CN1281744C - 麦芽糖/海藻糖转化酶及其制备和应用 - Google Patents

麦芽糖/海藻糖转化酶及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

一种以SDS-PAGE测得分子量为约57,000-120,000道尔顿，以两性电解质进行等电电泳测得PI为3.8-5.1的酶，该酶能将麦芽糖转化为海藻糖，反之亦然。该酶从Pimelobacter、Pseudomonas和Thermus属微生物中分离出来。使用该酶，可以很容易地以低成本从市售麦芽糖工业规模生产海藻糖。以该酶制备的海藻糖及其含海藻糖的糖类组合物，适于在食品，化妆品组合物和药物组合物中使用。

Description

麦芽糖/海藻糖转化酶及其制备和应用
本发明涉及新的酶及其制备和应用。更具体地说，本发明涉及将麦芽糖转化为海藻糖或将海藻糖转化为麦芽糖的酶(下文称之为麦芽糖-海藻糖转化酶)及其制备。本发明还涉及能产生该酶的微生物，用该酶制备的海藻糖，含海藻糖的糖类组合物以及含海藻糖或糖类组合物的组合物。
海藻糖或α，α-海藻糖是已知由葡萄糖组成的非还原糖。正如Advance in Carbohydrate Chemistry Vol.18 PP.201-225(1963，Academic Press，USA出版)和Applied andEnvironmental Microbiology，Vol.56 PP.3213-3215(1990)所述，海藻糖广泛存在于微生物，菌类植物、昆虫等内，尽管含量相当低。因为海藻糖是非还原糖，这样它既不与含氨基物质例如氨基酸和蛋白质反应，诱导氨基-羰基反应，也不会使含基酸物质变质。这样可使用海藻糖而不必担扰引起令人不满意的变黄和变质的弊病。因此，极需要建立工业规模制备海藻糖的方法。
常规制备海藻糖的方法例如是日本专利予公开No.154485/75中描述的方法——该方法中使用微生物，和日本专利予公开号216695/83中描述的方法，该方法通过结合使用麦芽糖-和海藻糖-磷酸酶将麦芽糖转化为海藻糖。但是前者不适于工业规模生产，因为海藻糖在作为初始原料的微生物中的含量，以干燥固体计(d.s.b)，通常低于15W/W％(除非特别指明，本说明书中将″W/W％″简写为″％″)，而且提取和提纯步骤复杂。后者有下述缺点：(i)因为海藻糖是通过葡萄糖-1-磷酸酯而形成的，那么作为底物的麦芽糖浓度不可能达到令人满意的高水平；(ii)磷酸酶酶反应体系是可逆反应，而且其目的产物海藻糖的产率相当低；(iii)保持该反应体系稳定并顺利进行酶促反应是非常困难的。因此，前面所述常规制备方法不可能作为工业规模的制备方法。
已知从淀粉物质、例如液化淀粉，糊精和麦芽低聚糖制备的淀粉部分水解物，因其具有还原末端基团而表现出还原力。其还原力一般以″右旋糖当量(DE)值″来表示(按其干重量计)。已知还原性淀粉部分水解物中，具相对高DE值的一般都有相当低的分子量和粘度，以及相对高的甜度及反应活性，并容易与含氨基物质，例如氨基酸和蛋白质反应，引起不希望的变黄、变味及变质现象。因为还原性淀粉部分水解物的性质随其DE值而变化，所以还原性淀粉部分水解物与其DE值之间的关系是很重要的。曾确信该领域中不可能打破这种关系。
有关海藻糖的制备，在″Food Chemicals″，No.88，PP.67-72(1992年8月)，″Current Status of Starch Application，Development and Related Problens″一章中，于″Oligosac-charides″通栏标题下曾报道：″尽管海藻糖有广泛的实用性，但通过直接糖-转变反应或水解反应的酶促制备，已有报道认为在该领域科学上说来几乎是不可能的。″因此，使用淀粉作为原料，通过酶促反应制备海藻糖，科学上视为极为困难的事。
然而本发明人改变了该传统观念，并成功地建立了如日本专利申请No.362131/92中所公开的海藻糖制备方法，其中通过使葡萄糖淀粉酶与能够形成非还原糖(具海藻糖结构作为末端单元，并且有3或更高的葡萄糖聚合度)的非还原糖形成酶一起，作用于由淀粉原料制备的，葡萄糖聚合度为3或更高的还原性淀粉部分水解物，而从非还原性淀粉部分水解物直接制备海藻糖。但是该方法需要2种以上的酶，并且要采用葡萄糖聚合度3或更高，而且粘度相当高的，分子量相对高的淀粉糖作为原料。而且，所得产物的糖类组合物相当复杂，并使得生产成本很高。因此，建立一种新的海藻糖制备方法，其中海藻糖由麦芽糖和葡萄糖聚合度为2的淀粉部分水解物形成，是适合于工业生产，稳定供给和市场销售的。
本发明的目的是提供麦芽糖-海藻糖转化酶，它能将可工业规模生产和稳定供给的麦芽糖转化成海藻糖，并提供海藻糖的新的制备和应用，以及含有用该酶制备的海藻糖的糖组合物。
为此目的，本发明人广泛地筛选能产生新型糖转化酶(该酶能从麦芽糖形成海藻糖)的微生物。结果，我们发现从日本Okayama的Okayama市土壤中分离出的Pimelobacter属微生物，即Pimelobacter SP.R48，从日本Hyogo的Nishinomiya市土壤中分离出的Pseudomonas属微生物，即Pseudomonas Putida H262以及Thermus属的微生物能形成转化麦芽糖为海藻糖的新型麦芽糖-海藻糖转化酶，并且还建立了海藻糖的制备方法和含海藻糖的糖组合物，以及含海藻糖或该糖组合物的食品、化状品和药物之类的组合物。这样，我们便完成了本发明。
附图的简要说明：
图1显示温度对从Pimelobacter SP.R48衍生的本发明的麦芽糖-海藻糖转化酶之酶活性的影响。
图2显示pH值对于从Pimelobacter SP.R48衍生的本发明的麦芽糖-海藻糖转化酶酶活性的影响。
图3显示温度对从Pimelobacter SP.R48衍生的本发明的麦芽糖-海藻糖转化酶稳定性的影响。
图4显示pH值对从Pimelobacter SP.R48衍生的本发明的麦芽糖-海藻糖转化酶稳定性的影响。
图5显示温度对从Pseudomonas Putida H262衍生的本发明的麦芽糖-海藻糖转化酶酶活性的影响。
图6显示pH值对从Pseudomonas Putida H262衍生的本发明的麦芽糖-海藻糖转化酶酶活性的影响。
图7显示温度对从Pseudomonas Putida H262衍生的本发明的麦芽糖-海藻糖转化酶稳定性的影响。
图8显示pH值对从Pseudomonas Putida H262衍生的本发明的麦芽糖-海藻糖转化酶稳定性的影响。
图9显示温度对从Thermus aquaticus(ATCC 33923)衍生的本发明的麦芽糖-海藻糖转化酶酶活性的影响。
图10显示pH对从Thermus aquaticus(ATCC 33923)衍生的本发明的麦芽糖-海藻糖转化酶酶活性的影响。
图11显示温度对从Thermus aquaticus(ATCC 33923)衍生的本发明的麦芽糖-海藻糖转化酶稳定性的影响。
图12显示pH值对从Thermus aquaticus(ATCC 33923)衍生的本发明的麦芽糖-海藻糖转化酶稳定性的影响。
本发明涉及麦芽糖-海藻糖转化酶及其制备和应用。更具体地说，本发明涉及能将麦芽糖转化为海藻糖或将海藻糖转化为麦芽糖的新的麦芽糖-海藻糖转化酶及其制备方法。本发明还涉及能产生该酶的微生物，用该酶制备的海藻糖，含海藻糖的糖组合物，以及含海藻糖或该糖组合物的组合物。.
Pimelobacter属微生物即Pimelobacter SP.R48和Pseudomonas Putida H262的鉴定试验，根据本发明给出下述结果。该试验根据由Takeji Hasegawa编著，由日本SeientificSocieties Press，Tokyo，Japan(1985)出版的″Biseibutsu-no-Bunrui-to-Dotei″(微生物的分类和鉴定)一书所述方法进行。Pimelobacter SP.R48的结果如下：
A，形态学：
(1)于27℃营养琼脂中培养时的细胞特征：通常以0.5-0.9×1.5-4.0μm的棒形存在；以单个存在，而不通常以V型对存在或以连接形式存在；不具游动性并且是无孢子的；非抗酸的；革兰氏染色阳性。
(2)于27℃在补充有酵母提取物和麦芽提取物的琼脂培养基中培养时的细胞特征：培养1天之后大小为0.6-1.0×1.3-4.2μm，而培养3天之后以大小为0.6-1.0×1.0-2.5μm的近球菌的形式存在；表现多态性；以单个存在而不常以V型对或连接形式存在。
B，培养性质：
(1)当于27℃在营养琼脂平皿上培养时所形成的菌落特征：
形状：培养24小时后为直径0.5mm的环状菌落，而培养3天之后直径为1.5-2mm；
边缘：如耳样；
投影：半球形；
光泽：无；
表面：皱褶样；
颜色：奶油色不透明菌落；
(2)于27℃在补充有酵母提取物和麦芽提取物的琼脂板上培养时所形成之菌落的特征：
形状：培养3天之后直径约1-1.5mm的环状菌落；
边缘：如耳状；
投影：半球形；
光泽：无；
表面：皱褶样；
颜色：奶油色不透明菌落；
(3)于27℃在斜面营养琼脂中培养所形成的菌落的特性：
生长：满意；
形状：如线状；
(4)27℃于营养明胶中穿刺培养时无液化明胶。
C，生理学性质：
(1)硝酸盐还原作用：阳性；
(2)脱氮反应：阴性；
(3)甲基红试验：阴性；
(4)VP试验：阴性；
(5)吲哚形成：阴性；
(6)硫化氢形成：阳性；
(7)淀粉水解作用：阴性；
(8)柠檬酸利用：阳性；
(9)无机氮源利用：利用铵盐和硝酸盐；
(10)色素形成：阴性；
(11)脲酶：阴性；
(12)氧化酶：阴性；
(13)催化酶：阴性；
(14)生长条件：生长于pH值5-9范围内，温度在15-40℃范围内；
(15)氧气要求：需氧；
(16)碳源的利用和酸形成：
  碳源   利用   酸形式
  D-葡萄糖D-半乳糖D-果糖D-甘露糖L-阿拉伯糖D-木糖L-鼠李糖麦芽糖蔗糖乳糖海藻糖棉子糖甘露糖醇糊精半乳糖醇   +-+++++++-++-+-   ---------------
(17)对氨基酸的脱羧酶试验，对L-赖氨酸，L-精氨酸和L-鸟氨酸为阴性；
(18)氨基酸利用：
利用L-谷氨酸钠和L-天冬氨酸钠；
(19)DNase：阴性；
(20)3-酮乳糖形成：阴性；
(21)DNA的鸟嘌呤(G)加胞嘧啶(C)的Mol％：72％；
(22)细胞壁的主要二氨基酸：
LL-二氨基庚二酸
Pseudomonas Putida H262的结果如下：
A，形态学
(1)于27℃在营养琼脂中培养时细胞的特征：
通常以0.5-0.7×1.0-2.0μm棒形存在，并且有不生孢子性；
具有鞭毛游动性；非抗酸性；革兰氏染色：阴性。
(2)于27℃在添加有酵母提取物和麦芽糖提取物的琼脂培养基中培养时细胞的特征：
培养1天之后大小为0.6-0.8×2.0-4.0μm。
B，培养性质
(1)于27℃在营养琼脂平皿上培养时所形成的菌落特征：
形状：培养24小时后为直径1-2mm的环形菌落，而培养3天之后直径为3.5-4mm；
边缘：完整；
投影：半球形；
光泽：湿性光泽；
表面：光滑；
颜色：乳油色或白色不透明菌落；
(2)当于27℃在补充有酵母提取物和麦芽提取物的琼脂平皿上培养时所形成的菌落的特征：
形状：培养3小时之后直径为4-5mm的环状菌落；
边缘：完整；
投影：半球形；
光泽：湿性光泽；
表面：光滑；
颜色：奶油色或白色不透明菌落；
(3)于27℃在斜面营养琼脂中培养所形成之菌落的特征：
生长：满意；
形状：线状。形成有光滑表面的相对湿性光泽、不透明黄奶油色的相对薄的投影；并且
(4)于27℃在营养明胶中穿刺培养时无液化明胶。
C，生理学性质：
(1)在琥珀酸培养基中的硝酸盐还原作用：阳性；
(2)脱氮反应：阴性；
(3)甲基红试验：阴性；
(4)VP试验：阴性；
(5)吲哚形成：阴性；
(6)硫化氢形成：阴性；
(7)淀粉水解作用：阴性；
(8)聚-β-羟丁酸酯聚集作用：阴性；
(9)原儿萘酸盐分解作用：原形；
(10)柠檬酸利用：阳性；
(11)无机氮源利用：利用铵盐和硝酸盐；
(12)色素形成：浅性色色素；
(13)萤光色素形成：阳性；
(14)脲酶：阳性；
(15)氧化酶：阳性；
(16)催化酶：阳性；
(17)生长条件：生长在pH值5-90范围，温度10-37℃范围内；
(18)对氧的要求：需氧；
(19)碳源利用及酸形成：
  碳源   利用   酸形成能力
  D-葡萄糖D-半乳糖D-甘露糖D-果糖L-阿拉伯糖D-木糖L-鼠李糖麦芽糖蔗糖乳糖海藻糖棉子糖甘露糖醇山梨糖醇半乳糖醇甘油   +-+++++++-++---+   --+------------+
(20)对氨基酸的脱羧酶试验：
对L-赖氨酸和L-鸟氨酸为阴性，对L-精氨酸为阳性；
(21)氨基酸利用
利用L-谷氨酸钠，L-天冬氨酸钠，L-精氨酸钠，L-组氨酸，
L-缬氨酸和D-丙氨酸，但不利用L-色氨酸；
(22)DNase：阴性；
(23)3-酮乳糖形成：阴性；
(24)DNA的鸟嘌呤(G)加胞嘧啶(C)的Mol％：63％。
根据上述结果，将其细菌学性质与文献，Bergey的Manual ofSystematic Bacteriology，Ist edition(1984)记载的相比较，结果表明微生物被鉴定为Pseudomonas Putida种微生物。
本发明人命名该微生物为″Pseudomonas Putida H262″，并于1994年2月23日保存于National Institute of Bioscience andHuman-Technology Agency of Industrial Science andTechnology，Ibaraki，Japan。该微生物在该日由该机构接收并保存，其保藏号为FERM BP-4579。
除了上面鉴定的微生物，Pseudomonas属的其它菌株及其突变体均可适用于本发明，只要它们产生本发明的麦芽糖-海藻糖酶即可。
而且，Thermus属微生物，例如Thermus aquaticus(ATCC25104)、Thermus aqunticus (ATCC 33923)，Thermusfilibormis(ATCC 43280)、Thermus ruber(ATCC 35948)、Thermus SP.(ATCC 43814)及Thermus SP.(ATCC 43815)等均适用于本发明。
任何营养培养基均可用于本发明，只要该微生物可在其中生长并产生本发明的酶：例如合成的和天然的营养培养基均可任意采用。任何含碳物质均可在本发明中作为碳源使用，只要它能被微生利用即可，这类碳源的例子是葡萄糖，果糖，糖蜜，海藻糖，乳糖，蔗糖，甘露糖醇，山梨糖醇，淀粉部分水解物等糖类以及柠檬酸和琥珀酸及其盐等有机酸。这些碳源在营养培养基中的浓度可适当选择。例如，在使用葡萄糖情况下，就微生物生长和繁殖而言较宜浓度通常为40W/V％或更低，优选10W/V％或更低(d.s.b)。本发明中也使用氮源，例如铵盐和硝酸盐等无机氮化合物，以及尿素，玉米浸泡液，酪蛋白，胨，酵母提取物及肉提取物等含氮有机化合物。本发明中使用的无机成分例如是钙盐、镁盐、钾盐、钠盐、磷酸盐以及锰锌、铁、钢、钼和钴的其他盐。
本发明所使用的培养条件是微生物可以生长和产生本发明的酶的条件，例如温度4-80℃范围的需氧条件，优选温度范围为约20-75℃，pH值范围为5-9，优选6-8.5。本发明采用的适当培养时间为比引发微生物生长所需时间较长的时间，优选10-100小时。对营养培养基中溶解氧(DO)的浓度并无特别限制，通常DO值约为0.5-20ppm即可满足要求。可通过控制通气速度，搅拌营养培养基，向通气中补充氧，和提高发酵罐的内压，使DO水平保持在上述范围内。该培养可采用批量方式或连续方式进行。
培养完成后，即可回收本发明的酶。因为本发明的酶活性既在细胞中也在无细胞上清液中存在，因而它们均可作为粗制酶回收和利用。新生产的培养物可整个作为粗制酶。本发明中可采用常规的液-固分离法从培养物中除去细胞。例如直接离心处理生成的培养物，用予涂层过滤器过滤细胞，或加入助滤剂过滤细胞，以及使用平板过滤器或空心纤维通过膜过滤分离细胞均是适用的。所得无细胞滤液可整个作为酶溶液使用，或可在使用前以常用方式加以浓缩。本发明所用的浓缩方法，例如采用硫酸铵盐析，使用丙酮和乙醇沉降，使用平板过滤器，空心纤维膜过滤等。
在本发明酶为胞内酶情况下，可用常规技术从细胞中提取，并将所得提取物作为粗制酶使用。为获得此种提取物，可使用超声波碎法，使用玻璃珠或氧化铝的机械破碎法、french压力破碎法等粉碎细胞，接着将所得物离心处理或膜过滤获得澄清的粗酶溶液。
可用常规技术固定无细胞滤液及其浓缩物，以及细胞提取物。此类固定技术的例子是使用离子交换剂结合法，使用树脂及膜的共价连接和吸附，以及使用高分子物质的包含法。从所得培养物分离的完整细胞可以作为粗制酶使用，或可在使用前固定之。例如将细胞与海藻酸钠混合加以固定，并将该悬浮液滴入氯化钙溶液中，使该液滴胶凝成颗粒。在其使用前，可用聚乙烯亚胺或戊二醛固定所得颗粒。
由此获得的粗制酶溶液可整个地使用，或在使用前以常规方法提纯。例如电泳显示单谱带的纯化酶制剂，可通过透析粗酶制剂(该粗酶制剂是通过用硫酸铵盐析来自破碎细胞的提取液，并加以浓缩而得到的)，并以采用″DEAE-TOYOPEARL″(一种阴离子交换剂)的阴离子交换层析，使用″BUTYL-TOYOPEARL″(一种疏水树脂)的疏水柱层析(它们均为Tosoh Corporation，Tokyo，Japan的产品)，使用″MONO Q HR5/5″(一种由瑞典Uppsala 的 Pharmacia LKBBiotechnology AB出售的阴离子交换剂)的阴离子交换柱层析，以及使用″TOYOPEARL HW-55″(一种由Tosoh Corporation，Tokyo，Japan出售的树脂)的凝胶过滤柱层析等连续纯化经过透析的溶液而制得。经这些处理程序提供电泳显示一单谱带的酶。
由此获得的本发明的麦芽糖-海藻糖转化酶有如下的物理化学性质：
(1)作用：将麦芽糖转化为海藻糖，反之亦然；
(2)分子量：以十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)测得为约57,000-120,000道尔顿；
(3)等电点(PI)：使用两性电解质以等电电泳法测得约为3.8-5.1；
(4)活性抑制作用：被1mM Cu++、Hg++和Tris-HCl缓冲剂抑制；
(5)来源：来源于微生物。
更具体地说，本发明酶的物理化学性质正如下面所示随其来源的不同而异。
来源于Pimelobacter SP.R48的麦芽糖-海藻糖转化酶有下述物理化学性质：
(1)作用：将麦芽糖转化为海藻糖，反之亦然。从1mole麦芽糖生成约1mole海藻糖，或从1mole海藻糖生成约1mole麦芽糖；
(2)分子量：用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺明胶电泳法(SDS-PAGE)测得为大约57,000-67,000道尔顿；
(3)等电点(PI)：使用两性电解质以等电电泳法测得约为4.1-5.1；
(4)活性抑制作用：被1mM Cu++、Hg++和Tris-HCl缓冲剂抑制；
(5)最适温度：当于pH7.0保温60分钟时约为20℃；
(6)最适pH值：当于25℃保温60分钟约为7.0-8.0；
(7)热稳定法：当于pH7.0保温60分钟时直到约30℃是稳定的；
(8)pH稳定性：当于20℃保温60分钟时，pH约为6.0-9.0条件下是稳定的。
来自Pseudomonas Putida H262的麦芽糖-海藻糖转化酶有
如下物理化学性质：
(1)作用：转化麦芽糖成为海藻糖，反之亦然；从1mole麦芽糖生成约1mole海藻糖，或从1mole海藻糖生成约1mole麦芽糖；
(2)分子量：由SDS-PAGE测得为大约110,000-120,000道尔顿；
(3)等电点(PI)：使用两性电解质以等电电泳法测得为大约4.1-5.1；
(4)活性抑制作用：被1mM Cu++，Hg++和50mM Tris-HCl缓冲剂所抑制；
(5)最适温度：于pH7.0保温60分钟时约为37℃；
(6)最适pH值：于pH7.0保温60分钟时pH约为7.3-8.3条件下是稳定的；
(7)热稳定性：于pH7.0保温60分钟时直到40℃是稳定的；
(8)pH稳定性：于35℃保温60分钟时pH为约6.0-9.0条件下是稳定的；
来自Thermus aquaticus(ATCC 33923)的麦芽糖-海藻糖转化酶有如下的物理化学性质：
(1)作用：转化麦芽糖成为海藻糖，反之亦然；从1mole麦芽糖生成约1mole海藻糖或从1mole海藻糖生成约1mole麦芽糖；
(2)分子量：以SDS-PAGE法测得约为100,000-110,000道尔顿；
(3)等电点(PI)：使用两性电解质以电泳法测得为约3.8-4.8；
(4)活性抑制作用：被1mM Cu++，Hg++和50mM Tris-HCl缓冲剂所抑制；
(5)最适温度：于pH7.0保温60分钟时约为65℃；
(6)最适pH值：于60℃保温60分钟时pH约为6.0-6.7是稳定的；
(7)热稳定性：于pH7.0保温60分钟时直到80℃是稳定的；
(8)pH稳定性：于60℃保温60分钟时，pH为5.5-9.5是稳定的。
按下述方法测定本发明的麦芽糖-海藻糖转化酶的活性：将1ml酶溶液加入到在10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中之作为底物的1ml20W/V％麦芽糖中，将该混合物溶液于25℃、35℃或60℃保温60分钟，接着于100℃加热溶液10分钟中止该酶促反应。用50mM磷酸盐缓冲液(pH7.5)将所得反应混合物精确地稀释11倍，并将0.4ml稀释溶液与0.1ml海藻糖酶溶液(每毫升1单位海藻糖酶)混合。将所得溶液于45℃保温120分钟，接着用葡萄糖-氧化酶法测定葡萄糖量。使用海藻糖和于100℃予加热10热分钟使酶失活的酶溶液作为对照，该酶溶液的活性测定同上。借助上述检测法，由本发明的麦芽糖-海藻糖转化酶所生成的海藻糖含量是根据所形成的葡萄糖量测定的，并且将1单位酶活性定义为每分钟形成1μmole海藻糖的酶量。所述反应温度，对于Pimelobacter属微生物的酶是25℃，对于Pseudomonas属微生物的酶是35℃，而对于Thermus属微生物的酶为60℃。
因为本发明的麦芽糖-海藻糖转化酶能转化麦芽糖为海藻糖，反过来也可以转化海藻糖为麦芽糖，所以可用麦芽糖或者海藻糖作为底物满足其最后使用。麦芽糖被用作制备海藻糖的底物。
任何麦芽糖均可用于本发明中，只要当受到本发明的麦芽糖-海藻糖转化酶的作用能转化为海藻糖即可。一般来说，具有最高可能纯度的高麦芽糖含量产物最好，优选纯度70％或更高(d.s.b)者。市售麦芽糖产物，和使用常规淀粉糖化技术所制得的麦芽糖也可使用。
从淀粉制备麦芽糖的例子如日本专利公开No.11437/81和17078/81中所公开的方法，其中使β-淀粉酶作用于胶凝和液化的淀粉，形成麦芽糖，然后将其从高分子糊精中分离出来，并以高麦芽糖含量产物回收之。其他例子如日本专利公开No.13089/72和3938/79中所公开的方法，其中使β-淀粉酶作用于加有淀粉脱支酶例如异淀粉酶和支链淀粉酶的胶凝和液化淀粉，形成麦芽糖，然后以高麦芽糖含量产物回收之。
将日本专利公开No.28153/81、3356/82和28154/81中所公开的酶，加入到按前述方法制备的，存在于所得高麦芽糖含量产物中的付产糖类如麦芽三糖中，以增加麦芽糖含量。在采用日本专利予公开No.23799/83中所述强酸性阳离子交换树脂的层析柱上除去付产物糖类，可更大地增加高麦芽糖含量产物中的麦芽糖含量。
对本发明中所使用的底物浓度并无特殊限制。本发明酶的酶促反应甚至在0.1％-50％原料麦芽糖的溶液中也能进行，从而形成海藻糖。含不溶性底物的悬浮液也可用于本发明。本发明酶促反应所使用的温度可定在不至使用酶失活的温度，即直到约80℃，优选温度范围为0-70℃。本发明酶促反应所使用的pH值定为大约5.5-9.0，优选pH约为6.0-8.5。本发明酶促反应所用时间根据反应条件而适当选择，通常当酶的用量约0.1-100单位/每克底物(d.s.b)时，时间约为0.1-100小时。
本发明的酶促反应能以相当高的转化率将麦芽糖原料转化为海藻糖，即最大值约为70-85％。
由此获得的反应混合物，按通常的方法过滤和离心处理以除去不溶性物质，并用活性炭脱色，用H-和OH-型离子交换树脂脱盐，并浓缩成糖浆状产物。假如必要，可将该糖浆产物任意地干燥成粉末产物或制成结晶产物。
另外，采用一种或多种方法加以提纯，很容易将粉末状产物加工成高纯度海藻糖产物，例如用离子交换柱层析和用活性炭或硅胶柱层析进行分级分离，以及用碱处理分解并除去剩余的还原糖。经上述柱层析分离出的麦芽糖可用作通过本发明的麦芽糖-海藻糖转化酶将麦芽糖转化为海藻糖的底物。
假如必要，可以用葡萄糖淀粉酶和α-葡萄糖苷酶水解本发明的含海藻糖糖类组合物，或使用环麦芽糊精葡聚糖转移酶和/或葡糖基转移酶进行糖转移反应，以控制其甜度、还原力及粘度。另外，生成的海藻糖产物中的还原糖类，可用碱处理使其分解并用酵母使其发酵，而任意除去，或者氢化成糖醇。由此消除其还原力。利用上述纯化法，例如离子交换柱层析法，可将葡萄糖从所得物中除去，获得高海藻糖含量馏分。由此获得的馏分很容易纯化和浓缩成糖浆状产物，并且假如必要，可将该糖浆产物进一步浓缩成超饱和溶液和结晶成含水和无水结晶海藻糖。
本发明所用离子交换柱层析包括例如日本专利予公开Nos.23799/83和72598/83中所述，采用强酸性阳离子交换树脂的层析法。使用柱层析很容易除去含在粗海藻糖产物中的付产物糖类，获得高海藻糖含量馏分。在这种情况下，可任意采用固定床法，移动床法和半移动法之中的一种。
为制备含水结晶海藻糖，将纯度为60％或更高的65-90％海藻糖溶液放入结晶器中，在存在或不存在约0.1-20％晶种的情况下，温度95℃或更低，优选10-90℃温度范围，搅拌下逐渐冷却，获得含水合结晶海藻糖的糖膏。可任意采用连续结晶法，该方法是使目的产物糖类于真空中浓缩而达到结晶。本发明可采用常规方法，例如分离、团块粉碎、流动床造粒及喷雾干燥来对糖膏水合结晶海藻糖或含海藻糖的结晶糖类进行处理。
在进行分离时，通常是对糖膏进行篮式离心，使含水结晶海藻糖从母液中分离出来，假如必要，用少量冷水喷淋洗涤所得含水结晶海藻糖，以利于制备高纯度的含水结晶海藻糖。
如用喷雾干燥法，通过高压泵喷嘴喷雾浓度约为60-85％(d.s.b)、结晶度约20-60％(d.s.b)的糖膏很容易制备出没有或基本上没有吸水性的结晶糖；以不至于熔化所得结晶粉末的约60-100℃的热空气干燥之；将所得粉末陈化1-20小时，同时吹入约30-60℃热空气。
若用团块粉碎法，则将湿度约为10-25％，结晶度为10-60％(d.s.b.)的糖膏放置几小时至3天左右，使其结晶并使整个固化形成块状，将所得团块磨碎或切碎并干燥，便很容易制得不含水或基本不含水的结晶糖。
虽然无水结晶海藻糖可通过干燥含水结晶海藻糖使其转化为无水形式而制得，但一般是这样制备：提供湿度小于10％的高海藻含量溶液，置于结晶器中，在晶种存在下和搅拌条件下保持在温度50-160℃，优选80-140℃，以获得含无水结晶海藻糖的糖膏，用常规方法例如团块粉碎法、流化床制粒法结晶和粉碎该无水结晶海藻糖，并在干燥和相对高的温度条件下喷雾干燥。
由此获得的本发明海藻糖是稳定的并且基本上无还原力。可以与别的原料，特别是氨基酸和寡聚肽及蛋白质之类的含氨基酸物质混合并加工，而无需顾虑会引起这些物质变黄、变味、变质等令人生厌的问题。海藻糖本身具有令人满意的高质量和甜度。因为海藻糖容易由海藻酶水解为葡萄糖，所以当口服时它容易被活的机体消化、吸收或作为能源利用。而且，海藻糖基本上不被诱发龋齿的微生物发酵，这就使之可用作甜味剂而基本上不会引起龋齿。
本发明的海藻糖是稳定的甜味剂，特别是当与粘合剂例如支链淀粉，羟乙基淀粉或聚乙烯吡咯烷酮结合使用时，结晶海藻糖可任意被用作糖衣片剂。此外，海藻糖还具有控制渗透压能力，赋予填充剂能力，赋予光泽能力，保持湿润能力，赋予粘性能力，基本上无发酵能力，避免胶凝淀粉退化能力以及避免其它糖类结晶的能力。
因此，本发明的海藻糖及其含海藻糖的糖组合物可以任意地作为甜味剂、调味剂、质量改善剂、稳定剂和填充剂，用于各种组合物例如食品、香烟、烟草、饲料、化状品及药物中。
本发明的海藻糖和糖组合物，可以整个地用作增甜调味剂。假如必要，它们可与适量的一种或多种其它甜味剂，例如粉末状糖蜜、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、异构糖、蜂蜜、槭糖、山梨糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、二氢查尔酮、斯替维甙、α-葡糖基斯替维甙、雷巴二糖苷(rebaudioside)、甘草皂甙、L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯、糖精、甘氨酸和丙氨酸，和/或糊精、淀粉及乳糖等填充剂结合使用。
含本发明海藻糖的粉末状结晶产物，或者糖组合物可以整个地使用，假如必要，使用之前它们可与赋形剂、填充剂、稀释剂和粘合剂等混合，并形成颗粒、球、短条、片状、方块和片剂。
本发明的含低还原力海藻糖的糖组合物及从水中分离的海藻糖可与能很好地与带有酸味、咸味、苦味、强烈味道和美味的其他材料相调和，并具有相当高的酸耐受性及抗热性。因此，它们一般作为甜味剂，口味改良剂和质量改善剂有利地应用于食品中。
本发明的海藻糖和含海藻糖的糖类组合物可被用于调味品例如酱油、固体酱油、″miso″、″funmatsu-miso″(一种粉状miso)、″moromi″(一种精制米酒)、″hishio″(一种精制酱油)、″furikake″(一种调味鱼饭)、蛋黄酱、加味料、醋、″sanbai-zu″(一种糖酱油、酱油和醋)、″funmatsu-sushi-su″(sushi用的粉状醋)、″chuka-no-moto″(一种做中国菜用的配制好的混合物)、″tentsuyu″(一种日本油炸食品用的酱)、″mentsuyu″(一种日本细面条用的酱)、果酱、蕃茄酱、″takuan-zuke-no-moto″(用于腌萝卜的予混合物)，″hakusai-zuke-no-moto″(用于新鲜的白油菜腌制的予制混合物)，″yakiniku-no-tare″(日本烤肉用的酱)、咖喱乳酪糊、配制好的煨制混合物、速容溶料混合物、″dashi-no-moto″(速溶原汁混合物)、混合调料、″mirin″(甜米酒)、″shin-mirin″(一种合成的mirin)、佐餐糖和咖啡糖。
本发明的海藻糖和含海藻糖的糖组合物也可任意用于增甜″wagashi″(日本糕饼)，例如″senbei″(稻米饼干)、″arare-mochi″(稻米糕饼块)、″okoshi″(小米和稻米糕饼)、″mochi″(稻米糊)、″manju″(带有豆酱的小园面包)、″uiro″(甜米冻)、″an″(豆酱)″yokan″(豆甜果子冻)，″mizu-yokan″(软adzuki豆果子冻)、″kin9yoku″(一种yokan)、果子冻、Pao de castella及″amedama″(一种日本太妃糖)；增甜糖果，例如小园面包、饼干、薄脆饼、曲奇、馅饼、布丁、黄油乳脂、牛奶蛋糊奶油、奶油松饼、蛋奶烘饼、蛋糕、面包圈、巧克力、口香糖、焦糖和糖块；冻甜食，例如冻其淋和冰糕；糖汁，例如″kajitsu-no-srrup-zuke″(一种糖水水果)和″korimitsu″(一种刨冰用的糖汁)；糊例如面粉糊、花生糊、水果糊和涂抹糊；加工水果和蔬菜，例如果酱、马菜兰，″syrup-zuke″(一种腌制水果)和″toka″(一种密饯)；腌菜和腌制品，例如″fukujin-zuke″(红色萝卜腌菜)、″bettara-zuke″(一种整个腌制的鲜萝卜)、″senmai-zuke″(一种切片腌制的鲜萝卜)和″rakkyo-zuke″(腌菜葱)；肉制品，例如火腿和香肠；鱼肉制品，如鱼火腿，鱼香肠，″kamaboko″(一种蒸鱼酱)，″shikuwa″(一种鱼酱)和″tenpura″(一种日本油炸鱼酱)；″chinmi″(一种开胃食品)例如″umi-no-shiokara″(一种海胆的咸内脏)，″ika-no-shikara″(一种鱿鱼的咸内脏)，″su-konbu″(经加工的海带)，″saki-surume″(干鱿鱼条)和″fugu-no-mirin-boshi″(一种干的mirin调味的河豚)；″tsukudani″(酱油中熬浓的食品)，例如紫菜类食用野菜、干鱿鱼、鱼和贝壳类的″tsukudani″；家常菜例如″nimame″(一种烹制豆)、土豆沙拉和″konbu-maki″(海带卷)；奶制品，例如牛奶饮料，酸乳酪和乳酪；罐头和瓶装产品例如肉、鱼肉、水果和蔬菜罐头；酒精饮料、例如合成米酒、果酒和白酒；软饮料，例如咖啡、茶、可可茶、果汁，碳酸饮料、酸牛奶饮料和含乳酸菌饮料；配制好的食品，例如配制好的布丁混合物、配制好的热糕饼混合物和″sukuseki-shiruco″(一种配制好的adzuki豆汤与稻米糕饼)和速溶汤料混合物；以及婴儿食品、治疗食品及补充有营养素的饮料；还可用于改善味道及上述所有食品的质量。
本发明的海藻糖及含海藻糖的糖组合物也用于饲料和宠物食品中供给动物，例如家养动物、家禽、蜜蜂、丝蚕和鱼，以改善它们的口味。本发明的海藻糖和糖组合物也可任意用于糊状和液体状的其它产品中作为甜味剂、口味改善剂和质量改善剂、稳定剂，例如用于烟草、香烟、牙膏、口红、胭脂、唇油、内用药、药片、锭剂、液滴剂型的鱼肝油、软糖、口服清凉剂、含濑剂、化状品及药品中。
本发明的海藻糖及含海藻糖的糖组合物可用在易于失去有效成分和活性的生物活性物质中作为品质改进剂和稳定剂，以及用于保健食品和含生物活性物质的药物组合物中。此类生物活性物质的例子是淋巴激活素如α-，β-，γ-干扰素，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，肿瘤坏死因子-β(TNF-β)，巨噬细胞迁移抑制因子、集落刺激因子，转移因子及白细胞介素2(IL-2)；激素，例如胰岛素、生长激素、催乳激素、促红细胞生成素、卵泡刺激激素和胎盘激素；生物学制剂，例如BCG疫苗、日本脑炎疫苗、麻疹疫苗、活脊髓灰质炎疫苗、天花疫苗、破伤风类毒素、竹叶青属蛇抗毒素及人免疫球蛋白，抗生素，例如青霉素、红霉素、氯霉素、四环素、链霉素及硫酸卡那霉素；维生素，例如维生素B1、维生素B2、维生素C、鱼肝油，类胡萝卜素、麦角甾醇、维生素E；酶，例如脂酶、弹性蛋白酶、尿激酶、蛋白酶，β-淀粉酶、异淀粉酶、葡聚糖酶及乳糖酶；提取物，例如人参提取物、海龟提取物、藻类提取物、芦荟提取物及蜂胶提取物；存活的微生物，例如病毒、乳酸菌、及酵母；以及其他生物活性物质如蜂王浆等。通过加入本发明海藻糖及其糖组合物，很容易将前面所述的生物活性物质制备成有高稳定性和高品质、不会丢失或失活活性物质及有效成分的保健食品及药物组合物。
如前所述，将本发明的海藻糖及其糖组合物掺入上述物质和组合物中的方法包括常规方法，例如混合、揉合、溶解、熔融、浸渍、渗透、喷啉、涂覆、喷雾、注射、结晶和固化。海藻糖和糖组合物通常以0.1％或更高的量，优选1％或更高量(d.s.b)掺入前述物质及组合物中。
下述实验更详述地解释本发明：
实验1
酶的产生
将由2.0W/V％葡萄糖、0.5W/V％多蛋白胨、0.1W/V％酵母提取物、0.06W/V％磷酸氢二钠、0.1W/V％磷酸氢钾、0.05W/V％七水合硫酸镁、0.5W/V％碳酸钠和水组成的液体营养培养基100ml的各等分样各放入500ml的锥形烧瓶中，并于115℃高压灭菌30分钟，冷却，并用Pimelobacter SP.R48(FERM BP-4315)种子培养物接种，接着于200rpm搅拌条件下，27℃培养24小时。将所得培养物汇集在一起，作为种子培养物使用。
将约201上述培养物所用的同样液体营养基的新鲜制剂放入301发酵罐中，灭菌、冷却至27℃，并用1V/V％种子培养物接种，接着于27℃、pH6.0-8.0搅拌和通气条件下培养约40小时。
积聚于所得培养物中的麦芽糖-海藻糖转化酶活性为0.55单位/ml。将培养物一部分用离心分离成细胞和上清液，并将细胞悬浮于50mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中，使其体积与该部分的原体积相等，然后检测细胞悬浮液和上清液中的酶活性，得出结果分别为0.5单位/ml和0.05单位/ml。该酶活性是在25℃测定得的值。
实验2
酶的纯化
将实验1获得的培养物离心处理得到约0.5kg湿细胞，然后将其悬浮于10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中。将该细胞悬浮液经″VIBROGEN-ZELLMHLE″(一种由Edmund B ühler Tubingen，Germany出售的细胞破碎装置)处理，所得混合物以15000xg离心30分钟获得约4.51上清液。加入硫酸铵于该上清液中，使其溶解得到饱和度为0.3的溶液，将该溶液于4℃放置4小时，并离心获得上清液。
再加入硫酸铵到所得上清液中，溶解后得到饱和度为0.8的溶液，将该溶液于4℃放置过夜并离心获得沉降物。
将该沉淀物溶解于10mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中，对同一缓冲液的新鲜制剂透析24小时，并离心除去不溶性物质。将400ml所得透析溶液分成2部分，分别进行柱层析，其中用300ml″DEAE-TOYOPEARL GEL″(一种由Tosoh Corporation，Tokyo，Japan市售的离子交换剂)装柱。
将吸附于离子交换剂上的本发明麦芽糖-海藻糖转化酶用添加有盐的上述缓冲液的新鲜制剂从柱上洗脱下来。回收柱上洗脱的含酶活性的馏份，合并后对添加有1M硫酸钠的上述缓冲剂的新配液透析。将透析溶液离心后除去不溶物，对其进行疏水柱层析，所用柱填充物为300ml″BUTYL-TOYOPEARL 650 GEL″(一种Tosohcorporation，Tokyo，Japan实现商品化的疏水凝胶)。用1M-OM硫酸铵的线性梯度缓冲液，将吸附于凝胶上的麦芽糖-海藻糖转化酶从柱上洗脱下来，然后回收含酶活性的馏份。
合并馏份后进行离子交换柱层析，所用柱填充物为10ml″MONOQ HR5/5″(一种由瑞典Uppsala的Pharmacia LKB BiotechnologyAB出售的凝胶)。各纯化步骤的总活性、比活性及产率列于表1中。
                         表1
  纯化步骤   总酶*活性(单位)   比活性(单位/mg蛋白)   产率(％)
  细胞破碎后的上清液盐析后的透析溶液离子交换柱洗脱物疏水柱洗脱物离子交换柱洗脱物   7,3102,7302,2901,160819   0.250.311.3510.833.6   10037.331.315.911.2
注：符号*表示为本发明的麦芽糖-海藻糖转化酶。
将由上述纯化程序所获得的纯化酶制剂用7.5％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，给出单一蛋白谱带，这表明它是一种纯度相当高的制剂。
实验3
酶的性质
对按实验2方法制得的纯化麦芽糖-海藻糖转化酶制剂的一部分，使用10％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。所测分子量经与同时进行电泳的标志蛋白质(由日本东京Japan Bio-Rad Laboratories商品化)进行比较，确定为约57,000-67,000道尔顿。
另一份纯化的麦芽糖-海藻糖转化酶制剂用聚丙烯酰胺凝胶(含2V/V％″AMPHOLINE″，一种由瑞典Uppsala的Pharmacia LKBBiotechnology AB市售的两性电解质)进行等电电泳。将所得凝胶切成片，然后测量它们的pH，得出酶的PI约为4.1-5.1。
按照测定酶活性所用的方法，研究温度和pH值对本发明酶活性的影响。其结果分别示于图1(温度的影响)和图2(pH的影响)中。当于pH7.0培养60分钟时该酶的最适温度为约20℃，而当于25℃保温60分钟时其最适pH值约为7.0-8.0。在试管中，于50mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)内，不同温度下保温60分钟来测定该酶的热稳定性，用冷水冷却试管，检测各缓冲液中残留的酶活性。在50mM磷酸盐缓冲液中，于不同pH值下，20℃保温60分钟以检测该酶的pH稳定性，调节缓冲液至pH7.0，并检测各缓冲液中残留的酶活性。该酶的热稳定性和pH稳定性结果分别示于图3和图4中。该酶在温度直到约30℃是稳定的，而于pH约6.0-9.0时是稳定的。1mM Cu++或Hg++和50mMTris-HCl缓冲液对该酶有抑制作用。
实验4
对糖的作用
对各种糖进行试验，以确定它们是否可作为本发明酶的底物使用。将葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖、可溶性淀粉、平均聚合度为18的直链淀粉、海藻糖、新海藻糖、龙胆二糖、曲二糖、异麦芽糖、纤维二糖、麦芽糖醇、蔗糖、麦芽寡糖、图拉糖、泊雷寡糖(paratinose)、海藻寡糖(terhalulose)或乳糖配成溶液。制备葡萄糖和等量α-葡萄糖1-磷酸或β-葡萄糖1-磷酸的溶液。
将该两溶液分别与按实验2方法制得的麦芽糖-海藻糖转化酶按2单位/g底物(d.s.b)的量相混合，调节它们的底物浓度到5W/V％，并于20℃、pH7.0进行酶促反应24小时。于酶促反应前后，用″KIESELGEL 60(20×20cm)″(一种由美国Rahway的Merk CO.Inc出售的TLC用的铝板)对两溶液进行薄层层析(TLC)分析，以测定本发明酶是否对这些糖有作用。使用展层溶剂体系1-丁醇，吡啶和水(＝6∶4∶1体积比)将所得产物在板上一次展开。喷洒20V/V％硫酸的甲醇溶液使板上产物显色，并于110℃加热该板10分钟。其结果列于表2中。
                          表2
  底物   酶的作用 底物   酶的作用
  葡萄糖麦芽糖麦芽三糖麦芽四糖麦芽五糖麦芽六糖麦芽七糖可溶性淀粉直链淀粉(平均聚合度18)海藻糖新海藻糖新海藻糖   -++-------+-- 龙胆二糖曲二糖异麦芽糖纤维二糖麦芽糖醇蔗糖麦芽寡糖松二糖泊雷寡糖海藻寡糖乳糖α葡萄糖1磷酸加葡萄糖β葡萄糖1磷酸加葡萄糖        -------------
注：该表中，符号″-″表示酶促反应前后没观察到有变化；符号″+″表示由于形成其它产物而使底物斑点的大小稍有缩小；符号″++″表示因为形成其它产物而使底物斑点的大小明显缩小。
正如表2所示结果所证明的，本发明的酶只作用于麦芽糖和海藻糖，特别显示出既不作用于含葡萄糖和α-葡萄糖1-磷酸的体系，也不作用于含葡萄和β-葡萄糖1-磷酸的体系。从该结果可以得出结论：本发明的酶是一种新酶，它不同于常规的麦芽糖-和海藻糖-磷酸化酶。
实验5
来自麦芽糖或海藻糖的产物
于麦芽糖水溶液中，按2单位/每克作为底物的麦芽糖(d.s.b)的量加入按实验2方法所制的麦芽糖-海藻糖转化酶以使最终底物浓度为5W/V％，将所得溶液于20℃，pH7.0条件下进行酶促反应24小时。用气相色谱法(以下简称为GLC)分析所得反应混合物中的糖类组成。将反应混合物的一部分干燥，溶于吡啶中并进行三甲基硅烷化处理，将获得之产物作为分析样品。该气相色谱所用的装置和条件是：″CG-16A″由日本东京的Shimadzu Corporation出售的气相色谱仪；直径3mm且长2m的不锈钢柱，填充由日本东京GLSciences Inc.市售的2％″SILICONE OV-17/CHROMORB W″；以氮气作载气，流速40ml/分；炉中增温速率为7.5℃/分，范围为160℃-320℃。在氢火焰离解检测器上分析糖组成。其结果列于表3中。
                      表3
  反应混合物中的糖   GLC保留时间(分)   糖组成(％)
  葡萄糖麦芽糖X   3.87和4.7011.93和12.2712.34*   4.922.372.8
注：符号″*″的值与海藻糖的值一致。
正如表3所示结果所证明的，产物″X″生成，其保留时间与市售的海藻糖保留时间一致。为鉴定“X″产物，进行下述确证实验。将新配制的，与上面所用的相同的麦芽糖水溶液用20mM醋酸盐缓冲液(pH4.5)稀释，使麦芽糖浓度为2W/V％，并取其0.5ml与0.1单位由日本东京的Seikagaku-Kogyo Co，Ltd，出售的葡萄糖淀粉酶样品相混合，然后于40℃使该混合物进行酶促反应20小时。
同样，将新配制的，与上面所用者相同的麦芽糖水溶液用20mM的醋酸盐缓冲液(pH7.0)稀释，使麦芽糖浓度为2W/V％，并取其0.5ml与0.5单位海藻糖酶相混合，然后于40℃使混合物进行酶促反应20小时。对未经处理的麦芽糖水溶液和用葡萄糖淀粉酶及海藻糖酶处理过的麦芽糖水溶液均进行GLC分析，然后研究所得数据，发现麦芽糖由葡萄糖淀粉酶完全分解成葡萄糖，而产品″X″则完好保留。
当用海藻糖酶处理时，麦芽糖完好保留但产物″X″完全被分解成葡萄糖。该葡萄糖淀粉酶和海藻糖酶的反应机理来看，可得出结论：本发明酶可从麦芽糖形成一种寡糖，即海藻糖。
并且，将根据本发明的纯化酶与作为底物的海藻糖反应，所用反应条件与麦芽糖的情况一样，并将所得反应混合物用GLC法分析，从所得数据确证本发明酶能从海藻糖生成麦芽糖。其结果示于表4中：
                            表4
  底物   A   B(％)   C(％)   D(％)
麦芽糖   葡萄糖麦芽糖海藻糖   4.922.372.8   27.90.072.1   78.521.50.0
海藻糖   葡萄糖麦芽糖海藻糖   3.217.279.6   19.90.080.1   83.016.70.0
注：该表中，符号″A″代表反应混合物中的糖；符号″B″表示本发明酶所生成的反应混合物中的各种糖的组成；符号″C″表示用葡萄糖淀粉酶处理的反应混合物中各种糖的组成；符号″D″表示用海藻糖酶处理各糖类组成。
正如表4结果所证明的，本发明的酶能将麦芽糖转化为海藻糖，反之亦然。本发现转换反应的平衡位置倾向于形成海藻糖，即麦芽糖转化为海藻糖的转换率为约70％或更高，它要高于海藻糖转化为麦芽糖的转化率。
实验6
麦芽糖浓度对海藻糖形成的影响
将分别含2.5，5，10，20或40W/V％麦芽糖的溶液，以每克麦芽糖2单位(d.s.b)的量与按实验2方法制得的纯化的麦芽糖-海藻糖转化酶相混合，于20℃和pH7.0条件下进行酶促反应。酶促反应期间，将反应混合物取样，并于100℃加热10分钟使剩余的酶失活。
用蒽酮-硫酸法测定反应混合物的总糖含量。还原糖含量用Somogyi-Nelson方法基于葡萄糖来定量，而还原力则作为还原糖含量与总糖含量之比来确定。
将样品稀释得到的糖浓度为约1W/V％，然后进行″MOL-CUT IILGC″(Japan Millipore Ltd.，Tokyo，Japan)以除去蛋白质，并用高压液相层析法(以下称为HPLC)分析其糖组成。所用装置和条件是：″CCPD SYSTEM″(由日本东京的Toson Corporation出售的HPLC装置)；″YMC-PACK PA-30″，(直径4.6mm长度250mm的柱，由日本东京的YMC C0；Ltd.出售)；洗脱系统为乙腈和水(＝78∶22体积比)；流速1.2ml/分；用差动式折射仪作为检测器。其结果示于表5中。
                                          表5
  麦芽糖浓度(％)   反应时间(小时)   还原力(％)             糖的组成(％)
  葡萄糖   麦芽糖   海藻糖
  0   50.3   0.0   100.0   0.0
2.5   282348   36.721.212.314.5   1.32.53.85.9   68.838.717.217.1   29.958.879.077.0
5.0   282348   34.820.212.014.2   1.92.63.25.7   65.335.717.317.3   32.861.779.577.0
10.0   282348   32.219.712.514.0   1.32.23.66.1   63.034.217.517.4   35.763.678.976.5
20.0   282348   34.220.212.915.1   2.02.93.46.0   63.735.117.417.4   34.362.079.276.6
40.0   282348   34.821.212.814.9   1.62.73.75.7   68.238.617.717.5   30.258.778.676.8
正如表5所示结果所证明的，麦芽糖转化为海藻糖的反应不取决于麦芽糖浓度，以约80％的转化率顺利进行。
实验7
温度对海藻糖形成的影响
将20W/V％麦芽糖溶液，以每克麦芽糖2单位(d.s.b)的量与按实验2所述方法制得的纯化的麦芽糖-海藻糖转化酶相混合，并分别于5、10、15、20或25℃下进行酶促反应。在酶促反应期间，以予定时间间隔取样，并将样品于100℃加热10分钟使剩余的酶失活。与实验6相似，用HPLC分析样品中糖的组成。在不同反应温度和反应时间取样的样品中的海藻糖含量示于表6中。
                                表6
  反应时间(小时)                      海藻糖含量(％)
  5℃   10℃   15℃   20℃   25℃
  282348   26.149.578.281.8   28.954.379.580.9   32.961.280.980.4   34.662.079.276.6   34.761.176.772.7
正如表6所示结果所证明的，当反应温度升高时，海藻糖形成率趋于提高，并且从麦芽糖转化为海藻糖的转化反应甚至在5℃时仍以海藻糖转化率约82％的高水平顺利进行。
实验8
从麦芽糖制备海藻糖
将10份重量的日本Okayama的Hayashibara BiochemicalLaboratories，Inc出售的麦芽糖溶解于40份重量水中，将该溶液按每克麦芽糖2单位的量(d.s.b)与按实验2方法制得的纯化的麦芽糖-海藻糖转化酶相混合，于15℃和pH7.0进行酶促反应48小时，然后于100℃将反应混合物加热10分钟使剩余的酶失活。用活性碳使该约含74％海藻糖(d.s.b)的反应混合物脱色，用H-型和OH-型离子交换剂脱盐，浓缩至约78W/V％溶液，然后与0.1％作为晶种的结晶海藻糖(d.s.b)相混合，然后于室温放置过夜以使之结晶。将所得糖膏分离成晶体，用少量水喷淋并洗涤，随后回收到约3.0份重量的高纯度结晶海藻糖，其纯度为99.8％(d.s.b)。
实验9
酶的产生
将含2.0W/V％葡萄糖、1.0W/V％硫酸铵、0.1W/V％磷酸氢二钾、0.06W/V％磷酸二氢钠、0.05W/V％硫酸镁、0.3W/V％碳酸钙和水的液体营养培养基100ml的等分样放入500ml的各锥形烧瓶中，于115℃高压灭菌30分钟后冷却。用Pseudomonas Putida(FERM BP-4579)种子培养物接种，然后在200rpm搅拌条件下，27℃培养24小时。所得培养物汇集起来作为种子培养物。
将约20L新配制的，与上面所用者相同的液体营养培养基等分样放入30L的发酵罐中、灭菌、冷却至27℃，并接种1V/V％种子培养物，接着在搅拌和通气条件下于27℃和pH6.5-8.0培养20小时。
积聚在所得培养物中的麦芽糖-海藻糖转化酶活性为0.12单位/ml。将一部分培养物离心处理使之分离成细胞和上清液。将细胞悬浮于50mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中，得到的体积与该部分的原体积相同。然后分别检测细胞悬浮液中和上清液中的酶活性，发现分别为0.11单位/ml和0.01单位/ml。该酶活性是在35℃下检测的。
实验10
酶的纯化
将实验9中制得的培养物离心处理，得到0.45kg湿细胞，然后将其悬浮于10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中。将约2L所得细胞悬浮液用″MINI-RABO″(一种日本东京Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.出售的超压力细胞破碎装置)处理使细胞破碎，然后将所得混合物以15,000xg离心30分钟，获得约1.7L上清液。将硫酸铵加入上清液中，使其溶解饱和度达到0.7，于4℃放置4小时，离心得到所形成的沉淀物。
将该沉淀物溶解于10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中，将该溶液对新配制的同样缓冲液透析24小时，并离心除去不溶物。将400ml经透析的溶液分成2份，分别进行离子交换柱层析，其中使用填充有300ml″DEAE-TOYOPEARL GEL″(一种由日本东京的TosohCorporation出售的凝胶)的层析柱。
本发明的麦芽糖-海藻糖转化酶吸附在凝胶上，用新配制的添加有盐的相同缓冲液洗脱。回收含酶活性的部份，并用装填有80ml″DEAE-TOYOPEARL GEL″的柱对其进行离子交换柱层析。用范围从0.1M至0.3M的线性盐梯度洗脱吸附于凝胶上的麦芽糖-海藻糖转化酶，然后回收含酶活性的部份。
将回收的馏份汇集起来，使用装填有400ml″TPYO-PEARL HW-55S″(一种由日本东京的Tosoh Corporation出售的凝胶)的层析进行凝胶过滤柱层析，回收含酶活性的洗脱份。各纯化步骤的总活性、比活性和产率列示在表7中。
                                表7
  纯化步骤   总酶活性*(单位)   比活性(单位/mg蛋白)   产率(％)
细胞破碎后的上清液盐析后的透析溶液离子交换柱第一次洗脱物离子交换柱第二次洗脱物凝胶过滤柱洗脱物 175012001090360156 0.040.070.534.56.5 10068.562.320.68.9
注：符号″*″是指本发明的麦芽糖-海藻糖转化酶。
使用7.5W/V％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶，对提纯的酶制剂进行凝胶电泳，发现为单一蛋白质谱带，这表明该制剂纯度相当高。
实验11
酶的性质
使用7.5％(W/V)十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶对按实验10所述方法制得的纯化的麦芽糖-海藻糖转化酶制剂的一部分进行电泳，并将其与同时进行电泳的日本东京Bio-Rad Laboratories市售的的标志蛋白质进行比较，确定其分子量为大约110,000-120,000道尔顿。
使用含有2％(W/V)″AMPHOLINE″(一种由Pharmacia LKBBiotechnology AB，Uppsala，Sweden推向市场的两性电解质)的聚丙烯酰胺凝胶对另一部分纯化的麦芽糖-海藻糖转化酶制剂的蛋白质进行等电聚焦电泳。其后将所得到的凝胶切成小片，测定它们的pH显示酶的pI约为4.1-5.1。
按照分析酶活性所用的方法，研究温度和pH对该酶活性的影响。结果分别示于图5(温度的影响)和图6(pH的影响)。当在pH7.0保温60分钟时，酶的最适温度约为20℃；当在35℃保温60分钟时最适pH约为7.3-8.3。在含有50mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)的容器内，在不同温度下将酶保温60分钟，用冷水冷却所得到的容器内的缓冲液并分析各缓冲液内的残留酶活性，以确定酶的热稳定性。在有不同pH的50mM磷酸盐缓冲液中，将酶35℃保温60分钟，将所得缓冲液调到pH7.0，并检测各缓冲液中的残留酶活性以确定酶的pH稳定性。所测得的酶的热和pH稳定性分别示于图7和8中。酶在高至约40℃的温度和pH约6.0-9.5时是稳定的。1mM Cu++或HgH以及50mM Tris-HCl缓冲液对该酶有抑制作用。
实验12
对糖的作用
按照实验4中所述方法(不同的是将反应温度定在35℃)，试验多种糖以确定它们是否可用作本发明实验10中制得的来自臭味假单胞菌(pseudomonas Putida)H262之酶的底物。与来自臭味假单胞菌H262的酶相似，来自脂肪杆菌菌种R48(Pimelobacter SPR48)的酶也特异性作用于麦芽糖和海藻糖，即可将麦芽糖转化成海藻糖，且反之亦然。已发现转化反应的平衡位置偏向于形成海藻糖，即麦芽糖转化成海藻糖的转化率高达约70％。
实验13
麦芽糖浓度对海藻糖生成的影响
向含有5、10、20和30％麦芽糖的溶液中以2单位/克麦芽糖(d.s.b)的量加入按实验10所述方法制得的纯化麦芽糖-海藻糖转化酶，并使溶液在35℃和pH7.0条件下进行酶促反应，同时以预定的时间间隔从反应混合物中取样。在100℃将样品加热10分钟以失活残留的酶。
按实验6中所述相似方法确定样品的还原力及糖组成。结果示于表8中。
                                              表8
麦芽糖浓度(％)   反应时间(小时)   还原力(％)                 糖组成(％)
  葡萄糖   麦芽糖   海藻糖
  0   50.3   0.0   100.0   0.0
5.0   272448   43.835.017.210.3   0.80.50.51.8   88.072.741.829.7   11.226.857.768.5
10.0   272448   46.834.616.014.8   1.21.42.23.7   86.564.936.426.5   12.333.761.469.8
20.0   272448   44.932.721.011.2   0.71.22.63.9   86.666.635.827.0   12.732.261.669.1
30.0   272448   44.838.217.812.9   0.00.61.83.9   89.572.541.829.6   10.526.956.466.5
从表8中所示结果可以看出，本发明的酶使麦芽糖以大约70％的产率形成海藻糖，不取决于作底物的麦芽糖的浓度。
实验14
从麦芽糖制备海藻糖
将10份重量的麦芽糖(Hayashibara BiochemicalLaboratories，Inc.，Okayama，Japan市售)溶解在40份重量的水中，再将该溶液按2单位/克麦芽糖量(d.s.b)与本发明纯化的麦芽糖-海藻糖转化酶混合，并在35℃和pH7.0条件下使酶促反应进行48小时，然后将所得反应混合物于100℃加热10分钟以灭活剩余的酶。用活性炭使含有约69％海藻糖(d.s.b)的反应混合物脱色，用H-和OH-形式的离子交换剂脱盐，并浓缩成约78％(W/V)溶液，然后与作为种晶的0.1％结晶海藻糖(d.s.b)混合，并于室温下将其放置过夜以结晶。将所得糖膏分离出晶体，用少量水喷淋并冲洗，然后回收约2.3份重量，纯度为99.7％(d.s.b)的高纯度结晶海藻糖。
实验15
酶的产生
将100ml由0.5W/V％多胨、0.1W/V％酵母浸膏、0.07W/V％硝酸钠、0.01W/V％磷酸氢二钾、0.02W/V％硫酸镁、0.01％W/V％氯化钙和水组成的液体营养培养基等分样调到pH7.5，放在500ml锥瓶中，于120℃高压灭菌20分钟，冷却并接种Thermus aquaticus CATCC33923)的菌种培养物，然后在200rpm搅拌条件下60℃培养24小时。汇集所得培养物并用作菌种培养物。
将大约20升如上述培养中所用的同样液体营养培养基的新鲜制剂等分样放入两个30升发酵罐中，灭菌，冷却到60℃并接种1V/V％种子培养物，然后在60℃和pH6.5-8.0的搅拌和通气条件下培养约20小时。
所得培养物中积聚的麦芽糖-海藻糖转化酶的活性为0.35单位/ml。离心一部分培养物分离出细胞和上清液，将细胞悬浮在50mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中达到该部分同样的体积，然后检测细胞悬浮液和上清液中的酶活性，表明分别为0.33单位/ml和0.02单位/ml。于60℃检测该酶活性。
实验16
酶的纯化
离心实验15中制得的培养物以得到0.28kg湿细胞，然后将其悬浮在10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中。用″MODEL US300″(由NipponSeiki Co.，Ltd.，Niigate，Japan市售的超声波粉碎机)处理所得细胞悬浮液以破碎细胞。以15,000xg离心所得混合物30分钟，得到约1.8L上清液。向上清液中加入硫酸铵并使之溶解在其中，以达到0.7饱和度，将此溶液4℃放置4小时，并离心得到沉积物。
将沉积物溶解在10ml磷酸盐缓冲液(pH7.0)中，将溶液以新制备的相同缓冲液透析24小时，并离心除去不溶性物质。将经过透析的1,560ml溶液分成三份，分别使用填有530ml″DEAE-TOYOPEARL650GEL″(Tosoh Corporation，Tokyo，Japan市售)的柱进行离子交换柱层析。
本发明的麦芽糖-海藻糖转化酶吸附到凝胶上，因此用添加有盐的新制备的相同缓冲液洗脱之。
回收具有酶活性的馏分，以加有1M硫酸铵的新制备的相同缓冲液透析，并使用装填有380ml″BUTYL-TOYOPEARL650 GEL″(一种由Tosoh Corporation，Tokyo，Japan市售的疏水凝胶)的柱进行疏水柱层析。用1M至OM盐的线性梯度液洗脱吸附到凝胶上的麦芽糖-海藻糖转化酶，然后回收含酶活性的馏分。
合并各馏分并使用装填380ml″TOYOPEARL HW-55S″(一种由Tosoh Corporation，Tokyo，Japan市售的凝胶)的柱进行凝胶过滤柱层析，然后回收洗脱的含酶活性馏分。
合并各部分并使用装填1.0ml″MONO.Q HR5/5″(PharmaciaLKB Biotechnology AB，Uppsala，Sweden市售)的柱进行离子交换层析。用0.1M至0.35M盐的线性盐梯度液从柱上洗脱酶，然后回收含酶活性的馏分。下列表9中总结了各纯化步骤的总活性、比活性和产率。
                          表9
  纯化步骤   总酶活性*(单位)   比活性(单位/mg蛋白)   产率(％)
  细胞破碎后的上清液盐析后的透析溶液离子交换柱的洗脱物疏水柱的洗脱物凝胶过滤柱的洗脱物离子交换柱的洗脱物   8,8008,7105.6902,050937467   0.100.162.517.6113135   10099.064.723.310.65.3
注：符号″*″代表本发明的麦芽糖-海藻糖转化酶。
用5W/V％十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶将纯化的酶制剂进行凝胶电泳，显示出单一的蛋白带。这意味着其为相对高纯度的制剂。
实验17
酶的性质
在含有7.5W/V％十二烷基磺酸钠的聚丙烯酰胺凝胶上将按实施16中所述方法制得的一部分纯化的麦芽糖-海藻糖转化酶制剂进行电泳，并将其与也同时进行电泳的标志蛋白质(Japan Bio-RadLaboratories，Tokyo，Japan市售)进行比较，确定其分子量约为100,000-110,000道尔顿。
在含有2W/V％″AMPHOLINE″(一种由Phramacia LKBBiotechology AB，Uppsala，Sweden市售两性电解质)的聚丙烯酰胺凝胶上将另一部分纯化的麦芽糖-海藻糖转化酶制剂进行等电聚焦电泳。之后将所得凝胶切成小片，并检测它们的pH，显示酶的pI约为3.8-4.8。
按照检测酶活性的方法研究温度和pH对本发明酶活性的影响。结果分别示于图9(温度的影响)和图10(pH的影响)中。当在pH7.0保温60分钟时，最适温度约为65℃，当于60℃保温60分钟时最适pH约为6.0-6.7。将酶放入含50mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)的试管中于不同温度下保温60分钟，用冷水冷却试管，并检测各缓冲液中的残留酶活性，以确定酶的热稳定性。将酶加在有不同pH的50mM磷酸盐缓冲液中60℃保温60分钟，将所得缓冲液调到pH7.0，并检测各缓冲液中的残留酶活性，以确定酶的pH稳定性。酶的热稳定性和pH稳定性的结果分别示于图11和12中。在温度高至80℃以及pH约为5.5-9.5时酶是稳定的。1mM Cu++或Hg++以及50mM Tris-HCl缓冲液对该酶有抑制作用。
实施18
对糖类的作用
试验各种糖以确定它们是否可用作按实验4中所述方法(不同的是反应温度定在50℃)得到的来自Thermas aquaticus(ATCC33923)的本发明酶的底物。与来自Pimelobacter SP.R48和臭味假单胞菌(Pseudomonsa Putida)H262的酶相似，来自Thermusaquaticus(ATCC 33923)的酶也特异地作用于麦芽糖和海藻糖，即它将麦芽糖转化成海藻糖且反之亦然。已发现转化反应和平衡位置偏向于生成海藻糖，即麦芽糖转化成海藻糖的转化率约为70％或更高。
实验19
麦芽糖浓度对海藻糖生成的影响
向含有2.5、5、10、20或40％麦芽糖的溶液中以2.5单位/g麦芽糖(d.s.b)的量加入按实验16所述方法制得的来自Thermusaquaticus(ATCC 33923)的纯化的麦芽糖-海藻糖转化酶，并在60℃和pH6.5条件下使之发生酶促反应。酶促反应开始后72小时取反应混合物样品，并于100℃加热30分钟以灭活余留的酶。与实验6中所述方法相似，测定样品还原力和糖的组成。结果示于表10中。
                                        表10
麦芽糖浓度(％)   反应时间(小时)   还原力(％)                  糖组成(％)
  葡萄糖   麦芽糖   海藻糖
2.55.010.020.040.0   07272727272   50.316.315.916.016.616.8   0.04.54.44.74.45.0   100.025.225.625.626.226.4   0.070.370.069.769.468.6
从表10所示结果可以看出，本发明以大约70％的产率从麦芽糖生成海藻糖，不取决于作为底物的麦芽糖的浓度。
实验20
温度对海藻糖生成的影响
向20％pH6.5的麦芽糖溶液中以2.5单位/g麦芽糖(d.s.b)的量加入按实验16所述方法制得的来自Thermus aquaticus(ATCC33923)的麦芽糖-海藻糖转化酶，并于40、50、60或70℃下使混合物进行酶促反应，同时以预定的时间间隔取样。将样品于100℃加热30分钟以失活剩余的酶。按实验6中所述相似的方法在HPLC上分析所得反应混合物的糖组成。表11中显示了在不同温度和反应时间的海藻糖含量。
                          表11
  反应时间(小时)                   海藻糖含量(％)
  40℃   50℃   60℃   70℃
  48244872   45.061.079.180.780.0   55.767.376.576.976.4   56.864.371.170.268.5   50.358.564.362.860.2
从表11所示结果可以看出，酶促反应温度越低，麦芽糖至海藻糖的转化率越高。该酶以大约80％的转化率将麦芽糖转化成海藻糖。
实验21
来自不同微生物的麦芽糖-海藻糖转化酶的产生及其性质
按实验15中所述方法，在锥形瓶中将已证实常见微生物中有生成本发明麦芽糖-海藻糖转化酶之能力的微生物加以保温。分析酶活性后，按实验16所述用细胞破碎装置处理所得培养物。从所得混合物中分离上清液并透析，以得到部分纯化的酶，然后按实验17中所述分析酶的特性。结果示于表12中。
                                                   表12
微生物   活性(单位/ml) 最适温度(℃)   最适pH   热稳定性(℃)   pH稳定性
  Thermus aquaticus(ATCC 27634)   0.30   大约65   大约6.0-6.5   高达80   大约5.5-9.5
  Thermus ruber(ATCC 35948)   0.26   大约50   大约6.0-7.0   高达50   大约5.5-10.0
  Thermus sp.(ATCC 43815)   0.25   大约65   大约6.0-6.5   高达80   大约5.5-9.5
  Pimelobacter sp.(ATCC 43815)实验1-3中所述的 0.55 大约20 大约7.0-8.0 高达30 大约6.0-9.0
  Pseudomonas putidadescribed in实验12-14中所述的 0.12 大约37 大约7.3-8.3 高达40 大约6.0-9.5
  Thermus aquaticus(ATCC 33923)实验18-20中所述的 0.35 大约65 大约6.0-6.7 高达80 大约5.5-9.5
按实验18中所述方法，研究表12中所示的从Thermus属已知微生物衍生的部分纯化的酶对各种糖的作用。结果表明，与从Thermus aquaticus(ATCC 33923)衍生的酶相似，这些部分纯化的酶可特异地作用于麦芽糖和海藻糖，并从麦芽糖生成了海藻糖。
表明从Thermus ruber(ATCC 35948)衍生的麦芽糖-海藻糖转化酶比从Thermus aquaticus(ATCC 33923)的酶有较低的最适温度和较低稳定温度，而从Thermus属各种微生物得到的酶与得自Thermus aquaticus(ATCC 33923)的酶具有差不多相同的特性，并且有相对高的热稳定性。
实验22
麦芽糖-海藻糖转化酶的部分氨基酸序列
用蒸馏水透析一部分按实验2所述方法得到的衍生于Pimelobacter SP.R48的、按实验10所述方法得到的衍生于Pseudomonas Putida H262的、或按实验16所述方法得到的衍生于Thermus aquaticus(ATCC 33923)的纯化的酶制剂，使用所得到物中的约80μg蛋白质作为样品分析含有酶之N末端的部分氨基酸序列。在Applied Biosystems Inc.(Foster City，USA)市售的蛋白质序仪″PROTELIN SEQUENCER MODEL 473A″上分析N末端。表13中显示了含有各酶之N末端的部分氨基酸序列。
                                     表13
  微生物   含有N末端的部分蛋白质序列
Pseudomonas putidaH262   Gly-Lys-Trp-Pro-Arq-Pro-Ala-Ala-Phe-Ile-1               5                   10Asp
Pimelobacter sp.R48   Ser-Thr-Val-Leu-Gly-Glu-Glu-Pro-Glu-Trp-1               5                   10Phe-Arg-Thr-Ala-Val-Phe-Tyr-Glu15
Thermus aquaticusATCC 33923   Met-Asp-Pro-Leu-Trp-Tyr-Lys-Asp-Ala-Val-1               5                   10Ile-Tyr-Gln
注：表中各数字是指从各部分氨基酸序列的N末端计数的氨基酸序号。
从表13所示的结果可以看出，从Pimelobacter SP.R48、Pseudomonas Putida H262和Thermus aquaticus(ATCC 33923)衍生的酶具有高同源性的部分氨基酸序列。从中可见从Pimelobac-ter菌属微生物衍生之酶的第10个氨基酸″Trp″至第16个氨基酸″Phe″与从Pseudomonas菌属微生物衍生之酶的第3个氨基酸″Trp″至第9个氨基酸″Phe″的部分氨基酸序列间有相当高的同源性。可用Trp-X1-Arg-X2-Ala-X3-Phe代表该部分氨基酸序列(其中符号″X1″是指″Phe″或″Pro″；符号″X2″是指″Thr″或″Pro″；且符号X3是指″Val″或″Ala″)。发现从Pimelobacter菌属的微生物衍生的从第14个氨基酸″Ala″到第17个氨基酸″Tyr″与从Thermus菌属的微生物衍生的从第9个氨基酸″Ala″到第12个氨基酸″Tyr″的部分氨基酸序列之间有相当高的同源性。可Ala-Val-X4-Tyr(其中符号″X4″是指″Phe″或″Ile″)表示该部分氨基酸序列。
实验23
海藻糖的物理化学性质
研究按实验8中所述方法制备的高纯度海藻糖的样品的物理化学性质。结果测得熔点为97.0℃，比旋光度为[α]D 20+199℃(C＝5)，融合热为57.8KJ/mole，无水海藻糖在水中25℃的溶解度为77.0g。这些结果与一起进行上述实验的购自Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.，Tokyo，Japan的商品含水结晶海藻糖的数据完全一致。
实验24
体内利用试验
按照H.Atsuji等人在J.Clinical Nutrition，Vol.41，No，2，PP.200-208(1972)中报导的方法，将实验8中制得的30g纯度为99.8％(d.s.b)的高纯度海藻糖样品，制成20W/V％水溶液，然后将其口服给予3个年龄分别为26、27和30岁的男性健康自愿者，以预定的时间间隔采集其血液样品，然后测定血糖和胰岛素水平。使用葡萄糖作为对照。结果可见海藻糖与葡萄糖有相似的行为，而且在服用后约0.5-1小时观察到血糖和胰岛素水平的最大值。这一结果表明该海藻糖易被活体消化，吸收和代谢，并作为能源被利用。因此，该海藻糖和含有该糖的组合物适于用作补充能量的糖。
实验25
急性毒性试验
给小鼠口服实验8中制备的纯度为99.8％，(d.s.b)的高纯度海藻糖样品以进行急性毒性试验。结果表明海藻糖是毒性相当低的物质，即使给小鼠服用可服剂量的最高水平也未见小鼠死亡。虽然不很准确，但测得LD50可达50g/kg或更高。
实验例A中举例说明了用本发明的麦芽糖-海藻糖转化酶制得的海藻糖和含有该糖的糖组合物，以及它们的制剂。实施例B中举例说明了含有海藻糖的本发明组合物或含海藻糖的糖组合物的本发明组合物：
实施例A-1
按照实验1中所述方法，使用同样的，但其中葡萄糖浓度调整到4.0W/V％的新制备的营养培养基，在通气和搅拌条件下，用发酵罐将Pimelobacter SP.R48菌种的微生物(FERM BP-4315)种子培养物培养60小时。所得培养物中麦芽糖-海藻糖转化酶的活性为0.75单位/ml。将一部分培养物离心分离成细胞和培养物上清液后检测它们的酶活性。结果观察到细胞中的酶活性约占65％，培养物上清液中的酶活性约占35％。用″MINI-BABO″——一种由DainipponPharmaceutical Co.，Ltd.，Tokyo，Japan市售的超高压细胞破碎装置处理约35L含细胞的培养物以破碎细胞。离心所得细胞悬浮液得到上清液，用UF-滤膜过滤之，然后回收约含有15单位/ml本发明麦芽糖-海藻糖转化酶的约1.2L浓缩物。
向10W/V％马铃薯淀粉悬浮液(pH5.5)中以2单位/g淀粉(d.s.b)的量加入由Nagase Biochemicals Ltd.，Kyoto，Japan市售的α淀粉酶样品——″SPITASE HS″，在搅拌和加热条件下使所得混合物胶凝化并液化，然后立即将混合物于120℃放置20分钟并将所得产物调整到50℃和pH5.0。将如此得到的混合物按2单位/g淀粉(d.s.b)的量与Nagase Biochemicals Ltd.，Kyoto，Japan市售的β-淀粉酶样品和按500单位/g淀粉(d.s.b)的量与HayashibaraBiochemical Laboratories Inc.，Okayama，Japan市售的异淀粉酶样品混合，并使所得混合物进行24小时酶促反应，以得到含有约92W/V％麦芽糖的糖溶液。于100℃将反应混合物加热20分钟，再加热至10℃，调到pH7.0，按1单位/g干物质的量与按上述方法制备的麦芽糖-海藻糖转化酶混合，并使酶促反应进行96小时。
将反应混合物在95℃保持10分钟，冷却，并用活性碳按常规方法脱色并过滤。用H-和OH-型离子交换剂脱盐纯化滤液并浓缩，并以约95％的产率(d.s.b)得到浓度约70W/V％的糖浆。
含有约69％海藻糖(d.s.b)并有低至DE18.2还原力的产物，具有中等甜度及适当的粘度和保温能力，因此可在各种组合物如食品、化妆品和医药中适当地用作甜味剂、口味改良剂、稳定剂、稀释剂、赋形剂和充填剂。
实施例A-2
将其中麦芽糖-海藻糖转化的酶促反应已暂停的按实施例A-1的方法制备的反应混合物，按10单位/g的量与由NagaseBiochemicals，Ltd.，Kyoto，Japan市售的葡糖淀粉酶″GLUCOZYME″混合，在pH5.0和50℃下使酶促反应进行24小时。加热处理所得反应混合物以失活剩余的酶，脱色、脱盐并纯化得到作进料溶液的糖溶液。使用由Tokyo Organic Chemical Institute，Ltd.，Tokyo，Japan市售的″XT-1016(Na +型，聚合度40％)″，将该溶液进行离子交换柱层析。将树脂装填入系列串连的，内径为5.4cm的4夹套不锈钢柱内，使达到总凝胶床深度为20m。保持柱内温度为60℃，以5V/V％的量向柱内加入糖溶液，以SV(空间速度)0.15供入60℃热水进行分级分离以除去葡萄糖，然后回收高海藻糖含量馏分。合并各馏分、纯化、浓缩、真空干燥并研磨，以大约55％(d.s.b)的产率得到高海藻糖含量粉末。
含有约97％海藻糖(d.s.b)并具有满意的低还原力及中度和高质量甜度的产物，可在各种组合物如食品、化妆品和医药中任意用作甜味剂、口味改良剂、质量改善剂、稳定剂、稀释剂、赋形剂和充填剂。
实施例A-3
用活性碳以常规方法使按实施例A-2所述方法制得的高海藻糖含量馏分脱色，并用离子交换剂脱盐和纯化。将滤液浓缩成约70W/V％的溶液，然后放入混有作为晶种之约2％含水结晶海藻糖的结晶器内，并逐渐冷却以得到结晶度约为45％的糖膏。将此糖膏从顶端装有喷嘴的干燥塔中以150kg/cm2的高压喷雾。在此喷雾步骤中，同时以从干燥塔顶部送入的85℃热空气给糖膏换气，在装于干燥塔底部的金属丝网输运装置上收集所得结晶粉末，并随通过金属丝网上行的45℃气流从干燥塔中逐步除去之。将所得结晶粉末注入熟化塔并熟化10小时，以完成结晶和干燥，然后以相当于高海藻糖含量级分原料(d.s.b)大约90％的产率回收所得的含水结晶海藻糖粉末。
该产物实质上是不吸湿的和易于处理的，这样就可使之随意地作为甜味剂、口味改良剂、质量改善剂及稳定剂用于各种组合物如食品、化妆品和医药中。
实施例A-4
按实施例A-3中所述的相似的方法纯化按实施例A-2所述方法制得的高海藻糖含量级分，将所得纯化产物放入蒸发器中，真空下煮沸得到湿含量约为3.0％的糖浆。将所得糖浆放在结晶器中，与按糖浆来说为1％(d.s.b)的无水结晶海藻糖混合，在搅拌条件下于120℃结晶，将所得混合物放入铅制简易容器中，并于100℃熟化6小时以使之成块。
将所得到的块用切割器切碎，用流化床干燥机干燥，以相当于高海藻糖含量级分原料约85％的产率(d.s.b)得到含湿量约0.3％的无水结晶海藻糖粉末。
该产物可在食品、化妆品和药物中任意地用作干燥剂，它们的原料和中间产物也可在食品、化妆品和医药等各种组合物中用作白色粉末状甜味剂。
实施例A-5
根据实验1的方法，将Pimelobacter SP.R48(FERM BP-4315)的种子培养物接种并培养在营养基中，离心所得培养物，得到具大约该酶800单位活性的100g湿细胞，然后与其中有已预先溶在10mM磷酸盐缓冲液内，由Wako Pure Chemical Industries，Ltd.，Tokyo，Japan市售的粘度为300-400cp之2.5％海藻酸钠的100ml10mM磷酸盐缓冲液揑合。将所得含有细胞的淤浆从溶液表面上方约20cm处连续滴入用磁搅拌器搅拌的0.1M氯化钙溶液中，以形成直径约2mm的球形凝胶。将凝胶在溶液中于室温静止约2小时并用Buchner瓷漏斗过滤，然后回收用海藻酸盐固定的细胞。将所得固定化细胞装入带套管的玻璃柱(直径30mm，长度200mm)中，加热柱并保持在20℃。以SV0.2向柱内供入40％麦芽糖溶液(pH6.8)，使之向下流出得到约含70％海藻糖(d.s.b)的糖溶液。纯化并浓缩如此制得的糖溶液，以大约95％(d.s.b)的产率得到浓度约为70％的糖浆。
该产物具有相当低的还原力和中等甜度及适当的保湿能力，因此可以如实施例A-1中所述产物一样用于各种组合物中。
实施例A-6
将33％玉米淀粉悬浮液与碳酸钙混合达到0.1％的终浓度，将此混合物调到pH6.5后，按0.2单位/g淀粉(d.s.b)的量加入″TERMAMYL 60L″(一种由Noyo Industri A/S CopenhagenDenmark市售的α-淀粉酶)混合，并使酶促反应在95℃下进行15分钟。于120℃将反应混合物高压灭菌30分钟，冷却到55℃，按500单位/g淀粉(d.s.b)的量与异淀粉酶样品(HayashibaraBiochemical Laboratories，Inc.，Okayama，Japan市售)，以及按30单位/g淀粉(d.s.b)的量与β-淀粉酶样品(NagaseBiochemicals，Ltd.，Kyoto，Japan市售)混合，并进行48小时酶促反应，然后回收麦芽糖含量约为84％(d.s.b)的糖溶液。将该糖溶液再在100℃放置10分钟，冷却到15℃，并以1.5单位/g淀粉(d.s.b)的量与按实施例A-1所述方法制得的本发明的麦芽糖-海藻糖转化酶混合，并使酶促反应进行72小时。于100℃将所得反应混合物加热15分钟，以灭活剩余的酶，用活性碳按常规方法脱色，用离子交换剂脱盐并纯化，然后浓缩所得产物，以大约95％(d.s.b)的产率得到浓度约70％的糖浆。
该产物含有约64％海藻糖(d.s.b)，具有相对低的还原力和中等甜度及适当的保湿能力，因此可将其如实施例1中所述产物一样用于各种组合物中。
实施例A-7
将按实施例A-5中所述方法制得的糖浆浓缩成约82％糖浆后放入结晶器中，与大约1％晶种混合，移入简易容器中，并于20℃放置4天使之结晶。用切刀将结晶切碎并干燥，以大约95％的产率(d.s.b)得到糖膏型含水结晶海藻糖粉末。
该产物基本上没有表现出吸湿性并且易于处理，因此它们如实施例A-1产物一样任意地用于各种组合物中。
实施例A-8
将按实施例A-6所述方法制得的糖浆浓缩成约80％糖浆后放入结晶器内，与大约1％作为晶种的含水结晶海藻糖混合，然后在搅拌条件下使之冷却以形成结晶。用篮式离心机分离得到的结晶体，然后用小量冷水喷淋，以大约20％的产率(d.s.b)得到高纯度含水结晶海藻糖。
该产物表现出如实验23中所示同样物理化学性质，并任意在食品、化妆品和医药等各种组合物中用作甜味剂、口味改善剂、质量改良剂、稳定剂，以及用作工业试剂和化学材料。
实施例A-9
将Pseudomonas Putida H262(FERM BP-4579)的种子培养物接种在营养培养基中，并按照实验9中所述方法，在搅拌和通气的条件下用发酵罐发酵约20小时。离心约18L所得到的培养物得到约0.4kg湿细胞，然后将细胞悬浮在4L10mM磷酸盐缓冲液中，用Nippon Seiki Co.，Ltd.，Niigata，Japan市售的″MODEL US300″超声波粉碎机处理以破碎细胞。离心所得混合物得到上清液并用UF滤膜浓缩之，然后回收到约400ml含有3.8单位/ml的麦芽糖-海藻糖转化酶的浓缩酶溶液。将10％马铃薯淀粉悬浮液(pH5.5)，按2单位/g淀粉(d.s.b)的量与″SPITASE HS″(一种NagaseBiochemicals，Ltd.，Kyoto，Japan市售的α淀粉酶样品)混合，在搅拌条件下加热使之胶凝并液化，然后在120℃高压灭菌20分钟，冷却到50℃并调到pH5.5。向所得混合物中按500单位/g淀粉(d.s.b)的量加入由Hayashibara Biochemical Laboratories，Inc.，Okayama，Japan市售的支链淀粉酶样品和以20单位/g淀粉(d.s.b)的量加入由Nagase Biochemicals，Ltd.，Kyoto，Japan市售的β-淀粉酶样品，使酶促反应进行24小时，然后回收约含92％麦芽糖的糖溶液。将该糖溶液于100℃加热20分钟，再调到40℃和pH7.0，按1.5单位/g的量与上述方法制得的麦芽糖-海藻糖转化酶混合，并使酶促反应进行72小时。将反应混合物于95℃加热10分钟，冷却后用活性碳以常规方法脱色并过滤，然后用H-和OH-型离子交换剂脱盐并纯化，浓缩所得溶液后以约97％的产率(d.s.b)得到浓度约为70W/V％的糖浆。该产物约含有65％海藻糖(d.s.b)，并具有相当低的还原力(低至DE16.2)，其具有中度甜度和足够的粘度以及保湿能力，因此其可在食品、化妆品及医药等多种组合物中被任意地用作甜味剂、口味改良剂、稳定剂、填充剂、稀释剂和赋形剂。
实施例A-10
将按实施例A-9方法得到的麦芽糖-海藻糖转化酶的反应后混合物于95℃加热10分钟以失活剩余的酶，调到pH5.0和55℃，按10单位/g淀粉(d.s.b)的量与″GLUCOZYME″(一种由NagaseBiochemicals，Ltd.，Kyoto，Japan市售的葡糖淀粉酶)混合并使酶促反应进行24小时。以常规方法加热反应混合物以失活剩余的酶。脱色、脱盐、纯化、并浓缩成55％糖溶液。按实施例A-2中所述的同样方法，使用″DOWEX 99(Ca++型，聚合度6％)——一种由DouChemical Co.，Midland，Michigan，USA市售的碱土金属强酸阳离子交换剂，对所得糖溶液进行柱层析，然后回收高海藻糖含量馏分。合并这些馏分，纯化并连续结晶同时浓缩，同篮式离心机分离所得糖膏后，用少量水喷淋所得结晶，以大约25％的产率(d.s.b)得到高纯度含水结晶海藻糖。该产物表现有如实验23之产物的同样物理化学性质，并与实施例A-8的产物一样，其可被任意地用于食品，化妆品和医药各种组合物中，以及用作工业试剂和化学原料。
实施例A-11
在实验9的相同营养培养基中培养Pseudomonas PutideH262(FERM BP-4579)的种子培养物，离心回收所得细胞，得到有大约400单位麦芽糖-海藻糖转化酶活性的100g湿细胞，然后与其中已溶解了的粘度为300-400cp之2.5％海藻酸钠的100ml 10mM磷酸盐缓冲液揑合。将含细胞的淤浆在溶液表面上方约20cm高度连续添加到用磁力搅拌器搅拌的0.1MCaCl2溶液中，以形成直径约2mm的球形凝胶。将凝胶在Cacl2溶液中，在室温下保持约2小时，用布氏漏斗过滤得到海藻酸钠固定化的细胞。将固定化细胞装填入直径30mm，长200mm的带套层的玻璃柱内并保持35℃。以SV 0.1的速率向柱内加入向下流动的40％麦芽糖溶液(pH6.8)，得到67％海藻糖溶液。按照实施例A-9中所述方法，纯化、浓缩、结晶并喷雾干燥该海藻糖溶液，以大约90％的产率(d.s.b)得到糖膏型含水结晶海藻糖粉末。该产物具有相当低的还原力，中等甜度和足够的保湿能力，因此与实验A-9中的产物一样可任意地用于多种组合物中。
实施例A-12
将Thermus aquaticus(ATCC 33923)和种子培养物接种于营养培养基中，并按照实验15中所述方法在搅拌-通气条件下培养约20小时。培养物具有约0.32单位/ml的麦芽糖-海藻糖转化酶活性。将从大约18L培养物中回收的0.18kg湿细胞悬浮在10mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中。用超声波破碎器处理约1.5L细胞悬浮液使细胞破碎。离心所得细胞碎片并回收上清液，然后用UF膜浓缩以得到约500ml有大约10单位/ml之麦芽糖-海藻糖转化酶活性的浓缩物。向15％玉米淀粉悬浮液(pH5.5)中按2单位/g淀粉的量加入″SPITASE HS″(一种由Nagase Biochemicals，Ltd.，Kyoto，Japan市售的α淀粉酶样品)，并在搅拌和加热条件下胶凝并液化。之后立即于120℃将混合物高压灭菌20分钟，冷却到55℃，并调到pH5.0。向所得混合物中按300单位/g淀粉的量加入由Hayashibara Biochemical Labo-ratories，Inc.，Okayama，Japan市售的异淀粉酶，和按20单位/g淀粉的量加入由Nagase Biochemicals，Kyoto，Japan市售的β淀粉酶，经24小时酶促反应后得到约92％麦芽糖溶液。于100℃加热所得溶液20分钟，冷却到50℃，调pH到7.0，按1.5单位/g干重的量与上面所制得的麦芽糖-海藻糖转化酶混合后进行酶促反应72小时。然后，将所得培养物于95％加热10分钟，冷却：并以惯用方法用活性碳脱色并过滤，然后用H-和OH-型离子交换剂脱盐并纯化所得溶液。将所得到的溶液浓缩后形成70％糖浆产率约为95％(d.s.b)。该产物含有大约64％海藻糖(d.s.b)并有DE18.0的低还原力，以及中等甜度、足够的粘度和令人满意的保湿能力，因此其可在食品、化妆品和医药等多种组合物中被任意地用作甜味剂、口味改善剂、稳定剂、填充剂、稀释剂和赋形剂。
实施例A-13
将实施例A-12中制得的糖浆浓缩成约80％糖浆，然后放入结晶器中，并按实施例A-8中所述相似的方法结晶并分离得到产率约为20％(d.s.b)的高纯度含水结晶海藻糖。该产物表现与实验23中所述产物相似的物理化学性质，并如实施例A-8中所述产物一样在多种组合物如食品、化妆品和医药中被任意地用作工业试剂、工业材料和化学材料。
实施例A-14
将Thermus aquaticus(ATCC 33923)的种子培养物接种在营养培养基中，并按实验15中所述方法培养，然后将所得培养物离心而得到约有1,500单位麦芽糖-海藻糖转化酶活性的50g湿细胞。将细胞悬浮在100ml粘度为300-400cp的2.5％海藻酸钠(一种由Wako Chemical Industries，Ltd.，Tokyo，Japan市售的试剂)中。将所得淤浆在溶液表面上方约20cm高度连续滴入用磁力搅拌器搅拌的0.1M CaCl2溶液中，以形成直径约2mm的球形凝胶。使凝胶在溶液中室温放置约2小时，然后用Buchmer漏斗过滤得到用海藻酸盐固定的细胞。将固定化细胞装填入带套层的直径30mm，长度为200mm的玻璃柱中，并加热到60℃。柱内供入以SV0.2速率向下流动的40％麦芽糖溶液(pH6.5)以得到约66％海藻糖溶液，然后以常规方法纯化、浓缩并喷雾干燥以到产率约为90％(d.s.b)的粉末海藻糖。该粉末有相对低的还原力和中等甜度，因此可如实施例A-12的产物一样被任意地用在多种组合物如食品、化妆品及医药中。
实施例B-1
甜味剂
向1份重量的按实施例A-8中所述方法制备的含水结晶海藻糖粉末中均匀地加入0.01分重量的″αG SWEET″——一种由ToyoSugar Refining C0.，Ltd.，Tokyo，Japan市售的α糖基卡哈苡苷产品，和0.01份重量的由Ajinomoto Co.，Ltd.，Tokyo，Japan市售的L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸产品——″ASPARTAME″，然后将所得混合物加入造粒机中得到颗粒甜味剂。
该产品具有令人满意的甜度并比蔗糖甜度大约高2.5倍，并且其热量值约为蔗糖的2/5。
因为该产品具有令人满意的稳定性并且不破坏其他与之混合的甜味剂，故可作为低热量食品的低热量甜味剂，适用于肥胖者和限制热量摄入的糖尿病人。
当诱发龋齿微生物作用于该产品时，它基本上不生成酸和不溶性葡聚糖，因此可将其用于甜味食品以预防龋齿。
实施例B-2
硬糖果
将100份重量约55W/V％蔗糖溶液与按实施例A-1中所述方法制得的30份重量的海藻糖糖浆加热混合，并真空浓缩所得溶液直到湿含量低至2％以下。将此浓缩物与1份重量的柠檬酸和足够量的柠檬香料和着色剂混合，以常规方法将所得混合物制成所需产品。
该产品具有令人满意的味道和咬嚼性质，并且无引起蔗糖结晶之弊病的高质量硬糖果。
实施例B-3
口香糖
加热3份重量的胶质使之软化，并与3份重量的结晶麦芽糖醇和4份重量的按实施例A-3中所述方法制得的含水结晶海藻糖粉末混合，再与足够量的香料和着色剂混合。按照常规方法用滚压器揑合所得混合物，制成并包装得到所需产品。
该产品是有令人满意的质地和口味的口香糖，并适于用作相当低或基本上不引起龋齿的口香糖。
实施例B-4
粉末果珍
将经过喷雾干燥制成的33份重量的桔汁粉末与50份按实施例A-7中所述方法制得的糖膏型高海藻糖含量粉末、10份重量的蔗糖、0.65份重量的无水柠蒙酸、0.1份重量的苹果酸、0.1％份重量的L-抗坏血酸、0.1份重量的柠檬酸钠、0.5份重量的支链淀粉和足够量的粉末香料均匀混合。研磨所得混合物并用流化床造粒机造粒30分钟以得到颗粒，同时喷淋作为粘结剂的按实施A-6所述方法制得的海藻糖糖浆，并以150m3的流速通入40℃空气。将如此得到的颗粒称重并包装后得到所需产品。
含有30％枯汁(d.s.b)的该产品可相当长时间保持其高质量，而没有令人不快的味道和气味。
实施例B-5
乳酸菌饮料
将175份重量的脱脂奶粉、130份重量的按实施例A-9所述方法制得的海藻糖糖浆、50份重量的日本专利预公开No.281795/92中所述的高乳蔗糖(lactosucrose)粉末溶解在1,150份重量的水中，将溶液于65℃加热30分钟除菌，冷却到40℃，以常规方法与30份重量作为起酵物的乳酸菌混合，并于37℃保温8小时以得到有令人满足的口味和香味的所需产品。因该产品含有寡糖，因此可稳定地保留乳酸菌并促进生长。
实施例B-6
乳蛋糕乳脂
充分混合100份重量的玉米淀粉、100份重量的按实施例A-6中所述方法制得的海藻糖糖浆、80份重量的麦芽糖、20份重量的蔗糖和1份重量的盐。将此混合物与280份重量的鸡蛋混合，并逐步与1,000份重量的煮沸牛奶混合。在加热条件下持续搅拌所得混合物，当混合物中的玉米淀粉完全胶凝而使整个内容物显示半透明时即停止加热，然后冷却所得物并向其中加入足够量的香草香料。将所得混合物称重，注射成形并包装后得到所需产品。
该产品具有平滑的表面和光泽，以及适当的口味和甜度
实施例B-7
″Uiro-no-moto″(甜稻米冻的预混合物)
均匀混合90份重量的稻米粉和20份重量的玉米淀粉、40份重量的蔗糖、80份重量的按实施例A-11所述方法制得的糖膏型含水结晶海藻糖、以及4份重量的支链淀粉，以制备Uiro-no-moto。将产物与水和足够量的matcha(粉末茶)掺合，并将所得混合物放入容器中通蒸汽60分钟以得到Uiro。该产品具有令人满意的光泽，咀嚼性质、香味和味道，并且因为其中所含淀粉的老化作用被充分抑制而具有相对长的货架保存期限。
实施例B-8
粉末肽
将1份重量的″HINUTE S″——一种由Fuji Oil Co.，Ltd.Tokyo，Japan市售的含有40％可食大豆的肽溶液与2份重量的按实施例A-10所述方法制得的含水结晶海藻糖混合，将所得混合物放入塑料容器中，于50℃真空干燥，并磨碎得到粉末状肽。该具有令人满意之味道和香味的产品可任意地被用作糖食如预混合物、冰糕和冰淇淋的材料，以及用作婴儿食品和以口服或插管喂饲形式用作治疗营养物。
实施例B-9
粉末状miso
向1份重量的akamiso(一种miso)中加入3份重量的按实施例A-4中所述制得的粉末状无水结晶海藻糖，并将混合物倒入在其表面有半球型坑的金属平板中，室温放置过夜以得到各约4g重的miso固体物，然后将其研成粉末即得到所需产品。
该产品可任意地用作方便面和汤的调味料，以及miso糖食。
实施例B-10
蛋黄粉
在平板加热器上于60-64℃加热灭菌从新鲜鸡蛋制备的蛋黄，并将1份重量的所得液体与相对于1份重量液体来说的4份重量的粉末状无水结晶海藻糖(按实施例A-4所述方法制备)混合。将所得混合物转入容器内放置过夜以形成块，同时使无水结晶海藻糖转变成含水结晶海藻糖。用切刀将如此得到的块切碎得到蛋黄粉。
该产品可任意用作糖食如预混和物、冰糕、冰淇淋和乳化剂的材料，以及用作婴儿食品和口服或插管喂饲的治疗用营养品。该产品也可用作皮肤保养剂和生发剂。
实施例B-11
An(豆糊)
将10份重量作为原料的adzuki豆按常规方法与水混合并煮沸，然后除去豆中的辛涩味和水溶性杂质得到大约21份重量的″adzuki-tsubu-nama-an″将其中加入14份重量的蔗糖、5份重量的按实施例A-12所述方法制得的海藻糖糖浆、5份重量的水，并将所得混合物煮沸，与小量沙拉油混合并小心揑合的不致于糊住豆。如此即得到大约35份重量的所需产品。
该产品没有因煮沸而脱色并且有令人满意的口味和香味，因此可见用作豆沙甜点心、带豆沙馅的甜面包、汤团、填加豆沙的薄酥饼、水糕和冰淇淋的材料。
实施例B-12
面包制品
按常规方法将100份重量的面粉、2份重量的酵母、5份重量的糖、1份重量的按实施例A-14所述方法制得的粉末状含水结晶海藻糖、0.1份重量的无机酵母食品与水揑合，于26℃发酵2小时，熟化30分钟并焙烤。
该产品是具有令人满意的色泽和膨松性及令人满意的弹性和适当甜度的高质量面包制品。
实施例B-13
火腿
向1,000份重量的切成片的火腿肉中加入15份重量的盐和3份重量的硝酸钾并研磨至均质状态，将火腿肉片堆码好并在冷藏室中放置过夜。然后，先将所得肉片放在由500份重量水、100份重量盐、3份重量硝酸钾、40份重量按实施例A-3所述方法制得的含水结晶海藻糖粉末和足够量胡椒薄荷组成的盐溶液中于冷藏室内浸泡7天，按常规方法用冷水洗、用线捆扎、熏制、蒸煮、冷却并包装而得到所需产品。
该产品是具有令人满意的光泽、味道和香味的高质量火腿。
实施例B-14
甜炼乳
在100份重量作为原料的新鲜牛奶中溶入3份重量按实施例A-5中所述方法制得的海藻糖糖浆和1份重量蔗糖，并在平板加热器上加热灭菌，浓缩成70％糖浆(d.s.b)，然后无菌装罐得到所需产品。
因为该产品具有中等甜度和香味，故可任意地给幼儿和儿童食品、水果、咔啡、可可和茶等作调料。
实施例B-15
润肤霜
按常规方法加热溶解2份重量的聚乙二醇单硬脂酸酯、5份重量的甘油单硬脂酸酯(自身乳化的)、2份重量的按实施例A-7中所述方法制得的糖膏型高海藻糖含量粉末、1份重量的α-糖基芸香苷、1份重量的液体凡士林、10份重量的三-2-乙基己酸甘油酯和足够量的防腐剂。使所得溶液与2份重量的L-乳酸、5份重量的1，3-丁二醇和66份重量的精制水混合，并用匀浆器乳化所得混合物，然后与足够量的香料在搅拌条件下混合以得到润肤霜。
该产品具有相对高的稳定性，可任意地用作高质量防晒霜、皮肤保护剂和皮肤增白剂。
实施例B-16
粉末人参提取物
将半份重量的人参提取物与1.5份重量的按实施例A-4所述方法制得的无水结晶海藻糖粉末混合，将所得混合物移入简易容器放置2天，以使无水结晶海藻糖转变成含水结晶海藻糖并形成块状，然后将其切碎并将其筛分成粉末状人参提取物。
将该产品与足够量的维生素B1和B2用造粒机处理而得到含有维生素的粉末状人参提取物。
如此得到的产品可任意用作补药、疲劳缓解剂和活力增进剂。该产品也可用作生发剂。
实施例B-17
固体药剂
将由Hayashibara Biochemical Laboratories，Inc.，Okayama，Japan生产，由Cosmo Bio，Tokyo，Japan推向市场的天然人α干扰素制剂，以常规方式加入固相抗人α干扰素抗体柱上，使吸附α干扰素，并在柱顶加入含牛血清白蛋白作为稳定剂的缓冲液，然后除去过量的白蛋白。继之用含5％按实施例A-2所述方法制得的高海藻糖含量粉末的生理盐水，随生理盐水的pH改变而从柱上洗脱α干扰素。用滤膜过滤所得洗脱物，并加入约20倍体积的由Hayashibara Shoji，Inc.，Okayama，Japan市售的无水结晶体麦芽糖粉末——-″FINETOSE″，以使滤液脱水，然后将所得经脱水的产物研成粉末，并用压片机将所得粉末压片以得到每片约含150单位天然人α干扰素的片剂(每片约200mg重)。
该产品可作为舌下含片，以每天每成年人1-10片的剂量给病人服用，并任意用于治疗病毒性疾病、过敏反应、风湿病、糖尿病和恶性肿瘤。特别是，该产品可适用于作目前病人数目正在显著增加之爱滋病和肝炎的治疗剂。掺入该产品中的海藻糖和麦芽糖可作为天然人α干扰素的稳定剂，使之即使在室温下亦将长时间保留活性。
实施例B-18
糖衣片剂
用由40份重量按实施例A-3所述方法制得的粉末状含水结晶体海藻糖粉末、2份重量有平均分子量200,000的支链淀粉、30份重量水、25份重量滑石粉、3份重量氧化钛组成的溶液包涂150mg重的粗制片核，直到总重量达到约230mg，再进一步用由65份重量的同一粉末状含水结晶海藻糖的新鲜制剂、1份重量的支链淀粉和34份重量的水组成的溶液包涂，并用液体石蜡使其具光泽，以得到具有令人满意的光泽和外观的糖衣片剂。
该产品具有相对高的休克耐受性并可相对长时间地保持其高质量。
实施例B-19
牙膏
按常规方式混合下列成分制备牙膏：
磷酸氢钙                 45.0％
支链淀粉                 2.95％
十二烷基磺酸钠           1.5％
甘油                     20.0％
聚氧乙烯山梨糖醇十二烷基酯                0.5％
防腐剂                                    0.05％
按实施例A-14所述方法制备的
粉状含水结晶体海藻糖                      12.0％
Maltitol                                  5.0％
水                                        13.0％
该产品因具有足够甜度而适用作小儿的牙膏。
实施例B-20
插管喂饲用的固体制剂
制备由下列组分组成的组合物：500份重量的按实施例A-8所述方法制备的含水结晶体海藻糖、270份重量的研成粉末的蛋黄、209份重量的脱脂乳、4.4份重量的氯化钠、1.8份重量的氯化钾、4份重量的硫酸镁、0.01份重量的硫胺素、0.1份重量的抗坏血酸钠、0.6份重量的乙酸维生素E和0.04份重量的尼克酰胺。将25g组合物的等分样注入带防潮压层的小袋内，热封后得到所需产品。
将1袋产品溶解在大约150～300ml水中制成流食，经口服或插管喂饲输入病人鼻腔、胃或小肠内以补充活体能量。
实施例B-21
超营养制剂(hyperalimentation
将按实施例A-10所述方法制备的高纯度含水结晶海藻糖溶解在水中制成约10W/V％的含水海藻糖溶液，然后以常规方式用滤膜过滤除去致热原，无菌注入塑料瓶中，封口后即得到所需产品。
该产品是一种令人满意的放置后基本没有改变的稳定的超营养制剂，可适于静脉内和腹腔内注射使用。该产品的10W/V％溶液是与血液等渗的，因此可以比葡萄糖高出2倍的浓度给活体补充能量。
实施例B-22
超营养制剂
将按实施例A-13所述方法制得的高纯度含水晶体海藻糖和由下列成分组成的氨基酸组合物搅拌下溶解在水中，以分别达到5W/V％和30W/V％的浓度，然后按实施例B-10的相似方法纯化所得溶液得到无热原溶液，将其注入塑料瓶中并密封即制成所需产品。
       氨基酸组合物的成分
  成分   mg/100ml
  L-异亮氨酸I-亮氨酸L-赖氨酸单盐酸化物L-蛋氨酸L-苯丙氨酸L-苏氨酸L-色氨酸L-缬氨酸L-天冬氨酸盐酸化物L-组氨酸单盐酸化物甘氨酸   18041062024029018060200270130340
虽然该产品是含有海藻糖和氨基酸的多成分超营养制剂，但其在放置后基本上没有改变，因此是相当稳定的，并可适于经静脉和腹腔内使用于活体。该产品可任意地用于为活体补充能量及氨基酸。
实施例B-23
治疗创伤的软膏
将200份重量的按实施A-2所述方法制备的高海藻糖含量粉末和300份重量的麦芽糖与50份重量的含3份重量碘的甲醇溶液混合，并将所得溶液与200份重量的10W/V％支链淀粉水溶液混合以制得具有令人满意的伸展性和粘附性的所需产品。
该产品中所含的碘可发挥杀菌活性，并且其中的海藻糖可作对活细胞的能量补充剂，因此该产品可缩短伤口愈合时间并能很好地愈合伤口表面。
从上面的描述可以看出，本发明的新的麦芽糖-海藻糖转化酶可以令人满意的高产率将麦芽糖转化成海藻糖。通过本发明酶促反应制得的本发明海藻糖和含有该糖的糖组合物，具有相对高的稳定性和质量及令人喜欢的甜度。当口服后它们可被机体同化、吸收并作为能源被利用。因此，它们可在食品、化妆品和药品等多种组合物中任意被用作甜味剂、口味改善剂、质量改良剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂和填充剂。
据此，本发明旨在提供一种从麦芽糖制备海藻糖(其中麦芽糖则可从廉价和实质上丰富的天然来源的淀粉制得)，以及在工业规模上并以相对低的成本制备含海藻糖之糖组合物的新技术。因此，本发明对淀粉、酶和生物化学科学等领域，以及特别是食品、化妆品和医药工业、林业、渔业、农业、家畜饲养业和化学工业等其他工业领域具有深远的影响。可以说本发明对各领域的作用都是相当大的。
虽然已对本发明优选方案作了描述，但应明确的是，可对本发明进行各种改动，而这些将包括在本发明待批权利要求内，并落入本发明的精神实质和范围之内。

Claims (15)

1.一种能够使麦芽糖转化成海藻糖并且也能够使海藻糖转化为麦芽糖的酶。
2.根据权利要求1的酶，它从选自脂肪杆菌属(Pimelobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)或栖热菌属(Thermus)中的微生物衍生而来。
3.根据权利要求2的酶，其中所说的微生物是保藏号为FERMBP-4315的脂肪杆菌属的种(Pimelobacter SP.)R48、保藏号为FERM BP-4579的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)H262或保藏号为ATCC 33923的水生栖热菌(Thermus aquaticus)。
 4.根据权利要求1的酶，其具有下列物理化学性质：
(1)根据十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳测得分子量为57,000-120,000道尔顿。
(2)使用两性电解质进行等电电泳测得等电点为3.8-5.1；
(3)其活性受1mM Cu++、50mM Tris-HCl缓冲液的抑制。
5.根据权利要求1的酶，其具有选自由下列一组序列组成的部分氨基酸序列；
(1)Trp-X1-Arg-X2-Ala-X3-Phe，其中X1是指“Phe”或“Pro”；
X2是指“Thr”或“Pro”；X3是指“Val”或“Ala”；
(2)Ala-Val-X4-Tyr，其中X4代表“Phe”或“Ile”。
6.制备权利要求1的酶的方法，包括：
(a)在营养培养基中培养能够产生该酶的微生物，以生成该酶；并且
(b)从所得培养物中回收所说的酶。
7.选自保藏号为FERM BP-4315的脂肪杆菌属之种R48和保藏号为FERM BP-4579的恶臭假单胞菌H262组成的一类能够生成权利要求1之酶的微生物。
8.降低麦芽糖之还原力的方法，其包括使权利要求1的酶在溶液中作用于麦芽糖的步骤。
9.制备含海藻糖之糖组合物的方法，包括：
(a)使权利要求1的酶在溶液中作用于麦芽糖以生成海藻糖，并且
(b)回收含有海藻糖的所得糖组合物。
10.根据权利要求9的方法，其中所说的麦芽糖是通过使β淀粉酶在加有或不加有淀粉脱支酶的情况下作用于淀粉物质的溶液而制备的。
11.根据权利要求10的方法，其中所述的海藻糖是含水结晶海藻糖或无水结晶海藻糖。
12.制备海藻糖的方法，包括：
(a)使权利要求1的酶作用于溶液中的麦芽糖以生成海藻糖；
(b)纯化所得溶液中的海藻糖，并
(c)回收被纯化的海藻糖。
13.根据权利要求12的方法，其中步骤(b)包括使该溶液经受葡糖淀粉酶的作用以增加海藻糖的含量并使用强酸型阳离子交换剂柱对所得海藻糖溶液进行柱层析的步骤。
14.根据权利要求12的方法，其中所说的麦芽糖是通过使β淀粉酶在加有或不加有淀粉脱支酶的情况下作用于淀粉类物质的溶液而制备的。
15.根据权利要求12的方法，其中所说的海藻糖是含水结晶海藻糖或无水结晶海藻糖。
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