozowej, gdzie X w sekwencjach (ii), (iii), (iv) i (viii) oznacza aminokwas wybrany z grupy obejmujacej Ala, Arg, Asn, Asp, Asx, Cys, Gln, Glu, Glx, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr i Val. PL

Description

Dziedzina wynalazku

Niniejszy wynalazek dostarcza sposobu wytwarzania oksydazy heksozowej technologią rekombinacji DNA i takiego enzymu wytwarzanego tą metodą oraz jego zastosowania w przemyśle spożywczym i innych dziedzinach.

Podstawa techniczna i stan techniki

Oksydaza heksozowa (D-heksozo:O2-oksydoreduktaza, EC 1.1.3.5) jest enzymem, który w obecności tlenu jest zdolny do utleniania D-glukozy i kilku innych cukrów redukujących w tym maltozy, laktozy i celobiozy, do ich odpowiednich laktonów, z następującą potem hydrolizą do odpowiednich kwasów aldobionowych. Oksydaza heksozowa różni się tym od innej oksydoreduktazy, oksydazy glukozowej, która potrafi jedynie przekształcać D-glukozę, że potrafi wykorzystywać szerszy zakres substratów. Utlenianie katalizowane przez oksydazę heksozową można przedstawić przykładowo jak niżej:

D-glukoza + O2 —>δ D-glukonolakton + H2O2, albo D-galaktoza + O2 -> γ-D-galaktogalakton + H2O2

187 218

Do tej pory, oksydaza heksozową (określana dalej jako HOX) była dostarczona przez izolowanie enzymu z laiku gatunków czerwonych alg, takich jak Iridophycus flaccidum (Bean i Hassid, 1956) i Chondrus crispus (Sullivan i in., 1973). Oprócz tego wykazano, że gatunek algi Euthora cristata wytwarza oksydazę glukozową.

Opisywano, że oksydaza heksozową izolowana z tych źródeł naturalnych może mieć potencjalne zastosowanie w wytwarzaniu pewnych produktów spożywczych. Tak więc wykazano, że oksydaza heksozowa izolowana z Iridophycus flaccidum jest zdolna do przekształcania laktozy w mleku z wytworzeniem odpowiedniego kwasu aldobionowego, oraz wykazano, że istnieje potencjalne zainteresowanie jako czynnikiem zakwaszającym mleko, np. zastępując zakwaszające kultury drobnoustrojów (Rand, 1972). W tym celu, oksydaza heksozową była wspomniana jako bardziej interesujący enzym niż oksydaza glukozowa, ponieważ ta ostatnia może być stosowana w mleku albo produktach spożywczych nie zawierających glukozy jedynie po dodaniu glukozy albo, w przypadku produktów mlecznych, dodaniu enzymu rozkładającego laktozę, laktazy, która rozkłada laktozę do glukozy i galaktozy. Nawet jeżeli w ten sposób glukoza staje się dostępnym Substratem dla oksydazy glukozowej, oczywiste jest, że tylko 50% produktów laktazy będzie wykorzystane jako substrat przez oksydazę glukozową, a więc nie będzie ona wydajnym czynnikiem zakwaszającym w naturalnym mleku albo produktach mlecznych.

Zdolność oksydoreduktaz tlenowych, w tym również oksydazy heksozowej do tworzenia nadtlenku wodoru, wywierającego wpływ antybakteryjny, wykorzystana została do poprawy stabilności podczas przechowywania pewnych produktów spożywczych, w tym sera, masła i soku owocowego, jak to ujawniono w JP-B-73/016612. Sugerowano również, że oksydoreduktazy mogą być potencjalnie przydatne jako „wymiatacze” tlenu albo antyutleniacze w produktach spożywczych.

W przemyśle piekarniczym i młynarskim znane jest zastosowanie czynników utleniających takich jak np. jodków, nadtlenków, kwasu askorbinowego, bromku potasu albo azodikarbonamidu do ulepszania przydatności mąki do pieczenia w celu uzyskania ciasta o ulepszonej ciągliwości, a więc posiadającego pożądaną siłę i stabilność. Mechanizmem czynników utleniających pozwalającym na uzyskanie takiego efektu jest to, że białka mąki, takie jak np. gluten w mące pszennej, zawierają grupy tiolowe, które po utlenieniu tworzą wiązania disiarczkowe, przez co białko tworzy bardziej stabilną matrycę powodującą lepszą jakość ciasta i zwiększenie objętości i struktury miękiszu wypieków.

Jednakże, zastosowanie niektórych współcześnie dostępnych środków utleniających jest kwestionowane przez konsumentów albo nie jest dozwolone przez ciała ustawodawcze, a więc próbuje się znaleźć alternatywy dla tych konwencjonalnych dodatków do ciasta i mąki, zaś stan techniki sugeruje zastosowanie oksydazy glukozowej dla powyższych celów. Tak więc, US 2,783,150 ujawnia dodanie oksydazy glukozowej do mąki w celu poprawienia charakterystyki reologicznej ciasta. CA 2,012,723 ujawnia środki poprawiające chleb obejmujące enzymy celulolityczne i oksydazę glukozową, zaś JP-A-084848 sugeruje zastosowanie kompozycji poprawiającej chleb, obejmującej oksydazę glukozową i lipazę.

Jednakże, zastosowanie oksydazy glukozowej jako dodatku poprawiającego ciasto i chleb ma te ograniczenie, że enzym ten wymaga obecności glukozy jako substratu, aby był skuteczny w układzie ciasta, zaś zawartość glukozy w mące zbóż jest ogólnie niska. Tak więc, w mące pszennej glukoza występuje w ilości 0-0,4% wagowo, tj. mąka może wcale nie zawierać glukozy. Stąd, nieobecność albo mała zawartość glukozy w cieście będzie czynnikiem ograniczającym zastosowanie oksydazy glukozowej jako czynnika poprawiającego ciasto. W przeciwieństwie, zawartość maltozy jest istotnie wyższa w świeżo przygotowanym cieście, po czym dalsza maltoza tworzy się z powodu aktywności β-amylazy obecnej w mące, albo dodanej.

Obecnym źródłem oksydazy heksozowej jest surowy albo częściowo oczyszczony preparat enzymu, izolowany przez ekstrakcję z wyżej wymienionych naturalnie występujących gatunków alg morskich. Jednakże, ponieważ ilość oksydazy heksozowej w algach jest mała, oczywiste jest, że wytwarzanie enzymu w ten sposób jest zbyt uciążliwe i kosztowne aby zapewnić ekonomiczne, komercyjne wytwarzanie enzymu ze źródeł naturalnych. Ponadto, za187 218 pewnienie wystarczająco czystego enzymu na ekonomicznym poziomie nie jest łatwe do osiągnięcia w ten sposób.

Tak więc, istnieje istotne zapotrzebowanie przemysłowe na zapewnienie alternatywnego i bardziej ekonomicznego źródła tego wartościowego przemysłowo enzymu, które byłoby niezależne od źródeł naturalnych jak również dostarczało enzymu w postaci czystej, tj. bez zanieczyszczających aktywności enzymatycznych albo innych zanieczyszczających substancji, w tym niepożądanych pigmentów alg i zanieczyszczeń środowiskowych, które mogą występować w regionach morskich, gdzie rosną gatunki alg wytwarzające oksydazę heksozową.

Ponadto, dostępność przemysłowa oksydazy heksozowej o czystości dopuszczalnej dla pożywienia w odpowiednich ilościach i ekonomicznych cenach bez wątpienia powinna otworzyć nowe zastosowania tego enzymu, nie tylko w przemyśle spożywczym ale również w innych dziedzinach przemysłu, jak to będzie dyskutowane dalej. Jednym z przykładów takich nowych zastosowań rekombinowanei oksydazy heksozowej w przemyśle spożywczym jest zastosowanie jako środka poprawiającego ciasto, innym przykładem jest zastosowanie aktywnego polipeptydu oksydazy heksozowej, albo rekombinowanego organizmu wytwarzającego polipeptyd, w wytwarzaniu laktonów.

Streszczenie wynalazku

Niniejszy wynalazek, dzięki zastosowaniu technologii rekombinowanego DNA, po raz pierwszy umożliwił dostarczenie aktywnego polipeptydu oksydazy heksozowej w ilościach odpowiednich przemysłowo oraz o jakości i czystości, która czyni aktywny polipeptyd oksydazy heksozowej według niniejszego wynalazku niezwykle przydatną dla ważnych celów przemysłowych, w tym do wytwarzania produktów spożywczych i farmaceutyków.

Wynalazek w pierwszym aspekcie dostarcza sposobu wytwarzania polipeptydu o aktywności oksydazy heksozowej, obejmującego izolowanie albo syntetyzowanie fragmentu DNA kodującego polipeptyd, wprowadzanie fragmentu DNA do odpowiedniego organizmu gospodarza, w którym fragment DNA jest połączony z odpowiednim sygnałem ekspresji dla fragmentu DNA, hodowanie organizmu gospodarza w warunkach prowadzących do ekspresji aktywnego polipeptydu oksydazy heksozowej i pozyskiwanie polipeptydu z pożywki hodowlanej albo z organizmu gospodarza.

W dalszym aspekcie, wynalazek dotyczy polipeptydu w postaci izolowanej, wykazującego aktywność oksydazy heksozowej, obejmującego przynajmniej jedną sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej (i) Tyr-Glu-Pro-Tyr-Gly-Gly-Val-Pro (Identyfikator Sekw. Nr 1), (ii) Ala-Ile-Ilk-Asn-Val-Thr-Gly-Lku-Val-Glu-Ser-Gly-Tyr-Asp-X-X-X-Gly-Tyr-X-ValSer-Ser (Identyfikator Sekw. Nr 2), (iii) Asp-Lku-Pro-Mkt-Ser-Pro-Arg-Gly-Val-Πk-Ala-Ser-Asn-Leu-X-Phe (Identyfikator Sekw. Nr 3), (iv) Asp-Ser-Glu-Gly-Asn-Asp-Gly-Glu-Leu-Phe^-Ala-His-Thr (Identyfikator Sekw. Nr 4), (v) Tyr-Tyr-Phe-Lys (Identyfikator Sekw. Nr 5), (vi) Asp-Pro-Gly-Tyr-Ilk-Va[--Ie-Asp-’V-lAsn-Ala-Gly-’ΠlrrX-A_Sp (Identyfikator Sekw. Nr 6), (vii) Lku-Gln-Tyr-Gln-yhr-Tyr-Trp-Gln-Glu-Glu-Asp (Identyfikator Sekw. Nr 7), (viii) X-Ilk-Arg-Asp-Phe-yyr-Glu-Glu-Mkt (Identyfikator Sekw. Nr 8) gdzie X oznacza aminokwas wybrany z grupy obejmującej Ala, Arg, Asn, Asp, Asx, Cys, Gln, Glu, Glx, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr i Val oraz ich muteiny i odmiany.

W jeszcze dalszym aspekcie, wynalazek dotyczy rekombinowanej cząsteczki DNA, obejmującej fragment DNA kodujący polipeptyd o aktywności oksydazy heksozowej i komórki drobnoustroju zawierającej tę rekombinowaną cząsteczkę.

W innym aspekcie, wynalazek dostarcza zastosowania polipeptydu o aktywności oksydazy heksozowej albo komórki drobnoustroju wyrażającej taki polipeptyd w wytwarzaniu produktów spożywczych albo paszy dla zwierząt i w wytwarzaniu produktu farmaceutycznego, produktów kosmetycznych i higieny zębów.

187 218

W innym przydatnym aspekcie, dostarczono sposobu redukowania zawartości cukru w produktach spożywczych, obejmującego dodanie do produktów spożywczych takiej ilości polipeptydu albo komórek drobnoustroju ujawnionych tu, która jest wystarczająca do usunięcia przynajmniej części cukru obecnego początkowo w produkcie spożywczym, sposobu wytwarzania produktu piekarniczego z ciasta, obejmującego dodanie polipeptydu o aktywności oksydazy heksozowej albo komórek drobnoustroju wyrażających ten polipeptyd do ciasta, oraz kompozycję poprawiającą ciasto zawierającą polipeptyd albo komórkę drobnoustroju według niniejszego wynalazku oraz przynajmniej jeden konwencjonalny składnik ciasta.

W innym aspekcie, wynalazek dotyczy zastosowania polipeptydu albo komórki drobnoustroju według niniejszego wynalazku jako odczynnika analitycznego do mierzenia zawartości cukrów.

W interesującym aspekcie, wynalazek dostarcza również zastosowania polipeptydu albo komórki drobnoustroju według niniejszego wynalazku w wytwarzaniu laktonu, w którym polipeptyd i/lub komórka drobnoustroju wprowadzana jest do reaktora, zawierającego węglowodan, który może być utleniany przez polipeptyd i prowadzenie reakcji w reaktorze w warunkach, w których węglowodan ulega utlenieniu.

Szczegółowe ujawnienie wynalazku

Oksydazy heksozowe są wytwarzane naturalnie przez niektóre gatunki alg morskich. Gatunki te są m.in. spotykane w rodzinie Gigartinaceae, która należy do rzędu Gigartinales. Przykładami gatunków alg wytwarzających oksydazę heksozową należących do Gigartinaceae są Chondrus crispus i Iridophycus flaccidum. Również gatunki alg należące do rzędu Cryptomeniales, obejmujące gatunek Euthora cristata, są potencjalnymi źródłami aktywnego polipeptydu oksydazy heksozowej według niniejszego wynalazku. Tak więc, te gatunki alg są potencjalnie przydatnymi źródłami oksydazy heksozowej i DNA kodującego aktywne polipeptydy oksydazy heksozowej. W znaczeniu tu użytym, określenie „aktywny polipeptyd oksydazy heksozowej” oznacza enzym, który utlenia przynajmniej D-glukozę, D-galaktozę, D-mannozę, maltozę, laktozę i celobiozę.

Przy stosowaniu tych naturalnych źródeł do izolacji natywnej oksydazy heksozowej, jak to czyniono w stanie techniki oraz w niniejszym wynalazku w celu identyfikacji materiału alg, który mógłby być zastosowany jako źródło mRNA do zastosowania w konstruowaniu cDNA oraz jako punkt wyjściowy do konstruowania starterów syntetycznych oligonukleotydowych DNA, enzym jest zwykle izolowany z wyjściowego materiału alg przez ekstrakcję z użyciem wodnych ośrodków ekstrakcyjnych.

Jako materiał wyjściowy do takiej ekstrakcji można zastosować algi w stanie świeżym, jak zebrano z morskich obszarów wzrostu, albo można zastosować po wysuszeniu np. powietrzem w temperaturze otoczenia albo dowolną odpowiednią metodą suszenia przemysłowego, taką jak suszenie w cyrkulującym podgrzanym powietrzu albo przez liofilizację. W celu ułatwienia późniejszego etapu ekstrakcji, świeży albo suszony materiał wyjściowy można poddać np. mieleniu albo mieszaniu.

Jako wodny ośrodek ekstrakcyjny, przydatne są roztwory buforów o pH w zakresie od 6 do 8, takie jak bufor 0,1 M fosforanu sodu, bufor 20 mM trietanoloaminy albo bufor 20 mM Tris-HCl. Oksydazę heksozową zwykle ekstrahuje się z materiału alg przez zawieszenie materiału wyjściowego w buforze i utrzymywanie zawiesiny w temperaturze w zakresie 0-20°C, takiej jak 5°C przez 1do 10 dni, korzystnie wytrząsając.

Zawieszony materiał alg oddziela się następnie od ośrodka wodnego odpowiednim sposobem separacji, takim jak filtracja, cedzenie albo odwirowanie, po czym pozyskuje się oksydazę heksozową z nadsączu albo filtratu. Ewentualnie, oddzielony materiał alg poddaje się jednemu lub wielu etapom ekstrakcji.

Ponieważ niektóre algi morskie zawierają kolorowe pigmenty, takie jak fikocyjaniny, może być konieczne poddanie filtratu albo nadsączu dalszemu etapowi ekstrakcji, podczas którego usuwa się pigmenty. Przykładowo, pigmenty można usunąć przez traktowanie filtratu albo nadsączu rozpuszczalnikiem organicznym, w którym pigmenty są rozpuszczalne, a następnie oddzielenie rozpuszczalnika zawierającego rozpuszczone pigmenty od ośrodka wodnego.

187 218

Pozyskiwanie oksydazy heksozowej z wodnego ośrodka ekstrakcyjnego można przeprowadzić dowolnym odpowiednim konwencjonalnym sposobem umożliwiającym izolację białek z ośrodka wodnego. Sposoby te, których przykłady zostaną opisane poniżej, obejmują takie metody jak chromatografia jonowymienna, po której ewentualnie następuje etap zatężania taki jak ultrafiltracja. Możliwe jest również pozyskiwanie enzymu przez dodanie substancji, takiej jak (NHą^SOą, która powoduje precypitację białka, po czym następuje oddzielenie precypitatu i ewentualnie poddanie białka warunkom umożliwiającym jego rozpuszczenie.

Dla celów wynalazku pożądane jest dostarczenie enzymu w zasadniczo czystej postaci, np. jako preparat zasadniczo pozbawiony innych białek albo zanieczyszczeń niebiałkowych i względnie surowy preparat enzymu powstały w wyniku powyższej ekstrakcji i izolacji, jest korzystnie poddawany dalszym etapom oczyszczania, filtracji żelowej albo ogniskowania chromatograficznego jak to opisano przykładowo poniżej.

Jak wspomniano wyżej, aktywny polipeptyd oksydazy heksozowej według niniejszego wynalazku jest dostarczony metodą technologii rekombinowanego DNA, co umożliwia wytwarzanie go przez hodowanie w pożywce hodowlanej odpowiedniego organizmu gospodarza zawierającego gen kodujący oksydazę heksozową i odzyskiwanie enzymu z tych komórek ilub z pożywki hodowlanej.

Dostarczony tu sposób wytwarzania oksydazy heksozowej obejmuje pierwszy etap izolowania albo konstruowania fragmentu DNA kodującego oksydazę heksozową. Dostępnych jest kilka strategii dostarczania takiego fragmentu DNA. Tak więc, fragment DNA można izolować jako taki z organizmu, który naturalnie wytwarza oksydazę heksozową. W celu identyfikacji położenia fragmentu kodującego DNA, konieczne jest posiadanie sond RNA albo DNA, których sekwencje w odpowiednich warunkach hybrydyzują z poszukiwanym fragmentem DNA, a następnie izolowanie fragmentu DNA zawierającego sekwencję kodującą i klonowanie go do odpowiedniego wektora klonującego.

Inna odpowiednia strategia, która jest ujawniona szczegółowo w poniższych przykładach, obejmuje izolowanie mRNA z organizmu wytwarzającego oksydazę heksozową i zastosowanie takiego mRNA jako punktu wyjścia do konstruowania biblioteki cDNA, którą można następnie zastosować w syntezie DNA w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) przy użyciu starterów oligonukleotydowych, które są syntetyzowane w oparciu o sekwencje aminokwasowe oksydazy heksozowej. Stwierdzono, że taka strategia jest odpowiednia do uzyskania fragmentu DNA kodującego oksydazę heksozową. Przykładowo, taką strategię opisano szczegółowo poniżej.

Syntetyczne oligonukleotydy wytworzono w oparciu o sekwencje peptydowe HOX-2 i HOX-3, uzyskane, jak to opisano niżej przez trawienie endoLys-C polipeptydu 40000 oksydazy heksozowej, ekstrahowanego z Chondrus crispus. PCR z użyciem pierwszej nici cDNA jako matrycy i startera sensownego HOX-2 i startera antysensownego HOX-3, dała fragment DNA wielkości 407 bp. Fragment ten wprowadzono do wektora E. coli, pT7 Blue i sekwencjonowano. Stwierdzono, że oprócz sekwencji peptydów HOX-2 i HOX-3, ten fragment 407 bp zawierał również otwartą ramkę odczytu zawierającą peptydy HOX-4 i HOX-5 powyższego fragmentu oksydazy heksozowej Chondrus crispus, wielkości 40000, którego izolowanie opisano poniżej.

Oligonukleotyd sensowny i antysensowny syntetyzowano w oparciu o fragment 407 bp, dzięki czemu możliwe było uzyskanie przez PCR dwóch fragmentów, 800 i 1400 bp, stosując jako matrycę cDNA. Te dwa fragmenty klonowano do wektora pT7 Blue i sekwencjonowano. Sekwencja DNA fragmentu 5' wykazała otwartą ramkę odczytu zawierającą peptyd HOX-6, który również wyizolowano z fragmentu oksydazy heksozowej wielkości 40000, pochodzącego z Chondrus crispus. Podobnie, fragment 3' wykazał ramkę odczytu zawierającą peptyd HOK-1, którego izolowanie opisano poniżej, oraz HOX-7 i HOX-8, uzyskane z fragmentu oksydazy heksozowej wielkości 29000, pochodzącego z Chondrus crispus, uzyskanego przez trawienie endoLys-C jak to również opisano poniżej.

W oparciu o skojarzone sekwencje DNA, zsyntetyzowano oligonukleotyd odpowiadający końcowi 5' domniemanego genu hox i oligonukleotyd odpowiadający końcowi 3' genu. Te dwa oligonukleotydy zastosowano w PCR z pierwszą nicią cDNA jako matrycą, uzyskując

187 218 fragment DNA wielkości około 1,8 kb. Fragment ten klonowano do wektora E. coli i sekwencjonowano. Sekwencja DNA była identyczna ze skojarzoną sekwencją powyższego końca 5', fragmentu 407 bp i 3', i wywnioskowano, że ta sekwencja około 1,8 kb koduje oba fragmenty oksydazy heksozowej Chondrus crispus, 40000 i 29000.

Jak jest to oczywiste dla specjalisty w dziedzinie, powyższa strategia izolowania fragmentu DNA kodującego aktywny polipeptyd oksydazy heksozowej, obejmująca izolowanie i charakteryzację oksydazy heksozowej, może być zastosowana do konstruowania takich fragmentów kodujących oksydazy heksozowe pochodzące z dowolnego źródła innego niż Chondrus crispus, w tym gatunki alg morskich wspomniane powyżej, jak również z innych roślin i drobnoustrojów.

Alternatywnie, sekwencja DNA fragmentu DNA kodującego aktywny polipeptyd oksydazy heksozowej może być konstruowana syntetycznie ustalonymi metodami standardowymi, np. metodą fosforoamidanu opisaną przez Beaucage i Caruthers (1981), albo metodą opisaną przez Matthes i in., (1984). Nawiązując do metody fosfoamidanu, oligonukleotydy są syntetyzowane, np. automatycznym syntezatorem DNA, oczyszczane, poddawane anilingowi, ligacji i klonowane do odpowiedniego wektora.

Ponadto, fragment DNA może być pochodzenia mieszanego genomowego i syntetycznego, mieszanego syntetycznego i cDNA albo mieszanego genomowego i cDNA, wytworzony przez poddanie ligacji fragmentów pochodzenia syntetycznego, genomowego albo cDNA, fragmentów odpowiadających różnym częściom całego fragmentu DNA, zgodnie z technikami standardowymi.

W kolejnym etapie sposobu według niniejszego wynalazku, izolowany albo syntetyzowany fragment DNA kodujący aktywny polipeptyd oksydazy heksozowej wprowadzany jest do odpowiedniego organizmu gospodarza, w którym fragment DNA jest łączony funkcjonalnie z odpowiednim sygnałem ekspresji dla fragmentu DNA. Wprowadzenie takie może być przeprowadzone metodami dobrze znanymi specjalistom, obejmujące konstruowanie wektora zawierającego wprowadzony fragment i transformowanie tym wektorem organizmu gospodarza. Odpowiednie wektory obejmują plazmidy, które są zdolne do replikacji w wybranym organizmie gospodarza. Uwzględnia się również, że fragment DNA może być integrowany do chromosomu organizmu gospodarza np. przez wprowadzenie fragmentu do elementu ulegającego transpozycji, takiego jak transpozon, i poddanie mieszaniny wybranego organizmu gospodarza i transpozonu warunkom, w których transpozon integruje się z chromosomem organizmu gospodarza i łączy się z odpowiednim sygnałem ekspresji.

Nawiązując do wynalazku, fragment DNA kodujący aktywny polipeptyd oksydazy heksozowej obejmujący gen dla polipeptydu wytworzony sposobami opisanymi powyżej albo dowolnymi metodami znanymi w dziedzinie, może być wyrażany w postaci aktywnej enzymatycznie przy użyciu wektora ekspresyjnego. Wektor ekspresyjny zawiera zwykle składniki typowego wektora klonującego, tj. element umożliwiający autonomiczną replikację wektora w wybranym organizmie gospodarza i jeden lub wiele znaczników fenotypowych w celu selekcjonowania. Wektor ekspresyjny zawiera sekwencje kontrolujące, kodujące promotor, operator, miejsce wiązania rybosomu, sygnał rozpoczynający translację i ewentualnie gen represora albo jeden lub wiele genów aktywatora. W celu umożliwienia wydzielenia wyrażanego polipeptydu, powyżej sekwencji kodującej genu może być wprowadzona sekwencja sygnałowa. W niniejszym kontekście, określenie „sygnał ekspresji” obejmuje dowolną spośród powyższych sekwencji kontrolnych, sekwencji represora albo aktywatora i sekwencji sygnałowych. Do ekspresji pod kierunkiem sekwencji kontrolnych, gen kodujący oksydazę heksozową jest połączony funkcjonalnie z sekwencjami kontrolującymi w sposób odpowiedni dla ekspresji. Sekwencje promotorowe, które mogą być włączone do wektorów plazmidowych i które mogą wspomagać transkrypcje genu oksydazy heksozowej obejmują, choć nie są ograniczone do promotora tac, promotorów pochodzących z faga lambda obejmujących promotory ^PL^iPR·

Wektor ekspresyjny niosący fragment DNA według niniejszego wynalazku, może być dowolnym wektorem, który jest zdolny do wyrażania genu oksydazy heksozowej w wybranym organizmie gospodarza, zaś wybór wektora zależy od komórki gospodarza, do którego będzie

187 218 wprowadzany. Tak więc, wektorem może być wektor replikujący autonomicznie, tj. wektor, który występuje jako jednostka pozachromosomalna, której replikacja jest niezależna od replikacji chromosomu, np. plazmid, bakteriofag albo element pozachromosomalny, minichromosom albo sztuczny chromosom. Alternatywnie, wektor może po wprowadzeniu do komórki gospodarza, integrować się z genomem komórki gospodarza i replikować wraz z chromosomem.

W wektorze, fragment DNA kodujący aktywny polipeptyd oksydazy heksozowej powinien być połączony funkcjonalnie z odpowiednią sekwencją promotora. Promotorem może być dowolna sekwencja DNA, która zapewnia aktywność transkrypcyjną w wybranym organizmie gospodarza i może pochodzić z genów kodujących białka homologiczne albo heterologiczne wobec organizmu gospodarza. Przykładami odpowiednich promotorów do kierowania transkrypcją fragmentów DNA według niniejszego wynalazku w organizmie gospodarza bakteryjnego są promotor operonu lac E. coli, promotory dagA genu agarazy Streptomyces coelicolor, promotory genu amylazy maltogenowej (amyM) Bacillus stearothermophilus, promotory genu amylazy a (amyQ) Bacillus amyloliquefaciens, promotory genów xylA i xy1B Bacillus subtilis.

Do transkrypcji w gatunkach grzybów, przykłady przydatnych promotorów wybrane są spośród genów kodujących oksydazę alkoholową Pichia pastoris, amylazy TAKA Aspergillus oryzae, proteinazy aspartylowej Rhizomucor miehei, obojętnej amylazy α Aspergillus niger, kwasostabilnej amylazy α A. niger, glukoamylazy A. niger, lipazy Rhizomucor miehei, proteazy alkalicznej Aspergillus oryzae, izomerazy triozofosforanu Aspergillus oryzae albo acetamidazy Aspergillus nidulans. Przykładami odpowiednich promotorów do ekspresji w gatunkach drożdży mogą być promotory Gal 1 i Gal 10 Saccharomyces cerevisiae. Do ekspresji w gatunkach bakterii takich jak E. coli, odpowiedni promotor może być wybrany spośród promotorów bakteriofaga, w tym promotora T7 albo promotora bakteriofaga lambda.

Wektor obejmujący fragment DNA kodujący aktywny polipeptyd oksydazy heksozowej może również zawierać znacznik umożliwiający selekcję, np. gen, którego produkt kompensuje defekt organizmu gospodarza, taki jak mutacja zapewniająca fenotyp aukotrofowy, albo znacznik może zapewniać odporność na antybiotyki albo oporność na jony metali ciężkich.

Organizm gospodarza według niniejszego wynalazku obejmujący konstrukt DNA albo wektor ekspresyjny, jak to opisano wyżej, może być zastosowany jako komórka gospodarza w rekombinacyjnym wytwarzaniu polipeptydu według niniejszego wynalazku. Komórka może być transformowana konstruktem DNA obejmującym gen kodujący polipeptyd według niniejszego wynalazku albo, dogodnie przez integrację konstruktu DNA z chromosomem gospodarza. Taka integracja jest ogólnie uważana za korzystną, ponieważ fragment DNA jest stabilniej utrzymywany w komórce. Integracja konstruktów DNA z chromosomem gospodarza może być przeprowadzona konwencjonalnymi metodami takimi jak np. rekombinacja homologiczna albo heterologiczna albo przy użyciu elementu ulegającego transpozycji. Alternatywnie, organizm gospodarza może być transformowany wektorem ekspresyjnym jak to opisano wyżej.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, organizmem gospodarza może być komórka organizmu wyższego, taka jak komórka zwierzęca, w tym ssaka, komórka ptaka albo owada, albo komórka roślinna. Jednakże, w najkorzystniejszych wykonaniach, organizmem gospodarza jest komórka drobnoustroju, np. komórka bakterii albo grzyba, w tym komórka drożdży.

Przykładami odpowiedniego organizmu gospodarza są gatunki bakterii Gram-dodatnich takich jak Bacillaceae, w tym Bacillus subtilis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megatherium i Bacillus thuringensis, gatunki Streptomyces takie jak Streptomyces murinus, bakterie kwasu mlekowego takie jak Lactococcus sp., takie jak Lactococcus lactis, Lactobacillus sp., w tym Lactobacillus reuteri, Leuconostoc sp. i Streptococcus sp. Alternatywnie, szczepy gatunków Gram-ujemnych należące do Enterobacteriaceae, w tym E. coli albo Pseudomonaceae mogą być wybrane jako organizm gospodarza.

Organizm gospodarza drożdży może być korzystnie wybrany spośród gatunków Saccharomyces, w tym Saccharomyces cerevisiae albo gatunki należące do Schizosajjharomyjes. Odpowiednie organizmy gospodarzy wśród grzybów nitkowatych obejmuj ą gatunki Aspergil12

187 218 lus, np. Aspergillus oryzae, Aspergillus nidulans albo Aspergillus niger. Alternatywnie, jako organizm gospodarza mogą być zastosowane szczepy gatunków Fusarium, np. Fusarium oxysporum albo gatunki Rhizomucor, takie jak Rhizomucor miehei. W jednym korzystnym wykonaniu, jako organizm gospodarza zastosowano szczep gatunku Pichia pastoris.

Niektóre z powyższych przydatnych organizmów gospodarza, takie jak gatunki grzybów albo gatunki bakterii Gram-dodatnich mogą być transformowane procesem, który obejmuje tworzenie protoplastu i transformację protoplastów, a następnie regenerację ściany komórkowej w sposób znany per se.

Do wytwarzania aktywnego polipeptydu oksydazy heksozowej, komórki rekombinowanego organizmu gospodarza, jak to opisano wyżej, hodowane są w warunkach prowadzących do ekspresji polipeptydu w postaci możliwej do odzyskania. Pożywką stosowaną do hodowania komórek może być dowolna konwencjonalna pożywka odpowiednia do hodowania danych komórek gospodarza i uzyskiwania ekspresji polipeptydu. Odpowiednie pożywki są dostępne od dostawców albo mogą być wytwarzane według opublikowanych przepisów.

Powstały polipeptyd jest zwykle pozyskiwany z pożywki hodowlanej konwencjonalnymi procedurami obejmującymi oddzielenie komórek od pożywki przez wirowanie albo filtrowanie, jeżeli to konieczne, po zniszczeniu komórek, a następnie precypitowanie składników białkowych nadsączu albo filtratu np. przez dodanie soli, takiej jak siarczan amonu, a następnie odwirowanie.

Przydatnym przemysłowo aspektem wynalazku jest to, że hodowle drobnoustrojów takie jak np. hodowle bakteryjne, które są stosowane do wytwarzania produktów spożywczych i paszowych, mogą być stosowane jako organizm gospodarza wyrażający gen kodujący aktywny polipeptyd oksydazy heksozowej. Tak więc hodowle początkowe kwasu mlekowego, które stosuje się w wytwarzaniu produktów mleczarskich albo innych produktów spożywczych, takich jak produkty mięsne albo winiarskie, i które np. obejmują jeden lub wiele szczepów bakterii kwasu mlekowego, mogą być stosowane jako organizm gospodarza, w którym oksydaza heksozowa może być wytwarzana bezpośrednio w produktach spożywczych, do których dodaje się kulturę początkową.

Podobnie gen kodujący oksydazę heksozową według niniejszego wynalazku może być wprowadzany bezpośrednio do hodowli początkowych bakterii kwasu mlekowego, które są stosowane jako inokulaty dodawane do roślin paszowych, takich jak trawa albo kukurydza albo do odpadowych produktów białkowych pochodzenia zwierzęcego, takich jak ryby i materiał odpadowy rzeźni, do wytwarzania kiszonek do karmienia zwierząt. W tym cełu, ekspresja oksydazy heksozowej przez inokulaty kiszonek powinny spowodować, że tlen początkowo obecny w paszy albo materiale odpadowym, który ma być zakiszony, pozbawiony zostaje tlenu, co powinno zahamować wzrost aerobowych bakterii gnilnych, takich jak bakterie Gramdodatnie i drożdże.

Uwzględnia się również, że hodowle drożdży takich jak drożdże piekarskie albo hodowle drożdży, które się stosuje do wytwarzania napojów alkoholowych, w tym wina i piwa, mogą być zastosowane jako organizm gospodarza dla genu kodującego aktywny polipeptyd oksydazy heksozowej według niniejszego wynalazku. Przykładowo, w przypadku takich rekombinowanych szczepów drożdży piekarskich, wytwarzana oksydaza heksozowa powinna wykazywać działanie poprawiające ciasto, jak to opisano poniżej.

Z powyższego staje się oczywiste, że bezpośrednie dodanie rekombinacyjnych hodowli drobnoustrojów wyrażających oksydazę heksozową według niniejszego wynalazku do produktów spożywczych albo jakichkolwiek innych produktów, gdzie pożądana jest aktywność oksydazy heksozowej, może być zastosowane jako alternatywa dla dodawania izolowanego enzymu.

W dalszych przemysłowo ważnych wykonaniach, rekombinowane hodowle drobnoustrojów wyrażające aktywny polipeptyd oksydazy heksozowej są stosowane w bioreaktorze do wytwarzania enzymu albo do wytwarzania laktonów z wyżej wymienionych węglowodanów, które mogą być utleniane przez aktywny enzym - oksydazę heksozową. Do tego ostatniego .zastosowania, komórki kultur drobnoustrojów są korzystnie unieruchamiane na podłożu stałym takim jak materiał polimerowy, który jest korzystnie w postaci małych cząstek

187 218 w celu zapewnienia dużej powierzchni do wiązania komórek. Alternatywnie, izolowany enzym może być zastosowany do powyższych celów, również korzystnie związany z materiałem podłoża stałego. W tym połączeniu wiązanie komórek albo enzymu może być dokonane dowolnym konwencjonalnym sposobem.

W innych korzystnych wykonaniach wynalazku, polipeptyd o aktywności oksydazy heksozowej może być produktem fuzyjnym, tj. polipeptydem, który oprócz aktywnych sekwencji aminokwasowych oksydazy heksozowej obejmuje dalsze sekwencje aminokwasowe wykazujące inne przydatne aktywności. Tak więc, uwzględnia się polipeptydy fuzyjne wykazujące jedną lub wiele aktywności enzymatycznych oprócz aktywności oksydazy heksozowej. Taka dodatkowa aktywność enzymatyczna może być wybrana spośród enzymów zdolnych do rozkładania węglowodanów, takich jak laktaza, amylaz, w tym glukoamylaz, glukanaz, celulaz, hemicelulaz, ksylanaz, laktaz albo innych oksydoreduktaz takich jak oksydaza glukozowa, oksydaza galaktozowa albo oksydaza piranozowa, jak również spośród proteaz i peptydaz, lipaz albo nukleaz. Dodatkowe sekwencje wybrane do integracji z polipeptydem oksydazy heksozowej według niniejszego wynalazku zależą od produktu do jakiego przeznaczony jest enzymatycznie czynny produkt. Tak więc, jako przykład, uwzględnia się, że fuzyjny polipeptyd oksydazy heksozowej do zastosowania w wytwarzaniu produktu mleczarskiego korzystnie obejmuje laktazę, proteazę albo peptydazę, zaś produkt fuzyjny przeznaczony do poprawy ciasta może zawierać, jako partnera fuzji, dowolny spośród powyższych enzymów rozkładających węglowodany. Jest również oczywiste, że komórki drobnoustrojów według niniejszego wynalazku, które wyrażają aktywny fuzyjny polipeptyd oksydazy heksozowej wykazujący dodatkową aktywność enzymatyczną może być zastosowany do inokulacji innych produktów spożywczych i pasz zwierzęcych w sposób opisany wyżej.

Uwzględnia się również, że odpowiednim partnerem fuzji może być sekwencja zapewniająca zmienioną charakterystykę oksydazy heksozowej, taką jak rozpuszczalność albo sekwencja, która może służyć jako grupa znacznikowa, zapewniająca oksydazie heksozowej zdolność do silniejszego i bardziej wybiórczego wiązania się z konkretnym podłożem stałym w celu oczyszczania albo unieruchamiania polipeptydu oksydazy heksozowej. Ponadto, w zakresie niniejszego wynalazku leży dostarczenie polipeptydu jako produktu chimerycznego obejmującego częściowe sekwencje aktywnych polipeptydów oksydazy heksozowej z różnych źródeł i kodowanych przez fragment DNA, który skonstruowano przez połączenie sekwencji DNA kodujących aktywny polipeptyd oksydazy heksozowej z tych różnych źródeł we fragment DNA kodujący cały polipeptyd chimeryczny.

W jednym z przydatnych zastosowań sposobem według niniejszego wynalazku jest sposób, w którym fragment DNA kodujący aktywny polipeptyd oksydazy heksozowej obejmuje przynajmniej jedną sekwencję DNA kodującą sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej (i) Tyr-Glu-Pro-Tyr-Gly-Gly-Val-Pro (Identyfikator Sekw. Nr 1), (ii) Ala-Ile-Ile-Asn-Val-Thr-Gly-Leu-Val-Glu-Ser-Gly-Tyr-Asp-X-X-X-Gly-Tyr-X-ValSer-Ser (Identyfikator Sekw. Nr 2), (iii) Asp-Leu-Pro-Met-Ser-Pro-Arg-Gly-Val-Ile-Ala-Ser-Asn-Leu-X-Phe (Identyfikator Sekw. Nr 3), (iv) Asp-Ser-Glu-Gly-Asn-Asp-Gly-Glu-Leu-Phe-X-Ala-His-Thr (Identyfikator Sekw. Nr 4), (v) Tyr-Tyr-Phe-Lys (Identyfikator Sekw. Nr 5), (vi) Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Val-Ile-Asp-Val-Asn-Ala-Gly-Thr-X-Asp (Identyfikator Sekw.

Nr 6), (vii) Leu-Gln-Tyr-Gln-Thr-Tyr-Trp-Gln-Glu-Glu-Asp (Identyfikator Sekw. Nr 7) , (viii) X-Ile-Arg-Asp-Phe-Tyr-Glu-Glu-Met (Identyfikator Sekw. Nr 8) gdzie X oznacza aminokwas wybrany z grupy obejmującej Ala, Arg, Asn, Asp, Asx, Cys, Gin, Głu, Glx, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr i Val oraz ich muteiny i odmiany.

W niniejszym kontekście określenie „odmiana” oznacza dowolną modyfikację sekwencji aktywnego polipeptydu oksydazy heksozowej, który nie powoduje całkowitego zniesienia aktywności oksydazy heksozowej. Modyfikacje mogą obejmować delecję, zastąpienie reszt

187 218 aminokwasowych obecnych w polipeptydzie w postaci uzyskanej ze źródeł naturalnych albo w już zmodyfikowanej sekwencji polipeptydowej albo modyfikacja może powodować wprowadzenie do takiego polipeptydu dodatkowych reszt aminokwasowych. Zastąpienie jednej lub wielu reszt aminokwasowych może być przeprowadzone przez modyfikowanie albo zastępowanie kodonu albo kodonów kodujących aminokwas albo aminokwasy, których zastąpienie jest korzystne, np. przez mutagenezę, w szczególności ukierunkowaną mutagenezę, przy użyciu znanych per se metod. Podobnie, usunięcie jednego lub wielu aminokwasów może być wykonane przez usunięcie odpowiedniego kodonu albo kodonów we fragmencie DNA kodującym polipeptyd według niniejszego wynalazku.

Jak to wspomniano wyżej, sposób według niniejszego wynalazku może w dalszym etapie obejmować oczyszczanie preparatu polipeptydu początkowo pozyskanego z pożywki hodowlanej i/lub z mikroorganizmów. Celem dalszego etapu jest uzyskanie preparatu enzymu w którym polipeptyd oksydazy heksozowej jest w zasadniczo czystej postaci. Określenie „zasadniczo czysta postać” oznacza, że preparat jest bez niepożądanych substancji zanieczyszczających pochodzących z pożywki hodowlanej, komórek organizmu gospodarza albo substancji wytworzonych przez te komórki podczas hodowli. Tak więc, ważne jest dla wielu zastosowań, żeby preparat polipeptydu powstały w wyniku etapu oczyszczania był zasadniczo bez jakichkolwiek aktywności enzymatycznych nie będących aktywnością. oksydązy heksozowej. Metody oczyszczania zależą od stopnia czystości, który jest pożądany ale zwykle są wybrane spośród konwencjonalnych metod oczyszczania białka takich jak wysalanie, procedury chromatografii powinowactwa albo jonowymiennej, w tym chromatografii oddziaływań hydrofobowych oraz metod filtracji żelowej takich jak metoda opisana w poniższych przykładach.

Jak wspomniano wyżej, wynalazek dotyczy w dalszym aspekcie polipeptydu w postaci wyizolowanej, posiadającego aktywność oksydązy heksozowej, obejmującego przynajmniej jedną z powyższych sekwencji aminokwasowych albo ich muteiny albo odmiany, jak to opisano wyżej. Korzystnie, polipeptyd wytwarzany jest według metod opisanych wyżej.

W zależności od sposobu wytwarzania, w szczególności konkretnego zastosowanego organizmu gospodarza, polipeptyd według wynalazku może być glikozylowany w różnym stopniu, albo może być z pewnych względów korzystnie wyrażany w postaci zasadniczo nieglikozylowanej.

W najkorzystniejszym wykonaniu wynalazku, jest to taki polipeptyd, którego charakterystyka funkcjonalna jest identyczna co oksydazy heksozowej występującej naturalnie w gatunku alg Chondrus crispus, jak to opisano w stanie techniki. Stwierdzono, że taka oksydaza heksozowa ekstrahowana z alg po poddaniu jej SDS-PAGE jak to opisano tutaj, może wykazywać osobne prążki wielkości 29000,40000 i/lub 60000.

W celu uzyskania ogólnie ekonomicznego zastosowania polipeptydu, korzystne jest aby enzym miał wysoką aktywność właściwą w szerokim zakresie pH. Tak więc, korzystne jest aby oksydaza heksozowa według niniejszego wynalazku wykazywała przynajmniej aktywność enzymatyczną w zakresie pH od 1 do 9, takim jak 2-9, obejmującym zakres 5-9. Uwzględniane jest, że zakres pH aktywności, albo optimum pH naturalnie występującej oksydazy heksozowej, mógł być modyfikowany w pożądanym kierunku i pożądanym stopniu, przez modyfikowanie enzymu jak to opisano wyżej albo przez losową mutagenezę replikonu albo organizmu gospodarza zawierającego DNA kodujący oksydazę heksozowa, a następnie selekcję mutantów wykazujących pożądaną zmienioną charakterystykę pH. Alternatywnie, takie modyfikacje enzymu mogą być ukierunkowane na modyfikację tolerancji cieplnej i optimum temperaturowego aktywności aktywnego polipeptydu oksydazy heksozowej, albo zmiany punktu izoelektrycznego enzymu.

Ponadto, polipeptyd według niniejszego wynalazku jest korzystnie enzymatycznie czynny w szerokim zakresie temperatur od 10-90°C, np. w zakresie 15-80°C w tym w zakresie 2060°C. W szczególności, może być korzystne dla pewnych celów żeby polipeptyd oksydazy heksozowej zachowywał istotną resztkową aktywność enzymatyczną w temperaturze 70°C i wyższej, np. gdy enzym przeznaczony jest do zastosowania w cieście, gdzie może być przydatne posiadanie aktywności oksydazy heksozowej podczas ostatniego etapu po którym następuje pieczenie.

187 218

Zakres zastosowania oksydazy heksozowej zależy od zakresu węglowodanów, które można zastosować jako substraty. Jakkolwiek oksydaza heksozową wydaje się mieć najwyższą swoistość substratową wobec heksoz, takich jak glukoza, galaktoza i mannoza, stwierdzono, że zakres węglowodanów, które mogą być wykorzystane jako substraty polipeptydów według wynalazku nie jest ograniczony do heksoz. Tak więc, korzystnym polipeptydem jest taki polipeptyd, który oprócz wysokiej swoistości wobec heksoz wykazuje również swoistość wobec innych węglowodanów, obejmujących disacharydy takie jak laktoza, maltoza i/lub celobioza, a nawet istotną swoistość wobec pentoz, obejmujących przykładowo ksylozę albo dezoksypentoz albo dezoksyheksoz takich jak ramnoza albo fbkoza. Ma istotne praktyczne implikacje to, że oksydaza heksozową oprócz wysokiej swoistości wobec heksoz i innych monosacharydów wykazuje również istotną swoistość wobec disacharydów, w szczególności laktozy obecnej w mleku i maltozy, która m.in. występuje w mące i ciastach ze zbóż.

Nawiązując, w innym korzystnym wykonaniu polipeptyd według niniejszego wynalazku jest to taki polipeptyd, który oprócz D-glukozy utlenia przynajmniej jeden cukier wybrany z grupy obejmującej D-galaktozę, maltozę, celobiozę, laktozę, D-mannozę, D-fiikozę i D-ksylozę.

W jeszcze innym najkorzystniejszym wykonaniu aktywny polipeptyd oksydazy heksozowej ma punkt izoelektryczny w zakresie 4-5. Konkretnie, polipeptyd może korzystnie mieć punkt izoelektryczny równy 4,3 ±0,1 albo 4,5 ± 0,1.

Ogólnie, polipeptyd według niniejszego wynalazku zwykle posiada ciężar cząsteczkowy określony przez filtrację żelową przy użyciu Sephacryl S-200 Superfine (Pharmacia) leżący w zakresie 100000-150000. Ciężar cząsteczkowy określony tą albo równoważnymi metodami jest również określony jako rzeczywisty ciężar cząsteczkowy. Konkretnie, polipeptyd może mieć rzeczywisty ciężar cząsteczkowy rzędu 110000 ± 10000.

W jeszcze dalszym aspekcie, Wynalazek dostarcza rekombinowanej cząsteczki DNA obejmującej fragment DNA kodujący polipeptyd wykazujący aktywność oksydazy heksozowej. Jak to opisano wyżej, taki fragment DNA może być wyizolowany ze źródeł naturalnych albo może być skonstruowany np. jak to opisano szczegółowo w poniższych przykładach. Ponadto, fragment kodujący może być również syntetyzowany w oparciu o sekwencję aminokwasową naturalnie występujących oksydaz heksozowych. Rekombinowana cząsteczka może być wybrana z grupy wektorów ekspresyjnych dowolnego rodzaju opisanych wyżej. W najkorzystniejszym wykonaniu, rekombinowana cząsteczka DNA obejmuje fragment DNA kodujący polipeptyd oksydazy heksozowej, który obejmuje przynajmniej jedną z sekwencji od (i) do (viii) albo muteinę albo pochodną takiego polipeptydu. W konkretnym wykonaniu, rekombinowana cząsteczka DNA obejmuje poniższą sekwencję DNA (Identyfikator Sekw. Nr 30):

TGAATTCGTG GGTCGAAGAG CCCTTTGCCT CGTCTCTCTG GTACCGTGTA TGTCAAAGGT 60

TCGCTTGCAC ACTGAACTTC ACG ATG GCT ACT CTT CCT CAG AAA GAC CCC 110

GGT

TAT

ATT

GTA

ATT

GAT

GTC

AAC

GCG

GGC

ACC

GCG

GAC

AAG

CCG

GAC

158

CCA

CGT

CTC

CCC

TCC

ATG

AAG

CAG

GGC

TTC

AAC

CGC

CGC

TGG

ATT

GGA

206

ACT

AAT

ATC

GAT

TTC

GTT

TAT

GTC

GTG

TAC

ACT

CCT

CAA

GGT

GCT

TGT

254

ACT

GCA

CTT

GAC

CGT

GCT

ATG

GAA

AAG

TGT

TCT

CCC

GGT

ACA

GTC

AGG

302

ATC

GTC

TCT

GGC

GGC

CAT

TGC

TAC

GAG

GAC

TTC

GTA

TTT

GAC

GAA

TGC

350

GTC

AAG

GCC

ATC

ATC

AAC

GTC

ACT

GGT

CTC

GTT

GAG

AGT

GGT

TAT

GAC

398

GAC

GAT

AGG

GGT

TAC

TTC

GTC

AGC

AGT

GGA

GAT

ACA

AAT

TGG

GGC

TCC

446

TTC

AAG

ACC

TTG

TTC

AGA

GAC

CAC

GGA

AGA

GTT

CTT

CCC

GGG

GGT

TCC

494

TGC

TAC

TCC

GTC

GGC

CTC

GGT

GGC

CAC

ATT

GTC

GGC

GGA

GGT

GAC

GGC

542

187 218

ATT

TTG

GCC

CGC

TTG

CAT

GGC

CTC

CCC

GTC

GAT

TGG

CTC

AGC

GGC

GTG

590

GAG

GTC

GTC

GTT

AAG

CCA

GTC

CTC

ACC

GAA

GAC

TCG

GTA

CTC

AAG

TAT

638

GTG

CAC

AAA

GAT

TCC

GAA

GGC

AAC

GAC

GGG

GAG

CTC

TTT

TGG

GCA

CAC

686

ACA

GGT

GGC

GGT

GGC

GGA

AAC

TTT

GGA

ATC

ATC

ACC

AAA

TAC

TAC

TTC

734

AAG

GAT

TTG

CCC

ATG

TCT

CCA

CGG

GGC

GTC

ATC

GCA

TCA

AAT

TTA

CAC

782

TTC

AGC

TGG

GAC

GGT

TTC

ACG

AGA

GAT

GCC

TTG

CAG

GAT

TTG

TTG

ACA

830

AAG

TAC

TTC

AAA

CTT

GCC

AGA

TGT

GAT

TGG

AAG

AAT

ACG

GTT

GGC

AAG

878

TTT

CAA

ATC

TTC

CAT

CAG

GCA

GCG

GAA

GAG

TTT

GTC

ATG

TAC

TTG

TAT

926

ACA

TCC

TAC

TCG

AAC

GAC

GCC

GAG

CGC

GAA

GTT

GCC

CAA

GAC

CGT

CAC

974

TAT

CAT

TTG

GAG

GCT

GAC

ATA

GAA

CAG

ATC

TAC

AAA

ACA

TGC

GAG

CCC

1022

ACC

AAA

GCG

CTT

GGC

GGG

CAT

GCT

GGG

TGG

GCG

CCG

TTC

CCC

GTG

CGG

1070

CCG

CGC

AAG

AGG

CAC

ACA

TCC

AAG

ACG

TCG

TAT

ATG

CAT

GAC

GAG

ACG

1118

ATG

GAC

TAC

CCC

TTC

TAC

GCG

CTC

ACT

GAG

ACG

ATC

AAC

GGC

TCC

GGG

1166

CCG

AAT

CAG

CGC

GGC

AAG

TAC

AAG

TCT

GCG

TAC

ATG

ATC

AAG

GAT

TTC

1214

CCG

GAT

TTC

CAG

ATC

GAC

GTG

ATC

TGG

AAA

TAC

CTT

ACG

GAG

GTC

CCG

1262

GAC

GGC

TTG

ACT

AGT

GCC

GAA

ATG

AAG

GAT

GCC

TTA

CTC

CAG

GTG

GAC

1310

ATG

TTT

GGT

GGT

GAG

ATT

CAC

AAG

GTG

GTC

TGG

GAT

GCG

ACG

GCA

GTC

1358

GCG

CAG

CGC

GAG

TAC

ATC

ATC

AAA

CTG

CAG

TAC

CAG

ACA

TAC

TGG

CAG

1406

GAA

GAA

GAC

AAG

GAT

GCA

GTG

AAC

CTC

AAG

TGG

ATT

AGA

GAC

TTT

TAC

1454

GAG

GAG

ATG

TAT

GAG

CCG

TAT

GGC

GGG

GTT

CCA

GAC

CCC

AAC

ACG

CAG

1502

GTG

GAG

AGT

GGT

AAA

GGT

GTG

TTT

GAG

GGA

TGC

TAC

TTC

AAC

TAC

CCG

1550

GAT

GTG

GAC

TTG

AAC

AAC

TGG

AAG

AAC

GGC

AAG

TAT

GGT

GCC

CTC

GAA

1598

CTT

TAC

TTT

TTG

GGT

AAC

CTG

AAC

CGC

CTC

ATC

AAG

GCC

AAA

TGG

TTG

1646

TGG

GAT

CCC

AAC

GAG

ATC

TTC

ACA

AAC

AAA

CAG

AGC

ATC

CCT

ACT

AAA

1694

CCT

CTT

AAG

GAG

CCC

AAG

CAG

ACG

AAA

TAGTAGGTCA CAATTAGTCA

1741

TCGACTGAAG TGCAGCACTT GTCGGATACG GCGTGATGGT TGCTTTTTAT AAACTTGGTA 1801

187 218

Ponadto, wynalazek dostarcza w innym aspekcie komórki drobnoustroju, która zawiera powyższą rekombinowaną cząsteczkę DNA. Powyższy ogólny opis organizmu gospodarza obejmującego fragment DNA kodujący polipeptyd według niniejszego wynalazku, obejmuje taką komórkę drobnoustroju i komórka taka może być wybrana z dowolnej z wyżej wymienionych grup, rodzin, rodzajów i gatunków drobnoustrojów, tj. komórka drobnoustroju może być wybrana spośród komórek bakteryjnych, grzybów i drożdży, w tym przykładowo komórek E. coli, komórek bakterii kwasu mlekowego, komórek Saccharomyces ckrkvisiak i komórek Pichia pastoris.

Komórka drobnoustroju według niniejszego wynalazku, jeżeli przeznaczona jest do bezpośredniego dodania do produktu, gdy jest to pożądane posiada aktywność oksydazy heksozowej, np. podczas procesu wytwarzania może być dostarczona w postaci hodowli drobnoustroju, korzystnie w postaci skondensowanej. Tak więc, taka kultura może korzystnie zawierać komórkę drobnoustroju według niniejszego wynalazku w gęstości, które korzystnie zawiera się w zakresie od 10i do 10^ na gram hodowli. Hodowla taka może być w postaci świeżej, tj. nie zamrożoną zawiesiną komórek w pożywce płynnej, albo może być w postaci zamrożonej albo wysuszonej, np. kultury liofilizowanej. Komórka drobnoustroju może być również dla konkretnych celów unieruchomiona na podłożu stałym.

Jak wspomniano powyżej, wynalazek dotyczy w dalszym aspekcie zastosowania aktywnego polipeptydu oksydazy heksozowej według niniejszego wynalazku albo komórki drobnoustroju wyrażającej ten polipeptyd w wytwarzaniu produktów spożywczych. W tym kontekście· określenie „wytwarzanie” powinno być rozumiane w najszerszym sensie, w taki sposób, że obejmuje dodanie oksydazy heksozowej albo komórki drobnoustroju do składników danego produktu spożywczego, przed, podczas albo po dowolnym kolejnym etapie, podczas pakowania i podczas składowania produktu końcowego, aż do momentu konsumpcji. Produkty spożywcze, gdy takie zastosowanie jest korzystne, mogą być dowolnymi produktami w których produkt końcowy oksydazy heksozowej zapewnia korzystny wpływ produktu spożywczego.

Naturalnie, pożądana aktywność oksydazy heksozowej uzyskiwana jest wyłącznie jeżeli substrat enzymu jest obecny w odpowiednich ilościach. Substraty węglowodanowe mogą być naturalnie obecne w produkcie spożywczym albo jego składniku, albo mogą być dodane albo wytworzone podczas procesu wytwarzania. Przykładem substratu wytworzonego podczas procesu wytwarzania, jest degradacja di-, oligo- albo polisacharydów do niższych cukrów, które są rozkładane przez oksydazę heksozową, co może nastąpić w wyniku aktywności enzymatycznej naturalnie obecnej w produkcie spożywczym albo dodanej podczas wytwarzania. Ponadto, substrat dla aktywnego polipeptydu oksydazy heksozowej może być wytworzony w wyniku aktywności enzymatycznej partnera fuzji jak to opisano wyżej.

Pożądane efekty aktywności oksydazy heksozowej w produkcie zawierającym substraty dla enzymu obejmują wytwarzanie laktonów z cukrów będących Substratem, które mogą być następnie przekształcone do odpowiednich kwasów, z wytworzeniem nadtlenku wodoru albo ze zużyciem tlenu.

Typowe przykłady produktów spożywczych, w których aktywność oksydazy heksozowej może być korzystna obejmują produkty mleczne, produkty spożywcze zawierające skrobię i napoje nie mleczne. Tak więc, w wytwarzaniu szerokiej gamy produktów mleczarskich pożądane jest obniżenie pH. Jest to konwencjonalnie uzyskiwane przez inokulację mleka kulturami początkowymi wytwarzającymi kwas mlekowy. Jak wspomniano powyżej, uwzględnia się, że oksydaza heksozową albo organizm wyrażający ten enzym może być zastosowany jako alternatywny sposób zakwaszania mleka. Ten sam efekt może być pożądany w innych produktach spożywczych, które są zakwaszane podczas wytwarzania, takich jak niektóre produkty mięsne i warzywne, które są obecnie zakwaszane przez dodanie kultur początkowych bakterii kwasu mlekowego.

Zużycie tlenu spowodowane aktywnością oksydazy heksozowej ma szereg korzystnych skutków w odniesieniu do wytwarzania produktów spożywczych i farmaceutycznych. Przez zmniejszenie zawartości albo usunięcie tlenu w pożywieniu albo farmaceutykach zawierających lipidy, które są wrażliwe na procesy utleniania, oksydaza heksozową może działać jako

187 218 przeciwutleniacz i dodatkowo, zmniejszenie ilości tlenu może zahamować wzrost organizmów gnilnych, który to wzrost jest zależny od obecności tlenu, tak więc aktywny polipeptyd oksydazy heksozowej może również działać jako czynnik antybakteryjny.

Ten ostatni efekt może być wykorzystany w celu wydłużenia okresu przechowywania paczkowanego pożywienia, gdzie można zapobiec gniciu przez włączenie aktywnego polipeptydu oksydazy heksozowej według niniejszego wynalazku do samego produktu spożywczego, albo przez dostarczenie mieszaniny oksydazy heksozowej i odpowiedniego substratu w opakowaniu, ale osobno od zawartości produktu spożywczego. W typowym przykładzie, mieszanina taka jest dołączona na wewnętrznej stronie pojemnika z pożywieniem, takiego jak np. puszka albo słoik. Nawiązując, oksydaza heksozowa według niniejszego wynalazku może być zastosowana jako czynnik usuwający tlen w pojemniku z żywnością.

Oczywiste jest, że powyższe efekty polipeptydu według niniejszego wynalazku w wytwarzaniu produktów spożywczych będą również możliwe do zastosowania w wytwarzaniu paszy dla zwierząt. W szczególności, efekty te są pożądane w wytwarzaniu kiszonek wytwarzanych albo z upraw pastewnych, takich jak trawa albo kukurydza albo z białkowych produktów ubocznych rzeźni albo przetwórni ryb. Takie produkty paszowe są silosowane przez dodanie kwasów albo bakterii wytwarzających kwas, takich jak inokulaty bakterii kwasu mlekowego. W celu ułatwienia wzrostu zakwaszających bakterii oraz w celu zapobieżenia wzrostu tlenowych organizmów gnilnych takich jak bakterie Gram-ujemne i drożdże, istotne jest aby uzyskać niskie stężenie tlenu w silosowanym materiale. Uwzględnia się więc, że oksydaza heksozowa według niniejszego wynalazku jest przydatna jako czynnik usuwający tlen albo zakwaszający w silosowaniu paszy, ewentualnie w postaci kompozycji dalej obejmującej jeden albo wiele konwencjonalnych dodatków kiszonkowych, takich jak inokulaty bakterii kwasu mlekowego albo enzymy, które wytwarzają niskocząsteczkowe substancje cukrowcowe.

Dalszym korzystnym zastosowaniem polipeptydu oksydazy heksozowej według niniejszego wynalazku jest zastosowanie enzymu do zmniejszania zawartości cukru w produktach spożywczych, obejmującym dodanie do produktu pewnej ilości polipeptydu albo komórki drobnoustroju wytwarzającej polipeptyd, w ilości wystarczającej do usunięcia przynajmniej części cukru początkowo obecnej w produkcie spożywczym. Takie zastosowanie może być np. korzystne w wytwarzaniu produktów dla pacjentów z cukrzycą, gdzie pożądana jest niska zawartość cukru oraz wytwarzaniu win o zmniejszonej zawartości alkoholu. W tym ostatnim zastosowaniu, oksydaza heksozowa jest korzystnie dodawana do moszczu przed inokulacją drożdżami.

W dalszym korzystnym aspekcie, wynalazek dotyczy zastosowania aktywnego polipeptydu oksydazy heksozowej albo komórki drobnoustroju wytwarzającej ten enzym według niniejszego wynalazku w wytwarzaniu produktów farmaceutycznych, kosmetycznych albo produktów higieny jamy ustnej, takich jak pasty do zębów. Pożądany efekt oksydazy heksozowej w tych produktach został opisany powyżej w odniesieniu do produktów spożywczych i pasz zwierzęcych.

Szczególnie interesującym zastosowaniem oksydazy heksozowej według niniejszego wynalazku jest jej zastosowanie jako czynnika poprawiającego ciasto. Stwierdzono, że dodanie oksydazy heksozowej do ciasta powoduje zwiększoną odporność na pieczenie gdy ciasto jest rozciągnięte, tj. enzym zapewnia zwiększoną wytrzymałość ciasta, dzięki czemu staje się ono mniej wrażliwe na odkształcenia mechaniczne. Oznacza to, że w oparciu o znany wpływ oksydazy glukozowej, uwzględnia się, że ten efekt dodania oksydazy heksozowej według niniejszego wynalazku do ciasta powoduje tworzenie usieciowania pomiędzy grupami tiolowymi aminokwasów zawierających siarkę w białkach mąki, co zachodzi gdy nadtlenek wodoru wytworzony przez enzym w cieście reaguje z grupami tiolowymi, które w ten sposób utleniają się.

Nawiązując, wynalazek dostarcza również sposobu wytwarzania produktów piekarniczych z ciasta, obejmującego dodanie do ciasta skutecznej ilości polipeptydu albo drobnoustroju według niniejszego wynalazku, które są zdolne do wyrażania tego polipeptydu i kompozycji ulepszającej ciasto zawierającej polipeptyd albo mikroorganizm zdolny do wyrażania takiego polipeptydu w cieście, i przynajmniej jednego konwencjonalnego składnika ciasta. W przydatnym wykonaniu, taka kompozycja może dalej zawierać co najmniej jeden enzym

187 218 poprawiający ciasto albo produkt piekarniczy, np. wybrany spośród celulazy, hemicelulazy, pentozanazy, lipazy, ksylazy, amylazy, oksydazy glukozowej i proteazy.

W jeszcze dalszym aspekcie wynalazku, oksydaza heksozowa stosowana jest jako odczynnik analityczny w sposobie określania w biologicznych i innych próbkach stężenia dowolnego cukru, który może być przekształcany przez enzym. Zwykle, zawartość cukru jest mierzona przez określenie ilości produktu końcowego powstałego na skutek przekształcenia enzymatycznego cukru stanowiącego substrat obecnego w mierzonej próbce. W ten sposób, uwzględnia się, że oksydaza heksozowa może być stosowna bezpośrednio jako odczynnik w teście diagnostycznym in vitro albo może być wbudowana w czujnik.

Wynalazek zostanie poniżej opisany w przykładowy sposób w następujących przykładach i dołączonych rysunkach, na których:

Figura 1 pokazuje przegląd schematyczny oczyszczania oksydazy heksozowej (HOX) oraz dwie strategie wykorzystane do uzyskania informacji o sekwencji aminokwasowej.

Figura 2 pokazuje natywną, nie-dysocjującą elektroforezę na żelu poliakrylamidowym (natywną PAGE) preparatów oksydazy heksozowej na różnych etapach oczyszczania. Próbki oznaczaj ą preparaty enzymatyczne uzyskane po chromatografii anionowymiennej i zatężaniu (ścieżka 1), po filtracji żelowej (ścieżka 2) i albo po chromatografii kationowymiennej, (ścieżka 3) albo ogniskowaniu izoelektrycznym (ścieżka 4). Phast gel (Pharmacia) barwiono srebrem. Ciężary cząsteczkowe wzorca białek (x 10'³) wskazane są po lewej. Prążek odpowiadający oksydazie heksozowej, który jest wskazany strzałką, został zidentyfikowany przez znakowanie enzymu na innym żelu puszczonym równolegle (nie pokazano). Cztery ścieżki puszczono na osobnych żelach.

Figura 3 pokazuje profil UV, uzyskany podczas oczyszczania oksydazy heksozowej przez filtrację żelową na Sephacryl S-200 HR, jak to opisano w tekście. Frakcje zawierające oksydazę heksozową (HOX) zaznaczono wypełnionym obszarem.

Figura 4 pokazuje SDS-PAGE oksydazy heksozowej oczyszczonej z Chondrus crispus przez chromatografię anionowymienną na DEAE-Sepharose Fast Flow, filtrację żelowa na sephacryl S-200, a następnie przez chromatografię kationowymienną na S-Sepharose Fast Flow (ścieżka 1) albo ogniskowanie chromatograficzne na kolumnie Mono P (ścieżka 2). Ciężary cząsteczkowe wzorca białek (x 10’³) zaznaczono po lewej stronie. Polipeptydy o ciężarze cząsteczkowym 60000, 40000 i 29000 zaznaczono strzałkami. Zredukowane próbki puszczono na 12% żelu poliakrylamidowym, który barwiono błękitem brylantowym Coomassie R-250. Dwie ostatnie ścieżki puszczono na osobnych żelach.

Figura 5 pokazuje ogniskowanie izoelektryczne (IEF) oksydazy heksozowej. Żel barwiono albo błękitem brylantowym Coomassie R-250 (ścieżka 1), albo znakowano aktywnością enzymatyczną, jak to opisano w tekście (ścieżka 2). Położenie znaczników punktu izoelektrycznego puszczonych równolegle zaznaczono po lewej stronie. Dwie ścieżki puszczono na osobnych żelach.

Figura 6 pokazuje rozdział HPLC w odwróconej fazie, peptydów wytworzonych przez trawienie polipeptydu HOX wielkości 40000 endoproteinazą Lys-C. Sygnały oznaczone 1, 2, 3, 4 i 5 poddano sekwencjonowaniu aminokwasów.

Figura 7 pokazuje rozdział HPLC w odwróconej fazie peptydów wytworzonych przez trawienie polipeptydu HOX wielkości 40000 endoproteinazą Lys-C. Sygnały oznaczone 1 i 2 poddano sekwencjonowaniu aminokwasów.

Figura 8 pokazuje badanie metodą Northern błot RNA ekstrahowanego z Chondrus crispus. Denaturujący żel agarozowy załadowano 30 pg (ścieżka 1) albo 3 pg (ścieżka 2) całkowitego RNA. Lewa strzałka pokazuje transkrypt swoisty dla oksydazy heksozowej. Położenia wzorca ciężaru cząsteczkowego w kb pokazano po prawej stronie.

Figura 9 pokazuje konstruowanie plazmidu pUP0153, który pośredniczy w ekspresji rekombinowanej oksydazy heksozowej w Pichia pastoris. Małe strzałki pokazują startery PCR. Szara ramka pokazuje gen oksydazy heksozowej.

Figura 10 pokazuje oczyszczanie rekombinowanej oksydazy heksozowej z Pichia pastoris, przez chromatografię anionowymienną na kolumnie HiTrap-Q (etap pierwszy). Aktyw20

187 218 ność oksydazy alkoholu (AOX) (·) i aktywność oksydazy heksozowej (HOX) (O) w zebranych frakcjach badano jak to opisano w tekście.

Figura 11 pokazuje oczyszczanie rekombinowanej oksydazy heksozowej z Pichia pastoris przez filtrację żelową na Sephacryl S-200 HR (etap drugi). Aktywność oksydazy alkoholowej (AOX) (·) i aktywność oksydazy heksozowej (HOX) (O) w zebranych frakcjach badano jak to opisano w tekście.

Figura 12 pokazuje konstruowanie plazmidu pUP0181, który pośredniczy w ekspresji rekombinowanej oksydazy heksozowej w E. coli. Małe strzałki pokazują startery PGR. Szara ramka pokazuje gen oksydazy heksozowej.

Figura 13 pokazuje SDS-PAGE rekombinowanej oksydazy heksozowej wytworzonej w E. coli. Surowe ekstrakty poddanych lizie komórek analizowano na 14% żelu denaturującym. Ciężary cząsteczkowe wzorców białek (x10’³) zaznaczono po lewej stronie. Żel barwiono błękitem brylantowym Coomassie R-250. Ścieżka 1 pokazuje ekstrakt z E. coli z pUP0181, ścieżka 2 pokazuje kontrolę bez plazmidu. Strzałka pokazuje prążek oksydazy heksozowej.

Figura 14 pokazuje konstruowanie plazmidu pUP0155, który pośredniczy w ekspresji rekombinowanej oksydazy heksozowej w Saccharomyces cerevisiae. Małe strzałki pokazują startery PCR. Szara ramka pokazuje gen oksydazy heksozowej.

Przykład 1.

Oczyszczanie oksydazy heksozowej z Chondrus crispus

Schematyczny przegląd oczyszczania i dwóch strategii zaadaptowanych do uzyskania sekwencji aminokwasowej enzymu pokazano na Fig. 1.

1.1. Zbieranie, suszenie i mielenie Chondrus crispus

Czerwone wodorosty Chondrus crispus zebrano od kwietnia do września na wybrzeżu w pobliżu Grena, Jutlandia, Dania na głębokości 2-5 metrów. Świeżo zebrane plechy alg zanurzono w zimnej wodzie i przechowywano na lodzie podczas transportu do laboratorium (< 24 godziny). Wodorosty suszono natychmiast albo przechowywano w stanie zamrożonym do dalszego przetwarzania. W celu izolacji enzymu, materiał przechowywano w -18°C, podczas gdy materiał przeznaczony do izolowania mRNA przechowywano w ciekłym azocie.

Plechy Chondrus crispus rozmrożono w 4°C i suszono na powietrzu w temperaturze pokojowej (20-25°C) przez 2-3 dni. Wysuszony materiał mielono na drobny proszek w młynku Waring Commercial Blender (model 34BL97, Waring, New Harford, Connecticut, USA).

1.2. Ekstrakcja enzymu

Około 500 g proszku z Chondrus crispus zmieszano z 2,5 l 20 mM Tris-Cl, pH 7,0. Wodę stosowaną w trakcie całej ekstrakcji i procedury oczyszczania otrzymano z układu Milli-Q UF Plus Laboratory Water Purification System (Millipore). Bufor schłodzono uprzednio do 4°C. Mieszaninę trzymano w 4°C przez 6-8 dni. Ekstrakt zebrano przez przefiltrowanie przez kilka warstw gazy.

Materiał z wodorostów poddano kolejnym ekstrakcjom, które przeprowadzono jak pierwszą opisaną wyżej. Materiał zwykle usuwano po 5-8 ekstrakcjach, gdy aktywność resztkowa zmniejszała się do nieznacznych wartości.

Filtrat klarowano przez odwirowanie przy 10000 x g w rotorze Sorvall GSA (Sorvall Instruments). Nadsącz filtrowano przez papier chromatograficzny Whatman (chr 1) i rozcieńczano wodą do przewodnictwa równego 7-8 mS/cm. pH doprowadzono do 7,5. Ekstrakt był gotów do chromatografii anionowymiennej jak opisano niżej.

1.3. Test na oksydazą heksozową

Zastosowano procedurę zasadniczo identyczną z opisaną przez Sullivan i Ikawa, 1973. Test ten opiera się na zasadzie, że nadtlenek wodoru wytworzony w trakcie utleniania cukru w obecności peroksydazy reaguje z substancją chromogenną, o-dianizydyną, tworząc barwnik z maksimum absorbancji przy długości fali 402 ran.

Mieszanina testowa składała się z 370 pl 0,1 M buforu fosforanu sodu, pH 7,0; 462 pl 0,1 M D-glukozy w 0,1 M buforze fosforanu sodu, pH 7,0; 9 pl peroksydazy chrzanowej, 0,1 mg/ml w wodzie (Sigma Chemicals, nr kat. P-6782 albo Boehringer Mannheim, n kat. 814 393);

187 218 i 9 μΐ o-dianizydyny *2HC1, 3,0 mg/ml w wodzie (3,3'-dimetoksy-benzydyna, Sigma Chemicals). Po inkubacji w temperaturze pokojowej przez 15-30 minut test zatrzymywano przez dodanie kropli 37% HCl (Merck, p.a.). Próbki po 100 ul przenoszono z probówek testowych do studzienek płytki do mikromiareczkowania (NUNC, Dania) i odczytywano absorbancję przy długości fali 410 nm na czytniku płytek Titertek Multiscan II PLUS (Labsystems/Flow Laboratories Finlandia) W celu upewnienia się, że obserwowana aktywność pochodziła z oksydazy heksozowej, a nie oksydazy glukozowej. Test co jakiś czas wykonywano z Dgalaktozą zamiast D-glukozą.

1.4. Chromatografia anionowymienna

Ten etap przeprowadzono na układzie chromatograficznym BioPilot (Pharmacia Biotech, Szwecja) połączonym z kolektorem frakcji SuperRac (LKB-Produkter AB, Szwecja).

Ten i następne etapy oczyszczania przeprowadzano w temperaturze pokojowej (2025°C), ale kolektor frakcji umieszczono w chłodni, tak, że zebrane frakcje przechowywano w 4°C do momentu wykonania testu enzymatycznego. Rejestrowano absorbancję przy 280 nm i przewodnictwo. Ekstrakt wprowadzono do kolumny ΧΚ5Ο/3Ο (Pharmacia, 5,0 x 25 cm) z objętością złoża równą 500 ml, którą stanowiła DEAE-Sepharose Fast Flow (Pharmacia), zrównoważona buforem A: 20 mM Tris-Cl, pH 7,5. Prędkość przepływu wynosiła 5 ml/min., podczas wprowadzania próbki i 10 ml/min. Podczas kolejnych etapów chromatografii. Po wprowadzeniu próbki kolumnę płukano 1200 ml buforu A. Adsorbowane białka eluowano 2800 ml gradientu od 0 do 100% buforu B: 20 mM Tris-Cl, 500 mM NaCl, pH 7,5. Zbierano frakcje po 15 ml.

Po każdym przebiegu chromatografii kolumnę regenerowano 500 ml 0,5 M NaOH, neutralizowano 500 ml 1,0 M Tris-Cl pH 7,5 i równoważono 1200 ml buforu A. Zebrane frakcje badano na aktywność oksydazy heksozowej jak to opisano wyżej (40 μΐ próbki, 30 minut inkubacji). Frakcje aktywności oksydazy heksozowej pulowano i przechowywano w 4°C.

1.5. Zatężanie frakcji zawierających aktywność oksydazy heksozowej

Kilka pul frakcji z chromatografii na DEAE-Sepharose połączono i zatężano przez ultrafiltrację w układzie Millipore Lab Ultrafiltration Cassette System (nr kat. XX420LCS0). Układ wyposażono w komorę z membraną o nominalnym ciężarze cząsteczkowym odcięcia równym 30000 (nr kat. PTTKOLCP2) i napędzano pompą perystaltyczną. Po zatężeniu w temperaturze pokojowej do około 50 ml, preparat enzymu dalej zatężano do 10-20 ml przez ultrafiltrację w 4°C w urządzeniu Centriprep (Amicon, USA, NMWC = 30000) według instrukcji producenta. Zatężony roztwór enzymu przechowywano w 4°C.

1.6. Elektroforeza na żelu poliakrylamidowym natywnego białka (PAGE)

Kompozycja preparatu enzymu uzyskana przez chromatografię jonowymienną i ultrafiltrację analizowano przez PAGE na układzie Pharmacia Phast System, patrz. Fig. 2. Puszczono żele o gradiencie 8-25% i znakowano srebrem według instrukcji producenta. Z Pharmacia zakupiono również zestaw zawierający poniższe wzorce ciężaru cząsteczkowego: tyreoglobulina (669000); ferrytyna (440000); katalaza (232000); dehydrogenaza mleczanowa (140000) i albumina (67000).

Znakowanie na aktywność oksydazy heksozowej przeprowadzono jak to opisano dla oksydazy glukozowej przez Sock i Rohringer (1988). Zasada testu polegała na tym, że reakcja redoks katalizowana przez oksydazę glukozowej albo oksydazę heksozową sprzęgnięto z redukcją soli tetrazolowej do kolorowego, nierozpuszczalnego formazanu.

Bezpośrednio po elektroforezie, żel Phast zanurzono w 10 ml świeżo przygotowanego roztworu barwiącego zawierającego: 0,1 M D-glukozę (albo D-galaktozę); 85 mM bufor kwasu cytrynowego/fosforany sodu pH 6,5; 0,2 mg/ml bromku 3-(4,5-dimetylotiazolo-2-ilo)-2,5-difenylotetrazolowego („thiazolyl blue”, MTT, Sigma Chemicals, nr kat. M 2128); i 0,1 mg/ml soli siarczanowej N-metylo-dibenzopirazyno-metylu („phenazin methosulphate”, PMS, Sigma Chemicals, nr kat. P 9625). Żel inkubowano w temperaturze pokojowej w ciemności, dopóki nie pojawił się wyraźnie widoczny fioletowy prążek (zwykle 5-90 minut), a następnie płukano 10% kwasem octowym, 5% glukozą i suszono na powietrzu.

187 218

Żel barwiony srebrem pokazano na Fig. 2, ścieżka 1. Jak widać na Fig. na tym etapie oczyszczania widoczne były liczne białka. Jednakże, przez znakowanie enzymatyczne zabarwił się wyłącznie jeden prążek zaznaczony strzałką na Fig. 2. (wynik nie pokazany).

1.7. Filtracja żelowa

Ten etap oczyszczania przeprowadzono na układzie FPLC (Pharmacia) wyposażonym w kolumnę XK26/70 (2,6 x 66 cm, Pharmacia) o objętości złoża równej 350 ml. Kolumnę upakowano żelem Sephacryl S-200 HR (Pharmacia) według instrukcji producenta. Buforem był 20 mM Tris-Cl, 500 mM NaCl, pH 7,5, zaś prędkość przepływu wynosiła 5 ml/minutę. Rejestrowano absorbancję przy 280 nm. Na kolektorze frakcji FRaC-100 zbierano frakcje po 2,5 ml (Pharmacia), które następnie umieszczano w lodówce (4°C) po FPLC. Zatężony preparat oksydazy heksozowej odwirowano przy 30000 rpm. W rotorze typu „swinging bucket” (Beckman) w ultrawirówce L7 (Beckman, przez 60 minut w 4°C. Porcje po 3,0-4,0 ml nadsączu mieszano z 5% gliceryną (Sigma Chemicals), filtrowano przez jednorazowe filtry o wielkości porów 0,22 pm (Millipore, nr kat. SLGV 025 BS) i wprowadzano do kolumny stosując aplikator do próbek SA-5 (Pharmacia) połączony z wlotem kolumny. Frakcje wykazujące aktywność oksydazy heksozowej identyfikowano przy użyciu testu opisanego powyżej (10 pl próbka, 15 minut inkubacji) i przechowywano osobno w -18°C do dalszego przetwarzania.

Profil UV i położenie elucji oksydazy heksozowej pokazano na Fig. 3. Jak widać na Fig., na tym etapie wyeliminowano zasadniczą część materiału pochłaniającego UV. Analiza elektroforetyczna natywnej PAGE i znakowanie srebrem (Fig. 2, ścieżka 2) wykazały, że jedynie niewiele składników zanieczyszczających pozostało po tym etapie.

1.8. Określanie ciężaru cząsteczkowego natywnej oksydazy heksozowej przez analityczną filtrację żelową..

Ciężar cząsteczkowy natywnej oksydazy heksozowej określono przez filtrację żelową na Sephacryl S-200 Superfine (Pharmacia). Rozmiary kolumny, bufor, prędkość przepływu i zbieranie frakcji wyglądały jak opisano wyżej. Niebieski dekstran do określania próżni kolumny (vo) i poniższe wzorce ciężaru cząsteczkowego uzyskano z Pharmacia: owalbumina (43000), albumina (67000), katalaza (158000) i aldolaza (252000). Próbkę zawierającą oksydazę heksozową otrzymano przez chromatografię na DEAE-Sepharose, jak to opisano wyżej. W oparciu o oznaczenie objętości elucji (v_e) wzorców białek i oksydazy heksozowej, obliczono odpowiednie wartości Kav (Ve-Vo/v_t-Vo). Na koniec wartości Kav wzorców białek wykreślono w stosunku do odpowiednich wartości logarytmu (ciężaru cząsteczkowego). Kav oksydazy heksozowej odpowiadała ciężarowi cząsteczkowemu natywnej, wynoszącemu około 110000. Jest to zgodne z Sullivani i Ikawa (1973), którzy stwierdzili, że ciężar cząsteczkowy wynosi 130000. Kerschensteiner i Klippenstein (1978) donoszą, że ciężar cząsteczkowy wynosi 140000, co również określono filtracją żelową

1.9. Chromatografia kationowymienna

Ten etap przeprowadzono na układzie SMART Micropurification Chromatography Sys 1 ml) wypełnioną żywicą S-Sepharose Fast Flow (Pharmacia). Kolumnę zrównoważono buforem A: 50 mM octan sodu, pH 4,5 (wytworzonym przez dostrojenie 50 mM kwasu octowego do pH 4,5 przy użyciu NaOH). Bufor B zastosowany do elucji gradientem zawierał 50 mM octan sodu, 500 mM NaCl, pH 4,5. Frakcje z filtracji żelowej wysalano na uprzednio wypełnionych, jednorazowych kolumnach Sephadex G-25 (PD-10, Pharmacia) które równoważono i eluowano 25 mM octanem sodu pH 4,5. 20 ml wysolonej próbki pochodzącej z 6 frakcji filtracji żelowej o wysokiej aktywności oksydazy heksozowej wprowadzono do kolumny z 50 ml Superloop (Pharmacia) przy przepływie 250 pl/minutę. Kolumnę płukano 4 objętościami buforu A przy tej samej prędkości przepływu. Związane białka eluowano gradientem od buforu A do buforu B w 5 ml. Frakcje po 250 (il pobrano podczas elucji na gradiencie i badano na aktywność oksydazy heksozowej jak to opisano wyżej (1 pl próbki, 15 minut inkubacji) i przechowywano w -18°C.

Powstały preparat oksydazy heksozowej analizowano przez PAGE i barwienie srebrem (Fig. 2, ścieżka 3). Prążek oksydazy heksozowej był jedynym znaczącym prążkiem, jakkolwiek obserwowano małe ilości zanieczyszczających białek.

187 218

1.10. Analityczna SDS-PAGE

Frakcje z chromatografii S-Sepharose wykazujące aktywność oksydazy heksozowej badane były również przez SDS-PAGE według Laemmli (1970). Miniżele 12,5% akrylamidu/bis-akrylamidu (mieszanina 37,5:1) o grubości 0,75 mm puszczono w aparacie MiniProtean II 9Bio-Rad). Żele zabarwiono błękitem brylantowym R-250, 10% kwasem octowym, 40% etanolem i odbarwiono 10% kwasem octowym, 30% etanolem.

Wynik elektroforezy przedstawiono na Fig. 4, ścieżka 1. Oczyszczony preparat oksydazy glukozowej wykazał silne prążki przy względnym ciężarze cząsteczkowym równym 40000 i 29000 i słaby prążek przy 60000 i 25000, odpowiednio. Ponadto, obserwowano dwa ostre dublety prążków 55000 i 57000.

1.11. SDS-PAGE, a następnie blotting i barwienie węglowodanów

Obecność węglowodanów w izolowanej cząsteczce oksydazy heksozowej badano zestawem DIG Glycan Detection Kit (Boehringer Mannheim), który jest przeznaczony do wykrywania mikrogramowych ilości cukrów w glikokoniugatach na membranach. W zasadzie, przylegające grupy hydroksylowe w węglowodanach są utleniane do aldehydów. Następnie, digoksygenina jest wiązana kowalencyjnie z grupami aldehydowymi i wykrywana koniugatem przeciwciała przeciwko digoksygeninie i fosfatazy alkalicznej.

Oczyszczoną oksydazę heksozową z chromatografii kationowymiennej puszczono na 12% żelu SDS-PAGE jak to opisano wyżej, przeniesiono na nitrocelulozę według procedur standardowych i barwiono na zawartość węglowodanów stosując Glycan Detection Kit, według instrukcji producenta. Nie zabarwił się żaden z prążków oksydazy heksozowej 60000, 40000, 29000 i 25000. Jedynie ostry dublet prążków przy 57000-55000 był silnie zabarwiony (wynik nie pokazany). Dublet prążków 57000-55000 zidentyfikowano jako zanieczyszczenie resztkowe.

Tak więc, można wywnioskować, że żaden ze składników oksydazy heksozowej obserwowany na SDS-PAGE nie był glikozylowany.

1.12. Ogniskowanie izoelektryczne

Frakcje oksydazy heksozowej z chromatografii S-Sepharose pulowano i zatężano przez ultrafiltrację w urządzeniu Centricon (Amicon) i analizowano przez ogniskowanie izoelektryczne (IEF) na płytkach agarozy Isogel, pH 3-10, według instrukcji producenta 9FMC Bioproducts, Rockland, ME, USA). Mieszaninę wzorców pI (FMC Bioproducts) puszczono równolegle z próbkami oksydazy heksozowej. Mieszanina składała się z cytochromu C (pI = 10,2), mioglobiny prążek większy/mniejszy (7,4/7,0), anhydraza węglanowa (6,1), β-laktoglobulina A/B (5,4/5,5), owalbumina (4,8), oksydaza glukozowej (4,2) i amyloglukozydaza (3,6). Żele zabarwiono błękitem brylantowym Coomassie R-250. Jak pokazano na Fig. 5, ścieżka 1, oczyszczony preparat oksydazy heksozowej składał się z dwóch odmian o, odpowiednio pI równym 4,3 i 4,5. Oczyszczoną oksydazę heksozową analizowano również przez ogniskowanie izoelektryczne na uprzednio odlanych żelach poliakrylamidowych pH 3,5-9,5 (Pharmacia, Ampholine PAGplates) według instrukcji producenta. Żele te znakowano również na aktywność enzymatyczną, przez inkubację mieszaninie znakującej jak to opisano wyżej dla natywnej PAGE. Jak pokazano na Fig. 5, ścieżka 2, obie odmiany pI są enzymatycznie czynne.

1.13. Ogniskowanie chromatograficzne.

Obserwacja kilku prążków w SDS-PAGE oczyszczonej na S-Sepharose oksydazy heksozowej jako że ostatni etap poruszył podejrzenia, że jeden lub wiele prążków może stanowić resztkowe zanieczyszczenie. Ponadto, chromatografia S-Sepharozy w sposób ciągły daje słaby uzysk. Stąd, wprowadzono ogniskowanie chromatograficzne jako ostatni etap oczyszczania, zamiast chromatografii kationowymiennej na S-Sepharose. Ogniskowanie chromatograficzne przeprowadzono na układzie chromatograficznym SMART wyposażonym w kolumnę Mono P HR 5/5 (0,5 x 5 cm, Pharmacia), o objętości złoża równej 1ml i 50 ml Superloop do podawania próbek. Buforem startowym do rozdzielenia w zakresie pH 5,0 i 3,5 była 25 mM piperazyna, doprowadzona do pH równego 5,5 przy użyciu HCl. Eluentem był Polybuffer 74 (Phar24

187 218 macia) 10-krotnie rozcieńczony wodą i doprowadzony do pH 5,5. Kolumnę traktowano uprzednio i równoważono buforem startowym jak to zaleca wytwórca.

Preparatykę próbek przeprowadzono w następujący sposób: W typowym doświadczeniu pulowano najlepsze frakcje z dwóch żelów (2x4 frakcje, 20 ml) i przepuszczono przez kolumnę Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (high sub, Pharmacia), którą upakowano w jednorazowej kolumnie Poly-Prep (Bio-Rad) i równoważono w buforze stosowanym do filtracji żelowej (20 mM Tris-Cl, 500 mM NaCl, pH 7,5). Traktowanie to niemal całkowicie usuwało pozostałą ilość czerwonego białka fikoerytryny i innych substancji barwnych, które adsorbowały na matrycy żelowej przy tej sile jonowej eliminując w ten sposób zanieczyszczenia, które były tylko częściowo usuwane podczas innych etapów procesu oczyszczania. Kolumnę Phenyl Sepharose zniszczono po użyciu. Aktywność oksydazy heksozowej była ilościowo odzyskana z eluentu, który był wysalany na jednorazowych kolumnach Sephadex G-25 (PD-10, Pharmacia) zrównoważonych i eluowanych buforem wyjściowym.

Przed wprowadzeniem próbki, 1 ml eluentu pompowano do kolumny. Prędkość przepływu wynosiła 0,5 ml/min. Po wprowadzeniu próbki, wytwarzano gradient pH przez pompowanie 11 ml eluentu przez kolumnę. W trakcie elucji gradientu pH zebrano 44 frakcje po 250 μί. Frakcje zawierające oksydazę heksozową zostały zidentyfikowane metodą testową opisaną powyżej (1 μί porcje, 15 minut inkubacji) i przechowywano w -18°C do dalszego stosowania.

Oksydazę heksozową oczyszczoną przez ogniskowanie chromatograficzne badano przez PAGE i barwienie srebrem (Fig. 2, ścieżka 4) i przez SDS-PAGE i barwienie błękitem Coomassie (Fig. 4, ścieżka 2) . W natywnej PAGE prążek oksydazy heksozowej był jedynym istotnym prążkiem i obserwowano jedynie nieznaczne ilości zanieczyszczeń. Przez SDSPAGE wykazano jasno, że ta metoda oczyszczania jest zdolna do usunięcia ostrych dubletów prążków 57000 i 55000. Prążek 25000 obserwowany po chromatografii S-Sepharose był bardzo słaby po ogniskowaniu chromatograficznym. Podsumowując, oksydaza heksozowa uzyskana przez chromatografię DEAE, filtrację żelową i ogniskowanie chromatograficzne wykazało jeden prążek w natywnej PAGE. W SDS-PAGE obserwowano silne prążki 40000 i 29000 i słaby prążek 60000.

Ponieważ intensywność składnika 60000 względem składników 29000 i 40000 różniła się pomiędzy różnymi preparatami enzymu, podejrzewano, że polipeptydy 29000 i 40000 mogą pochodzić z cięcia proteolitycznego około 60000 prekursora. Mogłoby to pasować do pomysłu struktury homodimerycznej enzymu, o natywnym ciężarze cząsteczkowym 110000120000, jak stwierdzono filtracją żelową, jak to opisano wyżej. Ponadto, ta hipoteza powinna być zgodna z wynikami uzyskanymi przez Kirschensteinera i Klippensteina, którzy stwierdzili natywny ciężar cząsteczkowy 140000 w filtracji żelowej i ciężar cząsteczkowy podjednostki 70000 w SDS-PAGE (Kirschensteiner i Klippenstein, 1978).

Przykład 2.

Generowanie i analiza sekwencji aminokwasowej fragmentu peptydowego oksydazy heksozowej

2.1. Trawienie oczyszczonej oksydazy heksozowej bromkiem cyjanogenu

Procedurę tę przeprowadzono, gdy chromatografia kationowymienna na S-Sepharose wciąż była stosowana jako ostatni etap oczyszczania.

Oksydaza heksozowa otrzymana przez oczyszczanie na DEAE Sepharose, Sephacryl S-200 i S-Sepharose została przeniesiona do agresywnego buforu, przez wymianę buforową na kolumnach PC3.2/10 Fast Desalting Column zawierającego Sephadex G-25 Superfme (Pharmacia, 0,32 x 10 cm, objętość złoża 0,8 ml) którą zamontowano w układzie SMART. Kolumnę zrównoważono i eluowano 200 mM dwuwęglanem amonu (BDH, AnalaR). W celu uzyskania zadowalającego odzysku, niezbędne było dodanie 500 mM chlorku sodu do próbki oksydazy heksozowej przed wstrzyknięciem.

Eluowaną oksydazę heksozową o wymienionym buforze rozdzielono do 1,5 ml probówek i liofilizowano na Speedvac (Savant Instruments). Dodano bromek cyjanogenu (CNBr,

Pierce), 200 μί 10 mg/ml roztworu w 70% kwasie mrówkowym (Promega). (Odczynniki uzyskane od Promega były składnikami „Probe Design™ Peptyde Separation System” nr kat.

187 218

V60300. Probówki inkubowano przez noc w ciemności w temperaturze pokojowej. Roztwory wysuszono w Speedvac, zawieszono w 50 pl wody i ponownie osuszono.

2.2. Oddzielenie fragmentów po bromku cyjanogenu przez SDS-PAGE o wysokiej rozdzielczości i elektroblotting na membranę poliwinylodieno difluorku (PVDF).

Peptydy wytworzone przez trawienie bromkiem cyjanogenu były rozdzielane SDS-Page wysokiej rozdzielczości według Schaegger i von Jagow (1987). Układ ten zapewnia doskonały rozdział peptydów o małym ciężarze cząsteczkowym 20-250 aminokwasów). Układ żelu obejmuje żel rozdzielczy 16,5%, 10% żel oddzielający i 4% lepki żel, wytworzone przy użyciu mieszaniny 29:1 akrylamidu/bisakrylamidu przez Promega).

Miniżele o grubości rzędu 0,75 puszczono w aparacie Mini Protean II (Bio-Rad). Nadsiarczan amonu i N,N,N',N'-terametylo-etylenodiamina (TEMED) pochodziły z BioRad, SDS pochodził z USB (najwyższej czystości). Tris pochodził z Fluka (nr kat. 93350). Tricyna i tioglikolan sodu pochodziły z Promega. Glicyna (p.a.), 2-merkaptoetanol (p.a.) i błękit bromofenolowy pochodziły z Merck, zaś gliceryna z Gibco BRL (najwyższej czystości). Tioglikolan sodu, 0,1 mM, dodano do bufora katody bezpośrednio przed zastosowaniem, w celu zapobieżenia blokadzie chemicznej końców aminowych peptydów podczas rozdziału. Żel puszczono jałowo przez 60 minut przy 30 V, aby umożliwić tioglikolanowi wymiecenie jakichkolwiek substancji reagujących z resztami aminowymi. Przygotowanie próbki: wysuszone fragmenty peptydu cięte bromkiem cyjanu zawieszono w 30 pl buforu zawierającego 63 mM Tris-Cl, pH 6,8, 1% SDS, 2,5% 2-merkaptoetanol, 10% glicerynę i 0,0012% błękit bromofenolowy. Próbki, które zmieniły kolor na żółty w trakcie preparatyki, z powodu zawartości resztek kwasu mrówkowego, zneutralizowano przez dodanie 1-3 pl 1,0 M zasady Tris dopóki nie powróciły do niebieskiego koloru. Próbki denaturowano przez podgrzanie do 95°C przez 5 minut przed nałożeniem na żel. Wraz z fragmentami oksydazy heksozowej puszczono równolegle mieszaninę wzorców ciężaru cząsteczkowego niskiego zakresu (Promega) o ciężarach cząsteczkowych w zakresie od 31000 i 2500. Elektroforezę prowadzono przy 150 woltach.

Transfer elektroforetyczny na membrany PVDF przeprowadzono w urządzeniu Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell (Bio-Rad) według wskazówek producenta. Trzy płachty membrany Problott (Applied Biosystems) przycięte do rozmiarów żelu zwilżono krótko w metanolu (Merck, p.a.), a następnie zanurzono w buforze do transferu (25 mM tris, 192 mM glicyna, pH 8,5, schłodzony do 4°C) przed połączeniem warstwowego układu do transferu. Po elektroforezie, żel inkubowano w buforze do transferu przez 5 minut w 4°C, a następnie włączono go do układu warstwowego o następujących warstwach: arkusz papieru Whatman (3MM chr), dwa arkusze membrany Problott, żel SDS-PAGE z rozdzielonymi peptydami, trzeci arkusz Problott i warstwa papieru Whatman. Układ warstwowy skierowano dwiema warstwami Problott w kierunku elektrody dodatniej. Jednostkę chłodzącą zamontowano w komorze buforu przed wypełnieniem jej schłodzonym buforem do transferu, po czym wykonano transfer w temperaturze pokojowej przez 60 minut przy stałym napięciu 100 V. Podczas transferu prąd zwiększono od około 270 mM do około 400 mA.

Po przeniesieniu, membranę płukano w wodzie przez minutę a następnie barwiono przez 30-45 sekund 100 ml świeżo wytworzonego roztworu barwiącego zawierającego 0,1% błękit brylantowy Coomassie R-250 (Bio-Rad), 5% kwas octowy (Merck p. a.) i 45% metanol (Merck p.a.). Następnie membranę odbarwiono w 3 zmianach około 80 ml świeżo wytworzonego 5% kwasu octowego, 45% metanolu po 30-60 sekund każda. Na koniec, membrany płukano w 3 zmianach wody w celu usunięcia zalegającej glicyny, a następnie suszono na powietrzu. Dobrze rozdzielone i względnie rzadkie prążki o ciężarach cząsteczkowych około 2500, 9000 i 16000. Wycięto i poddano analizie aminokwasowej i sekwencjonowaniu.

2.3. Analiza aminokwasową i sekwencjonowanie ciętego bromkiem cyjanu fragmentu 9000 oksydazy heksozowej.

Analizę aminokwasów przeprowadzono przez chromatografię jonowymienną i derywatyzaję po kolumnie, przy użyciu oftalodialdehydu. Próbki hydrolizowano w 110 °C przez 20 godzin w 6M HCl, 0,05% fenolu i 0,05% kwasie ditiodipropionowym (Barkholt i Jensen, 1989). Peptydy sokwoncjonowano na automatycznym sekwenatorze białka/peptydu Applied

187 218

Biosystems model 477A, wyposażonym we włączony szeregowo anlizator PTH, model 120A i układ analizy danych. Odczynniki do sekwencj ono wania białka otrzymano z Applied Biosystems. Analizę aminokwasową i analizę sekwencji peptydu uprzejmie wykonał Anie L. Jensen, Department of Protein Chemistry, University of Copenhagen, Dania.

Sekwencję peptydową zidentyfikowaną przez analizę fragmentu 9000 pokazano w tabeli 2.1. Początkowy uzysk fenylotiohydantoino-tyrozyny (PTH-Tyr) na etapie pierwszym wyniósł 22 pmole. Skład aminokwasowy fragmentu 9000 pokazano w tabeli 2.2.

Tabela 2.1. Sekwencja peptydowa uzyskana przez analizę sekwencji fragmentu 9000 oksydazy heksozowej po bromku cyjanu początek sekwencji peptydowej identyfikacja sekwencji sekwencja aminokwasowa ΗΟΧ, fragment 9000 CMBr peptyd HOK-1 Y-E-P-Y-G-G-Y-P

Skróty: Y=Tyr; E=Glu; P=Pro; G=Gly; V=Val

Tabela 2.2. Skład aminokwasowy fragmentu 9000 oksydazy heksozowej po bromku cyjanu

Aminokwas	% molamy	N
Asx	16,4	14
Thr	4,8	4
Ser	4,6	4
Glx	9,9	8
Pro	8,1	7
Gly	11,2	9
Ala	4,3	4
Cys	0	0
Val	5,2	5
Net	0,2	0
Ile	3,6	3
Leu	9,3	8
Tyr	6,1	5
Phe	4,6	4
His	1,0	1
Lys	8,1	7
Arg	2,7	2
Trp	ND	-
w sumie	100,0	85

ND-nie stwierdzono

2.4. Preparatywna SDS-PAGE i elektro biot na membranę PVDF

Poniższą procedurę przeprowadzono w celu uzyskania sekwencji aminokwasowych, które jak wiadomo pochodziły z polipeptydu 40000 albo 29000 preparatu oksydazy heksozowej.

Preparatywne żele SDS-PAGE puszczono zgodnie z Laemmli (laemmli, UK 1970). Miniżele zawierające 12,5% akrylamidu/bisakrylamidu (mieszanina 37,5:1) o grubości 0,75 mm puszczono w aparacie Mini-Protean II (Bio-Rad). Roztwór akrylamidu (BDH, nr kat. 44313) i Ν,Ν'-metyleno-bis-akrylamidu (BDH, nr kąt. 44300) przechowywano nad mieszaną żywicą jonowymienną Bio-Rad, nr kat. 142-6425). Źródła wszystkich pozostałych odczynników opisano wyżej.

Preparowanie próbek: Frakcje z ogniskowania chromatograficznego zatężano przez ultrafiltrację wirowniczą w 4°C w jednostkach Ultrafree-MC o NMWL 10000 i pojemnością próbki 400 μΐ (Millipore, nr kat. UFC3 LGC25). Przesącz zmieszano z jedną objętością 2x buforu do ładowania na żel zawierającego 125 mM Tris-Cl, pH 6,8, 2% SDS, 5% 2merkaptoetanol, 20% gliceryny i 0,0025% błękitu bromofenolowego. Próbki, które zmieniły kolor na żółty na skutek zawartości kwaśnych składników Polybuffer zneutralizowano przez dodanie 1-3 μΐ 1,0 M zasady Tris dopóki nie przywrócono niebieskiego koloru. Próbki denatu187 218 rowano przez podgrzanie do 95°C przez 5 minut i nałożono na żel w porcjach po około 30 pl na ścieżkę.

Wraz z fragmentami oksydazy heksozowej puszczono równolegle mieszaninę wzorców ciężaru cząsteczkowego (Bio-Rad) ciężarach cząsteczkowych w zakresie od 974000 do 14400. Elektroforezę prowadzono w małym prądzie 10 mA, w celu zminimalizowania ryzyka wywołanej termicznie modyfikacji chemicznej białek w próbce.

Transfer elektroforetyczny na membrany PVDF przeprowadzono, jak to opisano wyżej, z takim wyjątkiem, że zamiast trzech arkuszy Problott stosowano jeden arkusz membrany Immobilon P (Millipore, nr kat. IPVH 15150). Układ warstwowy umieszczono membraną w kierunku elektrody dodatniej.

Po przeniesieniu na membranę Immobilon P płukano ją w wodzie przez 10 sekund i barwiono przez 45-60 sekund w 100 ml świeżo wytworzonego roztworu barwiącego składającego się z 0,025% błękitu brylantowego Coomassie R-250, 5% kwasu octowego, 40% metanolu. Membranę odbarwiano przez 2-3 minuty w 250 ml świeżo wytworzonego roztworu 5% kwasu octowego, 30% etanolu (96% obj. Danisco, Dania). Membranę na koniec suszono na powietrzu i przechowywano w 4°C.

Wzorzec prążków na membranie był identyczny z wzorcem obserwowanym w analitycznej SDS-PAGE po końcowym oczyszczaniu przez ogniskowanie chromatograficzne. Wykazało ono silne prążki 40000 i 29000 i słaby prążek 60000.

Prążki 40000 i 29000 wycięto i zastosowano do analizy aminokwasowej oraz do trawienia enzymatycznego polipeptydów związanych z membraną, jak to opisano niżej. Ilość 60000 była zbyt mała by umożliwić dalszą analizę polipeptydu.

2.5. Analiza aminokwasową polipeptydów 40000 i 29000 oksydazy heksozowej

Składy aminokwasowe składników 29000 i 40000 oksydazy heksozowej pokazano w tabeli 2.3.

Tabela 2.3. Skład aminokwasowy polipeptydów 40000 i 29000 oksydazy heksozowej

Aminokwas	40 K	% molarny 29 K
Asx	11,5	12,5
Thr	5,9	5,2
Ser	6,1	4,7
Glx	9,7	15,1
Pro	5,2	5,4
Gly	13,6	9,7
Ala	6,6	6,4
Cys	1,1	0,9
Val	7,3	5,5
Met	1,5	2,3
Ile	3,7	4,4
Leu	8,5	8,6
Tyr	4,2	5,3
Phe	5,5	4,1
His	2,2	1,4
Lys	3,9	6,1
Arg	3,5	2,4
Trp	ND	ND
w sumie	100,0	100,0

ND-nie stwierdzono

187 218

2.6. Trawienie enzymatyczne polipeptydów oksydazy heksozowej związanych z membraną PVDF

Trawienie polipeptydów oksydazy heksozowej związanych z membraną PVDF i ekstrakcję powstałych peptydów proteolitycznych wykonano jak opisano w Fernandez i in., (1992) i Femandez i in., (1994).

Trawienie 40000 polipeptydu oksydazy heksozowej: 11 prążków 40000 o całkowitej ocenionej ilości białka rzędu 5 pg (co odpowiadało 125 pmolom) wycięto z membran PVDF barwionych błękitem Coomassie, odbarwiono w metanolu przez 1-2 minuty i płukano w wodzie przez 2-3 minuty. Prążki membran pocięto na kawałki 1 x 1 mm i przeniesiono do probówki mikrowirowniczej.

Pusty rejon membrany PVDF służył jako kontrola tła. Pocięte kawałki membrany namoczono w 50 pl buforu do trawienia zawierającego 1% (obj.) uwodornionego Triton Χ-100 (RTK-100), Sigma Chemicals, nr kat. X-100R-PC, albo Calbiochem, czystość do białek, nr kat. 648464), 10% acetonitrylu (Merck, Lichrosolv czystość do gradientów) i 100 mM TrisCl, pH 8,0. Enzymem proteolitycznym wybranym do trawienia była endoproteinaza Lys-C (endoLys-C), która tnie łańcuchy peptydowe po stronie C reszt lizynowych. Porcje po 5 pg endoLys-C (Boehringer Mannheim, czystość do sekwencjonowania, nr kat. 1047 825) rozcieńczono w 20 pl wody. Dodano 2 pl roztworu enzymu, odpowiadające 0,5 pg/ml (enzym: substrat 1:10). Trawienie prowadzono w 37°C przez 22-24 godziny.

Po trawieniu, próbki sonikowano w zbiorniku ultradźwiękowym (Elma Transonic) przez 5 minut i odwirowano przy 1700 rpm w mikrowirówce przez 5 minut, po czym przeniesiono nadsącz do nowej probówki. Kolejne płukania w 50 pl bufora do trawienia i 100 pl 0,1% kwasu trifluorooctowego (TFA, Pierce, nr kat. 28902) wykonano przez sonikację i odwirowanie jak to opisano powyżej. Wszystkie nadsącza pulowano, dając objętość 200 pl. Ekstrakty trzymano w -18°C do momentu oczyszczania peptydu.

Trawienie polipeptydu 29000 oksydazy heksozowej wykonano, jak to opisano dla składnika 40000, z takim wyjątkiem, że zastosowano cztery prążki o całkowitej zawartości białka równej 2,4 pg (około 80 pmoli), w oparciu o analizę aminokwasów.

2.7. Oczyszczanie peptydów wytworzonych przez działanie endoLys-C.

Fragmenty peptydowe otrzymane przez trawienie polipeptydów 29000 i 40000 oksydazy heksozowej rozdzielono na układzie chromatograficznym SMART. Układ był wyposażony w monitor o zmiennej długości fal pPeak i kolektor frakcji na 60 probówek. Kolumna o odwróconych fazach zastosowaną do rozdziału była oparta na krzemionce pRPC C2/C18 SC2.1/10 kolumna o małej średnicy (Pharmacia, wymiary kolumny 2,1 x 100 mm, wielkość cząstek 3 (im, średnia wielkość porów 125 A). Stosowano bufory: A: 0,1% TFA (Pierce) w wodzie Milli-Q i B: 0,1% TFAw acetonitrylu (Merck) Bufory przefiltrowano i odgazowano przez filtrację w podciśnieniu na filtrze 0,5 pm fluoropore (Millipore). Prędkość przepływu wynosiła 100 (pl/min. Absorbancja UV przesączu śledzona była przy długości 220 nm 254 nm i 280 nm. Gradient wynosił od 0 do 30% B (0,65 minut), 30-60% B (65-95 minut) i 60-80% B (95-105 minut). Następnie kolumnę płukano w 80% B przez 45 minut przy 200 pl/minutę. Frakcje po 50 pl zbierano pomiędzy t=15 minut i t=105 minut (3x60 frakcji) i przechowywano w -18°C w celu sekwencjonowania aminokwasów.

Mapa peptydowa uzyskana po trawieniu endoLys-C polipeptydu 40000 pokazana jest na Fig. 6. Jak widać na tej Fig., trawienie i rozdział HPLC spowodowały powstanie kilku sygnałów (pików) o wysokim stosunku sygnału do tła. Odpowiedni chromatogram pustej mieszaniny trawienia (nie pokazany) wskazał, że sygnały przed t = 83 nie były białkowe, pochodziły z rozpuszczalników prawdopodobnie zanieczyszczeń pochłaniających UV Triton Χ-100 albo ślady barwnika Coomassie. Sygnały oznaczone 1-5 na Fig. 6, wybrano do sekwencjonowania aminokwasów na podstawie poniższych kryteriów: 1) wysokość sygnału; 2) rzeczywista czystość; 3) wysoki stosunek A280:A220 i/lub A254:A220, wskazujący obecność reszt aromatycznych, które są najbardziej przydatne do wyboru sekwencji starterów PCR, z powodu ich niskiej degeneracji kodu genetycznego; 4) późny czas elucji, który może wskazywać względnie długi peptyd.

187 218

Chromatogram peptydów pochodzących z 29000 po endoLys-C pokazano na Fig. 7. Oczywiście, ten składnik oksydazy heksozowej dawał tylko nieliczne fragmenty peptydowe w porównaniu z polipeptydem 40000 na Fig. 6. Przy porównaniu chromatogramów, nie było przesłanek wskazujących, że którykolwiek fragment występuje w jednym i drugim polipeptydzie. Odkrycie to wskazuje, że składniki oksydazy heksozowej 29000 i 40000 nie mają wspólnych sekwencji aminokwasowych, co miało by miejsce gdyby polipeptyd 29000 powstawał w wyniku przekształcenia proteolitycznego polipeptydu 40000. (W porównaniu z produktami trawienia 40000, produkty trawienia 29000 zawierały jedynie niewielką ilość zanieczyszczających substancji eluujących później niż t = 83 minuty. Powodem tego może być to, że uwodorniony Triton X-100 z Calbiochem został zastosowany do trawienia 29000, podczas gdy trawienie 40000 przeprowadzono przy użyciu Tritony X-100 z Sigma Chemicals).

Frakcje odpowiadające sygnałom oznaczonym 1i 2 na mapie peptydowej 29000 (Fig. 7) poddano sokwoncjonowaniu aminokwasowemu.

2.8. Analiza sekwencji aminokwasowej peptydów wytworzonych proteolitycznie z oksydazy heksozowej.

Sekwencje peptydowe zidentyfikowane przez analizę frakcji odpowiadającym sygnałom 1-5 na Fig. 6 (peptydy HOX-2, HOX-3, HOX-4, HOX-5 i HOX-6) i sygnałom 1-2 na Fig. 7 (peptydy HOX-7 i HOX-8) pokazano poniżej w Tabeli 2.4. Początkowy uzysk aminokwasów PTH wynosił od 46 pmoli dla PTH-Tyr na etapie pierwszym w peptydzie HOX-5 do 6 pmoli dla PTH-Ile na etapie drugim w peptydzie HOX-8. Jak oczekiwano z absorbancji przy długości, odpowiednio dla sygnałów, 254 nm i 280 nm, wszystkie sekwencjonowane peptydy zawierały przynajmniej jeden aminokwas aromatyczny.

Tabela 2.4. Sekwencje peptydowe otrzymane przez analizę sekwencji endoproteinazy Lys-C peptydów uzyskanych z polipeptydów 40000 i 29000 oksydazy heksozowej.

Pochodzenie	identyfikacja	sekwencja
sekwencj onowanego sekwencj i	aminokwasowa
peptydu
40 K,	sygnał peptyd HOX-2	a-i-i-n-v-t-g-l-v-e-s-g-y-d-x-x-
1		X-G-Y-X-V-S-S-
40 K, 2	sygnał peptyd HOX-3	d-l-p-m-s-p-r-g-v-i-a-s-n-l-w-f-
4,0 K, α	sygnał peptyd HOX-4	D-S-E-G-N-D-G-E-L-F-X-A- (H) -T-
40 K, 4	sygnał peptyd HOX-5	Y-Y-F-K-
40 K,	sygnał peptyd HOX-6	d-p-g-y-i-v-i-d-v-n-a-g-t-p-d-
29 K, 1	sygnał peptyd HOX -7	L-Q-Y-Q-T-Y-W-Q-(E)-(E)-(D)-
29 K,	sygnał peptyd HOX-8	X-I-(R)-D-F-Y-E-E-M-

Reszty zidentyfikowane w sposób wątpliwy ujęto w nawiasy.

1) Reszta nr 15 została zidentyfikowana jako Asp albo Asn

2) Reszta nr 16 została zidentyfikowana jako Asp albo Ala

3) Reszta nr 17 została zidentyfikowana jako Arg albo Trp. Peptyd HOX-2 = Identyfikator Sekw. Nr 9

Peptyd HOX-3 = Identyfikator Sekw. Nr 10 Peptyd HOX-4 = Identyfikator Sekw. Nr 11 Peptyd HOX-5 = Identyfikator Sekw. Nr 12 Peptyd HOX-6 = Identyfikator Sekw. Nr 13

187 218

Peptyd HOX-7 = Identyfikator Sekw. Nr 14 Peptyd HOX-8 = Identyfikator Sekw. Nr 15

Przykład 3

Izolowanie genu oksydazy heksozowej z Chondrus crispus

3.1. Oczyszczanie RNA z Chondrus crispus

Świeżo zebrane plechy Chondrus crispus płukano zimną wodą i bezpośrednio zamrażano w ciekłym azocie w celu dalszego stosowania. Około 15 gramów thallusa Chondrus crispus zamrożonego w ciekłym azocie homogenizowano na drobny proszek w moździerzu. Zamrożony, homogenizowany materiał przeniesiono do probówki 50 ml (Nunc, nr kat. 339497) zawierającej 15 ml buforu ekstrakcyjnego (8 M chlorowodorek guanidyny; 20 mM kwas 2(N-morfolino)-etanosulfonowy (MES), pH 7,0; 20 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA); 50 mM β-merkaptoetanol).

Probówkę wytrząsano i trzymano na lodzie (0°C) podczas kolejnych etapów, o ile nie zaznaczono temperatury. Następnie probówkę odwirowano przez 20 minut przy 6000 x g w wirówce Heraeus Omnifuge 2.ORS i nadsącz zawierający RNA (około 15 ml) zebrano i przeniesiono do schłodzonej probówki 50 ml. Następnie do probówki zawierającej ekstrakt RNA dodano 1,5 ml 2 M octanu sodu, pH 4,25, 15 ml fenolu nasyconego wodą i 3 ml mieszaniny chloroform:alkohol izoamylowy (49:1).

Probówkę wytrząsano energicznie przez 1/2 minuty po czym rozdzielono fazy przez odwirowanie probówki przez 20 minut w Omnifuge przy 6000 x g. Fazę wodną (około 17 ml) przeniesiono do 30 ml probówki Corex (Sorvall, nr kat. 00156) i dodano równą objętość (około 17 ml) zimnego izopropanolu. Probówkę ponownie wytrząśnięto i inkubowano przez godzinę w -20°C. Precypitowany RNA zwirowano przez 20 minut przy 10000 rpm w wirówce Sorvall ze schłodzonym rotorem SS34. Nadsącz usunięto zaś osad RNA zawieszono w 4 ml 0,3 M octanu sodu, pH 5,5 i dodano 12 ml 96% etanolu.

Probówkę Corex wytrząsano i ponownie inkubowano przez co najmniej godzinę w -20°C, a następnie ponownie żwirowano RNA przez wirowanie przez 20 minut jak opisano wyżej. Nadsącz delikatnie usunięto, zaś osad RNA zawieszono w 2 ml 0,15 M octanu sodu, pH 5,5. Następnie dodano 8 ml 4 M octanu sodu, pH 5,5 i precypitowano RNA na lodzie przez 30 minut i ponownie zwirowano jak to opisano wyżej. Osad RNA przemyto 70% etanolem i zawieszono w 500 pl wody. Zawieszony RNA przeniesiono do probówki mikrowirowniczej i przechowywano w -20°C.

Czystość i stężenie RNA badano przez elektroforezę na żelu agarozowym i pomiar absorbeji przy długości 260 nm i 280 nm, jak to opisano w Sambrook i in., (1989).

3.2. Izolowanie poliadenylowanego RNA z Chondrus crispus

Poliadenylowany RNA izolowano z całkowitego RNA przez zastosowanie perełek magnetycznych pokrytych oligo dT (Dynabeads®oligo (dT)25, w zestawie mRNA Purification Kit™, Dynal). Około 100 pg całkowitego RNA zmieszano 1 mg Dynabeads®oligo (dT)25 i izolowano poliadenylowany RNA jak to opisano w protokole do zestawu mRNA Purification Kit™, Dynal. Uzysk poliadenylowanego RNA przy użyciu Dynabeads® wynosił od 1do 3 %.

Do izolacji poliadenylowanego RNA z Chondrus crispus stosuje się również inne sposoby, obejmujące zastosowanie kolumn upakowanych oligo-(dT)-celuloza (Clontech, nr kat. 8832-2), albo kolumn (mRNA Separator Kit™, Clontech, nr kat. K1040-1) jak to opisano w protokole dla tego zestawu. Uzysk poliadenylowanego RNA izolowanego na kolumnach oligo(dT) wynosi od 0,1 do 1% początkowej ilości RNA. Poliadenylowany RNA izolowany na kolumnach oligo(dT) zastosowano w syntezie cDNA jak to opisano niżej (3.4.), ale uzysk cDNA był bardzo niski (mniej niż 1%).

Powodem niższego uzysku i gorszej wydajności RNA izolowanego na kolumnach oligo(dT) w porównaniu z Dynabeads® może być obecność węglowodanów albo proteoglikanów w ekstrakcie całkowitego RNA. Węglowodany zanieczyszczające preparaty całkowitego RNA zakłócają, jak wykazano, oczyszczanie poliadenylowanego RNA i hamują syntezę cDNA, stąd opracowano metody izolacji RNA wolnego od węglowodanów (Groppe i in., 1993; Yeh i in.). Jednakże, poliadenylowany RNA oczyszczony tymi sposobami nie był tak skutecz187 218 ny w syntezie cDNA jak RNA izolowany przy użyciu Dynabeads®. Nawiązując, poliadonylowany RNA oczyszczony na Dynabeads® zastosowano jako matrycę do reakcji syntezy pierwszej nici cDNA (cf. 3.4. niżej).

3.3. Oligonukleotydy swoiste wobec oksydazy heksozowej

Zsyntetyzowano syntetyczne oligonukleotydy (DNA technology, ApS, Forskerparken,

DK-8000 Aarhus C, Dania) w oparciu o sekwencje aminokwasowe uzyskane z peptydów oksydazy heksozowej HOX-2, HOX-3 i HOX-4 (Tabela 2.4). Tabela 3.1. pokazuje oligonukleotydy i ich odpowiednie sekwencje aminokwasowe. W tabeli 3.1. pokazano również sekwencję DNA starterów zastosowanych w sekwencjonowa^iu DNA albo PCR.

Tabela 3.1. Sekwencje nukleotydowe syntetycznych oligonukleotydow swoistych wobec oksydazy heksozowej

Peptyd Starter

Hox Hox

Hox-2	A	I	I	N	V	T	G -
	L	V	E	S	G	Y	DXXXGYXVSS

	Hox2-3+	5'YTI gti GAR WSI	GGN TAYGA3'
Hox-3		DL PM	e P R G-
		V I A	e N L W	F
	Hox3-2-	3CAN TAD CGN AGI TTR RAI ACC	AAy
Hox-4		D S E G N	D G E	L F X A H T

Uox4-1+ ⁵Gar gGI AAY GAY GGI GAR CTN TT³' Hox4-2- 3’cty ccN TTR CTR CCI CTY GAI AA⁵'

Hox5+ 5'att GGG GCT CCT TCA AGA CCT T^'

Hox5- 5’tgaTGATTCAGTTTC3'

Hox6+ 5'ttg GAA GAA TAC GGT TOG^'

Hox7- 5'tac TATTIC GTC TGCTTG GG3’

Hox8- 5 GAA CTC TIC CGT GGTCTC CT 3'

Hox 10- 5'cca CCT GCG TGT TGG GGT CT3'

Hox11+ ⁵ CAG ATC TAC AAAACA TGC GAG3'

Hox12- 5'tgtCGCAGACTGTACTTG3'

Hox13- 5 GAGTGTACACGACATAAA3'

Hox5'-1 5'atg GCT ACT CTT CCC CAG AAA G3' gdzie Y oznacza C albo T, R oznacza A zalbo G; gdzie W oznacza A albo T, S oznacza C albo G; gdzie D oznacza A, G albo T, N oznacza A, C, G albo T, i I oznacza dezoksyinozynę.

HOX-2

HOX2-3+

HOX-3

HOX3-2+

HOX-4

HOX4-1+

HOX4-2HOX5+

HOX5HOX6+

HOX7IdenOyfikatar S elek. Nr 9 Identtdkator Sekw. Nr 16 Identtyikator Sekw. Nr 10 Idenbyikator Sekw. Nr 17 Ι^ο^^ηΟ^ SeOw. Nr 11 Ideenyfikato Sekw. Nr 18

Sekw. Nr 119 j^n^fii^^tt^r Sekw. Nr 20

SeOw. Nr 21 Μοπ^^Οογ Sekw. Nr 22 Identtylkator Sekw. Nr 13

187 218

HOX8- = Identyfikator SekWi Nr 24

HOX10- = Identyfikator Sekwi Nr 25

HOX11+ = Identyfikator SekWi Nr 26

HOX12- = Identyfikator SekWi Nr 27

HOX13- = Identyfikator Sekwi Nr 28

HOX5'-1 = Identyfikator SekWi Nr 29

3.4. Synteza cDNA i reakcja łańcuchowej polimerazy (PCR)

Poliadenylowany RNA zastosowano jako matrycę do reakcji syntezy pierwszej nici cDNA przy użyciu dostępnych w handlu zestawów. Około 1 pg poliadenylowanego RNA poddano odwrotnej transkrypcji jak to opisano w protokole zestawu Marathon™ cDNA Amplification Kit (Clontech) ze starterami Hox3-2- albo Hox4-2-. W następnej amplifikacji PCR zastosowano starter kotwiczący i adaptorowy zestawu, oprócz starterów swoistych wobec oksydazy heksozowej, odpowiednio, Hox3-2- albo Hox4-2-. Zastosowane bufory i warunki amplifikacji były jak to opisano zasadniczo w protokole zestawu Marathon™. Amplifikację PCR przeprowadzono przy użyciu AmpliTag (Perkin-Elmer Cetus) i urządzenia Perkin-Elmer Thermalcycler 480™, zaprogramowanego na 30 cykli po 1 minucie w 94°C, 2 minuty w 55°C i 2 minuty w 72°C. Elektroforeza 5 pl mieszaniny reakcyjnej na 1% żelu agarozowym (SeaPlaque® GTG, FMC) wykazała fragmenty DNA o wielkościach około 600 par zasad (bp) ze starterem Hox4-2- i 700 bp ze starterem Hox3-2-.

Te fragmenty DNA oczyszczono na żelu agarozowym przy użyciu dostępnych w handlu zestawów (QIAEX™ Gel Extraction Kit, nr kat. 20020, QUIAGEN) i około 100 ng fragmentu poddano ligacji i z 50 ng plazmidu pT7 Blue jak to opisano w protokole zestawu pT7 Blue TVector Kit (Novagen). E. coli DH5a (Life Technologies) albo E. coli NovaBlue (Novagen) transformowano mieszaniną ligacyjną i dalej analizowano białe, rekombinowane kolonie.

Plazmidowy DNA z tych kolonii oczyszczono stosując zestaw QUIAGEN Plasmid Midi Kit (QUIAGEN) i poddano analizie sekwencji DNA stosując Sequenase (Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit, USB). Reakcje sekwencjonowania DNA poddano elektroforezie na żelu poliakrylamidowym (Sequencing Gel Mix®6, Life Technologies). Analiza sekwencji DNA fragmentu 700 bp wykazała otwartą ramkę odczytu o możliwości kodowania 234 aminokwasów.

Tabela 3.2. poniżej pokazuje, że wszystkie sekwencje peptydowe z polipeptydu 40000, tj. HOX-2, HOX-3, HOX-4, HOX-5 i HOX-6, znaleziono w sekwencji 234 aminokwasów uzyskanych z otwartej ramki odczytu. Tak więc wywnioskowano, że fragment 700 bp koduje część genu oksydazy heksozowej. Sekwencja DNA fragmentu 600 bp była, jak się okazało, identyczna z częścią bliższą fragmentu 700 bp (patrz. Tabela 3.2).

Startery Hox2-3+ i Hox3-2- zastosowano podobnie w syntezie cDNA i amplifikacji PCR. Około 50 ng poliadenylowanego RNA poddano odwrotnej transkrypcji przy użyciu startera Hox3-2- jak to opisano w protokole do zestawu 3'-Amplifinder™ RACE Kit (Clontech). W kolejnej amplifikacji PCR zastosowano startery Hox2-3+ i Hox3-2-. Zastosowane bufory i warunki amplifikacji były zasadniczo jak to opisano dla polimerazy AmpliTaq (Perkin-Elmer Cetus) i protokole do zestawu 3'-Amplifindkr™ RACE Kit. Elektroforeza na żelu 5 pl mieszaniny reakcyjnej PCR wykazała fragment wielkości około 407 bp.

Fragment ten oczyszczono, wprowadzono do plazmidu pT7 Blue i sekwencjonowano, jak to opisano wyżej. Sekwencja DNA tego fragmentu jest identyczna jak dystalne 407 bp fragmentu 700 bp.

Sekwencję poniżej fragmentów 700 i 407 bp amplifikowano zestawem 3'Amplifinder™ RACE Kit (Clontech) stasując startery kotwiczące z zestawu jako starter 3 i startery Hox5+ i Hox4+ swoiste wobec oksydazy heksozowej jako swoiste genowo startery 5'. Bufory i warunki reakcji były jak opisano wyżej. PCR i analiza mieszaniny reakcyjnej na żelu agarozowym wykazała fragment o wielkości około 1,3 kb. Fragment wyizolowano i poddano analizie sekwencji DNA jak to opisano wyżej. Sekwencja DNA fragmentu 1,3 kb wykazała otwartą ramkę odczytu wielkości 357 aminokwasów. Ramka 357 aminokwasów zawierała sekwencje aminokwasowe peptydów HOX-2, HOX-3, HOX-4, HOX-5, HOX-7 i HOX-8.

187 218

Stąd wywnioskowano, że fragment DNA 1,3 kb kodował fragment 9000 po CNBr, polipeptyd 29000 i część polipeptydu 40000 oksydazy heksozowej.

Starter swoisty wobec końca 5' oksydazy heksozowej, Hox5'-l zastosowano wraz ze starterem oligo(dT) w celu amplifikacji prawdopodobnie całej ramki odczytu oksydazy heksozowej. Gen amplifikowano stosując PCR, wprowadzono do pT7 Blue i sekwencjonowano, jak to opisano wyżej. Sekwencja DNA tego fragmentu DNA 1,8 kb była identyczna z sekwencjami DNA fragmentów opisanych wyżej, z małymi różnicami. Ponieważ różnice te mogły być spowodowane błędami polimerazy podczas amplifikacji PCR, cały gen oksydazy heksozowej amplifikowano i izolowano z trzech niezależnych amplifikacji PCR. Stąd, sekwencja DNA pokazana poniżej w tabeli 3.2. skomponowana jest z przynajmniej trzech niezależnie uzyskanych sekwencji DNA w celu wykluczenia błędów PCR.

Sekwencja aminokwasowa uzyskana z otwartej ramki odczytu powyższej sekwencji DNA 1,8 kb zawiera wszystkie powyższe peptydy HOX, tj. od HOX-1 do HOX-8. Sekwencja DNA 1,8 kb koduje powyższe fragmenty 9000, 29000 i 40000 oksydazy heksozowej pochodzącej z Chondrus crispus. Ciężar cząsteczkowy polipeptydu pochodzącego z otwartej ramki odczytu jest zgodny z podejrzeniami, że polipeptyd jest podjednostką (prawdopodobnie fragmentem monomerycznym) dimerycznej cząsteczki oksydazy heksozowej.

3.5. Analiza metodą Northern błot RNA Chondrus crispus

Całkowity RNA izolowany z Chondrus crispus poddano analizie Northern błot. RNA oczyszczono jak to opisano wyżej (3.1) i frakcjonowano na denaturującym żelu agarozowym z formaliną i przenoszono na filtr HybondC (Amersham) jak to opisano w Sambrook i in., 1989. Stosując startery Hox2-3+ i Hox3-2- zsyntetyzowano przez PCR fragment DNA wielkości 400 bp jak to opisano wyżej. Fragment ten oczyszczono z 1,2% żelu agarozowego (SeaPlaque® GTG, FMC) i znakowano ³²P jak to opisano w Sambrook i in., 1989. Tę znakowaną radioaktywnie sondę hybrydyzacyjną zastosowano do sondowania biotu Northern.

Warunki hybrydyzacji:

3.5.1. Prehybrydyzacja w 65°C przez dwie godziny w buforze zawierającym 10x roztwór Denhardta (0,1% Ficoll, 0,1% poliwinylopirolidon, 0,1% albuminę surowicy bydlęcej), 2x SSC (IX SSC - 0,15 M chlorek sodu, 0,015 M cytrynian sodu, pH 7,0), 0,1% siarczan dodecylanu sodu (SDS) i 50 pg/ml denaturowanego DNA spermy łosia.

3.5.2. Hybrydyzacja w 65°C przez przynajmniej 14 godzin w buforze zawierającym 1x roztwór Denhardta, 2x SSC, 0,1% siarczan dekstranu, 50 pg/ml denaturowanego DNA spermy łososia i sonda znakowana ^MP (około 106 dpm/minutę). Filtr płukano dwukrotnie w 65°C przez 10 minut w 2x SSC, 0,1% SDS, a następnie dwukrotnie w 65°C przez 10 minut w 1x SSC, 0,1% SDS. Po końcowym płukaniu przez 10 minut w 65°C w 0,2x SSC, 0,1% SDS, filtr owinięto folią Saran Wrap i eksponowano na niego Kliszę rentgenowską (Kodak XAR2) przez 2 dni w -80°C stosując ekrany wzmacniające Siemens-Titan HS. Powstały autoradiogram (Fig. 8) pokazuje prążek o wielkości około 2 kb.

Tabela 3.2. Sekwencja nukleotydowa sekwencji DNA 1,8 kb (Identyfikator Sekw. Nr 30) i otwarta ramka odczytu sekwencji aminokwasowej oksydazy heksozowej o 546 aminokwasach, pochodząca z sekwencji DNA (Identyfikator Sekw. Nr 31).

TGAATTCGTG GGTCGAAGAG CCCTTTGCCT CGTCTCTCTG GTACCGTGTA TGTCAAAGGT 60

TCGCTTGCAC ACTGAACTTC ACG ATG GCT ACT CTT CCT CAG AAA GAC CCC 110

Met Ala Thr Leu Pro Gln Lys Asp Pro

5

GGT TAT ATT GTA ATT GAT GTC AAC GCG GGC ACC GCG GAC AAG CCG GAC 1161

Gly Tyr Ile Val Ile Asp Val Asn Ala Gly Thr Ala Asp Lys Pro Asp

187 218

CCA

CGT

CTC

CCC

TCC

ATG

(AG

CAG

AC

TTC

(AC

CGC

CGC

TGG

ATT1

AA

206

Pro

Arg

Leu

Pro

Ser

Met

Lys

Gln

Gly

Phe

Asn

Arg

(Arg

Tir?

Ile

Gle

30

33

40

ACT

AAT

ATC

GAT

TTC

GTT

TAT

GTC

GTG

TAC

ACT

CCT

CAA

AT

GAT

(TA

254

Thr

Asn

Ile

Asp

Phe

Val

GTyr

Val

Val

Tyr

Thr

Pro

Gln

Gly

AAe

Gcs

50 55

ACT ACA CTT Thr Ala Leu 60

GAC CGT GCT ATG

GAAA (AG

TGT cys

TCT CCC GGT AGA GAC

(A (A?r

302

Asp

Arg Ala

Met

Glu 65

Lys

Ser Pro

Gly 70

Thr

vaa

ATC

ATC

TCT

AC

GGC

CAT

TGC

TAC

GAG

GAC

TTC

GTA

ttt

GAC

GAA

(A

350

lle

Val

Ser

Gly

Gly

His

cys

Tyr

Glu

Asp

Phe

Val

Phe

Asp

dl

(ys

75

80

85

ATC

AAA

GCC

ATC

ATC

AAC

GTC

ACT

GGT

CTC

GTT

GAG

AGT

GGT

TAT

dA

398

Val

Lys

Ala

Ile

Ile

Asn

Val

Thr

Gly

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Tyy

Aas

90

95

100

105

AAC

AAT

AGG

AT

TAC

ttc

GTC

AGC

AGT

AA

GAT

ACA

AAT

TA

AC

(TC

446

Asp

Asp

Arg

Gly

Tyr

Phe

Val

Ser

Ser

Gly

Asp

Thr

Asn

Τηρ

GAl

See

110

11^^

120

TTC

AAA

ACC

TTG

TTC

AGA

GAC

(CC

AA

AGA

GTT

CTT

CCC

GdA

Gd

(TC

494

Phe

Lys

Thr

Leu

Phe

Arg

Asp

His

Gly

(Arg

Val

Leu

Pro

Gly

dl

(ee

125

130

U5

TAC

TAC

TCC

GTC

GGC

CTC

AT

GGC

ccc

ATT

GTC

AC

AA

AT

dA

AA

554

Cys

Tyr

Ser

Val

Gly

Leu

Gly

Gly

Hii

Ill

Val

Gly

Gly

Gly

AAp

dl

140

145

110

187 218

ATT TTG GCC CGC ^TTG

CAT His

mc Gly 160

CCC CCC GGT GAT TTG} CTC AGC GAC GGT

555

Ile

Leu Ala Arg 155

Leu

Leu

Pro

Vvl

CAp

Tt— 110

Glu

Ter

Gly

Val

GAG

GTC

GTC

GTT

AAG

CCA

GTC

CTC

ACC

GAA

GAT

TCG

GTA

CTC

ATT

TGT

603

Glu

Val

Val

Val

Lys

Pro

Val

Leu

Thr

G1u

Cajj

Tsr

Val

Leu

Lys

iyy

170

175

110

110

GTG

CAC

AAA

GAT

TCC

GAA

GIC

AAC

CAAC

TAJG

CAA

CTC

Gcc

TCGl

GCA

CAT

600

Val

His

Lys

Asp

Ser

Glu

Gly

Asn

Asp

Gly

G1u

Leu

Phe

Tcr?

Ala

Hii

190

195

220

ACA

GGT

GGC

CAlT

CGAC

GGA

AAC

TCGł

TATA

ATC

TTC

ACC

AAA

TAC

TAC

TTT

774

Thr

Gly Gly

Gly

Gly

Gly

Asn

Phe

Gly

IIl

Gil

Thr

Lys

Tyr

GT^so

PPe

205

210

215

AAG

GAT

TTG

CCC

ATG

TCT

C(CA

CCTG

CATC

GTC

ATC

GCA

TCCA

AAT

ΤΓΑ

CCA

770

Lys

Asp

Leu

Pro

Met

Ser

Pro

Arg

Gly

Vvl

TIl

Ala

Ser

Asn

Leu

Hii

220

225

230

TTC

AGC

TGG

<AAC

GIT

TTC

ACG

AGA

GAT

GCC

GTG

GAT

GAT

TTG

TTG

AAC

800

Phe

Ser

Trp

Asp

Gly

Phe

Thr

Arg

Asp

Ala

Leu

Gln

Asp

Leu

Leu

TCe

235

240

245

AAG

TAC

TTC

CAAA

CTT

GCC

AGA

TGT

GAT

TGG

AAG

AAT

ACG

GTT

GGC

AAG

808

Lys

Tyr

Phe

Lys

Leu

Ala

Arg

C«S

Asp

Tł-?

Lys

Asn

Thr

Val

Gly

Ly^^

250

255

220

265

TTT

CAA

ATC

nc

CAT

<CAG

GGA

GCG

GAA

GAG

ICC

GTC

ATG

TAC

TTG

TGT

926

Phe

lln

Ile

Phe

His

Gln

Ala

Ala

Glu

Glu

Ple

Val

Met

Trr

Leu

Tcr

270

5

80

187 218

974

ACA TCC TATA TTG

AAC CAC GCC GAG CGC GAG GCT CCC CAA GAC

CAT Acg

CAC CIa

Thr

Ser

Tyr See 285

Asa

Acp

Asa

Gic Acg 2^0

Glu

VgG

Ala

Glu

Asv 22^5

TAT

CAT

TTG

GAG

GCT

GGC

GTA

GAG

CGG

ATC

TAC

ACC

CCC

TGC

GGG

CCC

Tyr

His

Leu

Glu

Gla

Gsp

Ile

Glu

Gln

Ile

Tyr

Lys

Thr

Cys

Glu

Pro

300

330

331

ACC

AAA

GCG

CTT

GGC

GGG

CGT

GCT

CTT

TGG

GCG

CCG

TTC

CCC

GTG

CGG

Thr

Lys

Ala

Leu

Gly

Gly

His

Cla

Gly

Trp

Gla

Pro

Phe

Pro

Val

Crg

315

332

332

CCG

CGC

AAG

AGG

CGC

GCG

TCC

AGG

ACG

TCG

TGT

GTG

CGT

GCC

GCG

GCG

Pro

Arg

Lys

Arg

His

Thr

Ser

Lys

Thr

Ser

Tyr

Met

His

Csp

Glu

Thr

330

335

334

334

ATG

GAC

TAC

CCC

TTC

TGC

GCG

CTC

CCT

GCG

GCG

GTC

AAC

GGC

TCC

CTT

Met

Asp

Tyr

Pro

Phe

Tyr

Ala

Leu

Thr

Glu

Thr

Ile

Asn

Gly

Ser

Gly

350

355

360

CCG

AAT

CAG

CGC

GGC

CGG

TGC

AGG

TCT

GCG

TAC

CTG

CTC

AAG

GCT

TTC

Pro

Asn

Gln

Arg

Gly

Lys

Tyr

Lys

Ser

Ala

Tyr

Met

Ile

Lys

Gsp

Phe

365

3-70

375

CCG

GAT

TTC

CAG

GTC

GAC

GTG

CTC

TGG

CCG

TCC

CTT

GCG

GGG

GTC

CCG

Pro

Asp

Phe

Gln

Ile

Gsp

Val

Ile

Trp

Lys

Tyr

Leu

Thr

Glu

Val

Pro

380

335

339)

GAC

GGC

TTG

ACT

GGT

GCC

GCA

GTG

CCG

GGT

GCC

TTC

CTC

CGG

GTG

GCC

Asp

Gly

Leu

Thr

Ser

Ala

Glu

Met

Lys

Gsp

Gla

Leu

Leu

Gln

Val

Asp

395

440

440

ATG

TTT

GGT

GGT

GAG

GTT

CCC

AAG

GTG

GTC

TGG

GCT

GCG

GCG

GCA

GTC

Met

Phe

Gly

Gly

Glu

Ile

His

Lys

Val

VaI

Trp

Gsp

Cla

Thr

Cla

Val

1122

1107

1111

1116

1214

1262

1310

410

415

442

420

1358

187 218

GCG Ala

CAG CGC

GAG TAC ATT

ATC AAA Ale Lys

CTG Leu

CAG TAC CAG ACA ACA GGA AGA

1106

Gln

Ar ej

GIu

Tys 400

Ale

Gln 405

Tyr Gln

Thr

Tyr Trp Gln 440

GAA

GAA

GAC

CAGA

AGA

AGC

GTG AA^CC

CTC

GGG

TCG3 AT

AGA

GAC TT TAC

11^4

Glu

Glu

Asp

Lys

AAn

AAsi

Val Asn

Leu

Lys

TTp He

AAog

Asp Phe Tyo

445

450

455

GAG

GAG

ATG

TM?

AGA

ACG

AAT tAAC

GGA

GTT

CCA GAC

CCC

AAAC GGA CAG

1102

Glu

Glu

Met

ITs

AGu

Apo

Tyr Gly Aly

Val

Pro AAsp

Pro

AAsn Thr Gln

460

465

470

GTG

GAG

AGT

(AGG

AAA

AGT

GTG rn

GAG

GGA

TGC TAC

TTC

AAAC TAC CCG

1550

Val

Glu

Ser

GGu

Tys

Gly

Val Phe

Glu

Gly

cys Tyr

Phe

AAsn Tyo· Pro

475

480

485

GAT

GTG

GAC

TTT

AAkA

?AA

TGG AAG

AA^C

GGC

AA^G TAT

GTT

CGCC CTC GGG

1598

Asp

Val

Asp

Lye

AAn

AAn

Tto> Lys

Asn

Gly

Lys Ayr

Gly

Ala Leu Glu

490

495

500

505

CTT

TAC

TTT

TTT

AGG

0AAC

ACTG AAAC

CGC

CTC

ATC AAAG

GCC

AAAAA TCG TTG

1646

Leu

Tyr

Phe

Alu

Gly

Asn

Leu Asn

Arg

Leu

Ile Lys

Ala

Lys Trp Leu

510

515

220

TGG

GAT

CCC

aaa

AGA

ATC

TTC ACA

CGG

CGG

CAG AGC

ATC

CCT ACT AAA

1694

Trp

Asp

Pro

AAn

AGu

All

Phe Thr

Asn

Lys

Gln Ser

lle

Pro Thir Lys

525

500

535

CCT

CTT

AAG

GAG

CCC

AAA

CAA ACA

AAA

yAGTCAATGG GACyyGAyCA

1741

Pro

Leu

Lys

Glu

Pro

Lys

Gln Thr

Lys

540 555

TCGACTGAAG TGCAGCACTT GTCGGATACG GCGTGATGGT TGCTTTTTAT AAACTTGGTA 1801

187 218

W sekwencji aminokwasowej pokazanej wyżej, w tabeli 3.2., peptydy od HOX-1 do HOX-8 pokazane są wytłuszczoną czcionką albo podkreślone. Wytłuszczoną czcionką zaznaczono reszty aminokwasowe potwierdzone sekwencjonowaniem aminokwasowym peptydów. Podkreślenie wskazuje na reszty aminokwasowe, które uzyskano z sekwencji nukleotydowej, ale nie potwierdzono ich sekwencjonowaniem odpowiednich peptydów HOX.

HOX-1 stanowi reszty aminokwasowe 461-468, HOX-2 reszty 92-114, HOX-3 reszty 219-234, HOX-4 reszty 189-202, HOX-5 reszty 215-218, HOX-6 reszty 8-22, HOX-7 reszty 434-444 i HOX-8 reszty 452-460.

Przykład 4

Wytwarzanie rekombinowanej oksydazy heksozowej w Pichia pastoris.

4.1. Konstruowanie wektora do ekspresji rekombinowanej oksydazy heksozowej w Pichia pastoris.

Otwartą ramkę odczytu kodującą oksydazę heksozowej Chondrus crispus wprowadzono do wektora ekspresyjnego Pichia pastoris, pPIC3 (Research Corporation Technologies Inc., Tucson, Arizona). Plazmid zawierał promotor dehydrogenazy alkoholowej (promotor oax 1) i sygnał przerwania translacji Pichia pastoris (na Figurze 9, odpowiednio, aoxp i aoxt). Gen his4+ w wektorze umożliwia selekcję rekombinowanych His+ komórek Pichia pastoris. Gdy ta kaseta ekspresji jest transformowana do Pichia pastoris, ulega integracji z chromosomalnym DNA. Komórki Pichia pastoris niosące kasetę ekspresji z genem oksydazy heksozowej Chondrus crispus wprowadzonym poniżej promotora aoxl mogą być indukowane do wytwarzania oksydazy heksozowej przez dodanie induktora promotora aox1, metanolu. Mutant Pichia pastoris, KM71, który posiada defekt w głównym genie oksydazy alkoholowej, aox1, może być zastosowany jako biorca genu oksydazy heksozowej (Cregg i Madden, 1987; Tschopp i in., 1987). Jednakże, Pichia pastoris zawiera jeszcze jeden gen oksydazy alkoholowej, aox2, który również może ulec indukcji metanolem. Tak więc rekombinowana Pichia pastoris transformowana kasetą ekspresji oksydazy heksozowej powinna produkować dwie oksydazy, oksydazę heksozowej i oksydazę alkoholową, po dodaniu metanolu.

Przed wprowadzeniem genu oksydazy heksozowej do wektora ekspresyjnego pPIC3, zmodyfikowano sekwencje 5' i 3' otwartej ramki odczytu. Pierwszą nić cDNA zastosowano jako matrycę dla PCR. Zastosowano syntetyczne oligonukleotydy swoiste wobec końca 5' otwartej ramki odczytu, Hox5-l (Tabela 3.1) jako starter PCR wraz ze starterem (Hox3'-l) swoistym dla końca 3' sekwencji kodującej oksydazę heksozową Chondrus crispus. Starter Hox3'-1 miał sekwencję

5'-ACCAAGTTTATAAAAAGCAACCATCAC-3' (Identyfikator Sekw. Nr 32). Amplifikację PCR przeprowadzono przy użyciu zestawu GeneAmp®PCR Reagent Kit z polimerazą DNA AmpliTaq® (Perkin-Elmer Cetus. Program PCR obejmował 30 cykli po 30 sekund w 94°C, 30 sekund w 55°C i 2 minuty w 72°C. Elektroforeza na żelu mieszaniny reakcyjnej wykazała prążek o wielkości około 1,7 kb. Ten fragment 1,7 kb wprowadzono do wektora pT7 Blue (Novagen) (plazmid pUPO150) i poddano sekwencjonowaniu.

Fragment kodujący oksydazę heksozową Chondrus crispus wklonowano dalej do wektora ekspresyjnego Pichia pastoris pPIC3 (Clare i in., 1991) jak pokazano na Fig. 9. Plazmid pT7 niosący gen oksydaza heksozowa trawiono endonukleazą restrykcyjną NdeI i wygładzono końce polimerazą DNA Klenowa, zasadniczo jak to opisano w Sambrook i in., 1989. Po reaktywacji polimerazy ciepłem, DNA trawiono restrykcyjnie EcoRI i oczyszczono fragment DNA zawierający gen oksydazy heksozowej na żelu agarozowym jako tępo zakończony fragment DNA EcoRI (QUIEX™, QUIAGEN).

Wektor ekspresyjny Pichia pastoris pPIC3 trawiono restrykcyjnie enzymami SnaBI i EcoRI i oczyszczono na żelu agarozowym. Oczyszczony wektor i fragment kodujący oksydazę heksozową poddano ligacji i transformowano mieszaniną ligacyjną E. coli DH5a (Life Technologies) zasadniczo jak to opisano w Sambrook i in., 1989. Powstały wektor ekspresyjny zawierający gen oksydazy heksozowej z Chondrus crispus, pUPO153, poddano sekwencjonowaniu DNA w celu upewnienia się, czy w genie oksydazy heksozowej nie zaszły mutacje w trakcie procedury klonowania.

Plazmid pUPO153 oczyszczono z E. coli DH5a i wprowadzono do Pichia pastoris stosując elektroporację (The Pichia Yeast Expression System, Phillips Petroleum Company) albo

187 218 stosując The Pichia Spheroplast Module (Invitrogen, San Diego, USA). Mutanta Pichia pastoris o uszkodzonym układzie wykorzystywania metanolu, KM71 (genotyp his4, aox1::ARG4) (Cregg i Madden 1987; Tschopp i in., 1987). Zastosowano jako biorcę. Rekombinowane kolonie Pichia pastoris selekcjonowane na płytkach agarowych bez histydyny badane były przesiewowo przy użyciu PCR na obecność genu oksydazy heksozowej.

Oprócz starterów swoistych wobec oksydazy heksozowej (Tabela 3.1.) zastosowano startery swoiste wobec promotora oksydazy alkoholowej i sygnału przerwania translacji Pichia pastoris (Invitrogen).

Próbkę Pichia pastoris KM71 zawierającą pUPO 153 zdeponowano w Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1b, D-38124, Braunschweig, Niemcy, 23 maja 1996 pod numerem DSM 10693.

4.2. Ekspresja rekombinowanej oksydazy heksozowej w Pichia pastoris

Szczep KM71 Pichia pastoris zawierający kasetę ekspresji z genem oksydazy heksozowej wprowadzonym pomiędzy promotorem aoxl i sygnałem przerwania translacji hodowano w wytrząsanych butelkach w MD (1,34 g drożdżowej zasady azotowej na litr (Difco), 0,4 mg/l biotyny, 0,1% argininy i 20 g/l glukozy). 1-litrowe butelki zawierające 150 ml hodowli były inkubowane w wytrząsarce obrotowej w 30°C, 300 rpm. Gdy komórki osiągnęły gęstość OD600 = 15-20, zebrano je przez odwirowanie przy 6000 x g przez 10 minut i zawieszono w podobnej objętości (150 ml) pożywki indukcyjnej MM (1,34 g drożdżowej zasady azotowej na litr (Difco), 0,4 mg/l biotyny, 0,1% argininy, 20 g/l glukozy i 1% metanolu). Po hodowli przez dwa dni, dodano dodatkowo metanol (0,5%) w celu skompensowania zużytego i wyparowanego metanolu.

Trzy do czterech dni po indukcji, komórki zebrano przez odwirowanie (6000 x g, 10 minut i zawieszono w około 1/5 objętości 50 mM Tris-Cl, pH 7,5. Zawieszone komórki trzymano w chłodzie do rozbicia w prasie FRENCH® (SLM Instrument?, Inc., Rochester, NY). Komórki zniszczono w 20K FRENCH® Pressure Cell pod ciśnieniem wewnętrznym równym 20000 psi. Ekstrakt komórkowy sklarowano przez odwirowanie przy 10000 x g przez 10 minut w 5°C. Nadsącz zawierający oksydazę heksozową ostrożnie pobrano i poddano oczyszczaniu jak opisano poniżej.

4.3. Oczyszczanie rekombinowanej oksydazy heksozowej z Pichia pastoris

4.3.1. Etap pierwszy, chromatografia anionowymienna

Sklarowany homogenat z prasy FRENCH (100-150 ml) poddano chromatografii anionowymiennej w układzie FPLC, wyposażonym w dwie 5-ml kolumny HiTrap-Q, wypełnione Q-Sepharose High Performance (Pharmacia). Kolumny połączono szeregowo i przeprowadzono chromatografię w temperaturze pokojowej. Kolumny zrównoważono buforem A: 20 mM Tris-Cl, pH 7,5. Prędkość przepływu wynosiła 1,25 ml podczas wprowadzania próbki i 2,5 ml podczas płukania i elucji. Po wprowadzeniu próbek kolumnę płukano 30 ml bufora A. Adsorbowane białka eluowano 200 ml gradientu bufora A do bufora B: 20 mM Tris-Cl, 750 mM NaCl, pH 7,5. Podczas płukania i elucji gradientem pobierano frakcje po 2 ml. Frakcje badano na aktywność oksydazy heksozowej jak to opisano wyżej w Przykładzie 1.3 (10 pl, 15 inkubacji). Frakcje badano również na aktywność oksydazy alkoholowej (AOX) w teście, który był identyczny jak dla oksydazy heksozowej, ale jako substrat stosowano 0,5% metanol zamiast 0,05M glukozy. Jak widać na Figurze 10, profile aktywności pokazują, że AOX i HOX eluowały równolegle przy stężeniu soli równym 400 mM NaCl. Frakcje zawierające oksydazę heksozo wąpulowano i przechowywano w 4°C.

4.3.2. Etap drugi, filtracja żelowa.

Pulę z pierwszego etapu oczyszczania (20-30 ml) zatężano do około 3,5 ml przez ultrawirowanie w 4°C w urządzeniu Centriprep (Amicon, USA, nominalny ciężar cząsteczkowy odcięcia = 30000). Zatężony preparat oksydazy heksozowej sklarowano przez odwirowanie, zaś nadsącz zmieszano z gliceryną do stężenia końcowego 5%. Próbkę wprowadzono na kolumnę przy użycia aplikatora SA-5 (Pharmacia) połączonego z wlotem kolumny. Filtrację żelową przeprowadzono w 4°C na kolumnie XK 26/70 (2,6 x 66 cm, Pharmacia) z pojemnością złoża 350 ml. Kolumnę wypełniono Sephacryl S-200 HR (Pharmacia) według instrukcji

187 218 producenta. Buforem był 20 mM Tris-Cl, 500 mM NaCl, pH 7,5, zaś pompa perystaltyczna P1 (Pharmacia) ustawiona była na 0,5 ml/minutę. Rejestrowano absorbancję Uv przy długości fali 280 nm. Pobierano frakcje po 2,5 ml i badano na aktywność oksydazy heksozowej i oksydazy alkoholowej, jak to opisano wyżej (10 pl próbka, inkubacja 15 minut). Profile aktywności wykazały, że aktywności AOX i HOX są oddzielone, patrz Fig. 11. Wynik ten był oczekiwany, ponieważ oksydaza alkoholowa z drożdży metylotropowych takich jak Pichia pastoris ma natywnie ciężar cząsteczkowy równy około 600000 (Sahm i Wagner, 1973), podczas gdy HOX ma natywnie ciężar cząsteczkowy równy około 11^^(^^^130000, jak to opisano w rozdziale 1.8. Objętość elucji rekombinowanej HOX była identyczna z objętością elucji obserwowaną wcześniej na tej samej kolumnie dla natywnej HOX z Chondrus crispus (rozdz. 1.7. i

1.8.). Tak więc, rekombinowana HOX w rzeczywistości miała ten sam ciężar cząsteczkowy co natywna HOX izolowana z Chondrus crispus. Frakcje zawierające oksydazę heksozową pulowano i przechowywano w 4°C.

4.4.3. Etap trzeci, chromatografia anionowymienna na kolumnie Mono Q

Pulę z powyższego etapu drugiego dalej oczyszczano przez chromatografię anionowymienna w układzie FPLC wyposażonym w kolumnę Mono Q HR 5/5 (objętość złoża 1 ml). Kolumnę zrównoważono w buforze A: 20 mM Tris-Cl, pH 7,5. Przepływ wynosił 1 ml/min. Pule z etapu drugiego wysalano przez filtrację żelową w buforze A na kolumnach z Sephadex G-25 (PD-10 Pharmacia). Po wprowadzeniu próbki, kolumnę płukano 30 ml buforu A. Adsorbowane białka eluowano 20 ml gradientu od 0 do 100% buforu B: 20 mM Tris-Cl, 500 mM NaCl, pH 7,5. Zbierano frakcje po 0,5 ml i badano na aktywność oksydazy heksozowej, jak to opisano wyżej (10 pl próbki, inkubacja 15 minut). Frakcje zawierające oksydazę heksozową pulowano i przechowywano w 4°C.

4.3.4. Etap czwarty, ogniskowanie chromatograficzne

Pulę z powyższego etapu trzeciego oczyszczano przez ogniskowanie chromatograficzne na kolumnie Mono P HR 5/5, jak to opisano wyżej w Przykładzie 1.13., z takim wyjątkiem, że pominięto etap adsorpcji na fenylo-Sepharose. Porównując natywną i rekombinowaną oksydazę heksozową - obie postaci uzyskane w końcowym oczyszczaniu przez ogniskowanie chromatograficzne - stwierdzono, że aktywność właściwa rekombinowanej oksydazy heksozowej z Pichia pastoris była podobna co natywnej postaci izolowanej z Chondrus crispus. Oczyszczony preparat rekombinowanej oksydazy heksozowej składał się z dwóch prążków migrujących jako 29000 i 40000.

Podsumowując, rekombinowaną oksydazę heksozową można izolować i oczyszczać z organizmu gospodarza Pichia pastoris. W SDS-PAGE, rekombinowany, oczyszczony enzym wykazywał te same prążki 40000 i 29000, co odpowiedni enzym natywny z Chondrus crispus.

4.4. Właściwości rrkOmbinnwanej oksydazy heksozowej z Pichia pastoris.

Wytwarzanie i analiza sekwencji aminokwasowej fragmentów peptydowych rekombinowanej oksydazy heksozowej (rHOX).

Oczyszczoną rHOX zastosowano w preparatywnej SDS-PAGE i transferze elektrycznym na membranę PVDF, jak to opisano w Przykładzie 2.4. Powstałe prążki 29000 i 40000 poddano trawieniu enzymatycznemu polipeptydów oksydazy heksozowej związanych z PVDF, jak to opisano w Przykładzie 2.5. Fragmenty peptydowe rozdzielono przez chromatografię ciekłofazową w odwróconych fazach, jak to opisano w Przykładzie 2.7. Dobrze rozdzielone i rzadkie prążki wybrano do analizy sekwencji aminokwasowej przez automatyczną degradację Edmana (10-etapową), jak to opisano wyżej w Przykładzie 2.3. Otrzymana sekwencja aminokwasowa pokazana jest w tabeli 4.1.

187 218

Tabela 4.1. Sekwencje peptydowe otrzymane przez analizę sekwencji peptydów uzyskanych przez działanie kndoprotkinazy Lys-C na polipeptydy 40000 i 29000 rekombinowanej oksydazy heksozowej wyrażanej w Pichia pastoris.

Pochodzenie sekwencjonowaokgo peptydu	sekwewen
	Etap nr	1	2
40000	peptyd HOX-9	D	P
29000	peptyd HOX-10	L	Q

sskwek^ja aminokwaaswa i i Y L

3	4	5	6	7	8	9	10
G	Y	I	V	I	D	V	N
Y	Q	T	Y	W	Q	E	E
i	i	i	i	i	i	i	i
T	E	V	P	D	G	L	T

Sekwencja peptydu HOX-9 z rekombinowanego fragmentu 40000 wykazuje sekwencję identyczną z Aspxs do Asn 7 w sekwencji aminokwasowej oksydazy heksozowej z Chondrus crispus jak pokazano w tabeli 3.2. (Identyfikator Sekw. Nr 30). Analiza sekwencji próbki peptydu uzyskanej z rekombinowanego polipeptydu 29000 wykazała dwie reszty w każdym etapie. Identyfikacje sekwencji ammokwasowej pokazują, że dwa peptydy obecne w próbce odpowiadają Leu434 do Glu443 i Tyr388 do Thr397, w sekwencji aminokwaskwej oksydazy heksozowej Chondrus crispus, patrz, tabela 3.2. (Identyfikator Sekw. Nr 30).

Można więc wywnioskować, że sekwencje peptydowe uzyskane z rekombinowanej oksydazy heksozowej były identyczne z odpowiednimi sekwencjami aminokwasowymi natywnej oksydazy heksozowej z Chondrus crispus.

Ponadto, można wywnioskować, że Pichia pastoris transformowana genem oksydazy heksozowej z Chondrus crispus była w stanie wytwarzać rekombinowaną oksydazę heksozową.

4.4.1. Swoistość substratowa

Swoistość substratowa rekombinowaoej oksydazy heksozowej z Pichia pastoris i natywnej oksydazy heksozowej z Chondrus crispus była porównywana przy użyciu licznych cukrów w stężeniu końcowym 0,1 M w teście opisanym wyżej. Względne wielkości pokazane są w tabeli 4.2.

Tabela 4.2. Swoistość substratowa rekombinowanej oksydazy heksozowej wyrażanej w Pichia pastoris i natywnej -oksydazy heksozowej z Chondrus crispus

		Względna wielkość
Substrat	enzym rekombinowany	enzym natywny niniejsza praca	enzym natywny Sullivan i ikawa, 1973
D-glukoza	100	100	100
D-galaktoza	15	15	82
maltoza	51	31	40
celobioza	5i	33	32
laktoza	38	25	22

Jak pokazano w tabeli 4.2., swoistość substratowa rkkombinkwanej oksydazy heksozowej była niemal identyczna co natywnego enzymu. Jednakże, jakkolwiek względne wielkości wśród disacharydów zmniejszały się dla obu postaci enzymu w kierunku maltozy, celobiozy i laktozy, enzym rekombmowany wydawał się być mniej wybiórczy w utlenianiu tych disacharydów. Wyniki dla enzymu natywnego były niemal idkotycznk co w pracy Sullivan i in., 1973.

187 218

4.4.2. Zahamowanie dietyloditiokarbaminianem sodowym

Sullivan i Ikawa (1973) donoszą, że oksydaza heksozowa z Chondrus crispus jest silnie hamowana przez dietyloditiokarbaminian sodowy. Porównywano rekombinowaną oksydazę heksozową z Pichia pastoris i natywny enzym z Chondrus crispus pod względem hamowania przez ten związek wiążący miedź. Inhibitor włączono do testu enzymatycznego w dwóch stężeniach, 0,1 mM i 0,01 mM, jak to opisano w Sullivan i Ikawa (1973). Wyniki pokazano w tabeli 4.3.

Tabela 4.3. Porównanie wpływu hamującego dietyloditiokarbaminianu sodu na aktywność enzymatyczną rekombinowanej oksydazy heksozowej z Pichia pastoris i natywnej oksydazy heksozowej z Chondrus crispus

Zahamowanie (%)

Stężenie inhibitora enzym rekombinowany enzym natywny

0,1 mM 9(5 95

0,01 mM 39 41

Z tabeli 4.3 wynika, że rekombinowana i natywna oksydaza heksozową była równie wrażliwa na zahamowanie dietyloditiokarbaminianem sodu. Ponadto, wyniki były podobne do danych z natywną oksydazą heksozową, opisywanych przez Sullivana i Ikawa (1973).

Przykład 5

Wytwarzanie rekombinowanej oksydazy heksozowej w Escherichia coli

5.1. Konstruowanie wektora do ekspresji rekombinowanej oksydazy heksozowej w E. coli.

Otwartą ramkę odczytu kodującą oksydazę heksozową Chondrus crispus pokazaną w tabeli 3.2. (Identyfikator Sekw. Nr 30) wprowadzono do wektora ekspresyjnego E. coli, pET17b (Novagen). Plazmid zawierał silny, możliwy do indukowania promotor bakteriofaga T7 i sygnał przerywający translację T7. Geny wprowadzone pomiędzy te elementy kontrolujące mogą ulegać ekspresji przez dodanie izopropylo-P-D-tiogalaktopIranozydu (1PTG), jeżeli plazmid namnażany jest w specjalnym gospodarzu E. coli, np. szczepie BL21(DE3) (Novagen).

Gen oksydazy heksozowej został zmodyfikowany na końcach 5' i 3' w celu wprowadzenia genu do wektora ekspresyjnego -pET17b. Gen oksydazy heksozowej wyizolowano przez PCR przy użyciu starterów swoistych dla końców 5' i 3' genu oksydazy heksozowej. Starter 5' (Hox5'-2) miał sekwencję 5'-ATGAATI'CGTGGGTCGAAGAGCCC-3' (Identyfikator Sekw. Nr 33), zaś starterem swoistym dla końca 3' był Hox3'-1. Jako matrycę zastosowano pierwszą nić cDNA z Chondrus crispus. Amplifikację PCR przeprowadzono przy użyciu polimerazy DNA AmpliTaq® (Perkin-Elmer Cetus) jak to opisano w Przykładzie 4.1. Elektroforeza na żelu agarozowym mieszaniny reakcyjnej wykazała prążek o wielkości około 1,7 kb. Ten fragment 1,7 kb wprowadzono do wektora pT7 Blue (Novagen) dając początek plazmidowi pUP0161.

Modyfikacja końca 5' genu oksydazy heksozowej i klonowanie genu do wektora ekspresyjnego E. coli pokazano na Fig. 12. Koniec 5' zmodyfikowano przez PCR w celu wprowadzenia miejsca Ndel w miejscu początku translacji ATG Oligonukleotyd Hox5'-4, o sekwencji 5'-CAGGAATTCATATGGCTACTCTTCCCCAGAAAG-3' (Identyfikator Sekw. Nr 34) zastosowano do wraz z oligonukleotydem Hox13-(Identyfikator Sekw. Nr 28) (Tabela 3.1.) Amplifikacja PCR została opisana w Przykładzie 4.1. Mieszaninę reakcyjną frakcjonowano na 2% żelu agarozowym, zaś fragment 180 bp swoisty wobec oksydazy heksozowej oczyszczono według Przykładu 3.4. Fragment 180 bp trawiono restrykcyjnie endonukleazą ClaI i EcoRI, po czym poddano ligacji z pUP0161 trawionym tymi samymi enzymami, dając początek plazmidowi pUP0167.

Gen oksydazy heksozowej w plazmidzie pUPO167 był dalej klonowany w celu skonstruowania wektora ekspresyjnego oksydazy heksozowej dla E. coli. Plazmid pUPO167 trawiono restrykcyjnie enzymami Ndel i BamHI, oraz enzymami BamHI i SalI. Pierwsza reakcja

187 218 dawała fragment 1,6 kb, kodujący fragment 5' i część środkową genu oksydazy heksozowej, podczas gdy reakcja z enzymami BamHI i Sali dawała fragment 200 bp kodujący koniec 3' genu oksydazy heksozowej. Dwa fragmenty swoiste wobec genu oksydazy heksozowej oczyszczono na żelu agarozowym jak to opisano w Przykładzie 3.4. i poddano ligacji z plazmidem pET17b trawionym endonukleazami Ndel i Xhol. Plazmid pET17b niosący gen oksydazy heksozowej oznaczono jako pUPO181. Sokwencjonowanio DNA wykazało, że nie wprowadzono mutacji w genie oksydazy heksozowej podczas procesu izolacji i klonowania.

5.2. Ekspresja rekombinowanej oksydazy heksozowej w Escherichia coli..

Plazmid pUPO181 wprowadzono do E. coli szczepu BL21(DE3) (Novagen) standardową procedurą transformacji (Sambrook i in., 1989). Komórki hodowano w wytrząsanych butelkach w pożywce LB (Sambrook i in., wyżej). Przy gęstości komórkowej OD600 = 0,5 komórki indukowano do ekspresji rekombinowanej oksydazy heksozowej przez dodanie 10‘³ M IPTG Godzinę po dodaniu IPTG, komórki zebrano przez odwirowanie i zawieszono w buforze do próbek i poddano SDS-PAGE jak to opisano wyżej w Przykładzie 1.10.

Wynik elektroforezy pokazano na Figurze 13. Surow181 wykazywał wyraźny prążek białka wielkości 62000. Ten prążek 62000 miał ten sam ciężar cząsteczkowy co produkt translacji przewidziany z otwartej ramki odczytu. Nie transformowane komórki E. coli nie wykazywały białka 62000.

Próbkę E. coli BL21(DE3) zawierającąpUPO181 zdeponowano w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1b, D-38124, Braunschweig, Niemcy, 23 maja 1996 pod numerem DSM 10692.

Przykład 6

Wytwarzanie rekombinowanej oksydazy heksozowej w Saccharomyces cerevisiae

6.1. Konstruowanie wektora do ekspresji rekombinowanej oksydazy heksozowej w Saccharomyces cerevisiae

Otwartą ramkę odczytu kodującą oksydazę heksozowej Chondrus crispus, pokazana w tabeli 3.2 (Identyfikator Sekw. Nr 30) wprowadzono do wektora ekspresyjnego drożdży, pYES2 (Invitrogen). Plazmid pYES2 jest episomalnym wektorem o dużej liczbie kopii przeznaczonym do indukowalnej ekspresji białek rekombinowanych w Saccharomyces cerevisiae. Wektor zawiera sekwencje aktywujące i promotorowe z genu Gall S. cerevisiae, w celu silnej, ściśle regulowanej transkrypcji. Sygnał przerwania transkrypcji pochodzi z genu CYC1.

Gen oksydazy heksozowej z Chondrus crispus zmodyfikowano na końcach 5' i 3', w celu wprowadzenia genu do wektora ekspresyjnego pYES2. Gen oksydazy heksozowej izolowano z plazmidu pUPO150, jak to opisano w Przykładzie 4.1. (Figura 9). Gen oksydazy heksozowej wyizolowano jako fragment DNA tępo zakończony-EcoRI i wprowadzono do plazmidu pYES2 trawionego restrykcyjnie enzymami PvuII i EcoRI (Figura 14). Powstały plazmid, pUPO155 poddano sekwencjonowaniu DNA w celu upewnienia się, że w trakcie klonowania nie wystąpiły mutacje.

Plazmid pUPO155 oczyszczono z E. coli DH5a i transformowano do S. corovisiao przez elektroporację (Grey i Brendel, 1992). Jako biorcę zastosowano szczep PAP1500 (genotyp at, ura3-52, trp1::GAL10-GAL4, lys2-801, leu2A1, his3A200, pep4::HIS3, prblA1.6R, can1 , GAL) (Pedersen i in., 1996).

6.2. Ekspresja rekombinowanej oksydazy heksozowej w Saccharomyces cerevisiae

Szczep S. corevisiao 1500 zawierający plazmid pUP0155 hodowano i indukowano 2% galaktozą, jak to opisano w Pedersen i in., 1996. Trzy dni po indukcji, komórki zebrano przez odwirowanie i poddano lizie jak to opisano wyżej w Przykładzie 4.2. Surowy ekstrakt badano na aktywność oksydazy heksozowej przy użyciu testu z o-dianizydyną, opisanego wyżej w Przykładzie 1.3. Tabela 6.1 pokazuje, że komórki S. cerevisiao niosące gen oksydazy heksozowej są zdolne do wyrażania aktywnej oksydazy heksozowej.

187 218

Tabela 6.1. Wytwarzanie rokombinowanoj oksydazy heksozowej w Saccharomycos corovisiae Saccharomyces cerevisiao

Substrat	+ gen oksydazy heksozowej kontrola nie rekombinowana
D-glukoza D-galaktoza bez substratu	+ + 0 + 0 0 0

= brak wykrywalnej aktywności

Próbkę Saccharomyces cerevisiae szczepu 1500 zawierającą pUP0155 zdeponowano w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zollkulturen GmbH (DSM), Mascherodor Weg 1b, D-38124, Braunschwoig, Niemcy, 23 maja 1996 pod numerem DSM 10694.

187 218

Literatura:

1. Barkholt, V. and A.L. Jensen 1989. Amino Acid Analysis: Determination of Cysteine plus Half-Cystine in Proteins after Hydrochloric Acid Hydrolysis with a Disulfide Compound as Additive. Analytical Biochemistry 177:318-322.

2. Bean, R.C. and W.Z. Hassid 1956. J. Biol. Chem. 218:425- 436.

3. Clare, J J., F.B. Rayment, S.P. Ballantine, K. Sreekrishna and M.A. Romanos 1991. High-leyel expression of tetanus toxin fragment C in Pichia pastoris strains containing multiple tandem integrations of the gene. Bio/Technology 9: 455-460.

4. Cregg, J.M. and K.N. Madden 1987. Development of transformation systems and construction of methanol-utilisa-tion-defective mutants of Pichia pastoris by gene disruption. In: Biological Research on Industrial Yeast, Vol III. Stew- art, G G et al. (Eds.). pp 1-18. CRC Press, Boca Raton, FL.

5. Fernandez, J. et al. 1992. Internal Protein Sequence Analysis: Enzymatic Digestion for Less Than 10 pg of Protein Bound to Polyvinylidene Difluoride or Nitrocellulose Membranes. Analytical Biochemistry, 201:255-264.

6. Fernandez, J. et al. 1994. An Improved Procedure for Enzymatic Digestion of Polyvinylidene Difluoride-Bound Proteteins for Internal Sequence Analysis. Analytical Biochemistry, 218:112-117.

7. Groppe, J.C. and D.E. Morse 1993. Isolation of full-length RNA templates for reverse transcription from tissues rich in RNase and proteoglycans, Anal. Biochem., 210:337-343.

8. Kerschensteiner, D.A. and GL. Klippenstein 1978. Purification, Mechanism, and State of Copper in Hexose Oxidase. Federation Proceedings 37:1816 abstract.

9. Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature (London) 227:680-685.

10. Pedersen P.A., J.H. Rasmussen, and PL. Jorgensen. 1996. Expression in high yield of pig α1β1 Na,K-ATPase and inactive mutants D369N and D807N in Sacctiaromyces cerevisiae, J. Biol. Chem. 271: 2514-2522.

11. Rand, A.G. 1972. Direct enzymatic conversion of lactose to acid: glucose oxidase and hexose oxidase. Journal of Food Science 37:698-701.

12. Sahm, H. and Wagner, F. 1973. Microbial assimilation of methanol. Eur. J. Biochem. 36: 250-256.

13. Sambrook, J., E.F. Fritsch and T. Maniatis 1989. Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

14. Schagger, H. and G von Jagow 1987. Tricine-Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis for the Separation of Proteins in the Rangę from 1 to 100 kDa. Analytical Biochemistry 166:368-379.

15. Sock, J. and R. Rohringer 1988. Activity Staining of Blotted Enzymes by Reaction Coupling with Transfer Membrane- Immobilized Auxiliary Enzymes. Analytical Biochemistry 171:310-319.

16. Sullivan, J.D. and M. Ikawa 1973. Purification and Characterization of Hexose Oxidase from the red Alga Chondrus crispus. Biochemica et .Biophysica Acta 309:11 -22.

17. Tschopp, J. F., G Sverlow, R. Kosson, W. Craig, and L. Grinna 1987. High-level secretion of glycosylated invertase in the methylotrophic yeast, Pichia pastoris. Bio/Technology 5: 1305-1308.

18. Yeh, K-W, R.H. Juang and J-C. Su. A rapid and efficient method for RNA isolation from plants with high carbohydrate content. Focus 13:102-103

187 218

LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGOLNE:

(i) ZGŁASZAJĄCY:

(A) NAZWA: Bioteknologisk Institut (B) ULICA: Anker Engelunds Vej 1 (C) MIASTO: Lyngby (D) KRAJ: Denmark (E) KOD POCZTOWY: 2800 (ii) TYTUŁ wynalazku:

(iii) LICZBA SEKWENCJI: 34 (iv) POSTAĆ MOŻLIWA DO ODCZYTANIA PRZEZ KOMPUTER:

(A) TYP NOŚNIKA: Floppy disk (B) KOMPUTER: IBM PC compatible (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 8 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: nieznana (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: ID SEKW NR: 1:

Tyr Glu Pro Tyr Gly Gly Val Pro 1 5 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR:.2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 23 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: nieznana (D) TOPOLOGIA: nieznana

187 218 (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: ID SEKW NR: 2:

Ala Ile Ile Asn Val Thr Gly Leu Val Glu Ser Gly Tyr Asp Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Gly Tyr Xaa Val Ser Ser 20 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 3:

(i) CffiARAKTERYSTYIKA SEEKWUC JI:

(A) DŁUGOŚĆ: 16 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: nieznana (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: ID SEKW 1NR: 3:

Asp Leu Pro Met Ser Pro Arg Gly Val Ile Ala Ser Asn Leu Xaa Phe 15 10 15 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 4:

(i) CffiARAKTERYSITYK SEEKWETCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 14 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: nieznana (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI:

(ii) OPIS SEIKWSNCJI: ID SEKW NR: 4:

Asp Ser Glu Gly Asn Asp Gly Glu Leu Phe Xaa Ala His Thr 15 10 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 5:

(i) CffiAfRAKTERYSTO®. SEEKWETCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 4 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwas (C) NNCIOWOŚĆ: nieznana (D) TOPOLOGIA: nieznana

187 218 (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: ID SEKW NR: 5:

Tyr Tyr Phe Lys 1 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 6:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: nieznana (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: ID SEKW NR: 6:

Asp Pro Gly Tyr Ile Val Ile Asp Val Asn Ala Gly Thr Xaa Asp 15 10 15 (2) INFORMACJĄ DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 7:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 11 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: nieznana (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: ID SEKW NR: 7:

Leu Gln Tyr Gln Thr Tyr Trp Gln Glu Glu Asp 15 10 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 8:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: nieznana (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko

187 218 (xi) OPIS SEKWENCJI: ID SEKW NR: 8:

Xaa Ile Arg Asp Phe Tyr Glu Glu Met 1 5 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 9:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 23 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: nieznana (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: ID SEKW NR: 9:

Ala Ile Ile Asn Val Thr Gly Leu Val Glu Ser Gly Tyr Asp Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Gly Tyr Xaa Val Ser Ser 20 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 10:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 16 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: nieznana (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: ID SEKW NR: 10:

Asp Leu Pro Met Ser Pro Arg Gly Val Ile Ala Ser Asn Leu Trp Phe 15 10 15

187 218 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 11:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 14 aminokwasów (B) RODZAJ: amino kwas (C) NICIOWOŚĆ: nieznana (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: ID SEKW NR: 11:

Asp Ser Glu Gly Asn Asp Gly Glu Leu Phe Xaa Ala His Thr 15 10 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 12:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 4 aminokwasy (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: nieznana (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: ID SEKW NR: 12:

Tyr Tyr Phe Lys 1 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 13:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: nieznana (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: ID SEKW NR: 13:

Asp Pro GIy Tyr Ile Val Ile Asp Val Asn Ala Gly Thr Pro Asp 15 10 15

187 218 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 14:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 11 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: nieznana (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: ID SEKW NR: 14:

Leu Gln Tyr Gln Thr Tyr Trp Gln Glu Glu Asp 15 10 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 15:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: nieznana (D) TOPOLOGIA: nieznana (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: ID SEKW NR: 15:

Xaa Ile Arg Asp Phe Tyr Glu Glu Met 1 5 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 16:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy

187 218 (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: zmodyfikowana zasada; N=inozyna (B) LOKALIZACJA: para zasad 3, 6 and 12 (C) SPOSÓB IDENTYFIKACJI: dostępny w sprzedaży (D) INNA INFORMACJA (xi) OPIS SEKWENCJI: ID SEKW NR: 16:

YTNGTNGARW SNGGNTAYGA 20 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 17:

(i) CffiAUAKERYSTYi». SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 23 pary zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: zmodyfikowana zasada; N=inozyna (B) LOKALIZACJA: para zasad 6 and 12 (C) SPOSÓB IDENTYFIKACJI: dostępny w sprzedaży (D) INNA INFORMACJA (xi) OPIS SEKWENCJI: ID SEKW NR: 17:

AACCANARRT TNGANGCDAT NAC 23 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 18:

(i) CIDARAęTERYSTYYA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 23 pary zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: i my kwas nukleinowy (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: zmodyfikowana zasada; N=inozyna

187 218 (B) LOKALIZACJA: para zasad 6 and 15 (C) SPOSÓB IDENTYFIKACJI: dostępny w sprzedaży (D) INNA INFORMACJA (xi) OPIS SEKWENCJI: ID SEKW NR: 18:

GARGGNAAYG AYGGNGARCT NTT 23 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 19:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 23 pary zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: zmodyfikowana zasada; N=inozyna (B) LOKALIZACJA: para zasad 3 i 9 (C) SPOSÓB IDENTYFIKACJI: dostępny w sprzedaży (D) INNA INFORMACJA (xi) OPIS SEKWENCJI: ID SEKW NR: 19:

AANAGYTCNC CRTCRTTNCC YTC 23 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 20:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 pary zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: ID SEKW NR: 20:

ATTGGGGCTC CTTCAAGACC TT 22 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 21:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy

187 218 (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: ID SEKW NR: 21:

TGATGATTCC AAAGTTTC 18 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 22:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: ID SEKW NR: 22:

TTGGAAGAAT ACGGTTGG 18 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 23:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: ID SEKW NR: 23:

TACTATTTCG TCTGCTTGGG 20 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 24:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy

187 218 (xi) OPIS SEKWENCJI: ID SEKW NR:.24:

GAACTCTTCC GTGGTCTCCT 20 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 25:

( i) CfflARACTERYSTTYA SEEWEECJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: ID SEKW NR: 25:

CCACCTGCGT GTTGGGGTCT 20 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 26:

( i) CffiARAKTERYSTYiKY SEKWENCAn. i (A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKA ini^y kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: ID SEKW NR: 26:

CAGATCTACA AAACATGCGA G 21 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 27:

( i) CIUARAWΓERYSTΉW. 3Ι·Έ^ν^ΜΟΙ^1:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKA irny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: ID SEKW NR: 27:

TGTCGCAGAC TGTACTTG

187 218 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 28:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: ID SEKW NR: 28:

GAGTGTACAC GACATAAA 18 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 29:

( i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 pary zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: ID SEKW NR: 29:

ATGGCTACTC TTCCCCAGAA AG 22 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 30:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEEKWttNCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1801 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (genomowy) (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) LOTALIZΑCJΑ:84..1721 (xi) OPIS SEKWENCJI: ID SEKW NR: 30:

TGKAEEHGTG GG^G^GAG CCCTTEGHCE CGECTHECEG GTAHCGTGTA EGTHKKAGGE

187 218

TCGCTTGCAC ACTGAACTTC ACG ATG GCT ACT CTT CCT CAG AAA GAC CCC 110

Met Ala Thr Leu Pro Gln Lys Asp Pro

5

GGT Gly 10

TAT Tyr

ATT Ile

GTA Val

ATT Ile

GAT Asp 15

GTC Val

AAC Asn

GCG Ala

GGC ACC

GCG Ala

GAC Asp

AAG Lys

CCG Pro

GGC. A^s> 25

150

Gly

Thr 20

CCA

CGT

CTC

CCC

TCC

ATG

AAG

CCAS

GGC

TTC

GA^C

CGC

CGC

TGG

ATT

GGA

200

Pro

Arg

Leu

Pro

Ser

Met

Lys

Gln

Gly

Phe

Asn

Arg

Aog

Trp

Ile

Gil

30

35

40

ACT

AAT

ATT

GAT

TTC

GTT

TAT

GTC

GTG

TAC

ACT

CCT

CAA

(GGT

GCT

TTG

254

Thr

Asn

Ile

Asp

Phe

Val

Tyr

Val

Val

Tyr

Thr

Pro

Gln

Gly

Ala

CCs

45

50

5 !5

ACT

GCA

CTT

GAC

CGT

GCT

ATG

GAA

(AAC

TGT

TCT

CCC

GGT

ACA

GTC

AGG

302

Thr

Ala

Leu

Asp

Arg

Ala

Met

Glu

Lys

Cys

Ser

Pro

Gly

Thr

Val

Aa o

60

65

70

ATC

GTC

TCT

GGC

G(^<C

CAT

TGC

TAC

GAG

GAC

TTC

GTA

TTT

CAC

GAA

TGG

350

Ile

Val

Ser

Gly

Gly

His

Cys

Tyr

GGn

Asp

Phe

Val

Phe

Asp

Glu

CCs

75

80

85

GTC

AAG

GCC

atc

ATC

AAC

GTC

ACT

GGT

CTC

GTT

GAG

AGI

GGT

TAT

GAG

390

Val

Lys

AAa

Ile

Ile

Asn

Val

Thr

Gly

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Tyr

Acs>

90

95

110

105

GAC

GAT

AGG

GGT

TAC

TTC

GTC

AGC

AGT

(GGA

GAT

ACA

AM

TGG

GGC

TCC

440

Asp

Asp

Axg

Gly

Tyr

Phe

Val

Ser

See

dy

Asp

Thr

Asn

Trp

Gly

Ser

110

111

110

TTC

AAG

ACC

TTG

TTC

AGA

GAC

CAC

GGA

AGA

GTT

CTT

CCC

GGG

GGT

TTC

494

Phe

Lys

Thr

Leu

Phe

Arg

Asp

His

Gly

.Arg

Wl

Leu

Pro

Gly

Gly

See

125

133

H5

TGC

TAC

TCC

GTC

GGC

CTC

(GGT

GGC

CAC

ATT

GTC

GGC

(GGA

GGT

GAC

GH

542

Cys

Tyr

Ser

Val

Gly

Leu

Gly

Gly

His

Ilee

Wl

Gly

Gly

Gly

Asp

GGu

140

114

110

ATT

TTG

GCC

CGC

TTG

CAT

GGC

CTC

CCC

GTC

GG^T

T(GG

CCC

AGC

(HC

GGG

590

Ile

Leu

Ala

Arg

Leu

His

Gly

Leu

Ppo

Val

Aop

Trp

Llu

Ser

Gly

wi

155

110

116

GAG

GTC

GTC

GTT

AAG

CCA

GTC

CCC

AtZC

GGAr

d^C

TCG

GTA

CCC

(ΓΗ

TTA

638

Glu

Val

Val

Val

Lys

Ppo

Wl

Leu

Tłir

CG.u

Aop

(er

Wl

Leu

Lys

Tts

170

115

110

185

GTG

CAC

AAA

GAT

TCC

GAA

GGC

AAC

GAC

GGG

GAG

CTC

CCC

TGG

GCA

CAC

60 6

187 218

Val

His

Lys

Asp

Ser 190

Alu

nly

Asn

Asp

nly 195

llu

Leu

Phu

Trp

Ala 200

His

ACA

GGT

GGC

GGT

AAG

GGA

AAC

TTT

GGA

ATCC

ATC

AGC

CCA

TAC

TAC

TTC

304

Thr

Gly

Gly

Gly

Gly

Gly

Asn

Phe

Gly

Ile

Ile

Thr

Lys

Tyr

Tyr

Phe

205

210

215

AAG

GAT

TTG

CCC

ATG

TCT

CCCC

CGG

GGC

GTC

ATC

AGA

TCA

AAT

TTA

CAC

822

Lys

Asp

Leu

Pro

Met

Ser

Pro

Arg

Gly

Val

Ile

Ala

Ser

Asn

Leu

His

220

225

230

TTC

AGC

TGG

GAC

GAT

TTC

ACG

AGA

GAT

GCC

TTG

CAG

(ACT

Tr^G

TTG

ACA

830

Phe

Ser

Trp

Asp

Gly

Phe

Thr

Arg

Asp

Ala

Leu

Gln

Asp

Leu

Leu

Thr

235

240

245

AAG

TAC

TTC

ccac

CTT

GCC

AGA

TGT

GAT

TGG

AAG

TCA?

ACG

GTT

GGC

TCCG

878

Lys

Tyr

Phe

Lys

Leu

Ala

Aog

Cys

Asp

Trp

Lys

Asn

Thr

Val

Gly

Lys

250

25 5

260

265

TTT

CAA

ATC

TTC

CAT

CAG

GCA

GCG

G(CC

GAG

TTT

GTC

ATG

TAC

TTG

TAT

2T 6

Phe

Gln

Ile

Phe

His

Gln

Ala

Ala

Glu

Glu

Phe

Val

Met

Tyr

Leu

Tyr

200

225,

280

ACA

TCC

TAC

TCG

AAC

CGAC

GCC

GAG

CGC

GTCC

GTT

GCC

CCCC

GAC

CGT

śCAC

9T 4

Thr

Ser

Tyr

Ser

Asn

Asp

Ala

Glu

Arg

Glu

Val

Ala

Gln

Asp

TCrg

His

285

220

29 5

TAT

CAT

TTG

GAG

GCT

GAC

ATA

GGCC

CAG

ATC

TAC

TCCC

ACA

TGC

GAG

CCC

1022

Tyr

His

Leu

Glu

Ala

Asp

Ile

Glu

Gln

Ile

Tyr

Lys

Thr

Cys

Glu

Pro

300

300

3 30

ACC

AAA

GCG

CTT

GAG

GGG

CAT

GCT

GGG

TGG

GCG

CCG

TTC

CCC

GTG

CGC

10 20

Thr

Lys

Ala

Leu

Gly

Giy

Hii

Ala

Gly

Trp

TCLa

Pro

Phe

Pro

Val

Arg

315

330

332

CCG

CGC

aac;

TkGG

CAC

ACA

TCC

TCCG

ACG

TCG

TAT

ATG

CAC

GAC

GAG

ACG

1188

Pro

Arg

Lys

Arg

His

Thr

Ser

Llt

TTr

Seu

Tyr

Met

His

Asp

Glu

TTr

330

333

330

330

ATG

GAC

TAC

CCC

TTC

TAC

GCG

CCT

ACC

TGG

ACG

ATC

TCCC

GGC

TCC

GGG

ZL16 6

Met

Asp

Tyr:

Ppo

Phe

TTr

Ala

Llu

TTh

Glu

Thr

TIl;

Asn

Gly

Ser

Gly

350

335

360

CCG

AAT

cac;

AGl

AGC

TCCG

TAC

TCCG

TCT

TlG

TAC

ATG

ATC

TCCG

GAT

TTT

1214

Pro

Asn

Gln

TAg

Gly

Lls

TTr

TLy

See

Ala

Tyy

Met

Tla

Llt

Asp

Phr

365 370 375

CCl

GAT

TTC

CCC

TTG

GAC

TAT

GCC

TTA

TAC.

TAC

TGT

ACG

GAG

GlT

CCG

hro

Asp

Phh

Uln

lle

Alp

Val

Tla

TTp

Tsy

Ti^r

Tlu

TTr

TAn

Val

Ppo

380

338

330

187 218

GAC Asp

GGC TTG Gly Leu 395

ACT Thr

AGT Ser

GCC Ala

GAA ATG Glu Met 400

AAG Lys

GAT Asp

GCC Ala

TTA Leu 40 5

CTC Llu

CAG Gln

GTG Val

GTAC Asp

1310

ATG

TTT

GGT

GGT

GAG

ATT

CAC

AAG

GTG

GTC

TGG

GAT

GCG

ACG

GCA

CCC

1358

Met

Phe

Gly

Gly

Glu

Ile

His

Lys

Val

Val

Trp

Asp

Ala

Thr

Ala

Val

410

415

440

425

GCG

CAG

CGC

GAG

TAC

ATC

ATC

AAA

CTG

CAG

TAC

CAG

ACA

TAC

TGG

CAG

1406

Ala

Gln

Arg

Glu

Tyr

Ile

Ile

Lys

Leu

Gln

Tyr

Gln

Thr

Tyr

Trp

Gln

430

435

400

GAA

GAA

GAC

AAG

GAT

GCA

GTG

AAC

CTC

AAG

TGG

ATT

AGA

GAC

ttt

TAC

1454

Glu

Glu

Asp

Lys

Asp

Ala

Val

Asn

Leu

Lys

Τη?

Ile

Arg

Asp

Phe

Tyr

445

450

4!55

GAG

GAG

ATG

TAT

GAG

CCG

TAT

GGC

GGG

GTT

CCA

CGCC'

CCC

TCCC

ACG

(.CAG

150 2

Glu

Glu

Met

Tyr

Glu

Pro

Tyr

Gly

Gly

Val

Pro

Asp

Pro

Asn

Tho

Gln

460

465

470

GTG

GAG

AGT

GGT

AAA

GGT

GTG

TTT

GAG

GGA

TGC

TTCC

TTC

TACC

TAC

CCG

1150

Val

Glu

Ser

Gly

Lys

Gly

Val

Phe

Glu

Gly

Cys

Tyr

Phe

Asn

Tyo

Pro

475

480

448

GAT

GTG

GAC

TTG

AAC

AAC

TGG

AAG

AAC

GGC

AAG

TAT

GGT

GCC

CTC

GTAC

1198

Asp

Val

Asp

Leu

Asn

Asn

Trp

Lys

Asn

Gly

LyL

lyy

Gly

Ala

Leu

Glu

490

495

550

505

CTT

TAC

TTT

TTG

GGT

AAC

CTG

AAC

CGC

CTC

ATC

CCA

GCC

TAAC

TGG

TTG

1646

Leu

Tyr

Phe

Leu

Gly

Asn

Leu

Asn

Arg

Leu

Ile

LyT

Ala

Lys

Trp

Leu

510

551

520

TGG

GAT

CCC

AAC

GAG

ATC

TTC

ACA

AAC

AAA

CAC

GAC

ATC

CCT

ACT

AAA

1694

Trp

Asp

Pro

Asn

Glu

Ile

Phe

Thr

Asn

Lys

Gln

See

IlL

Ppo

Thr

Lys

525

550

553

CCT

CTT

AAG

GAG

CCC

AAG

CAG

ACG

AAA

TAGTAGGTCA CAATTAGTCA

1774

Pro

Leu

Lys

Glu

Pro

Lys

Gln

Thr

Lys

540

555

TCGACTGAAG TGCAGCACTT GTCGGATACG GCGTGATGGT TGCTTTTTAT AAACTTGGTA 1801 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 31:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 546 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa

187 218 (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (xi) OPIS SEKWENCJI: ID SEKW NR: 31:

Met 1

Ala Thh Leu

Poo 5

U1o

Ty o

Aso

roo uso 10

Ty o

llo Vao

ie o

Aso 15

Val

Asn

Ala

Gly

Thr

Ala

Asp

Lys

Pro

Asp

Pro

Arg

Leu

Pro

Ser

Met

Lys

20

25

30

Gln

Gly

Phe

Asn

Arrg

Arg

Trp

Ile

Gly

Thr

Asn

Ile

Asp

Phe

Val

Tyr

35

40

45

Val

Val

Tyr

Thr

Pro

Gln

Gly

Ala

Cys

Thr

Ala

Leu

Asp

Aog

Ala

Met

50

55

60

Glu

Lys

Cys

Ser

Pro

Gly

Thr

Val

AOrg

Ile

Val

Ser

Gly

Gly

His

Cys

65

70

75

80

Tyr

Glu

Asp

Phe

Val

Phe

Asp

Glu

Cyo

Val

Lys

Ala

Ile

11 e

Asn

Val

85

90

95

Thr

Gly

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Tyr

Asp

Asp

Asp

Arg

Gly

Tyr

Phe

Val

100

115

110

Ser

Ser

Gly

Asp

Thr

Asn

Trp

Gly

Ser

Phe

Lys

Thr

Leu

Phe

Arg

Asp

115

110

115

His

Gly

.Arg

Val

Leu

Pro

Gly

Gly

Ser

Cys

Tyr

Ser

Val

Gly

Leu

Gly

130

135

110

Gly

His

Ile

Val

Gly

Gly

Gly

Asp

Gly

Ile

Leu

Ala

Arg

Leu

His

Gly

145

150

155

160

Leu

Pro

Val

Asp

Trp

Leu

Ser

Gly

a^«^i

GGn

Val

Val

Val

Lys

Pro

Val

165

110

175

Leu

Thr

Glu

Asp

S er

Val

Leu

Ll^sj

Tyr

Val

His

Lys

Asp

Ser

Glu

Gly

180

118

190

Asn

Asp

Gly

Glu

Leu

Phe

Trp

Ala

His

Thr

Gly

Gly

Gly

Gly

Gly

Asn

195

220

2205

Phe

Gly

11 e

Ile

Thr

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Lys

Asp

Leu

Ppo

Met

SSr

Ppo

210

22^5

222

Arg

Gly

Val

Ile

Ala

SSe

Asn

Leu

Hi.s

PP.h

SSe

Thp

Asp

Gly

Phe

Thr

225

230

220

220

187 218

Arg Asp

Ala

Leu Gln Asp Leu Leu Thr Lys

Tyr

Phe

Lys

Leu

Ala 255

Arg

245

2250

Cys

Asp

Lys

Asn

Ohr

Val

Gly

Lys

Phe

Gln

Ile

Phe

His

Gln

Ala

260

265

220

Ala

Glu

Glu

Ph.e

Vil

Met

Tyr

Leu

Tyr

Thr

Ser

Oyr

Ser

Asn

Asp

Ala

275

280

263 25

Glu

Arg

Glu

Val

Ala

Gln

Alp

Ppg

His

Oyr

Hss

Leu

Glu

ALa

Asp

Ile

290

295

300

Glu

Gln

Ile

Oyr

Lys

Thr

Cys

Glu

Pro

Oho

Lys

Ala

Leu

Gl y

Gly

His

305

310

315

330

Ala

Gly

Orp

Ala

Pro

Phe

Pro

VaL

Arg

Pro

Arg

Lys

Arg

His

Thr

Ser

325

330

335

Lys

Thr

Ser

Tyr

Met

His

Asp

Glu

Oho

Met

Asp

Tyr

Ppo

Phe

Oyr

Ala

340

335

335

Leu

Thr

Glu

Thr

Ile

Asn

Gly

Ser

Gly

Pro

Asn

Gln

Arg

Gly

Lys

Tyr

355

3 <50

330

Lys

Ser

Ala

Tyr

Mee

Ile

Iys

.Asp

Plie

Pro

Asp

Phe

Gln

Hu

Asp

Val

370

375

330

Ile

Trp

Lys

Tyr

Leu

Thr

Glu

Val

Pro

Asp

Gly

Leu

Thr

Ser

Ala

Glu

385

390

399

440

Met

Lys

Asp

Ali

Leu

Leu

Gln

Val

Asp

Met

Phe

Gly

Gly

Glu

IIn;

His

405

440

415

Lys

Val

Val

Trp

Asp

Ala

Thr

Ali

ViL

Ala

Gln

Arg

Glu

Tyr

Ile

He

420

442

443

Lys

Leu

Gln

Tyr

Gln

Thr

Tyr

Τη?

Gln

Glu

Glu

Asp

Ll.

Agp

Ali

Val

435

440

444

Asn

Leu

Lys

Tro

I In

Arg

Asp

PPe

Tyr

Glu

Alu

M^t;

Ayr

Alu

Pro

Tyr

450

445)

440

Gly

Gly

Val

Pro

Asp

Ppo

Asn

Thr

Gln

Vil

Glu

Ser

Gly

Lys

Gln

Val

465

440

440

440

Phe

Glu

Gly

Cys

Tyo

PPe

Asn

Tj.

Ppo

Asp

Val

Asp

Leu

Asn

Aap

Aop

485 490 495

Lys Asn Gly Lys Tyr Gly Ala Leu Glu Leu Tyr Phe Leu Gly Asn Leu 500 505 510

187 218

Asn Arg Leu

Ile

Lys Ala

Lys

Trp 520

Leu

Trp Asp

Pro

Asn 525

Glu

Ile

Phe

515

Thr

Asn

Lys

Gln

Ser

Ile

Pro

Thr

Lys

Pro

Leu

Lys

Glu

Pro

Lys

Gln

530

535

540

Thr

Lys

545 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 32:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 27 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: ID SEKW NR: 32:

ACCAAGTTTA TAAAAAGCAA CCATCAC 27 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 33:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 24 pary zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: ID SEKW NR: 33:

ATGAATTCGT GGGTCGAAGA GCCC 24 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR: 34:

( i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 33 pary zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza

187 218 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy (xi) OPIS SEKWENCJI: ID SEKW NR: 34:

CAGGAATTCA TATGGCTACT CTTCCCCAGA AAG 33

187 218

3 4

Fig. 2

187 218

187 218

Fig. 5

187 218

BCoueqjosqy c

£ <D £

c jo

UJ

Czas elucji (min.

187 218

Bpoueqjosqv φ

E c

.2 zj

UJ

Czas elucji (min.

187 218

2

Fig. 8

187 218

1. strand cDNA 1 nić cDNA

Fig. 9

187 218

Figure 10

glukoza metanol

Aktywność oksydazy (10 μ1/15 min.

Oxidase acth/ity (A₄₁₀ /10//I/15min) fraction number (2.0 ml)

Liczba frakcji (2.0 ml)

187 218

Aktywność oksydazy (^Α41θ/10 μΙ/15 min)

Oxidase activity (A_41o/10 μΙ/15 min)

Liczba frakcji (2,5 ml)

187 218

PCR EcjRI + Clal

pUPOlól .EcoRI + Clal

EcoRI Clal Clal

187 218

2

Fig. 13

187 218

Ndel + Kle no w EcoRI

Ligation

Ligaćja

/©URI

pUPO155

Fig. 14

187 218

Oczyszczanie oksydazy heksozy z Chondrus crispus, a następnie wytwarzanie i rozdział fragmentów peptydowych w celu analizy sekwencji aminokwasowej

FIG. 1

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 6,00 zł.

Claims (37)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania polipeptydu o aktywności oksydazy heksozowej, znamienny tym, że obejmuje wyizolowanie kodującego polipeptyd fragmentu DNA pochodzącego z gatunku alg morskich, wprowadzenie fragmentu DNA do odpowiedniego organizmu gospodarza, w którym fragment DNA jest połączony z odpowiednim sygnałem ekspresji dla tego fragmentu DNA, hodowanie organizmu gospodarza w warunkach prowadzących do ekspresji polipeptydu o aktywności oksydazy heksozowej oraz odzyskanie polipeptydu z pożywki albo organizmu gospodarza, przy czym fragment koduje polipeptyd obejmujący przynajmniej jedną sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z:

   (i) Tyr-Glu-Pro-Tyr-Gly-Gly-Val-Pro (Identyfikator Sekw. Nr 1), (ii) Ala-Ile-Ile-Asn-Val-Thr-Gly-Leu-Val-Glu-Ser-Gly-Tyr-Asp-X-X-X-Gly-Tyr-X-ValSer-Ser (Identyfikator Sekw. Nr 2), (iii) Asp-Leu-Pro-Met-Ser-Pro-Arg-Gly-Val-Ile-Ala-Ser-Asn-Leu-X-Phe (Identyfikator Sekw. Nr 3), (iv) Asp-Ser-Glu-Gly-Asn-Asp-Gly-Glu-Leu-Phe-X-Ala-His-Thr (Identyfikator Sekw. Nr 4), (v) Tyr-Tyr-Phe-Lys (Identyfikator Sekw. Nr 5), (vi) Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Val-Ile-Asp-Val-Asn-Ala-Gly-Thr-X-Asp (Identyfikator Sekw. Nr 6), (vii) Leu-Gln-Tyr-Gln-Thr-Tyr-Trp-Gln-Glu-Glu-Asp (Identyfikator Sekw. Nr 7), (viii) X-Ile-Arg-Asp-Phe-Tyr-Glu-Glu-Met (Identyfikator Sekw. Nr 8), oraz (ix) z sekwencji ^ninokwasowych °d (i) do ((^iii) z delecją, addycją lul?

   substytucją jednego lub więcej aminokwasów, zasadniczo nie zmieniającą aktywności peptydu oksydazy heksozowej, gdzie X w sekwencjach (ii), (iii), (iv) i (viii) oznacza aminokwas wybrany z grupy obejmującej Ala, Arg, Asn, Asp, Asx, Cys, Gln, Glu, Glx, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr i Val.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że gatunek alg morskich wybrany jest z grupy składającej się z Chondrus crispus, Irydophycus flaccidum i Euthora cristata.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że organizm gospodarza jest mikroorganizmem wybranym z grupy składającej się z gatunków bakterii, grzybów i drożdży.
4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że organizm gospodarza jest wybrany z grupy składającej się z E. coli, Saccharomyces cerevisiae i Pichia pastoris.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje jako dalszy etap oczyszczanie preparatu polipeptydu odzyskanego wstępnie z pożywki hodowlanej i/lub mikroorganizmu, w celu uzyskania preparatu, w którym polipeptyd jest w zasadniczo czystej postaci.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że polipeptyd o aktywności oksydazy heksozowej jest produktem fuzyjnym.
7. 7. Polipeptyd pochodzący z gatunku alg morskich o aktywności oksydazy heksozowej i będący w zasadniczo czystej postaci, obejmujący przynajmniej jedną sekwencję aminokwasową wybraną z grupy składającej się z:

   (i) Tyr-Glu-Pro-Tyr-Gly-Gly-Val-Pro(IddntvfikatorSekw. Nr 1 ),

   187 218 (ii) Ala-Ile-Ile-Asn-Val-Thr-Gly-Leu-Val-Glu-Ser-Gly-Tyr-Asp-X-X-X-Gly-Tyr-X-ValSer-Ser (Identyfikator Sekw. Nr 2) , (iii) Asp-Leu-Pro-Met-Ser-Pro-Arg-Gly-Val-Ile-Ala-Ser-Asn-Leu-X-Phe (Identyfikator Sekw. Nr 3), (iv) Asp-Ser-Glu-Gly-Asn-Asp-Gly-Glu-Leu-Phe-X-Ala-His-Thr (Identyfikator Sekw. Nr 4), (v) Tyr-Tyr-Phe-Lys (Identyfikator Sekw. Nr 5), (vi) Asp-Pro-Gly-Tyr-Ile-Val-ne-Asp-Val-Asn-Ala-Gly-T]hr-X-Asp (Identyfikator Sekw. Nr 6), (vii) Leu-Gln-Ty-Gln-Thr-Tyr-Trp-Gln-Glu-Glu-Asp (Identyfikator Sekw. Nr 7), (viii) X-Ile-Arg-Asp-Phe-Tyr-Glu-Glu-Met (Identyfikator Sekw. Nr 8), oraz (ix) kt(^i^r^jl^(^l\^i(^li z selkwencji mninokwasotwyh 0) (viii) z addycją lr^lb substytucją jednego lub więcej aminokwasów, zasadniczo nie zmieniającą aktywności peptydu oksydazy heksozowej, gdzie X w sekwencjach (ii), (iii), (iv) i (viii) oznacza aminokwas wybrany z grupy obejmującej Ala, Arg, Asn, Asp, Asx, Cys, Gln, Glu, Glx, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr i Val.
8. 8. Polipeptyd według zastrz. 7, wytwarzany sposobem określonym w zastrz. 1.
9. 9. Polipeptyd według zastrz. 7, wytwarzany przez komórkę drobnoustroju wybraną z grupy składającej się z komórki bakterii, komórki grzybów oraz komórki drożdży.
10. 10. Polipeptyd według zastrz., wytwarzany przez komórkę wybraną z grupy składającej się z komórki E. coli, komórki Saccharomyces cerevisiae i komórki Pichia pastoris.
11. 11. Polipeptyd według zastrz. 7, będący w zasadniczo nie glikozylowanej postaci.
12. 12. Polipeptyd według zastrz. 7, wykazujący charakterystykę funkcjonalną, która jest identyczna albo częściowo identyczna z charakterystyką oksydazy heksozowej występującej naturalnie w Chondrus crispus.
13. 13. Polipeptyd według zastrz. 12, który po poddaniu go SDS- PAGE wykazuje osobne prążki 29000,40000 i/lub 60000.
14. 14. Polipeptyd według zastrz. 7, wykazujący aktywność enzymatyczną w znkresie pH od 5 do 9.
15. 15. Polipeptyd według zastrz. 7, o optimum temperatury dla aktywności enzymatycznej w zakresie od 20°C do 60°C.
16. 16. Polipeptyd według zastrz. 7, utleniający przynajmniej jeden cukier wybrany z grupy składającej się z D-glukozy, D- galaktozy, maltozy, celobiozy, laktozy, D-mannozy, D-fukozy i D-ksylozy.
17. 17. Polipeptyd według zastrz. 7, o punkcie izoelektrycznym w zakresie od 4 do 5.
18. 18. Polipeptyd według zastrz. 7, o ciężarze cząsteczkowym w zakresie 100000-150000, określonym filtracją żelową na Sephacryl S-200 Superfine (Pharmacia).
19. 19. Polipeptyd według zastrz. 7 będący częścią produktu fuzyjnego obejmującego sekwencje aminokwasowe o dodatkowej aktywności enzymatycznej.
20. 20. Rekombinowana cząsteczka DNA obejmująca fragment DNA kodujący polipeptyd określony w zastrz. 7.
21. 21. Cząsteczka DNA według zastrz. 20, obejmująca sekwencję DNA (Identyfikator Sekw. Nr 30):

    TGAATTCGTG GGTCGAAGAG CCCTTTGCCT CGTCTCTTCTG GTACCGTGTA TGTCCAAAGGT 60 TCGCTTGCAC ACTGAACTTC ACGATGGCTA CTCTTCCTCA G1AAAGACCCC GGTTATATTG 120 TAATTGATGT CAACGCGGGC ACCGCGGACA AGCCGGACCC ACGTCTCCCC TCCATGGAAGC 180 AGGGCTTCAA CCGCCGCTGG ATTGGAACTA ATTTTCGATTT CGTTTATGTC GTGTACACTC 240 CTCAAGGTGC TTGTACTGCA CTTGACCGTG ctatggaaaao GTGTTCTCCC GGTACAGTCA 3 00 GGATCGTCTC TGGCGGCCAT TGCTACGAGG ACTTCGTATT TTACGAATGC GTCCAA3GCCCA 3(50 TCATCAACGT CACTGGTCTC GTTGAGAGTG GTTATGACGA CGATAGGGGT TACTTCGTCA 420

    187 218

    GCAGTGGAGA TACAAATTGG GGCTCCTTCA AGACCTTGTT CAGAGACCAC GGAAGAGTTC 480 TTCCCGGGGG TTCCTGCTAC TCCGTCGGCC TCGGTGGCCA CATTGTCGGC GGAGGTGACG 540 GCATTTTGGC CCGCTTGCAT GGCCTCCCCG TCGATTGGCT CAGCGGCGTG GAGGTCGTCG 600 TTAAGCCAGT CCTCACCGAA GACTCGGTAC TCAAGTATGT GCACAAAGAT TCCGAAGGCA 660 ACGACGGGGA GCTCTTTTGG GCACACACAG GTGGCGGTGG CGGAAACTTT GGAATCATCA 720 CCAAATACTA CTTCAAGGAT TTGCCCATGT CTCCACGGGG CGTCATCGCA TCAAATTTAC 780 ACTTCAGCTG GGACGGTTTC ACGAGAGATG CCTTGCAGGA TTTGTTGACA AAGTACTTCA 840 AACTTGCCAG ATGTGATTGG AAGAATACGG TTGGCAAGTT TCAAATCTTC CATCAGGCAG 900 CGGAAGAGTT TGTCATGTAC TTGTATACAT CCTACTCGAA CGACGCCGAG CGCGAAGTTG 960 CCCAAGACCG TCACTATCAT TTGGAGGCTG ACATAGAACA GATCTACAAA ACATGCGAGC 1020 CCACCAAAGC GCTTGGCGGG CATGCTGGGT GGGCGCCGTT CCCCGTGCGG CCGCGCAAGA 1080 GGCACACATC CAAGACGTCG TATATGCATG ACGAGACGAT GGACTACCCC TTCTACGCGC 1140 TCACTGAGAC GATCAACGGC TCCGGGCCGA ATCAGCGCGG CAAGTACAAG TCTGCGTACA 1200 TGATCAAGGA TTTCCCGGAT TTCCAGATCG ACGTGATCTG GAAATACCTT ACGGAGGTCC 1260 CGGACGGCTT GACTAGTGCC GAAATGAAGG ATGCCTTACT CCAGGTGGAC ATGTTTGGTG 1320 GTGAGATTCA CAAGGTGGTC TGGGATGCGA CGGCAGTCGC GCAGCGCGAG TACATCATCA 1380 AACTGCAGTA CCAGACATAC TGGCAGGAAG AAGACAAGGA TGCAGTGAAC CTCAAGTGGA 1440 TTAGAGACTT TTACGAGGAG ATGTATGAGC CGTATGGCGG GGTTCCAGAC CCCAACACGC 1500 AGGTGGAGAG TGGTAAAGGT GTGTTTGAGG GATGCTACTT CAACTACCCG GATGTGGACT 1560 TGAACAACTG GAAGAACGGC AAGTATGGTG CCCTCGAACT TTACTTTTTG GGTAACCTGA 1620 ACCGCCTCAT CAAGGCCAAA TGGTTGTGGG ATCCCAACGA GATCTTCACA AACAAACAGA 1680 GCATCCCTAC TAAACCTCTT AAGGAGCCCA AGCAGACGAA ATAGTAGGTC ACAATTAGTC 1740 ATCGACTGAA GTGCAGCACT TGTCGGATAC GGCGTGATGG TTGCTTTTTA TAAACTTGGT 1800 A 1801
22. 22. Komórka drobnoustroju, znamienna tym, że zawiera rekombinowaną cząsteczkę DNA określoną w zastrz. 20.
23. 23. Komórka według zastrz. 22, znamienna tym, że jest wybrana z grupy składającej się z komórki bakterii, komórki grzybów oraz komórki drożdży.
24. 24. Komórka według zastrz. 23, znamienna tym, że jest wybrana z grupy składającej się z komórki E. coli, komórki bakterii kwasu mlekowego, komórki Saccharomyces cerevisiae i komórki Pichia pastoris.

    187 218
25. 25. Sposób wytwarzania produktu spożywczego, znamienny tym, że stosuje się polipeptyd określony w zastrz. 7 lub komórkę drobnoustroju określoną. w zastrz. 22.
26. 26. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że produkt spożywczy wybrany jest z grupy składającej się z produktu mleczarskiego, produktu spożywczego zawierającego skrobię i napoju niemlecznego.
27. 27. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że polipeptyd działa jako czynnik przeciwko drobnoustrojom albo jako przeciwutleniacz.
28. 28. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że polipeptyd działa jako czynnik usuwający tlen w opakowaniu spożywczym.
29. 29. Sposób wytwarzania paszy zwierzęcej, znamienny tym, że obejmuje stosowanie polipeptydu określonego w zastrz. 7 albo komórki drobnoustroju określonej w zastrz. 22.
30. 30. Sposób według zastrz. 29, znamienny tym, że paszą zwierzęcą jest kiszonka.
31. 31. Sposób redukowania zawartości cukru w produkcie spożywczym, znamienny tym, że obejmuje dodanie do produktu polipeptydu określonego w zastrz. 7 albo komórki drobnoustroju określonej w zastrz. 22 w ilości, która jest wystarczająca do usunięcia przynajmniej części cukru początkowo obecnego w produkcie spożywczym.
32. 32. Sposób wytwarzania produktu wybranego z grupy obejmującej produkt farmaceutyczny, produkt kosmetyczny i produkt higieny jamy ustnej, znamienny tym, że stosuje się polipeptyd określony w zastrz. 7 albo komórkę drobnoustroju określoną w zastrz. 22.
33. 33. Sposób wytwarzania produktu pieczonego z ciasta, znamienny tym, że obejmuje dodanie do ciasta polipeptydu określonego w zastrz. 7 albo komórki drobnoustroju określonej w zastrz. 22 zdolną do wyrażania tego polipeptydu w cieście.
34. 34. Kompozycja polepszająca ciasto, znamienna tym, że obejmuje polipeptyd określony w zastrz. 7 albo komórkę drobnoustroju określoną w zastrz. 22, zdolną do wyrażania takiego polipeptydu w cieście oraz co najmniej jeden konwencjonalny składnik ciasta.
35. 35. Kompozycja według zastrz. 34, znamienna tym, że ponadto obejmuje przynajmniej jeden enzym wybrany z grupy składającej się z celulazy, hemicelulazy, ksylanazy, pentozanazy, amylazy, lipazy i proteazy.
36. 36. Sposób analizowania zawartości cukru w próbce, znamienny tym, że jako odczynnik analityczny stosuje się polipeptyd określony w zastrz. 7 albo komórkę drobnoustroju określoną w zastrz. 22.
37. 37. Sposób wytwarzania laktonu, znamienny tym, że stosuje się polipeptyd określony w zastrz. 7 albo komórkę drobnoustroju określoną w zastrz. 22, przy czym obejmuje on wprowadzenie polipeptydu i/lub komórki drobnoustroju do reaktora zawierającego węglowodan, który może być utleniony przez polipeptyd i działającego w warunkach, w których węglowodan jest utleniany do laktonu.