CN1484701A - 具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的多肽 - Google Patents
具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的多肽 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1484701A CN1484701A CNA028036573A CN02803657A CN1484701A CN 1484701 A CN1484701 A CN 1484701A CN A028036573 A CNA028036573 A CN A028036573A CN 02803657 A CN02803657 A CN 02803657A CN 1484701 A CN1484701 A CN 1484701A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gly
- ala
- thr
- ser
- val
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2428—Glucan 1,4-alpha-glucosidase (3.2.1.3), i.e. glucoamylase
Abstract
本发明以提供可以用于制造具有环{→6)－α－D－吡喃葡萄糖基－(1→3)－α－D－吡喃葡萄糖基－(1→6)－α－D－吡喃葡萄糖基－(1→3)－α－D－吡喃葡萄糖基－(1→}结构的环状四糖的多肽、以及编码该多肽的DNA和其用途作为课题，通过确立作用于作为非还原末端结合样式具有α－1，4糖苷键的葡萄糖聚合度在2以上的糖，实质上不增加上述糖的还原力进行α－葡糖基转移，使作为非还原末端的结合样式具有α－1，6糖苷键，作为该非还原末端以外的结合样式具有α－1，4糖苷键的葡萄糖聚合度在3以上的糖生成的多肽、编码该多肽的DNA、包含编码该多肽的DNA和可自我复制载体的可复制重组DNA、将该重组DNA导入适宜宿主形成的转化体、该多肽的制造方法和其用途，解决上述课题。
Description
技术领域
本发明涉及到具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的多肽(以下没有特别强调时，都称之为「本发明的多肽」)以及通过基因重组技术制造该多肽的制造方法和其用途。
背景技术
以葡萄糖为组成糖的糖，例如用淀粉作为原料制造的淀粉部分分解物，已知有直链淀粉、淀粉糊精、麦芽糖糊精、麦芽寡糖、异麦芽寡糖等。已知通常这些糖分子的两端的任一端为非还原端，而另一端为还原端，表现出还原性。一般来说，淀粉部分分解物单位固态物的还原力的大小是以等价葡萄糖(Dextrose Equivalent＝DE)表示的。该值大的糖通常是低分子、低粘度、有甜味、反应性强，容易与氨基酸或蛋白质等含有氨基的物质发生羰氨反应，褐变之后发出恶臭，存在着容易使得到的制品的品质劣化的缺点。为了改善这样缺点，很早就期待着不改变淀粉部分分解物的组成糖葡萄糖，而降低或消减其还原力的方法。例如，就象Journal of American Chemical Society、第71卷、353至358页(1949)中记载的那样，已知有通过使macerans淀粉酶作用于淀粉，生成6至8分子的葡萄糖经α-1，4-糖苷键连接的α-、β-或γ-环糊精的方法。现在可以由淀粉工业规模生产环糊精，有效利用这些糖具有的非还原性、无味、包合能力等特性，用于各种用途。另外就象本申请人于特开平7-143876号公报以及特开平7-213283号公报等中公布的那样，通过使非还原性糖生成酶以及海藻糖游离酶作用于麦芽寡糖等淀粉部分分解物，使通过2分子葡萄糖α，α-结合形成的海藻糖的方法也已知。现在，该海藻糖可以由淀粉进行工业规模生产，由于其还原性、温和，可以在产生高品质的甜味特性的用途中利用。象这样以葡萄糖为组成糖的非还原糖，如葡萄糖聚合度为2的α，α-海藻糖、葡萄糖聚合度为6至8的α-、β-或γ-环糊精已经可以工业规模生产，虽然利用这些特性可用于各种用途，但这样的非还原性糖的种类有限，期待着更多种类的非还原性糖乃至低还原性糖的开发。
而近年来，以葡萄糖为组成糖的新的环状的四糖类已有报道。即在European Journal of Biochemistry、第226卷、641至648页(1994年)中主要报道了通过使水解酶alternanase作用于葡萄糖残基α-1，3糖苷键与α-1，6糖苷键交互连接成的alternan，生成具有环{→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}结构的环状四糖(在本说明书中没有特别强调时，都略称为「环状四糖」，在有甲醇共存下可以使该糖结晶析出。
具有这样环状结构的环状四糖是非还原性糖，表现出包合能力，有使挥发性有机物稳定的作用和不引起羰氨反应、不用担心褐变、劣化，期待着在各种用途中可以利用、加工。
然而，环状四糖的制造必需的原料alternan和酶alternanase的获得不仅困难，而且生产这样酶的微生物也不容易获得。
在这样状况下，就象先前国际专利申请公开第WO 01/90338 A1号公布的那样，本发明人等用作为非还原末端结合样式具有α-1，6糖苷键、作为该非还原末端以外的结合样式具有α-1，4糖苷键的葡萄糖聚合度在3以上的糖(在本说明书中也将该糖略称为「α-异麦芽糖基葡萄糖」)作为原料，使能特异切断该糖中的α-异麦芽糖基部分和除此以外的葡萄糖基部分，将该α-异麦芽糖基部分转移，生成环状四糖的α-异麦芽糖基转移酶作用于上述原料，使环状四糖生成获得了成功。该α-异麦芽糖基转移酶是通过从α-异麦芽糖基葡萄糖转移α-异麦芽糖基生成环状四糖的酶，详细地说是具有以下理化性质的α-异麦芽糖基转移酶。
(1)作用
通过从作为非还原末端结合样式具有α-1，6糖苷键、该非还原末端以外的结合样式为α-1，4糖苷键的葡萄糖聚合度在3以上的糖转移α-异麦芽糖基，生成具有环{→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}结构的环状四糖。
(2)分子量
通过SDS-凝胶电泳法确定，具有约82,000至约136,000道尔顿范围内的分子量。
(3)等电点
通过含有两性电解质的电泳方法确定，具有pl约3.7至8.3范围内的等电点。
(4)最适温度
在pH6.0、反应30分钟的反应条件下，最适温度处于约45℃至约50℃的温度范围内。
(5)最适pH
在35℃、反应30的反应条件下，最适pH处于pH约5.5至6.5的范围内。
(6)温度稳定性
在pH6.0下保持60分钟的条件下，在约45℃以下具有温度稳定区。
(7)pH稳定性
于4℃下保持24小时的条件下，在pH约3.6至10.0的范围内具有稳定pH区。
但是，就环状四糖的原料糖看，虽然有望由丰富又便宜供给的淀粉生产，但实际上由于α-异麦芽糖基转移酶不直接作用于淀粉，所以正在采用预先使淀粉转换成具有上述特定结构的α-异麦芽糖基葡萄糖，例如6-α-葡糖基麦芽糖或异麦芽糖基麦芽糖等比较低的低分子异麦芽寡糖，然后使其被α-异麦芽糖基转移酶作用使环状四糖生成的手法。另外，就从原料生成环状四糖的收率看，使用6-α-葡糖基麦芽糖时，收率约为原料6-α-葡糖基麦芽糖重量的44％。同样使用异麦芽糖基麦芽糖时的收率约为31％，而用淀粉时，不仅需要予先使α-淀粉酶、淀粉去分支酶、β-淀粉酶和α-糖苷酶等作用淀粉生成6-α-葡糖基麦芽糖等比较低的低分子异麦芽寡糖，而且环状四糖的收率也极低，约为15％。由淀粉生产环状四糖虽然这样低的收率也可以生产，但担心成本高、期待着以淀粉作为原料，提高环状四糖的收率的新的制造方法的确立。
在这样状况下，本发明人等期待着以淀粉作为原料，能够提高由淀粉得到环状四糖的收率，生成α-异麦芽糖基葡萄糖的新的酶，所以一直对微生物进行广泛检索。结果意外地发现国际专利申请公开第WO 01/90338 A1号公布的从土壤中分离出来的属于杆菌(Bacillus)属和节杆菌(Arthrobacter)属的生产α-异麦芽糖基转移酶的微生物C9株、C11株、N75株和A19株都生产新的α-异麦芽糖基葡糖生成酶，通过使新的α-异麦芽糖基葡糖生成酶和α-异麦芽糖基转移酶作用于以淀粉部分分解物为代表的比较高的高分子寡糖，发现可以显著提高目标环状四糖的收率，在阐明该α-异麦芽糖基葡糖生成酶的诸多性质的同时，确立了该酶的制造方法，以及利用该酶进行的α-葡糖基转移反应方法、α-异麦芽糖基葡糖的制造方法、以及该酶和α-异麦芽糖基转移酶合用的环状四糖或含有环状四糖的糖及其制造方法，同时确立含有通过这些方法得到的环状四糖、或含有环状四糖的糖的食物、化妆品、药品等的组成物。然而，问题是这些微生物生产α-异麦芽糖基葡糖生成酶的能力不充分，在大规模制造α-异麦芽糖基葡糖和环状四糖时，必须大量培养作为这样酶的供给源的微生物。
这一点，在今天，由于分子生物学进步，已知酶的本质是多肽，构成该多肽的氨基酸序列左右着该酶活性的表达，该氨基酸序列由基因DNA编码。因此，分离编码多肽的基因，如果能够解析其碱基序列，制作含有编码该多肽的DNA的重组DNA，然后导入适宜的微生物和动植物细胞，通过将得到的转化体于适宜的营养培养基中进行培养，已经可以比较容易地获得所需要量的多肽。鉴于这样的状况，弄清编码作为上述酶本质的多肽的基因，阐明其碱基序列成了当务之急。
发明内容
本发明的第一个目的是创造具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的多肽，该多肽通过从非还原末端结合样式具有α-1，4糖苷键的葡萄糖聚合度在2以上的糖，在实质上不增加还原力情况下进行α-葡糖基转移，生成非还原末端的结合样式具有α-1，6糖苷键，该非还原末端以外的结合样式为具有α-1，4糖苷键的葡萄糖聚合度在3以上的糖。
本发明的第二的目的在于提供编码上述多肽的DNA。
本发明的第三个目的在于提供含有上述DNA的能够复制的重组DNA。
本发明的第四个目的在于提供导入了上述重组DNA的转化体。
本发明的第五个目的在于提供利用上述转化体制造具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的多肽的制造方法。
本发明的第六个目的在于提供上述多肽的用途。
本发明通过具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的多肽解决上述第一个目的，而该酶具有下述理化性质。
(1)通过从非还原末端结合样式具有α-1，4糖苷键的葡萄糖聚合度在2以上的糖，在实质上不增加还原力情况下转移α-葡糖基，生成非还原末端的结合样式具有α-1，6糖苷键，该非还原末端以外的结合样式为α-1，4糖苷键的葡萄糖聚合度在3以上的糖。
(2)分子量
通过SDS-凝胶电泳法确定，具有约74,000至约160,000道尔顿范围内的分子量。
(3)最适温度
在pH6.0、反应60分钟的反应条件下，最适温度处于约40℃至约50℃的温度范围内。
在pH6.0、反应60分钟的反应条件下，有1mM Ca2+存在下，最适温度处于约45℃至约55℃的温度范围内。
在pH8.4、反应60分钟的反应条件下，最适温度约为60℃。
在pH8.4、反应60分钟的反应条件下，有1mM Ca2+存在下，最适温度约为65℃。
(4)最适pH
在35℃、反应60分钟的反应条件下，最适pH处于pH约6.0至8.4的范围内。
(5)温度稳定性
在pH6.0下保持60分钟的条件下，在约45℃以下具有温度稳定区。
在pH6.0下保持60分钟的条件下，有1mM Ca2+存在下，在约60℃以下具有温度稳定区。
在pH8.0下反应60分钟的条件下，在约55℃以下具有温度稳定区。
在pH8.0下保持60分钟的条件下，有1mM Ca2+存在下，在约60℃以下具有温度稳定区。
(6)pH稳定性
于4℃下保持24小时的条件下，在pH约为5.0至10.0的范围内具有稳定pH区。
本发明通过编码上述多肽的DNA解决上述第二个目的。
本发明通过含有编码上述多肽的DNA和可自我复制的载体形成的可复制DNA解决上述第三个目的。
本发明通过将含有编码上述多肽的DNA和可自我复制的载体形成的可复制重组DNA导入适宜宿主形成的转化体解决上述第四个目的。
本发明通过培养将含有编码上述多肽的DNA和可自我复制的载体的可复制重组DNA导入适宜宿主形成的转化体，从培养物提取多肽的多肽制造方法解决上述第五个目的。
本发明通过确立上述多肽的种种用途解决上述第六个目的。
附图的简单说明
图1是表示使具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的多肽作用于麦芽四糖时生成的产物X的1H-NMR光谱。
图2是表示使具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的多肽作用于麦芽五糖时生成的产物Y的1H-NMR光谱。
图3是使具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的多肽作用于麦芽四糖时生成的产物X的13C-NMR光谱。
图4是使具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的多肽作用于麦芽五糖时生成的产物Y的13C-NMR光谱。
图5是表示温度对来自圆孢芽孢杆菌C11株的α-异麦芽糖基葡糖生成酶的酶活性的影响图。
图6是表示温度对来自圆孢芽孢杆菌N75株的α-异麦芽糖基葡糖生成酶的酶活性的影响图。
图7是表示温度对来自球形节杆菌A19株的α-异麦芽糖基葡糖生成酶的酶活性的影响图。
图8是表示pH对来自圆孢芽孢杆菌C9株的α-异麦芽糖基葡糖生成酶的酶活性的影响图。
图9是表示pH对来自圆孢芽孢杆菌N75株的α-异麦芽糖基葡糖生成酶的酶活性的影响图。
图10是表示pH对来自球形节杆菌A19株的α-异麦芽糖基葡糖生成酶的酶活性的影响图。
图11是表示本发明的来自圆孢芽孢杆菌C11株的α-异麦芽糖基葡糖生成酶的温度稳定性图。
图12是表示来自圆孢芽孢杆菌N75株的α-异麦芽糖基葡糖生成酶的温度稳定性图。
图13是表示来自球形节杆菌A19株的α-异麦芽糖基葡糖生成酶的酶的温度稳定性图。
图14是表示来自圆孢芽孢杆菌C11株的α-异麦芽糖基葡糖生成酶的pH稳定性图。
图15是表示来自圆孢芽孢杆菌N75株的α-异麦芽糖基葡糖生成酶的pH稳定性图。
图16是表示来自球形节杆菌A19株的α-异麦芽糖基葡糖生成酶的pH稳定性图。
图17是表示来自本发明的重组DNA『pBGC2』的限制酶图。图中，用黑粗线表示的部分是编码来自圆孢芽孢杆菌C11的本发明的具有α-异麦芽糖基转移酶活性的多肽的DNA。
图18是表示本发明的重组DNA『pBGN2』的限制酶图。图中，用黑粗线表示的部分是编码来自圆孢芽孢杆菌N75的本发明的具有α-异麦芽糖基转移酶活性的多肽的DNA。
图19是表示来自本发明的重组DNA『pAGA1』的限制酶图。图中，用黑粗线表示的部分是编码来自球形节杆菌A19的本发明的具有α-异麦芽糖基转移酶活性的多肽的DNA。
具体实施方式
所谓本发明的多肽指的是具有通过从非还原末端结合样式具有α-1，4糖苷键的葡萄糖聚合度在2以上的糖，在实质上不增加还原力情况下转移α-葡糖基，生成非还原末端的结合样式具有α-1，6糖苷键，该非还原末端以外的结合样式为α-1，4糖苷键的葡萄糖聚合度在3以上的糖的酶活性的整个多肽。本发明的多肽通常具有已解析的氨基酸序列，作为其中一例，如具有序列表中序列号1所示氨基酸序列、或具有在该氨基酸序列中缺失、或者是被其他氨基酸置换、或者再附加1个或多个氨基酸、即1个或2个以上、根据场合不同，1至50个、或1至30个、或1至10个氨基酸的氨基酸序列的多肽。另外即使是相同的DNA，由于导入该DNA的宿主或含有该DNA的转化体的培养中使用的营养培养基成分、组成、培养温度和pH等不同，由于DNA表达后受到宿主内外酶的修饰等，虽然保持着所期望的理化性质，但有时生成在序列表中序列号1所示氨基酸序列的N末端附近的氨基酸缺失、或被其他氨基酸置换1个或多个氨基酸、即1个或2个以上、根据场合不同，缺失、置换1至50个、或1至30个、或1至20个、或1至10个氨基酸，或者在N末端再新加上1个或2个以上、根据场合不同，加上1至30个、或1至20个、或1至10个氨基酸的变异体。即使是这样的变异体，只要他具备所期望的理化性质，不用说也都包括在本发明的多肽中。
本发明的多肽可以通过将本发明的DNA导入适宜宿主，从得到的转化体的培养液中获取。作为本发明中使用的转化体，例如可以是含有序列表中序列号4、5或6所示从5’，末端开始的碱基序列，或在那些碱基序列中缺失、置换、或附加1或数个碱基的碱基序列，或与这些序列互补的碱基序列，或根据基因的简并性，在不改变他编码的氨基酸序列情况下，用其他碱基置换这些碱基序列中1个或数个碱基后的碱基序列构成的含DNA的转化体。另外，作为上述碱基序列可以例示利用遗传密码的简并性，在不改变编码的氨基酸序列情况下，将1个或数个、即1个或2个以上、根据场合不同，1至150个、或1至90个、或1至60个、或1至30个氨基酸用其他碱基置换后的碱基序列。
本发明的DNA只要是编码本发明的多肽的碱基序列，不管是来自天然的，还是人为合成的都可以。作为天然的供给源，例如包括于平成12年4月25日以受托号FERM BP-7143保藏于日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6所的独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心的圆孢芽孢杆菌C9菌株，以及于平成12年4月25日以受托号FERM BP-7144保藏于日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6所的独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心的圆孢芽孢杆菌C11菌株、以及于平成13年5月16日以受托号FERM BP-7591保藏于日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6所的独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心的含圆孢芽孢杆菌N75菌株的杆菌属，或平成13年5月16日以受托号FERM BP-7590保藏于日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6所的独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心的含球形节杆菌A19株在内的节杆菌属的微生物。从这些微生物的菌体可以得到含有该发明的DNA的基因。即，将这样的微生物接种于营养培养基，在需氧条件下培养约1至3天后，从培养物中收集菌体，通过用溶菌酶或β-葡聚糖酶等溶解细胞壁的酶或超声波进行处理，使含有该DNA的基因排到菌体外。此时，也可以使用蛋白酶等蛋白质水解酶，或在SDS等表面活性剂存在下进行冻融。对这样得到的处理物可以通过使用酚萃取、醇沉淀、离心分离、核酸酶处理等该领域中通常用的方法，可以得到目的DNA。另外，人为合成本发明的DNA可以根据序列表中序列号4、5或6所示碱基序列进行化学合成。另外，也可以以含有该DNA的基因作为模板，使用可作为适当引物的化学合成DNA，进行PCR合成。
使用这些DNA工业上可以大量、便宜而且容易地制造本发明的多肽。即，将该DNA插入通常可自我复制的适宜载体之后，做成重组DNA，然后将其导入适宜宿主，将得到的转化体于适宜营养培养基中进行培养，从该培养物中收集菌体，从该菌体中获得含有该DNA的重组DNA，将该重组DNA导入通常容易增殖的适宜宿主，进行转化，通过将得到的转化体于适宜营养培养基中进行培养，可以制造本发明的多肽。只要能获得编码本发明的多肽的DNA，利用通常的重组DNA技术可以比较容易地制备上述重组DNA。另外作为上述载体，如pBR322、pUC18、Bluescript II SK(+)、pUB110、pTZ4、pC194、pHV14、TRp7、YEp7、pBS7等质粒载体和λgt·λC、λgt·λB、ρ11、φ1和φ105等噬菌体载体。其中，用大肠杆菌表达本发明的DNA时，pBR322、pUC18、Bluescript II Sk(+)、λgt·λC和λgt·λB合适，用枯草杆菌表达时，pUB110、pTZ4、pC194、ρ11、φ1和φ105合适。pHV14、TRp7、YEp7和pBS7在二种以上的宿主内使重组DNA复制时有用。
为了将本发明涉及到的DNA插入到上述载体，可以采用该领域中通常用的方法。具体来说，首先将含有DNA的基因和可自我复制的载体用限制酶和/或超声波切断，然后对生成的DNA片段和载体片段进行连接。如果利用对基因和载体切断处核苷酸具有特异作用的限制酶，特别是II型限制酶，详细地讲如果使用Sau 3AI、Eco RI、Hind III、Bam HI、Sal I、Xba I、Sac I、Pst I等，容易对DNA片段和载体片段进行连接。根据需要，可以将两者进行退火后，在生物体内或生物体外使DNA连接酶作用。这样得到的重组DNA导入大肠杆菌、枯草杆菌、放线菌、酵母等适宜宿主之后，作成转化体，从这些转化体中克隆所期望的转化体，通过培养该克隆可以容易且大量复制。在上述克隆时，运用菌落杂交法，可以选择在含有作为非还原末端结合样式具有α-1，4糖苷键的葡萄糖聚合度在2以上的糖的营养培养基中进行培养，由该糖生成非还原末端的结合样式具有α-1，6糖苷键，该非还原末端以外的结合样式为具有α-1，4糖苷键的葡萄糖聚合度在3以上的糖的转化体。
通过这些克隆得到的转化体在营养培养基中进行培养，可以在菌体内外生产该多肽。营养培养基通常使用碳源、氮源、矿物质、以及根据需要，补充氨基酸或维生素等微量营养素的通常用的液体培养基，作为碳源，如淀粉、淀粉水解物、葡萄糖、果糖、蔗糖、海藻糖等糖源，而作为氮源，如氨、铵盐、尿素、硝酸盐、胨、酵母提取物、脱脂大豆、玉米浸渍液、肉汤等含氮无机物和有机物。将转化体接种于这样的培养基，将培养基的温度维持在20至40℃，pH维持在2至10，通过通气搅拌等在需氧条件下培养约1至6天，可以得到含有该多肽的培养物。该培养物作为含有本发明多肽的粗多肽可以直接使用，但通常在使用之前，都是通过渗透(压)休克或表面活性剂将多肽从菌体抽提出来，或通过超声波或细胞溶解酶将菌体破碎之后，通过过滤、离心分离等从菌体或菌体破碎物中分离、纯化本发明的多肽。纯化可以采用该领域用于纯化多肽的通常方法，例如，对于除去菌体或菌体破碎物的培养物可以采用将从浓缩、盐析、透析、分级沉淀、凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水层析、亲和层析、凝胶电泳、等电点电泳等中选择出来的1种或2种以上方法适当组合的方法。
本发明的多肽具有从作为非还原末端结合样式具有α-1，4糖苷键的葡萄糖聚合度在2以上的糖，在实质上不增加还原力情况下转移α-葡糖基，生成非还原末端的结合样式具有α-1，6糖苷键，该非还原末端以外的结合样式为α-1，4糖苷键的葡萄糖聚合度在3以上的糖的酶活性，详细地讲，该多肽具有以下理化性质。
(1)作用
通过从作为非还原末端结合样式具有α-1，4糖苷键的葡萄糖聚合度在2以上的糖，在实质上不增加还原力情况下转移α-葡糖基，生成非还原末端的结合样式具有α-1，6糖苷键，该非还原末端以外的结合样式为α-1，4糖苷键的葡萄糖聚合度在3以上的糖。
(2)分子量
通过SDS-凝胶电泳确定，具有约74,000至约160,000道尔顿范围内的分子量。
(3)最适温度
在pH6.0、反应60分钟的条件下，最适温度处于约为40℃至约50℃的温度范围内。
在pH6.0、反应60分钟的反应条件下，有1mM Ca2+存在下，最适温度处于约为45℃至约55℃的温度范围内。
在pH8.4、反应60分钟的条件下，最适温度约为60℃。或者
在pH8.4、反应60分钟的条件下，有1mM Ca2+存在下，最适温度约为65℃。
(4)最适pH
在35℃、反应60分钟的条件下，最适pH处于pH约为6.0至8.4的范围内。
(5)温度稳定性
在pH6.0下保持60分钟的条件下，在约45℃以下具有温度稳定区。
在pH6.0下保持60分钟的条件下，有1mM Ca2+存在下，在约60℃以下具有温度稳定区。
在pH8.0下保持60分钟的条件下，在约55℃以下具有温度稳定区。
在pH8.0下保持60分钟的条件下，有1mM Ca2+存在下，在约60℃以下具有温度稳定区。
(6)pH稳定性
于4℃下保持24小时的条件下，在pH约为5.0至10.0的范围内具有稳定pH区。
作为本发明多肽作用的底物可以使用淀粉、支链淀粉、直链淀粉、糖原等含有α-1，4糖苷键的多糖，以及它们经淀粉酶或酸等部分水解得到的淀粉糊精、麦芽糖糊精、麦芽寡糖等部分水解物。也可以随意使用这些含有α-1，4糖苷键的葡糖基糖进一步经分支酶等加支酶(EC 2.4.1.18)处理的糖。作为经淀粉酶分解的部分分解物，例如可以使用经Handbook of Amylases and Related Enzymes、パ-ガモン·プレス公司(东京)(1988年)记载的α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)、麦芽三糖生成淀粉酶(EC 3.2.1.116)、麦芽四糖生成淀粉酶(EC 3.2.1.60)、麦芽五糖生成淀粉酶、麦芽六糖生成淀粉酶(EC 3.2.1.98)等淀粉酶分解的部分分解物。另外，在制备部分分解物时也可以使支链淀粉酶(3.2.1.41)、异淀粉酶(EC 3.2.1.68)等淀粉去分支酶随意作用。作为底物的淀粉可以使用玉米、小麦、米等来自谷类的地上淀粉，也可以使用土豆、甘薯、木薯等地下淀粉，优选使用使淀粉糊化和/或液化了的溶液。该淀粉部分分解的程度由于分解程度越低，环状四糖的产率越高，DE在约20以下、优选在约12以下、更理想的是在约5以下合适。底物浓度没有特别限定。例如，即使使用底物浓度0.1％(w/w)(以下在本说明书中，没有特别强调时，将『％(w/w)』略称为『％』)的低浓度溶液的时候，本发明的酶反应也可进行，工业生产上1％以上合适。另外在底物溶液中即使是含有完全不溶的不溶性底物的溶液也可以。希望浓度在40％以下，更优选是在20％以下合适。反应温度，反应进行的温度，即在直到65℃附近的温度、优选是在30至55℃附近的温度进行反应比较好。反应pH通常可以调整到4.5至8的范围内。优选是将pH调整到5.5至7的范围内。反应时间根据酶反应的进行状况适当选择。
通过使α-异麦芽糖基转移酶作用于本发明多肽作用于上述底物后生成的α-异麦芽基葡萄糖，可以大量且容易制造本领域中有用的环状四糖。使α-异麦芽糖基转移酶作用的时期无论在使本发明多肽作用时作用，还是在使该多肽失活后作用都可以。然而，如果用本发明多肽和α-异麦芽糖基转移酶同时作用为宜。具体来说，通过对淀粉或其部分分解物在糖原的水溶液中与本发明的多肽和α-异麦芽糖基转移酶合用，由淀粉或其部分分解物生成的环状四糖的收率大约是固态物重量的30％以上，而使用糖原时得到的环状四糖的收率大约是固态物重量的80％以上。本发明多肽和α-异麦芽糖基转移酶合用时的环状四糖的生成机制由两者的反应特性推测如下。
(1)本发明多肽作用于作为非还原末端的结合形式具有α-1，4-糖苷键的葡萄糖聚合度在2以上的糖，作用于例如淀粉、糖原或它们的部分分解物等的糖的非还原末端的α-1，4-葡萄糖基，使该葡萄糖基经分子间转移到其他的非还原末端葡萄糖基的6位羟基，生成非还原末端具有α-异麦芽糖基的糖。
(2)α-异麦芽糖基转移酶作用于非还原末端具有异麦芽糖基的糖，该异麦芽糖基经分子间转移到位于其他的非还原末端含有异麦芽糖基的糖的非还原末端葡萄糖基的3位羟基上，生成非还原末端具有异麦芽糖基-1，3-异麦芽糖基的糖。
(3)α-异麦芽糖基转移酶作用于该非还原末端具有异麦芽糖基-1，3-异麦芽糖基的糖，通过分子内转移作用，将异麦芽糖基-1，3-异麦芽糖基与糖断开，然后进行环化，生成环状四糖。
(4)在(3)中异麦芽糖基-1，3-异麦芽糖基断开后的糖再次通过(1)至(3)的反应，生成环状四糖，这些反应反复进行，可生成、积蓄大量环状四糖。
就象以上说明的那样，可以推测，通过合用本发明的多肽和α-异麦芽糖基转移酶，象上述那样两者反复作用于各自的底物，环状四糖的收率显著提高。
另外在该环状四糖的生成反应中，进而与其它转移酶合用，四糖的收率提高也可实现。即，通过合用本发明的多肽和α-异麦芽糖基转移酶，使他们作用于浓度约为15％的淀粉部分分解物，得到的环状四糖的收率约为底物固态物重量的55％，在相同条件下，通过合用本发明多肽和α-异麦芽糖基转移酶以及环麦芽糊精葡聚糖基转移酶(シクロマルトデキストリングルカノトランスフエラ一ゼ)，使他们作用，环状四糖收率再提高相当于基质固态物重量的约5至10％，即可以提高到约60至65％。
通过上述反应得到的溶液作为含有环状四糖的溶液或含有环状四糖的糖的溶液可以直接使用。然而，一般来说，这些糖都是通过适宜手法精制后使用。作为精制方法，可以适宜采用众所周知的方法，例如将用活性炭进行脱色、精制，通过H型和OH型离子交换树脂脱盐，通过薄层层析、高效液相层析、离子交换柱层析、活性炭柱层析、硅胶柱层析等柱层析分级，通过醇和丙酮等有机溶剂进行分级，通过具有适度的分离性能的膜的分离，以及使用淀粉酶，例如α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)等或α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.20)等酶对残存的其他糖进行分解的方法，利用酵母发酵处理，通过碱处理等将残存还原性糖分解除去等各种精制方法1种或2种以上组合后可进行精制。特别是作为工业大量生产方法，离子交换柱层析合适，例如通过使用特开昭58-23799号公报、特开昭58-72598号公报等中公开的使用强酸性阳离子交换树脂的柱层析除去夹杂的糖，可以有效制造含有高纯度的环状四糖或含有环状四糖的糖。此时，可以随意采用固定床方式、移动床方法、类似移动床方法中的任一种方法。
这样得到的环状四糖或含有环状四糖的糖可以随意地进一步浓缩、做成糖浆状制品，或干燥后做成非晶形的环状四糖或含有非晶形的环状四糖的粉末状糖制品。
为了制造环状四糖结晶，例如可以在有机溶剂存在或不存在下通过将固态物纯度在约50％以上、固态物浓度约30％至约90％的环状四糖高含有液加入到结晶罐中，在相当于固态物重量0.1％至20％环状四糖种晶存在下，于95℃、优选是在10至90℃的范围内在搅拌条件下，由高温徐徐冷却到低温，制造含有环状四糖的浆(マスキツト)。作为由浆(マスキツト)制造环状四糖结晶或含有环状四糖的糖的方法，可以适宜采用例如块粉碎法、流动造粒法、喷雾干燥法等众所周知的方法，作为制造含蜜结晶的方法可以适宜采用分蜜方法等。
这样得到的环状四糖为上品，为带有淡甜味的非还原性白色粉末或糖浆，而且稳定，与其他材料、特别是氨基酸、寡肽、蛋白质等含有氨基酸的物质混合，即使加工，也几乎不会褐变，不发生恶臭，也不损伤混合的其他材料的物性。另外，由于环状四糖具有包合能力，在防止香味成分、有效成分等挥散、防止品质劣化、保持香味成分、有效成分稳定方面非常好。如果需要，通过合用环状糊精类、分枝环状糊精类、环糊精类、环果聚糖类等其他环状糖，通过包合能力进一步提高各种成分的稳定性也可以有效实施。除了上述环状四糖以外，环糊精类等环状糖不必限定于高纯度的糖，低纯度的环状糖、例如大量麦芽糊精以及含有各种环糊精的淀粉部分分解物也可以利用。
另外使用本发明的多肽得到的环状四糖由于实质上不会被淀粉酶或α-葡糖苷酶分解，所以即使口服也不会被消化吸收，另外也很难被肠道内细菌发酵，可以作为极低热量的水溶性食物纤维利用，即使是虫牙诱发菌等也很难发酵，也可以用作很难引起虫牙的甜味料，以及作为粉末状物的粘着、固结防止剂。另外这样的环状四糖本身是无毒、无害的天然甜味料，是安全而稳定的甜味料。对于环状四糖结晶制品，与出芽短梗孢糖、羟乙基淀粉、聚乙烯基吡咯烷酮等粘合剂合用用于片剂、糖衣片剂也可以有效实施。另外，还具备渗透压调节性、赋形性、赋予光泽性、保湿性、粘性、防止其他糖结晶性、难发酵性等有用的性质。
因此，使用本发明的多肽得到的环状四糖或含有该糖的糖作为甜味料、调味剂、品质改良剂、稳定剂、防止变色剂、赋形剂等在饮食物、嗜好物、饲料、饵料、化妆品、医药品等各种组成物中可以有效利用。
另外，使用本发明的多肽得到的环状四糖或含有该糖的糖可以直接用作加甜味的调味料。如果需要，也可以与例如粉饴、葡萄糖、果糖、乳糖、异构化糖、砂糖、麦芽糖、海藻糖(α，α-海藻糖、α，β-海藻糖、β，β-海藻糖)、蜂蜜、枫糖、山梨糖醇、麦芽糖醇、氢查尔酮、蛇菊甙、α-葡糖基蛇菊甙、ラカンカ甜味物、干草甜、ソ-マチン、L-天冬氨酰苯丙氨酸甲酯、糖精、乙酰氨基磺酸钾(acesulfameK)、三氯蔗糖(sucralose)、甘氨酸、丙氨酸等其他的甜味料合用，或者也可以与糊精、淀粉、乳糖等增量剂合用。尤其是与赤藓糖醇、木糖醇、麦芽糖醇等低热量甜味料或α-葡糖基蛇菊甙、ソ-マチン、L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯、糖精、乙酰氨基磺酸钾(acesulfameK)、三氯蔗糖(sucralose)等1种或2种以上高甜度甜味料，作为低能量甜味料或者减肥甜味料等使用很适合。
使用本发明的多肽得到的环状四糖或含有该糖的糖可以直接使用，或根据需要，与其他增量剂、赋形剂、粘合剂等混合之后，可以随意做成颗粒、球状、短棒状、板状、立方体、片剂等各种形状使用。
使用本发明的多肽得到的环状四糖或含有该糖的糖的甜味与具有酸味、咸味、涩味、香味、苦味等其他味道的各种物质充分调和，因为耐酸性、耐热性强，所以在使一般食品带上甜味、改善味道、改善品质等中可以有效利用。例如，用作酱油、粉末酱油、大酱、粉末大酱、未过滤的酒、酱菜、(撒在饭上)粉状食品、蛋黄酱、饰品、食用醋、三杯醋、粉末饭卷醋、中国调料、天汁、面汁、辣酱油、番茄酱、烧肉料汁、カレ-ルウ、炖(焖)食品的调料、汤料、汤(ダシ)调料、复合调味料、料酒、新料酒、餐用糖、咖啡用糖等各种调味料的甜味料、以及味道改良剂、品质改良剂等也可以有效实施。另外，用于使煎饼、小方块糯米点心、米和芝麻等加糖做的点心、皮糖样点心、餅类、馒头、米粉糕、馅类、羊羹、水羊羹、锦玉、果冻、蛋糕、麦芽糖球等各种日本点心、面包、饼干、椒盐饼干、小糖餅、馅饼、プリン、加糖奶油浆、蛋奶羹、奶油填馅点心、华夫饼干、海棉状点心、炸面圈、巧克力、口香糖、焦糖、牛轧糖、水果糖等各种洋点心、冰淇淋、雪糕等冰糕、果汁、冰蜜汁类、花酱、花生酱、果泥等酱类、果子酱、橘子果酱、咸果酱、糖果等果实、蔬菜的加工食品类、什锦酱菜、暴腌的咸甜萝卜、千枚渍、腌野薤等腌物类、日本罗卜咸菜素、腌白菜素等腌物的素、火腿、香肠等畜肉制品类、鱼肉火腿、鱼肉香肠、鱼糕、筒状鱼卷、炸虾(鱼)等鱼肉制品、海胆、咸乌贼、醋海带、さきするめ、料酒浸的河豚干、鳕、真鲷、虾等田麸等各种珍味类、用海苔、野菜、麻雀、小鱼、贝等制造的用调料注的制品类、煮豆、土豆沙拉、海带卷等家常菜食品、乳制品、鱼肉、畜肉、果实、蔬菜罐头、陶装类、合成酒、增酿酒、清酒、果酒、发泡酒、啤酒等酒类、咖啡、可口可乐、果汁、碳酸饮料、乳酸饮料、乳酸菌饮料等清凉饮料、预混合料、热饼混合料、即饮饮料、即饮咖啡、即饮年糕小豆汤、即饮汤等即用食品、另外脱乳食品、治疗食品、饮料剂、胨食品、冷冻食品等各种饮食物带有甜味、味道改良剂、品质改良等也可以有效实施。另外也可以用于提高家畜、家禽、以及蜜蜂、蚕、鱼等饲养动物的饲料、饵料等嗜好性为目的的用途中。此外，作为香烟、牙膏、口红、唇膏、内服液、片剂、口含片、肝油糖球、口中清凉剂、口中香剂、漱口剂等各种的固态物、用作膏状、液体状等嗜好物、化妆品、医药品等各种组成物的甜味剂、或味道改良剂、矫味剂、以及作为品质改良剂、稳定剂等可以有效利用。作为品质改良剂、稳定剂在容易失去有效成分、活性等各种生理活性物质或含有这些物质的健康食品、医药品等中可以有效利用。例如干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β、巨噬细胞游走抑制因子、神经刺激因子、转移因子、白介素II等淋巴因子含有液、胰岛素、生长激素、催乳激素、促红细胞生成素、卵细胞刺激激素等激素含有液、BCG疫苗、日本脑炎疫苗、麻疹疫苗、小儿麻痹疫苗、天花疫苗、破伤风类病毒、ハブ抗毒素、人免疫球蛋白等生物制剂含有液、青霉素、红霉素、氯霉素、四环素、链霉素、硫酸卡那霉素等抗生素含有液、硫胺素、核黄素、L-抗坏血酸、肝油、胡萝卜素、麦角甾醇、生育酚等维生素含有液、EPA、DHA、花生四烯酸等高不饱和脂肪酸或其酯的衍生物、脂肪酶、酯酶、尿激酶、蛋白激酶、β-淀粉酶、异淀粉酶、葡聚糖酶、乳糖酶等酶含有液、药用人参提取物、甲鱼提取物、小球藻提取物、芦荟提取物、蜂[巢蜡]胶提取物等提取物等或高级凝胶等各种生理活性物质、以及病毒、乳酸菌、酵母等活菌膏等不失去有效成分或活性的、而且稳定的高品质液体状、膏状或固状健康食品和药品等容易制造。
使上述那样的各种组成物中含有用本发明多肽得到的环状四糖或含有环状四糖的糖的方法只要是包括在直至完成该制品的工序中都可以，例如可以适宜选择混合、混揉、溶解、融解、浸渍、浸透、散布、涂布、被覆、喷雾、注入、结晶、固化等众所周知的方法。含有的环状四糖的量通常为0.1％以上，优选在1％以上。
以下根据实验例对圆孢芽孢杆菌C11株(FERM BP-7144)、圆孢芽孢杆菌N75株(FERM BP-7591)以及球形节杆菌A19株(FERMBP-7590)产生的具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性多肽的理化性质的阐明、以及编码具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性多肽的DNA的阐明、以及利用该DNA的具有重组型α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性多肽的制备方法进行说明。
实验例1来自圆孢芽孢杆菌C11株的具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性多肽的制备
实验例1-1 α-异麦芽糖基葡糖生成酶的制备
将淀粉部分分解物(商品名『パインデツクス#4』)4.0％(w/v)、酵母提取物『アサヒミ-スト』1.8％(w/v)、磷酸氢二钾0.1％(w/v)、磷酸二氢钠·12水盐0.06％(w/v)、硫酸镁·7水盐0.05％(w/v)以及水构成的液体培养基100ml装入到500ml容量的三角烧瓶中，用高压灭菌锅于121℃下灭菌20分钟，冷却之后，接种圆孢芽孢杆菌C11，将于27℃、230rpm下进行48小时旋转振荡培养的菌液作为种培养。将与种培养时同样组成的培养基约20L加入到容量30L的发酵罐中，加热灭菌、冷却温度达到27℃后，接种种培养液1％(v/v)，维持在27℃、pH6.0至8.0范围内，进行48小时通气搅拌培养。培养后，对培养物中的酶活性进行测定，结果α-异麦芽糖基葡糖生成酶的活性约为0.55单位/ml，α-异麦芽糖基转移酶活性约为1.8单位/ml，对该培养物进行离心分离(10,000rpm，30分钟)，对回收的约18L上清的酶活性进行测定，结果α-异麦芽糖基葡糖生成酶的活性约为0.51单位/ml(总活性约为9,180单位)，α-异麦芽糖基转移酶活性约为1.7单位/ml(总活性约为30,400单位)，两个酶活性都主要是在上清中被检测的，表明两个酶都是被分泌到培养液的分泌型酶。
而上述两种酶的活性象下述那样测定。即，α-异麦芽糖基葡糖生成酶的测定如下：将麦芽三糖溶解于100mM醋酸缓冲液(pH6.0)(终浓度为2％(w/v))，作为底物溶液，然后向0.5ml的底物溶液中加入0.5ml酶液，于35℃下进行60分钟酶反应，将该反应液煮沸10分钟，使反应停止后，通过高效液相层析(HPLC)法对该反应液中的麦芽糖进行定量。α-异麦芽糖基葡糖生成酶的1个活性单位定义为在上述条件下1分钟内生成1μ摩尔麦芽糖的酶量。而HPLC使用『Shodex KS-80』柱(昭和电工(株式会社)制造)，在柱温60℃、洗脱液水的流速0.5ml/min的条件下进行，用差示折射计『RI-8012』(东曹株式会社制造)进行检测。
α-异麦芽糖基转移酶活性测定如下：将6-α-葡糖基麦芽糖溶解于100mM醋酸缓冲液(pH6.0)(终浓度为2％(w/v))，作为底物溶液，然后向0.5ml的底物溶液中加入0.5ml酶液，于35℃下进行30分钟酶反应，将该反应液煮沸10分钟，使反应停止后，该反应终止液中的葡萄糖量通过用葡萄糖氧化酶法进行定量，α-异麦芽糖基转移酶的1个活性单位定义为在上述条件下1分钟内生成1μ摩尔葡萄糖的酶量。
实验例1-2 部分纯化酶标准品的制备
将实验例1-1方法得到的培养上清约18L用80％饱和硫铵溶液进行盐析，于4℃下放置24小时后，该盐析沉淀物经离心分离(10,000rpm、30分钟)回收，溶解于10mM磷酸缓冲液(pH7.5)后，对同样缓冲液进行透析，得到大约416ml粗酶液。该粗酶液含有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性约为8,440单位，α-异麦芽糖基转移酶活性约为28,000单位。使用三菱化学株式会社制造『Sepabeads FP-DA13』凝胶对该粗酶液进行离子交换层析。此时，无论α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性成分，还是α-异麦芽糖基转移酶活性成分都没有吸附在『Sepabeads FP-DA13』凝胶上，在非吸附级分中检测到两个酶的活性。回收该非吸附级分，对含有1M硫铵的10mM磷酸缓冲液(pH7.0)透析，该透析液经离心分离除去不溶物，使用『Sephacryl HRS-200』凝胶(Amersham pharmacia biotech株式会社制造)进行亲和层析(凝胶量为500ml)。酶活性成分吸附在『Sephacryl HR S-200』凝胶上，用浓度从1M下降至0M硫铵进行线性梯度洗脱，再继续用浓度从0mM提高至100mM麦芽四糖进行线性梯度洗脱，结果使α-异麦芽糖基转移酶活性成分与α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性成分分离之后洗脱，在硫铵线性梯度浓度约为0.3M附近的级分中检测到α-异麦芽糖基转移酶活性，在麦芽四糖线性梯度浓度约30mM附近的级分中检测到α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性。将α-异麦芽糖基转移酶活性级分与α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性级分一个一个地回收，分别作为具有α-异麦芽糖基转移酶活性的部分纯化酶标准品、具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的部分纯化酶标准品回收，对这些酶标准品分别进行纯化。
实验例1-3 具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的多肽的纯化
将用实验例1-2方法得到的具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的部分纯化酶标准品对含有1M硫铵的10mM磷酸缓冲液(pH7.0)透析，该透析液经离心分离除去不溶物，使用东曹株式会社制造的『Butyl-Toyopearl 650M』凝胶进行疏水层析(凝胶量为350ml)。该酶活性成分吸附于『Butyl-Toyopearl 650M』凝胶上，用硫铵浓度从1M降至0M进行线性梯度洗脱，结果在硫铵浓度约0.3M附近，吸附的酶活性成分被洗脱出来，收集回收表现出该酶活性的级分。再次将该回收液对含有1M硫铵的10mM磷酸缓冲液(pH7.0)透析，该透析液经离心分离除去不溶物，使用『Sephacryl HR S-200』凝胶进行亲和层析，进行纯化。该纯化各个阶段中的具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的酶标准品的酶活性量、比活性、收率如表1所示。
表1
| 工序 | α-异麦芽糖基葡糖生成酶多肽活性量(单位) | α-异麦芽糖基葡糖生成酶多肽比活性(单位/mg蛋白) | 收率(％) |
| 培养上清 | 9,180 | 0.14 | 100 |
| 硫铵盐析后的透析液 | 8,440 | 0.60 | 91.9 |
| 离子交换柱洗脱液 | 6,620 | 1.08 | 72.1 |
| 亲和层析柱洗脱液 | 4,130 | 8.83 | 45.0 |
| 疏水柱洗脱液 | 3,310 | 11.0 | 36.1 |
| 亲和层析柱洗脱液 | 2,000 | 13.4 | 21.8 |
通过含有7.5％(w/v)聚丙烯酰胺的凝胶电泳检定纯化的α-异麦芽糖基葡糖生成酶多肽标准品的纯度，结果表明蛋白带为单一带，是纯度高的多肽。
实验例1-4 具有α-异麦芽糖基转移酶活性的多肽的纯化
将用实验例1-2方法得到的具有α-异麦芽糖基转移酶活性的部分纯化酶标准品对含有1M硫铵的10mM磷酸缓冲液(pH7.0)透析，该透析液经离心分离除去不溶物，使用东曹株式会社制造的『Butyl-Toyopearl 650M』凝胶进行疏水层析(凝胶量为350ml)。该酶活性成分吸附于『Butyl-Toyopearl 650M』凝胶上，用硫铵浓度从1M降至0M进行线性梯度洗脱，结果在硫铵浓度约0.3M附近被洗脱出来，收集回收表现出该酶活性的级分。再次将该回收液对含有1M硫铵的10mM磷酸缓冲液(pH7.0)透析，该透析液经离心分离除去不溶物，使用『Sephacryl HR S-200』凝胶进行亲和层析来纯化。该纯化各个阶段中的具有α-异麦芽糖基转移酶活性的酶标准品的酶活性量、比活性、收率如表2所示。
表2
| 工序 | α-异麦芽糖基转移酶多肽活性量(单位) | α-异麦芽糖基转移酶多肽比活性(单位/mg蛋白) | 收率(％) |
| 培养上清 | 30,400 | 0.45 | 100 |
| 硫铵盐析后的透析液 | 28,000 | 1.98 | 92.1 |
| 离子交换柱洗脱液 | 21,800 | 3.56 | 71.7 |
| 亲和层析柱洗脱液 | 13,700 | 21.9 | 45.1 |
| 疏水柱洗脱液 | 10,300 | 23.4 | 33.9 |
| 亲和层析柱洗脱液 | 5,510 | 29.6 | 18.1 |
通过含有7.5％(w/v)聚丙烯酰胺的凝胶电泳检定纯化的具有α-异麦芽糖基转移酶活性的酶标准品的纯度，结果表明蛋白带为单一带，是纯度高的多肽。
实验例2 来自圆孢芽孢杆菌N75的具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性多肽的制备
实验例2-1 α-异麦芽糖基葡糖生成酶的制备
将淀粉部分分解物(商品名『パインデツクス#4』、)4.0％(w/v)、酵母提取物『アサヒミ-スト』1.8％(w/v)、磷酸氢二钾0.1％(w/v)、磷酸二氢钠·12水盐0.06％(w/v)、硫酸镁·7水盐0.05％(w/v)以及水构成的液体培养基100ml装入到500ml容量的三角烧瓶中，用高压灭菌锅于121℃下灭菌20分钟，冷却之后，接种圆孢芽孢杆菌N75，将于27℃、230rpm下进行48小时旋转振荡培养的菌液作为种培养。将与种培养时同样组成的培养基约20L加入到容量30L的发酵罐中，加热灭菌、冷却温度达到27℃后，接种种培养液1％(v/v)，维持在27℃、pH6.0至8.0范围内进行48小时通气搅拌培养。培养后，对培养物中的酶活性进行测定，结果α-异麦芽糖基葡糖生成酶的活性约为0.34单位/ml，α-异麦芽糖基转移酶活性约为1.1单位/ml。对该培养物进行离心分离(10,000rpm，30分钟)，对回收的约18L上清的酶活性进行测定，结果α-异麦芽糖基葡糖生成酶的活性约为0.33单位/ml(总活性约为5,940单位)，α-异麦芽糖基转移酶活性约为1.1单位/ml(总活性约为19,800单位)，两个酶活性都主要是在上清中被检测到，表明两个酶都是被分泌到培养液的分泌型酶。
实验例2-2 部分纯化酶标准品的制备
将实验例2-1得到的培养上清约18L用80％饱和硫铵溶液进行盐析，于4℃下放置24小时后，该盐析沉淀物经离心分离(10,000rpm、30分钟)回收，溶解于10mM tris-磷酸缓冲液(pH8.3)后，对同样缓冲液进行透析，得到约450ml粗酶液。该粗酶液含有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性约4,710单位，α-异麦芽糖基转移酶活性约15,700单位。使用三菱化学株式会社制造『Sepabeads FP-DA13』凝胶对该粗酶液进行离子交换层析。α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性成分吸附在『Sepabeads FP-DA13』凝胶上，而α-异麦芽糖基转移酶活性成分没有吸附在『Sepabeads FP-DA13』凝胶上，而是在非吸附级分中检测到。然后用NaCl浓度从0M至1M线性梯度进行洗脱，结果α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性成分大约在NaCl线性梯度中的约0.25M附近被洗脱出来。将α-异麦芽糖基转移酶活性级分与α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性级分一个一个地回收，作为具有α-异麦芽糖基转移酶活性的部分纯化酶标准品、具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的部分纯化酶标准品分别回收，对这些酶标准品分别进行纯化。
实验例2-3 具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的多肽的纯化
将用实验例2-2方法得到的具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的部分纯化酶标准品对含有1M硫铵的10mM磷酸缓冲液(pH7.0)透析，该透析液经离心分离除去不溶物，使用『Sephacryl HR S-200』凝胶(Amersham pharmacia biotech株式会社制造)进行亲和层析(凝胶量为500ml)。酶活性成分吸附在『Sephacryl HR S-200』凝胶上，用硫铵浓度从1M降至0M的线性梯度进行洗脱，接着用麦芽四糖浓度由0mM上升到100mM的线性梯度进行洗脱，结果在麦芽四糖线性梯度浓度约30mM附近的级分检测到α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性。回收该酶活性级分。将该回收液对含有1M硫铵的10mM磷酸缓冲液(pH7.0)透析，该透析液经离心分离除去不溶物，使用东曹株式会社制造的『Butyl-Toyopearl 650M』凝胶进行疏水层析(凝胶量为350ml)。该酶吸附于『Butyl-Toyopearl 650M』凝胶上，用硫铵浓度从1M降至0M的线性梯度进行洗脱，在硫铵浓度约0.3M附近吸附的酶被洗脱出来，收集回收表现出该酶活性的级分。再次将该回收液对含有1M硫铵的10mM磷酸缓冲液(pH7.0)透析，该透析液经离心分离除去不溶物，使用『Sephacryl HR S-200』凝胶进行亲和层析纯化。该纯化的各个阶段中的具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的酶标准品活性量、比活性、收率如表3所示。
表3
| 工序 | α-异麦芽糖基葡糖生成酶多肽活性量(单位) | α-异麦芽糖基葡糖生成酶多肽比活性(单位/mg蛋白) | 收率(％) |
| 培养上清 | 5,940 | 0.10 | 100 |
| 硫铵盐析后的透析液 | 4,710 | 0.19 | 79.3 |
| 离子交换柱洗脱液 | 3,200 | 2.12 | 53.9 |
| 亲和层析柱洗脱液 | 2,210 | 7.55 | 37.2 |
| 疏水柱洗脱液 | 1,720 | 10.1 | 29.0 |
| 亲和层析柱洗脱液 | 1,320 | 12.5 | 22.2 |
通过含有7.5％(w/v)聚丙烯酰胺的凝胶电泳检定纯化的α-异麦芽糖基葡糖生成酶多肽标准品的酶标准品纯度，结果表明蛋白带为单一带，是纯度高的多肽。
实验例2-4 具有α-异麦芽糖基转移酶活性的多肽的纯化
将用实验例2-2方法得到的具有α-异麦芽糖基转移酶活性部分纯化酶标准品对含有1M硫铵的10mM磷酸缓冲液(pH7.0)透析，该透析液经离心分离除去不溶物，使用『Sephacryl HR S-200』凝胶(Amersham pharmacia biotech株式会社制造)进行亲和层析(凝胶量为500ml)。酶活性成分吸附在『Sephacryl HR S-200』凝胶上，用硫铵浓度从1M降至0M的线性梯度进行洗脱，结果大约在硫铵浓度为约0.3M附近检测到该酶活性。回收该酶活性级分。将该回收液对含有1M硫铵的10mM磷酸缓冲液(pH7.0)透析，该透析液经离心分离除去不溶物，使用『Butyl-Toyopearl 650M』凝胶(东曹株式会社制造)进行疏水层析(凝胶量为350ml)。该酶活性成分吸附于『Butyl-Toyopearl 650M』凝胶上，用硫铵浓度从1M降至0M的线性梯度进行洗脱，在硫铵浓度约0.3M附近被洗脱出来，收集回收表现出该酶活性的级分。将该回收液对10mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)透析，该透析液经离心分离除去不溶物，使用『SuperQ-Toyopearl 650C』凝胶(东曹株式会社制造)进行离子交换柱层析(凝胶量380ml)。该酶不吸附于『SuperQ-Toyopearl 650C』凝胶上，而是在非吸附级分中洗脱出来，回收得到的洗脱级分，作为精制酶标准品。该纯化的各个阶段中的具有α-异麦芽糖基转移酶活性的酶标准品活性量、比活性、收率如表4所示。
表4
| 工序 | α-异麦芽糖基转移酶多肽活性量(单位) | α-异麦芽糖基转移酶多肽比活性(单位/mg蛋白) | 收率(％) |
| 培养上清 | 19,000 | 0.33 | 100 |
| 硫铵盐析后的透析液 | 15,700 | 0.64 | 82.6 |
| 离子交换柱洗脱液 | 12,400 | 3.56 | 65.3 |
| 亲和层析柱洗脱液 | 8,320 | 11.7 | 43.8 |
| 疏水柱洗脱液 | 4,830 | 15.2 | 25.4 |
| 离子交换柱洗脱液 | 3,850 | 22.6 | 20.3 |
通过含有7.5％(w/v)聚丙烯酰胺的凝胶电泳检定纯化的具有α-异麦芽糖基转移酶活性的酶标准品的纯度，结果表明蛋白带为单一带，是纯度高的多肽。
实验例3 来自球形节杆菌A19的具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性多肽的制备
实验例3-1 α-异麦芽糖基葡糖生成酶的制备
将淀粉部分分解物(商品名『パインデツクス#4』)4.0％(w/v)、酵母提取物『アサヒミ-スト』1.8％(w/v)、磷酸氢二钾0.1％(w/v)、磷酸二氢钠·12水盐0.06％(w/v)、硫酸镁·7水盐0.05％(w/v)以及水构成的液体培养基100ml装入到500ml容量的三角烧瓶中，用高压灭菌锅于121℃下灭菌20分钟，冷却之后，接种球形节杆菌A19，将于27℃、230rpm下进行48小时旋转振荡培养的菌液作为种培养。将与种培养时同样组成的培养基约20L加入到容量30L的发酵罐中，加热灭菌、冷却后温度达到27℃后，接种种培养液1％(v/v)，维持在27℃、pH6.0至9.0范围内进行48小时通气搅拌培养。培养后，对培养物中的酶活性进行测定，结果α-异麦芽糖基葡糖生成酶的活性约为1.1单位/ml，α-异麦芽糖基转移酶活性约为1.7单位/ml。对该培养物进行离心分离(10,000rpm，30分钟)，对回收的约18L上清的酶活性进行测定，结果α-异麦芽糖基葡糖生成酶的活性约为1.06单位/ml(总活性约为19,100单位)，α-异麦芽糖基转移酶活性约为1.6单位/ml(总活性约为28,800单位)，两个酶活性主要都是在培养上清中被检测到，表明两个酶都是被分泌到培养液的分泌型酶。
另外，来自球形节杆菌A19的α-异麦芽糖基葡糖生成酶的活性测定除了作为底物的缓冲液用100mM甘氨酸-NaOH缓冲液(pH8.4)以外，其他按照实验例1记载的方法那样进行。
实验例3-2部分纯化酶标准品的制备
将实验例3-1方法得到的培养上清约18L用60％饱和硫铵溶液进行盐析，于4℃下放置24小时后，该盐析沉淀物经离心分离(10,000rpm、30分钟)回收，溶解于10mM tris-磷酸缓冲液(pH7.0)后，对同样缓冲液进行透析，得到大约850ml粗酶液。该粗酶液含有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性约为8,210单位的，α-异麦芽糖基转移酶活性约为15,700单位。将该粗酶液使用『DEAE-Toyopearl650S』凝胶(东曹株式会社制造)进行离子交换层析(凝胶量380ml)。两个酶活性都吸附于『DEAE-Toyopearl 650S』凝胶，然后用NaCl浓度从0M至1M线性梯度进行洗脱，结果α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性成分大约在NaCl线性梯度中的约0.2M附近被洗脱出来，α-异麦芽糖基转移酶活性成分大约在NaCl线性梯度中的约0.3M附近被洗脱出来。将α-异麦芽糖基转移酶活性级分与α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性级分一个一个地回收，作为具有α-异麦芽糖基转移酶活性的部分纯化酶标准品、具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的部分纯化酶标准品分别回收，对这些酶标准品分别进行纯化。
实验例3-3 具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的多肽的纯化
将用实验例3-2方法得到的具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的部分纯化酶标准品对含有1M硫铵的10mM磷酸缓冲液(pH7.0)透析，该透析液经离心分离除去不溶物，使用『Sephacryl HR S-200』凝胶(Amersham pharmacia biotech株式会社制造)进行亲和层析(凝胶量为500ml)。酶活性成分吸附在『Sephacryl HR S-200』凝胶上，用硫铵浓度从1M降至0M的线性梯度进行洗脱，结果大约在硫铵的线性梯度浓度为约0.2M附近的级分检测到α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性。然后回收该酶活性级分，作为精制酶标准品。该纯化的各个阶段中的具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的酶标准品活性量、比活性、收率如表5所示。
表5
| 工序 | α-异麦芽糖基葡糖生成酶多肽活性量(单位) | α-异麦芽糖基葡糖生成酶多肽比活性(单位/mg蛋白) | 收率(％) |
| 培养上清 | 19.100 | 0.11 | 100 |
| 硫铵盐析后的透析液 | 8.210 | 0.48 | 43.0 |
| 离子交换柱洗脱液 | 6.890 | 4.18 | 36.1 |
| 亲和层析柱洗脱液 | 5.220 | 35.1 | 27.3 |
通过含有7.5％(w/v)聚丙烯酰胺的凝胶电泳检定纯化的α-异麦芽糖基葡糖生成酶多肽标准品的酶标准品的纯度，结果表明蛋白带为单一带，是纯度高的多肽。
实验例3-4 具有α-异麦芽糖基转移酶活性的多肽的部分纯化
将用实验例3-2方法得到的具有α-异麦芽糖基转移酶活性部分纯化酶标准品对含有1M硫铵的10mM磷酸缓冲液(pH7.0)透析，该透析液经离心分离除去不溶物，使用『Sephacryl HR S-200』凝胶(Amersham pharmacia biotech株式会社制造)进行亲和层析(凝胶量为500ml)。酶活性成分吸附在『Sephacryl HR S-200』凝胶上，用硫铵浓度从1M降至0M的线性梯度进行洗脱，结果大约在硫铵浓度为0M附近的级分检测到该酶活性。然后回收该酶活性级分，作为部分纯化酶标准品。该纯化的各个阶段中的具有α-异麦芽糖基转移酶活性的酶标准品的酶活性量、比活性、收率如表6所示。
表6
| 工序 | α-异麦芽糖基转移酶多肽活性量(单位) | α-异麦芽糖基转移酶多肽比活性(单位/mg蛋白) | 收率(％) |
| 培养上清 | 28,800 | 0.18 | 100 |
| 硫铵盐析后的透析液 | 15,700 | 0.97 | 54.5 |
| 离子交换柱洗脱液 | 7,130 | 4.01 | 24.8 |
| 亲和层析柱洗脱液 | 1,800 | 11.9 | 6.3 |
通过含有7.5％(w/v)聚丙烯酰胺的凝胶电泳检定纯化的具有α-异麦芽糖基转移酶活性的酶标准品的纯度，结果表明，除了主要的蛋白带以外，还看到3种小的蛋白带。
实验例4-1 对各种糖的作用
使用各种糖进行能否作为α-异麦芽糖基葡糖生成酶多肽的底物的试验。制备含有麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖、异麦芽糖、异麦芽三糖、6-α-葡糖基麦芽糖、异6-α-葡糖基麦芽糖、海藻糖、曲二糖、黑曲霉二糖、新海藻糖、纤维二糖、龙胆二糖、麦芽糖醇、麦芽三糖醇、乳糖、蔗糖、吡喃葡糖基蔗糖、セラギノ-ス、麦芽糖基葡糖苷、异麦芽糖基葡糖苷的溶液。
向这些溶液中分别按照每1g底物固态物各2单位加入用实验例1-3方法得到的来自圆孢芽孢杆菌C11的纯化α-异麦芽糖基葡糖生成酶多肽标准品，或用实验例2-3方法得到的来自圆孢芽孢杆菌N75的纯化α-异麦芽糖基葡糖生成酶多肽标准品，用实验例3-3方法得到来自球形节杆菌A19的精制α-异麦芽糖基葡糖生成酶多肽标准品，将底物浓度调整到2％(w/v)，然后于30℃、pH6.0(来自球形节杆菌A19的酶调到pH8.4)条件下使酶作用24小时。为了研究酶反应前后反应液中的糖，进行硅胶薄层层析(以下略为『TLC』)，作为展开溶剂使用正丁醇、吡啶、水混合液(容量比6∶4∶1)，作为薄层板使用『キ-ゼル胶60』(铝板，20×20cm，默克公司制造)，进行2次展开后，用硫酸-甲醇法对糖进行发色检测，确认酶对各个糖有无作用。结果如7所示。
表7
| 底物 | 酶作用 | ||
| C11株酶 | N75株酶 | A19株酶 | |
| 麦芽糖 | + | + | + |
| 麦芽三糖 | ++ | ++ | ++ |
| 麦芽四糖 | +++ | +++ | +++ |
| 麦芽五糖 | +++ | +++ | +++ |
| 麦芽六糖 | +++ | +++ | +++ |
| 麦芽七糖 | +++ | +++ | +++ |
| 异麦芽糖 | - | - | - |
| 异麦芽三糖 | - | - | - |
| 6-α-葡糖基麦芽糖 | - | - | - |
| 异6-α-葡糖基麦芽糖 | ++ | ++ | ++ |
| 海藻糖 | - | - | - |
| 曲二糖 | + | + | + |
| 黑曲霉二糖 | + | + | + |
| 新海藻糖 | + | + | + |
| 纤维二糖 | - | - | - |
| 龙胆二糖 | - | - | - |
| 麦芽糖醇 | - | - | - |
| 麦芽三糖醇 | + | + | + |
| 乳糖 | - | - | - |
| 蔗糖 | - | - | - |
| 吡喃葡糖基蔗糖 | + | + | + |
| セラギノ-ス | - | - | - |
| 麦芽糖基葡糖苷 | ++ | ++ | ++ |
| 异麦芽糖基葡糖苷 | - | - | - |
注)在酶反应前后，
-表示没有变化，
+表示底物的点稍有减少，确认有其他产物，
++表示底物的点减少很多，确认有其他产物，
+++表示底物的点几乎消失，确认有其他产物，
就象表7所表明的那样，具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的多肽在试验的各种糖中，对葡萄糖聚合度3以上，非还原末端具有麦芽糖结构的糖作用最好。而葡萄糖聚合度为2的糖中，对麦芽糖、麴二糖、黑曲糖、新海藻糖、麦芽三糖醇、6-α-葡糖基麦芽糖稍有作用。
实验例4-2来自麦芽寡糖的产物
向最终固态物浓度为1％的麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖或麦芽五糖的各个水溶液中分别加入用实验例1-3方法得到的具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的多肽，加入的量分别为每1g固态物2单位(麦芽糖和麦芽三糖水溶液的情况)、0.2单位(麦芽四糖水溶液的情况)、0.1单位(麦芽五糖水溶液的情况)，然后于35℃、pH6.0条件下作用8小时，于100℃下保持10分钟，停止反应。用HPLC对该酶反应液的糖组成进行测定。HPLC使用『YMC Pack ODS-AQ303』柱(株式会社ワイエムシ-制造)，在柱温40℃、洗脱液水的流速为0.5ml/min的条件下进行，用差示折射计『RI-8012』(东曹株式会社制造)进行检测。检测结果如表8所示。
表8
| 反应中生成的糖的种类 | 底物麦芽糖 | 底物麦芽三糖 | 底物麦芽四糖 | 底物麦芽五糖 |
| 葡萄糖 | 8.5 | 0.1 | 0.0 | 0.0 |
| 麦芽糖 | 78.0 | 17.9 | 0.3 | 0.0 |
| 麦芽三糖 | 0.8 | 45.3 | 22.7 | 1.9 |
| 麦芽四糖 | 0.0 | 1.8 | 35.1 | 19.2 |
| 麦芽五糖 | 0.0 | 0.0 | 3.5 | 34.4 |
| 麦芽六糖 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 4.6 |
| 异麦芽糖 | 0.5 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
| 葡糖基麦芽糖 | 8.2 | 1.2 | 0.0 | 0.0 |
| 葡糖基麦芽三糖 | 2.4 | 31.5 | 6.8 | 0.0 |
| X | 0.0 | 2.1 | 30.0 | 11.4 |
| Y | 0.0 | 0.0 | 1.4 | 26.8 |
| Z | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 1.7 |
| 其他 | 0.6 | 0.1 | 0.2 | 0.0 |
表中
葡糖基麦芽糖是α-异麦芽糖基葡萄糖(别名：62-O-α-葡糖基麦芽糖、6-α-葡糖基麦芽糖)
葡糖基麦芽三糖是α-异麦芽糖基麦芽糖(别名：63-O-α-葡糖基麦芽三糖)，
X为本实验例已经阐明结构的α-异麦牙糖基麦芽三糖(别名：64-O-α-葡糖基麦芽四糖)
Y为本实验例已经阐明结构的α-异麦芽糖基麦芽四糖(别名：65-O-α-葡糖基麦芽五糖)
Z为尚未鉴定的糖。
就象表8的结果所表明的那样，使具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的多肽作用的结果表明，由底物麦芽糖主要生成葡萄糖和α-异麦芽糖基葡萄糖(别名：62-O-α-葡糖基麦芽糖)，由底物麦芽三糖主要生成麦芽糖和α-异麦芽糖基麦芽糖(别名：63-O-α-葡糖基麦芽三糖)，此外生成少量的葡萄糖、麦芽四糖、α-异麦芽糖基葡萄糖(别名：62-O-α-葡糖基麦芽糖)以及产物X。由底物麦芽四糖主要生成麦芽三糖和产物X，少量的麦芽糖、麦芽五糖、α-异麦芽糖基麦芽糖(别名：63-O-α-葡糖基麦芽三糖)以及产物Y。由底物麦芽五糖主要生成麦芽四糖和产物Y，少量的麦芽三糖、麦芽六糖、产物X和产物Z。
对由底物麦芽四糖生成的主要产物-产物X、以及由底物麦芽五糖生成的主要产物-产物Y进行分离纯化。通过使用分级用HPLC柱『YMC Pack ODS-A R355-15S-15 12A』柱(株式会社ワイエムシイ制造)对产物X、Y进行纯化分离，从来自上述麦芽四糖的反应物分离出纯度99.9％以上的产物X标准品，固态物回收率约8.3％，从来自上述麦芽五糖的反应物分离出纯度为99.9％以上的产物Y，固态物回收率约11.5％。
就得到的产物X和产物Y，按照常规方法进行甲基化和NMR分析。甲基化的分析结果归纳在表9中。而有关NMR分析的结果，图1和图2分别给出了产物X和产物Y的1H-NMR光谱图。另外图3和图4分别给出了产物X和产物Y的13C-NMR谱，这些结果归纳在表10中。
表9
| 分析甲基化物的种类 | 组成比 | |
| 产物X | 产物Y | |
| 2，3，4-三甲基化物 | 1.00 | 1.00 |
| 2，3，6-三甲基化物 | 3.05 | 3.98 |
| 2，3，4，6-四甲基化物 | 0.82 | 0.85 |
从这些结果判明麦芽四糖经具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的多肽作用生成的产物X是葡萄糖基α结合在麦芽四糖的非还原末端葡萄糖的6位羟基的5糖，是结构式1表示的α-异麦芽糖基麦芽三糖(别名：64-O-α-葡糖基麦芽四糖)。
结构式1：
α-D-Glcp-(1→6)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-
(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-D-Glcp
而麦芽五糖的产物Y是葡萄糖基α结合在麦芽五糖的非还原末端葡萄糖的6位羟基的6糖，是结构式2表示的α-异麦芽糖基麦芽四糖(别名：65-O-α-葡糖基麦芽五糖)。
结构式2：
α-D-Glcp-(1→6)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-
(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-D-
Glcp
表10
| NMR化学位移值(ppm) | |||
| 葡萄糖号 | 碳号 | 产物X | 产物Y |
| a | 1a | 100.8 | 100.8 |
| 2a | 74.2 | 74.2 | |
| 3a | 75.8 | 75.7 | |
| 4a | 72.2 | 72.2 | |
| 5a | 74.5 | 74.5 | |
| 6a | 63.2 | 63.1 | |
| b | 1b | 102.6 | 102.6 |
| 2b | 74.2 | 74.2 | |
| 3b | 75.8 | 75.7 | |
| 4b | 72.1 | 72.1 | |
| 5b | 74.0 | 74.0 | |
| 6b | 68.6 | 68.6 | |
| c | 1c | 102.3 | 102.3 |
| 2c | 74.2 | 74.2 | |
| 3c | 76.0 | 76.0 | |
| 4c | 79.6 | 79.5 | |
| 5c | 73.9 | 73.9 | |
| 6c | 63.2 | 63.1 | |
| d | 1d | 102.2 | 102.3 |
| 2d | 74.0(α)，74.4(β) | 74.2 | |
| 3d | 76.0 | 76.0 | |
| 4d | 79.8 | 79.5 | |
| 5d | 73.9 | 73.9 | |
| 6d | 63.2 | 63.1 | |
| e | 1e | 94.6(α)，98.5(β) | 102.1 |
| 2e | 74.2(α)，76.7(β) | 74.0(α)，74.4(β) | |
| 3e | 75.9(α)，78.9(β) | 76.0 | |
| 4e | 79.6(α)，79.4(β) | 79.8 | |
| 5e | 72.6(α)，77.2(β) | 73.9 | |
| 6e | 63.4(α)，63.4(β) | 63.1 | |
| f | 1f | 94.6(α)，98.5(β) | |
| 2f | 74.2(α)，76.7(β) | ||
| 3f | 76.0(α)，78.9(β) | ||
| 4f | 79.6(α)，79.5(β) | ||
| 5f | 72.6(α)，77.2(β) | ||
| 6f | 63.3(α)，63.3(β) | ||
从以上实验结果可以如下面那样判断具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的多肽对麦芽寡糖的作用。
1)具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的多肽作用于作为底物含有非还原末端的结合方式为α-1，4糖苷键的葡萄糖聚合度在2以上的糖，催化具有将其非还原末端的葡萄糖残基转移到其他分子的非还原末端的葡萄糖残基的6位上作用的分子间的6-葡萄糖基转移，生成在非还原末端含有6-O-α-葡糖基的葡萄糖聚合度增加1个的α-异麦芽糖基葡萄糖(别名：6-O-α-葡糖基麦芽寡糖)和葡萄糖聚合度减少1个的麦芽寡糖。
2)具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的多肽也稍微能催化4-葡萄糖基转移，由麦芽寡糖生成很少量葡萄糖聚合度增加1个的麦芽寡糖和葡萄糖聚合度减少1个的麦芽寡糖。
实验例4-3 还原力生成试验
为了研究具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的多肽是否具有还原力生成能力，进行了以下试验。向最终浓度为1％的麦芽四糖水溶液中按照1g底物固态物0.25单位的比例加入用实验例1-3方法得到的来自圆孢芽孢杆菌C11的纯化α-异麦芽糖基葡糖生成酶多肽标准品、或用实验例2-3方法得到的来自圆孢芽孢杆菌N75的纯化α-异麦芽糖基葡糖生成酶多肽标准品、用实验例3-3方法得到的来自球形节杆菌A19的纯化α-异麦芽糖基葡糖生成酶多肽标准品，然后于35℃、pH6.0(来自球形节杆菌A19的酶的情况下，pH8.4)条件下使酶作用，随时采集一部分反应液，于100℃下保持10分钟之后停止反应，对反应液的还原力进行测定。即，用Somogyi-Nelson法测定该酶反应前后溶液的还原糖量，另外同时用蒽酮硫酸法测定该酶反应前后溶液的全糖量，还原力产率(％)用以下计算式算出。
计算式：
结果如表11所示。
表11
| 反应时间(时间) | 还原力产率(％) | ||
| C11株酶 | N75株酶 | A19株酶 | |
| 0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
| 1 | 0.1 | 0.1 | 0.0 |
| 2 | 0.0 | 0.0 | 0.1 |
| 4 | 0.1 | 0.0 | 0.0 |
| 8 | 0.0 | 0.1 | 0.1 |
就象表11结果所表明的那样，若使具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的多肽作用于底物麦芽四糖，没有增加反应物的还原力，该具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性多肽没有表现出水解作用，或生成不能检测程度的很少量产物。
实验例4-4 分子量
用实验例1-3方法纯化得到的来自圆孢芽孢杆菌C11的具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性多肽、或用实验例2-3方法纯化得到的来自圆孢芽孢杆菌N75的具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性多肽、用实验例3-3方法纯化得到的来自球形节杆菌A19的具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性多肽经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(凝胶浓度为7.5％(w/v))，与同时电泳的分子量标准(日本バイオ·ラツド·ラボラトリ-ズ(株)制造)进行比较，测定该酶多肽的分子量。来自C11的该多肽的分子量约为137,000±20,000道尔顿，来自N75的该多肽的分子量约为136,000±20,000道尔顿，来自A19的该多肽的分子量约为94,000±20,000道尔顿。
实验例4-5 等电点
用实验例1-3方法纯化得到的来自圆孢芽孢杆菌C11的具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性多肽、或用实验例2-3方法纯化得到的来自圆孢芽孢杆菌N75的具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性多肽、用实验例3-3方法纯化得到的来自球形节杆菌A19的具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性多肽经含有2％(w/v)两性电解质(Amershampharmacia biotech(株)制造)的等电点聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，对电泳后的蛋白带以及凝胶的pH进行测定，求出该酶多肽的等电点。测定的结果为：来自C11的该多肽的等电点pl约为5.2±0.5，来自N75的该多肽的等电点pl约为7.3±0.5，来自A19的该多肽的等电点pl约为4.3±0.5。
实验例4-6 作用温度和pH
在各种温度、pH条件下，根据实验例1-1给出的α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的测定方法研究温度和pH对α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的影响。关于温度的影响是在没有Ca2+存在下和有1mMCa2+存在下测定的。这些结果表示在图5[温度的影响(来自C11多肽)]、图6[温度的影响(来自N75多肽)]、图7[温度的影响(来自A19多肽)]、图8[pH的影响(来自C11多肽)]、图9[pH的影响(来自N75多肽)]、图10[pH的影响(来自A19多肽)]中。结果表明，来自圆孢芽孢杆菌C11的具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的酶标准品的最适温度在pH6.0、反应60分钟条件下约为45℃(没有Ca2+存在)或约为50℃(有1mM Ca2+存在)，其最适pH在35℃、反应60分钟条件下约为6.0，来自圆孢芽孢杆菌N75的具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的多肽的最适温度在pH6.0、反应60分钟条件下约为50℃(没有Ca2+存在)或约为55℃(有1mM Ca2+存在)，其最适pH在35℃、反应60分钟条件下，约为6.0，来自球形节杆菌A19的具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的多肽的最适温度在pH8.4、反应60分钟条件下约为60℃(没有Ca2+存在)或约为65℃(有1mM Ca2+存在)，其最适pH在35℃、反应60分钟下约为8.4。
实验例4-7 稳定性
具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的多肽的温度稳定性是通过将含有该多肽的溶液[20mM醋酸缓冲液、pH6.0(来自A19的多肽，的情况下，20mM甘氨酸-NaOH缓冲液，pH8.0)]于没有Ca2+存在或有1mM Ca2+存在下的各个温度保持60分钟，水冷却后通过测定残存α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性求出的。而pH稳定性是将具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的多肽于各个pH的50mM缓冲液中于4℃下保持24小时后，将pH调到6.0(来自A19的多肽的情况下，pH8.0)，测定残存的酶活性求出的。这些结果分别如图11[温度稳定性(来自C11多肽)]、图12[温度稳定性(来自N75多肽)]、图13[温度稳定性(来自A19多肽)]、图14[pH稳定性(来自C11多肽)]、图15[pH稳定性(来自N75多肽)]、图16[pH稳定性(来自A19多肽)]所示。来自圆孢芽孢杆菌C11的具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性多肽的温度稳定性约在低于40℃(没有Ca2+存在)或约在低于45℃(有1mM Ca2+存在)，该多肽的pH稳定性在约5.0至10.0范围，来自圆孢芽孢杆菌N75的具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性多肽的温度稳定性约在低于45℃(没有Ca2+存在)，或约在低于50℃(有1mMCa2+存在)，该多肽的pH稳定性在约5.0至9.0范围，来自球形节杆菌A19的具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性多肽的温度稳定性约在低于55℃(没有Ca2+存在)，或约在低于60℃(有1mM Ca2+存在)，该多肽的pH稳定性在约5.0至9.0范围。
实验例5 部分氨基酸序列
实验例5-1 N末端氨基酸序列
对用实验例1-3方法纯化得到的来自C11株的具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的多肽、用实验例2-3方法纯化得到的来自N75株的具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的多肽、用实验例3-3方法纯化得到的来自A19株的具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的多肽用蛋白测序仪『型号47.3A』(Applyed biosystems公司生产)对他们的N末端氨基酸序列进行分析，结果来自C11株的具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的多肽具有序列表中序列号7所示的氨基酸序列，来自N75株的具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的多肽具有序列表中序列号19所示的氨基酸序列，来自A19株的具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的多肽具有序列表中序列号26所示的氨基酸序列。
实验例5-2 来自C11株多肽的内部氨基酸序列
将用实验例1-3方法纯化得到的具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的多肽的一部分对10mM Tris-HCl缓冲液(pH9.0)透析后，用同一缓冲液将得到的透析液稀释到浓度为1mg/ml。通过向该样品液(1ml)加入10μg的胰蛋白酶(和光纯药株式会社销售)，于30℃下反应22小时进行肽化。为了分离生成的肽，进行反相HPLC。即，使用『microbondpack C18柱』(直径2.1mm×长150mm、Waters公司制造)，流速为0.9ml/分，于室温下，在从0.1％三氟乙酸-8％乙腈溶液至0.1％三氟乙酸-40％乙腈溶液的120分钟的线性梯度的条件下对肽进行柱层析分级。从柱子上洗脱下来的肽通过测定在波长210nm的吸光度进行检测。分别收集与其他肽充分分离的10个肽[P8(保留时间约8分钟)、P20(保留时间约20分钟)、P56(保留时间约56分钟)、P60(保留时间约60分钟)、P62(保留时间约62分钟)、P64(保留时间约64分钟)、P75(保留时间约75分钟)、P82(保留时间约82分钟)、P88(保留时间约88分钟)、P99(保留时间约99分钟)]，将各含多肽级分分别进行真空干燥之后，溶解于200μl的0.1％三氟乙酸-50％乙腈溶液中后，将各个肽分别上样到蛋白质测序仪，对各自氨基酸序列进行分析，得到了序列表中序列号8至17所示的氨基酸序列。
实验例5-3 来自N75株多肽的内部氨基酸序列
将用实验例2-3方法纯化得到的具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的多肽的一部分对10mM Tris-HCl缓冲液(pH9.0)进行透析后，用同一缓冲液将得到的透析液稀释到浓度为约1mg/ml。通过向该样品液(1ml)加入20μg的赖氨酰肽链内切酶(和光纯药株式会社销售)，于30℃下反应24小时进行肽化。为了分离生成的肽，进行反相HPLC。即使用『microbondpack C18柱』(直径3.9mm×长150mm、Warters公司制造)，流速为0.9ml/分，于室温下，在从0.1％三氟乙酸-8％乙腈溶液至0.1％三氟乙酸-36％乙腈溶液的120分钟的线性梯度的条件下对肽进行柱层析分级。从柱子上洗脱下来的肽通过测定在波长210nm的吸光度进行检测。分别收集与其他肽充分分离的5个肽[PN 47(保留时间约47分钟)、PN 59(保留时间约59分钟)、PN 67(保留时间约67分钟)、PN 87(保留时间约87分钟)、PN 89(保留时间约89分钟)]，将各含有肽的级分分别进行真空干燥之后，溶解于200μl的0.1％三氟乙酸-50％乙腈溶液中后将各个肽分别上样到蛋白质测序仪，对各自氨基酸序列进行分析，得到了序列表中序列号20至24所示的氨基酸序列。
实验例5-4 来自A19株多肽的内部氨基酸序列
将用实验例3-3方法纯化得到的具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的多肽的一部分对10mM Tris-HCl缓冲液(pH9.0)进行透析后，用同一缓冲液将得到的透析液稀释到浓度为约1mg/ml。通过向该样品液(1ml)加入20μg的赖氨酰肽链内切酶(和光纯药株式会社销售)，于30℃下反应24小时进行肽化。为了分离生成的肽，进行反相HPLC。即使用『microbondpack C18柱』(直径2.1×长150mm、Waters公司制造)，流速为0.9ml/分，于室温下，在从0.1％三氟乙酸-16％乙腈溶液至0.1％三氟乙酸-36％乙腈溶液的120分钟的线性梯度的条件下对肽进行柱层析分级。从柱子上洗脱下来的肽通过测定在波长210nm的吸光度进行检测。分别收集与其他肽充分分离的5个肽[PA39(保留时间约39分钟)、PA 81(保留时间约81分钟)、PA 86(保留时间约86分钟)、PA 92(保留时间约92分钟)、PN 104(保留时间约104分钟)]，将各含有肽的级分分别进行真空干燥之后，溶解于200μl的0.1％三氟乙酸-50％乙腈溶液后，将各个肽分别上样到蛋白质测序仪，分析各自的氨基酸序列，得到了序列表中序列号27至31所示的氨基酸序列。
实验例6 含有编码来自圆孢芽孢杆菌C11菌株多肽的DNA的重组DNA和转化体的制备
实验例6-1 染色体DNA的制备
将含有淀粉部分分解物『パインデツクス#4』2.0％(w/v)、酵母提取物1.0％(w/v)、磷酸氢二钾0.1％(w/v)、磷酸氢二钠·12水盐0.06％(w/v)、硫酸镁·7水盐0.05％(w/v)以及水构成的培养基100ml装入到500ml容量的三角烧瓶中，用高压灭菌锅于121℃下灭菌20分钟，冷却之后，接种圆孢芽孢杆菌C11菌株，于27℃、230rpm下进行24小时旋转振荡培养。然后将经离心分离从培养物中收集的菌体悬浮于TES缓冲液(pH8.0)，加入0.05％(w/v)溶菌酶，于37℃温育30分钟。于-80℃下对该处理物冷冻1小时后，加入TSS缓冲液(pH9.0)后，加温至60℃，加入TES缓冲液/酚混合液，于冰水中一边冷却，一边激烈振荡5分钟，经离心分离收集上清。向该上清加入2倍上清容积的冷乙醇，回收沉淀的粗染色体DNA，溶解于SSC缓冲液(pH7.1)后，分别加入核酸酶和蛋白酶7.5μg和125μg，于37℃温育1小时使其反应。向反应物中加入氯仿/异戊醇混合液，对染色体DNA进行萃取，加入冷乙醇，收集含有生成染色体DNA的沉淀。将这样得到的纯化染色体DNA溶解于SSC缓冲液(pH7.1)，终浓度约为1mg/ml，将该溶液于-80℃下冷冻。
实验例6-2转化体BGC2的制备
取1ml实验例6-1制备的纯化染色体DNA溶液，加入约35单位的限制酶Sau 3AI，于37℃反应20分钟，对染色体DNA进行部分分解后，通过蔗糖密度梯度超离心法收集由约2,000至6,000碱基对构成的DNA片段。另一方面，通过常规方法使限制酶Bam HI作用于质粒载体『Bluescript II SK(+)』(Stratagene·cloning system公司制造)，完全切断后，使用该被切断的质粒载体0.5μg和先前得到的DNA片段约5μg，用『DNA连接试剂盒』(宝酒造(株)制造)按照附带的说明书操作，进行连接，用得到的重组DNA通过通常的感受态细胞法对100μl感受态细胞『EpicurianColiXL2-Blue』(Stratagene·cloning system公司制造)进行转化，制作基因文库。将得到的作为基因文库的转化体接种于按照常规方法制备的含有胰蛋白酶10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠5g/L、氨苄青霉素钠盐100mg/L以及5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷50mg/L的琼脂平板培养基(pH7.0)，于37℃下培养24小时后，将培养基上形成的白色菌落约5,000个固定于尼龙膜『Hybond-N+』上。另一方面，根据实验例5-2方法中阐明的序列表中序列号16所示氨基酸序列第4到第11位的氨基酸序列化学合成用5’-GGNTTYATGAAYTTYAGRTGGGA-3’表示的碱基序列的寡核苷酸，依据常规方法用[γ-32P]ATP和T4聚核苷酸激酶进行同位素标记，得到作为探针1的合成DNA。从在先前得到的固定于尼龙膜上的菌落中，表现出与探针1显著会合的菌落中使用通常的菌落杂交法选择2种转化体。根据常规方法，从这2种转化体提取重组DNA，另一方面，根据序列表中序列号17所示氨基酸序列第4到第11位的氨基酸序列化学合成用5’-GAYGCNTGGATGTTYGGNGAYTGG-3’表示的碱基序列的探针2，同样进行同位素标记后，使用通常的Sorthern杂交，选择表现出显著会合的重组DNA，将该转化体命名为『BGC2』。
实验例6-3 DNA序列的解析
将用实验例6-2方法得到转化体『BGC2』按照常规方法接种于含有氨苄青霉素钠盐100μg/ml的L-肉汤(broth)培养基(pH7.0)，于37℃下进行24小时旋转振荡培养。培养结束后，通过离心分离从培养物中收集菌体，用通常的碱-SDS法提取重组DNA。用通常的双脱氧法对该重组DNA的碱基序列进行分析，表明该重组DNA是来自圆孢芽孢杆菌C11菌株，链长5294碱基对的含有序列表中序列号18所示碱基序列的DNA。就象图17所表示的那样，在该重组DNA中，该DNA连接在限制酶Xba I识别部位的下游。另外，由该碱基序列推定的氨基酸序列是并记序列号18中的序列，该氨基酸序列与用实验例5-1的方法确认的本发明的多肽的N末端氨基酸序列和用实验例5-2方法阐明的中间部分氨基酸序列、序列表中序列号7和序列号8至17所示氨基酸序列进行比较时，表明序列表中序列号7所示氨基酸序列与并记在序列号18的氨基酸序列第36至44位的氨基酸序列完全一致。另外序列表中序列号8、9、10、11、12、13、14、15、16和17所示氨基酸序列分别与并记在序列表中序列号18中的第823至832、第576至589、第874至904、第1117至1141、第657至670、第367至399、第970至993、第938至953、第279至295以及第632至651位的氨基酸序列完全一致。另外由序列表中序列号18中第4783至4785位的碱基序列编码的翻译终止密码子(5’-TAA-3’)可以判明本发明的多肽的C末端是紧靠其前面的谷氨酰胺(序列表中序列18号中第1284位的氨基酸)。
这些结果表示本发明的多肽具有序列表中序列号1所示氨基酸序列，本发明的多肽是由来自圆孢芽孢杆菌C11菌株的序列表中序列号4所示碱基序列的DNA编码的。另外并记在序列表中序列号18中的氨基酸序列的第1至35位的氨基酸序列被推定为该多肽的分泌信号肽序列。从这些事实可以判明，该多肽分泌前的前体肽是由并记在序列表中序列号18中的氨基酸序列构成，该氨基酸序列由序列表中序列号18所示碱基序列编码。所以将确认了该碱基序列的重组DNA命名为『p BGC2』。
实验例7 含有编码来自圆孢芽孢杆菌N75菌株的多肽的DNA的重组DNA和转化体的制备
实验例7-1 染色体DNA的制备
将含有淀粉部分分解物『パインデツクス#4』2.0％(w/v)、酵母提取物1.0％(w/v)、磷酸氢二钾0.1％(w/v)、磷酸二氢钠·12水盐0.06％(w/v)、硫酸镁·7水盐0.05％(w/v)以及水构成的培养基100ml装入到500ml容量的三角烧瓶中，用高压灭菌锅于121℃下灭菌20分钟，冷却之后，接种圆孢芽孢杆菌N75菌株，于27℃、230rpm下进行24小时旋转振荡培养。然后将经离心分离从培养物中收集的菌体悬浮于TES缓冲液(pH8.0)，加入0.05％(w/v)溶菌酶，于37℃温育30分钟。于-80℃下对该处理物冷冻1小时后，加入TSS缓冲液(pH9.0)后，加温至60℃，加入TES缓冲液/酚混合液，于冰水中一边冷却，一边激烈振荡5分钟，经离心分离收集上清。向该上清加入2倍上清容积的冷乙醇，回收沉淀的粗染色体DNA，溶解于SSC缓冲液(pH7.1)后，分别加入核酸酶和蛋白酶7.5μg和125μg，于37℃温育1小时，使其反应。向反应物中加入氯仿/异戊醇，对染色体DNA进行萃取，加入冷乙醇，收集含有生成的染色体DNA的沉淀。将这样得到的纯化染色体DNA溶解于SSC缓冲液(pH7.1)，终浓度约为1mg/ml，将该溶液于-80℃下冷冻。
实验例7-2 转化体BGN2的制备
取1ml实验例7-1制备的纯化染色体DNA溶液，加入约200单位的限制酶Kpn I，于37℃反应16小时，对染色体DNA进行分解后，通过蔗糖密度梯度超离心法收集由约3,000至7,000碱基对构成的DNA片段。另一方面，通过常规方法使限制酶Kpn I作用于质粒载体『Bluescript II SK(+)』(Stratagene·cloning system公司制造)，完全切断后，使用该被切断的质粒载体0.5μg和先前得到的DNA片段约5μg，用『DNA连接试剂盒』(宝酒造(株)制造)按照附带的说明书操作，进行连接，用得到的重组DNA通过通常的感受态细胞法对感受态细胞100μl『Epicurian Coli XL2-Blue』(Stratagene·cloning system公司制造)进行转化，制作基因文库。将得到的作为基因文库的转化体接种于按照常规方法制备的含有胰蛋白酶10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠5g/L、氨苄青霉素钠盐100mg/L以及5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷50mg/L的琼脂平板培养基(pH7.0)，于37℃下培养24小时后，将培养基上形成的白色菌落约2,500个固定于尼龙膜『Hybond-N+』(Amersham公司制造)。另一方面，根据实验例5-3方法中阐明的序列表中序列号24所示氨基酸序列第4到第11位的氨基酸序列，化学合成用5’-GAYGCNTGGATGTTYGGNGAYTGG-3’表示的碱基序列的寡核苷酸，依据常规方法用[γ-32P]ATP和T4聚核苷酸激酶进行同位素标记，得到作为探针1的合成DNA。从在先前得到的固定于尼龙膜上的菌落中，表现出与探针1显著会合的菌落中使用通常的菌落杂交法选择3种转化体。根据常规方法，从这3种转化体提取重组DNA，另一方面，根据序列表中序列号23所示氨基酸序列第14到第21位的氨基酸序列化学合成用5’-GTNAAYCARAAYCAYTGGTTYTA-3’表示的碱基序列的探针2，同样进行同位素标记后，使用通常的Sorthern杂交，选择表现出显著会合的重组DNA，将该转化体命名为『BGN2』。
实验例7-3 DNA序列的解析
将用实验例7-2方法得到的转化体『BGN2』按照常规方法接种于含有氨苄青霉素钠盐100μg/ml的L-肉汤培养基(pH7.0)，于37℃下进行24小时旋转振荡培养。培养结束后，通过离心分离从培养物中收集菌体，用通常的碱-SDS法提取重组DNA。用通常的双脱氧法对该重组DNA的碱基序列进行分析，结果该重组DNA是来自圆孢芽孢杆菌N75菌株，链长4991碱基对的含有序列表中序列号25所示碱基序列的DNA。就象图18所表示的那样，在该重组DNA中，该DNA连接在限制酶Kpn I识别部位的下游。另外，由该碱基序列推定的氨基酸序列是并记在该序列号25中的序列，该氨基酸序列与用实验例5-1的方法确认的本发明的多肽的N末端氨基酸序列和用实验例5-3方法阐明的作为中间部分氨基酸序列的序列表中序列号19和序列号20至24所示氨基酸序列进行比较时，表明序列表中序列号19所示氨基酸序列与并记在该序列号25中的氨基酸序列第36至43位的氨基酸序列完全一致。另外序列表中序列号20、21、22、23和24所示氨基酸序列分别与并记在序列表中序列号25中的氨基酸序列的第907至925、第367至386、第1034至1058、第996至1020、以及第632至642位的氨基酸序列完全一致。另外由序列表中序列号25中第4294至4296位的碱基序列编码翻译终止密码子(5’-TAA-3’)可以判明本发明的多肽的C末端是紧靠其前面的谷氨酰胺(序列表中序列25中第1286位的氨基酸)。
这些结果表示本发明的多肽具有序列表中序列号2所示氨基酸序列，本发明的多肽是由来自圆孢芽孢杆菌N75菌株的序列表中序列号5所示的碱基序列的DNA编码的。另外序列表中与序列号25并记的氨基酸序列的第1至35位的氨基酸序列被推定为该多肽的分泌信号肽序列。从这些事实可以判明，该多肽分泌前的前体肽是由序列表中与序列号25并记的氨基酸序列构成，该氨基酸序列由序列表中序列号25所示碱基序列编码。所以将确认了该碱基序列的重组DNA命名为『p BGN2』。
实验例8 含有编码来自球形节杆菌A19的多肽的DNA的重组DNA和转化体的制备
实验例8-1 染色体DNA的制备
将含有淀粉部分分解物『パインデツクス#4』 2.0％(w/v)、酵母提取物1.0％(w/v)、磷酸氢二钾0.1％(w/v)、磷酸二氢钠·12水盐0.06％(w/v)、硫酸镁·7水盐0.05％(w/v)以及水构成的培养基100ml装入到500ml容量的三角烧瓶中，用高压灭菌锅于121℃下灭菌20分钟，冷却之后，接种球形节杆菌A19，于27℃、230rpm下进行24小时旋转振荡培养。然后将经离心分离从培养物中收集的菌体悬浮于TES缓冲液(pH8.0)，加入0.05％(w/v)溶菌酶，于37℃温育30分钟。于-80℃下对该处理物冷冻1小时后，加入TSS缓冲液(pH9.0)后，加温至60℃，加入TES缓冲液/酚混合液，于冰水中一边冷却，一边激烈振荡5分钟，经离心分离收集上清。向该上清加入2倍上清容积的冷乙醇，回收沉淀的粗染色体DNA，溶解于SSC缓冲液(pH7.1)后，分别加入核酸酶和蛋白酶7.5μg和125μg，于37℃温育1小时使其反应。向反应物中加入氯仿/异戊醇混合液，对染色体DNA进行萃取，加入冷乙醇，收集含有生成染色体DNA的沉淀。将这样得到的纯化染色体DNA溶解于SSC缓冲液(pH7.1)，终浓度约为1mg/ml，将该溶液于-80℃下冷冻。
实验例8-2 转化体AGA1的制备
取1ml实验例8-1制备的纯化染色体DNA溶液，加入约10单位的限制酶Kpn I，于37℃反应30分钟，对染色体DNA进行部分分解后，通过蔗糖密度梯度超离心收集由约4,000至8,000碱基对构成的DNA片段。另一方面，通过常规方法使限制酶Kpn I作用于质粒载体『Bluescript II SK(+)』(Stratagene·cloning system公司制造)，完全切断后，使用该切断的质粒载体0.5μg和先前得到的DNA片段约5μg，用『DNA连接试剂盒』(宝酒造(株)制造)按照附带的说明书操作，进行连接，用得到的重组DNA通过通常的感受态细胞法对感受态细胞『Epicurian Coli XL2-Blue』(Stratagene·cloning system公司制造)100μl进行转化，制作基因文库。将得到的作为基因文库的转化体接种于按照常规方法制备的含有胰蛋白酶10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠5g/L、氨苄青霉素钠盐100mg/L以及5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷50mg/L的琼脂平板培养基(pH7.0)，于37℃下培养24小时后，将培养基上形成的白色菌落约6,000个固定于尼龙膜『Hybond-N+』(Amersham公司制造)。另一方面，根据实验例5-4方法中阐明的序列表中序列号27所示氨基酸序列第1到第11位的氨基酸序列化学合成用5’-CARGARTGGAAYYTNACNGGNGAYCCNTGGAC-3’所示的碱基序列的寡核苷酸，依据常规方法用[γ-32P]ATP和T4聚核苷酸激酶进行同位素标记，得到作为探针1的合成DNA。从在先前得到的固定于尼龙膜上的菌落中表现出与探针1显著会合的菌落中使用通常的菌落杂交法选择3种转化体。根据常规方法，从这3种转化体提取重组DNA，另一方面，根据序列表中序列号29所示氨基酸序列第6到第16位的氨基酸序列，化学合成用5’-TGGACNCARCCNGARGCNGGNGCNGTNTTGCA-3’表示的碱基序列的探针2，同样进行同位素标记后，使用通常的Sorthern杂交，选择表现出显著会合的重组DNA，将该转化体命名为『AGA1』。
实验例8-3 DNA序列的解析
将用实验例8-2方法得到转化体『AGA1』按照常规方法接种于含有氨苄青霉素钠盐100μg/ml的L-肉汤培养基(pH7.0)，于37℃下进行24小时旋转振荡培养。培养结束后，经离心分离从培养物采集菌体用通常的碱-SDS法提取重组DNA。用通常的双脱氧法对该重组DNA的碱基序列进行分析，表明该重组DNA是来自球形节杆菌A19株，链长5811碱基对的含有序列表中序列号32所示碱基序列的DNA。就象图19所表示的那样，在该重组DNA中，该DNA连接在限制酶Kpn I识别部位的下游。另外，由该碱基序列推定的氨基酸序列是并记在该序列号32中的序列，该氨基酸序列与用实验例5-1的方法确认的本发明的多肽的N末端氨基酸序列和用实验例5-4方法阐明的中间部分氨基酸序列的序列表中序列号26以及序列号27至31所示氨基酸该序列进行比较时，表明序列表中序列号26所示氨基酸序列与并记在序列号32中的氨基酸序列第37至49位的氨基酸序列完全一致。另外序列表中序列号27、28、29、30和31所示氨基酸序列分别与并记在序列表中的序列号32中的第227至239、第345至374、第401至430、第89至115、以及第641至667位的氨基酸序列完全一致。另外由序列表中序列号32中第4550至4552位的碱基序列编码的翻译终止密码子(5’-TGA-3’)可以判明本发明的多肽的C末端是紧靠其前面的苯丙氨酸(序列表中序列号32中第965位氨基酸)。
这些结果表示本发明的多肽具有序列表中序列号3所示氨基酸序列，本发明的多肽是由来自球形节杆菌A19株(FERM BP-7590)的序列表中序列号6所示的碱基序列的DNA编码的。另外并记在序列表的序列号32中的氨基酸序列的第1至36位的氨基酸序列被推定为该多肽的分泌信号肽序列。从这些事实可以判明，该多肽分泌前的前体肽是由并记在序列表的序列号32中的氨基酸序列构成，该氨基酸序列由序列表中序列号32所示碱基序列编码。所以将确认了该碱基序列的重组DNA命名为『pAGA1』。
实验例9 通过本发明转化体生产多肽
实验例9-1 转化体BGC2
将含有淀粉部分分解物『パインデツクス#4』5g/L、(蛋白)胨20g/L、酵母提取物20g/L以及磷酸氢二钠1g/L的水溶液100ml装入到500ml容量的三角烧瓶中，用高压灭菌锅于121℃下灭菌15分钟，冷却之后，于无菌下将pH调到7.0后，无菌下添加氨苄青霉素钠盐10mg，制备液体培养基。向该液体培养基中接种用实验例6-2方法得到的转化体『BGC2』，于27℃下进行48小时通气搅拌培养。为了研究该培养物中有无该多肽，按照常规方法，对该培养物进行离心分离，分离成培养上清和菌体，然后分别回收。对于菌体通过超声破碎法从细胞中制备全提取物、用浸透压休克法从细胞外周胞质制备提取物。上述超声破碎法采用使菌体悬浮于10mM磷酸缓冲液(pH7.0)后，将该菌体悬浮液一边于冰水中冷却，一边用超声波匀浆器(『型号UH-600』)((株式会社)エスエムテ-制造)破碎细胞，该破碎物作为细胞全提取物的方法。上述渗透(压)休克法是采用将菌体用含有30mM氯化钠的10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.3)洗净后，将洗净菌体悬浮于含有200g/l蔗糖和1mM-EDTA的33mM Tris-HCl缓冲液(pH7.3)，于27℃下振荡20分钟，然后进行离心分离，回收菌体，将该菌体悬浮于预先于4℃下冷却的0.5mM氯化镁水溶液，于冰水中振荡20分钟，从细胞外周胞质提取的方法。然后经离心分离回收上清，将该上清作为细胞外周胞质提取物。
对这样得到的培养上清、细胞全提取物和细胞外周胞质提取物分别测定α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性，将各个活性值换算成每1ml培养物的值。结果如表12所示。
表12
| 样品 | α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性(单位/ml-培养物) |
| 培养上清 | 0.0 |
| 细胞全提取物 | 1.1 |
| 细胞外周胞质提取物 | 1.0 |
就象表12所表明的那样，转化体『BGC2』在细胞内产生本发明的多肽，其中大部分都分泌到细胞外周胞质。另外作为第一对照，将大肠杆菌『XL2-Blue』株在除了培养基中不加氨苄青霉素外，其他都与上述转化体的情况同一条件下进行培养，从培养物中制备培养上清和菌体破碎物。作为第二对照，将圆孢芽孢杆菌C11株在除了不含氨苄青霉素外，其他都与上述转化体的情况同一条件下进行培养，从培养物中制备培养上清和菌体破碎物。第一对照的培养上清以及菌体破碎物中都没有检测到α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性。在第二对照的培养上清和菌体破碎物中虽然检测到α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性，但每一培养物分别约为0.37单位和0.02单位，与转化体『BGC2』相比该值明显地低。
将上述得到的细胞外周胞质提取物再按照实验例1的方法，进行盐析、透析，使用『Sepabeads FP-DA13』凝胶、『Sephacryl HR S-200』凝胶、『Butyl-Toyopearl 650M』凝胶进行柱层析，纯化，按照实验例1给出的方法对本发明的多肽进行分析。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，分子量约137,000±20,000道尔顿，经等电点聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析，等电点约为5.2±0.5，α-异麦芽糖基转移酶活性的最适温度约为45℃(没有Ca2+存在下)，约50℃(Ca2+存在下)。最适pH约6.0。温度稳定性约到40℃(没有Ca2+存在下)，约50℃(Ca2+存在下)。pH稳定性约为5.0至10.0。这些结果表明，该重组型多肽与用实验例1方法得到的具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的多肽的理化性质实质上是相同的。
实验例9-2 转化体BGN2
将含有淀粉部分分解物『パインデツクス#4』5g/L、(蛋白)胨20g/L、酵母提取物20g/L以及磷酸氢二钠1g/L的水溶液100ml装入到500ml容量的三角烧瓶中，用高压灭菌锅于121℃下灭菌15分钟，冷却之后，于无菌下将pH调到7.0后，无菌下添加氨苄青霉素钠盐10mg，制备液体培养基。向该液体培养基中接种用实验例7-2方法得到的转化体『BGN2』，于27℃下进行48小时通气搅拌培养。为了研究该培养物中有无该多肽，与实验例9-1的方法同样分别制备培养上清、细胞全提取物和细胞外周胞质提取物。对于培养上清、细胞全提取物和细胞外周胞质提取物分别测定α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性，将各个活性值换算成每1ml培养物的值。结果如表13所示。
表13
| 样品 | α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性(单位/ml-培养物) |
| 培养上清 | 0.54 |
| 细胞全提取物 | 0.91 |
| 细胞外周胞质提取物 | 0.85 |
就象表13所表明的那样，转化体『BGN2』在培养上清和细胞内产生本发明的多肽，其中大部分都分泌到细胞外周胞质。另外作为第一对照，将大肠杆菌『XL2-Blue』株在除了培养基中不加氨苄青霉素外，其他都与上述转化体情况相同条件下进行培养，从培养物中制备培养上清和菌体破碎物。作为第二对照，将圆孢芽孢杆菌N75株在除了不含氨苄青霉素外，其他都与上述转化体情况相同条件下进行培养，从培养物中制备培养上清和菌体破碎物。第一对照的培养上清以及菌体破碎物都没有检测到α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性。在第二对照的培养上清和菌体破碎物中虽然检测到α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性，但每一培养物分别约为0.21单位和0.01单位，与转化体『BGN2』相比该值明显地低。
将上述得到的培养上清和细胞外周胞质提取物的混合物再按照实验例2的方法，进行盐析、透析，使用『Sepabeads FP-DA13』凝胶、『Sephacryl HR S-200』凝胶、『Butyl-Toyopearl 650M』凝胶进行柱层析，纯化，按照实验例2给出的方法对本发明的多肽进行分析。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，分子量约136,000±20,000道尔顿，经等电点聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析，等电点约为7.3±0.5，α-异麦芽糖基转移酶活性的最适温度约为50℃(没有Ca2+存在下)，约55℃(Ca2+存在下)。最适pH约6.0。温度稳定性约到45℃(没有Ca2+存在下)，约50℃(Ca2+存在下)。pH稳定性约为5.0至9.0。这些结果表明，该重组型多肽与用实验例2方法得到的具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的多肽的理化性质实质上是相同的。
实验例9-3 转化体AGA1
将含有淀粉部分分解物『パインデツクス#4』5g/L、(蛋白)胨20g/L、酵母提取物20g/L以及磷酸氢二钠1g/L的水溶液100ml装入到500ml容量的三角烧瓶中，用高压灭菌锅于121℃下灭菌15分钟，冷却之后，于无菌下将pH调到7.0后，加入氨苄青霉素钠盐10mg制备液体培养基。向该液体培养基中接种用实验例8-2方法得到的转化体『AGA1』，于27℃、进行约48小时通气搅拌培养。为了研究该培养物中有无该多肽，与实验例9-1的方法同样分别制备培养上清、细胞全提取物和细胞外周胞质提取物。对于培养上清、细胞全提取物和细胞外周胞质提取物分别测定α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性，将各个活性值换算成每1ml培养物的值。结果如表14所示。
表14
| 样品 | α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性(单位/ml-培养物) |
| 培养上清 | 0.51 |
| 细胞全提取物 | 2.5 |
| 细胞外周胞质提取物 | 2.4 |
就象表14所表明的那样，转化体『AGA1』在培养上清和细胞内产生本发明的多肽，其细胞中大部分都分泌到细胞外周胞质。另外作为第一对照，将大肠杆菌『XL2-Blue』株在除了培养基中不加氨苄青霉素外，其他都与上述转化体的情况相同条件下进行培养，从培养物中制备培养上清和菌体破碎物。作为第二对照，将球形节杆菌A19株在除了不含氨苄青霉素外，其他都与上述转化体的情况相同条件下进行培养，从培养物中制备培养上清和菌体破碎物。第一对照的培养上清以及菌体破碎物中都没有检测到α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性。在第二对照的培养上清和菌体破碎物中虽然检测到α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性，但每一培养物分别约为0.33单位和0.01单位，与转化体『AGA2』相比该值明显地低。
将上述得到的培养上清和细胞外周胞质提取物的混合物再按照实验例3的方法，进行盐析、透析，使用『DEAE-Toyopearl 650M』凝胶、『Sephacryl HRS-200』凝胶进行柱层析，进行纯化，按照实验例3给出的方法对本发明的多肽进行分析。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，分子量约94,000±20,000道尔顿，经等电点聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析，等电点约为4.3±0.5，α-异麦芽糖基转移酶活性的最适温度约为60℃(没有Ca2+存在下)，约65℃(Ca2+存在下)。最适pH约8.4。温度稳定性约到55℃(没有Ca2+存在下)，约60℃(Ca2+存在下)。pH稳定性约为5.0至9.0。这些结果表明，该重组型多肽与用实验例3方法得到的具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的多肽的理化性质实质上是同一的。
这些结果表明，本发明的多肽通过重组DNA技术可以制造，同时多肽的产率也显著提高。
以下通过实施例对本发明的多肽的制造方法和使用本发明多肽制备环状四糖和含有环状四糖的糖的制造方法。
实施例1 本发明多肽的制造
将含有淀粉部分分解物『パインデツクス#4』5g/L、(蛋白)胨20g/L、酵母提取物20g/L以及磷酸氢二钠1g/L的水溶液100ml装入到500ml容量的三角烧瓶中，用高压灭菌锅于121℃下灭菌15分钟，冷却，无菌下将pH调到7.0后，加入氨苄青霉素钠盐100μg/ml。向该液体培养基中接种用实验例5-2方法得到的转化体『BGC2』，于27℃、230rpm下进行24小时旋转振荡培养，得到种培养液。然后将上述同样组成的液体培养基约18L加入到容量30L的发酵罐中，同样进行灭菌、冷却后到27℃后，加入氨苄青霉素钠盐50μg/ml，接种1v/v％种培养液，维持在27℃进行48小时通气搅拌培养。对培养物进行离心分离，回收菌体，悬浮于10mM磷酸缓冲液(pH7.0)后，经超声波处理破碎菌体，通过离心分离除去不溶物，得到上清。对该培养上清中的酶活性进行测定，结果每1L培养物检测出约1,100单位的酶活性。使用该上清，通过实验例1的方法进行纯化，得到含有每ml约61单位的比活性约13.5单位/mg蛋白质的本发明多肽水溶液约70ml。
实施例2 本发明多肽的制备
将含有淀粉部分分解物『パインデツクス#4』5g/L、(蛋白)胨20g/L、酵母提取物20g/L以及磷酸氢二钠1g/L的水溶液100ml装入到500ml容量的三角烧瓶中，用高压灭菌锅于121℃下灭菌15分钟，冷却，无菌下将pH调到7.0后，加入氨苄青霉素钠盐100μg/ml。向该液体培养基中接种用实验例6-2方法得到的转化体『BGN2』，于37℃、230rpm下进行24小时旋转振荡培养，得到种培养液。然后将上述同样组成的液体培养基约18L加入到容量30L的发酵罐中，进行同样灭菌、冷却到27℃后，加入氨苄青霉素钠盐50μg/ml，接种1v/v％种培养液，维持在27℃进行48小时通气搅拌培养。对培养物进行离心分离，得到上清。对该培养上清中的酶活性进行测定，结果每1L培养物检测出约750单位的酶活性。使用该上清，通过实验例2的方法进行纯化，得到含有每ml约72单位的比活性约12.6单位/mg蛋白质的本发明多肽水溶液75ml。
实施例3 含有环状四糖的糖浆状物的制备
将木薯淀粉做成浓度约为25％的淀粉乳，加入α-淀粉酶(商品名『木薯酶』、ナガセ生物化学工业(株式会社)制造)(每100g淀粉固态物加0.2g)，于85℃至90℃下反应约20分钟，然后于120℃高压灭菌20分钟，再急剧冷却到约35℃，得到DE约4的液化溶液，按照最终平均每g淀粉固态物对应2.2单位和6.6单位的比例，向液化溶液中分别加入用实施例1方法得到的多肽和用实验例1-4方法得到的α-异麦芽糖基转移酶，再加入环麦芽糖糊精葡聚糖基转移酶(株式会社林原生物化学研究所制造)使每1g淀粉固态物为10单位，于pH6.0、35℃下反应48小时。将该反应液于95℃下保存30分钟后，调整到pH5.0、50℃后，按照每1g固态物300单位比例加入α-葡糖苷酶(商品名『转葡糖苷酶L「アマノ」』、天野株式制药会社制造)，反应24小时，再按照每1g固态物30单位加入葡糖淀粉酶(商品名『グルコチ-ム』ナガセ生物化学工业株式会社制造)，反应17小时，将该反应液加热到95℃，保持30分钟后，利用常规方法将冷却、过滤后得到的滤液用活性炭进行脱色，通过H型和OH型离子交换树脂进行脱盐纯化，进一步浓缩之后得到含有浓度为60％环状四糖的糖浆，收率约为原料淀粉固态物的90％。
该糖浆每份固态物含有葡萄糖38.4％、环状四糖58.1％以及含有3.5％其他糖，有温和甜味、适度的粘度、保湿性、包合性，作为甜味料、味道改良剂、脱水防止剂、稳定剂、防止变色剂、赋形剂、包合剂等可以在各种饮食、化妆品、药品等各种组成物中有效利用。
实施例4 环状四糖结晶性粉末的制造
将玉米淀粉做成浓度约为20％的淀粉乳，然后加入0.1％碳酸钙，将pH调整到6.5，每100g淀粉固态物加入α-淀粉酶0.3g(商品名『ダ-マミ-ル60L』、ノボ公司制造)，于95℃反应约15分钟，然后于120℃高压灭菌20分钟，再急剧冷却到约35℃，得到DE约4的液化溶液，按照最终平均每g淀粉固态物分别对应2.5单位和7.0单位的比例向液化溶液中加入用实施例1方法得到多肽和用实验例1-4方法得到α-异麦芽糖基转移酶，再加入环麦芽糖糊精葡聚糖基转移酶(株式会社林原生物化学研究所制造)，使每1g淀粉固态物为10单位，于pH6.0、35℃下反应48小时。将该反应液于95℃下保存30分钟后，调整到pH5.0、50℃后，按照每1g固态物300单位比例加入α-葡糖苷酶(商品名L『转葡糖苷酶L「アマノ」』、天野制药株式会社制造)，反应24小时，再按照每1g固态物30单位比例加入葡糖淀粉酶(商品名『グルコチ-ム』ナガセ生物化学工业株式会社制造)，反应17小时，将该反应液加热到95℃，保持30分钟后，利用常规方法将冷却、过滤后得到的滤液用活性炭进行脱色、通过H型和OH型离子交换树脂进行脱盐纯化，进一步浓缩之后，得到每份固态物含有葡萄糖34.2％、环状四糖62.7％、其他糖3.1％的浓度为60％的环状四糖的糖浆。
使用强酸性阳离子交换树脂(商品名『アンバ-ライトCR-1310(Na型)』、オルガノ株式会社制造)对该含有环状四糖的糖浆进行柱层析。将树脂充填到4根内径5.4cm的带有外套的不锈钢柱，直列串接，树脂层全长20m。将柱温维持在60℃，加入相当于树脂为5％(v/v)的糖液，用SV0.13使60℃的温水流过，进行分级，用HPLC法对洗脱液的糖组成进行检测，收集含环状四糖量高的级分，进行纯化，得到单位固态物约含98％环状四糖的环状四糖含量高的溶液。
将该溶液浓缩到浓度约为70％后，加入到结晶罐中，作为种晶加入约2％的含5至6个水结晶环状四糖，慢慢冷却，得到结晶率约45％的浆(マスキツト)。从干燥塔上的喷嘴以150kg/cm2的高压对该浆(マスキツト)进行喷雾。同时从干燥塔的上部送85℃的热风，吸收设计在底部传送用金属网传送带上的结晶粉末，一边从传送带的下面送45℃的温风，一边使该粉末缓慢地移到干燥塔外，取出。将该结晶粉末填充到熟化塔后，边送温风，边使其熟化10小时，完成结晶和干燥，得到收率约为原料淀粉固态物20％的含5至6个水结晶环状四糖粉末。
本品还原性非常低、很难发生羰氨反应、也没有吸湿性、操作容易、有温和甜味、适度的粘度、保湿性、包合性和难消化性，作为甜味料、低热量食品原材料、味道改良剂、风味改良剂、品质改良剂、脱水防止剂、稳定剂、赋形剂、包合剂、粉末化基体材料等可以在各种饮食、化妆品、药品等各种组成物中有效利用。
实施例5 环状四糖结晶性粉末的制备
将玉米淀粉做成浓度约为30％的淀粉乳，然后加入0.1％碳酸钙，将pH调整到6.5，每100g淀粉固态物加入α-淀粉酶0.3g(商品名『ダ-マミ-ル60L』、ノボ公司制造)，于95℃反应约15分钟，然后于120℃高压灭菌20分钟，再急剧冷却到约51℃，得到DE约4的液化溶液，按照每克淀粉固态物分别对应2.4单位和8.0单位的比例向液化溶液中加入用实施例2方法得到多肽和用实验例2-4方法得到α-异麦芽糖基转移酶，再加入环麦芽糖糊精葡聚糖基转移酶(株式会社林原生物化学研究所制造)，使每1g淀粉固态物为3单位，于pH5.5、51℃下反应48小时。将该反应液于95℃下保存30分钟后，调整到pH5.0、50℃后，按照每1g固态物300单位比例加入α-葡糖苷酶(商品名『转葡糖苷酶「アマノ」』、天野制药株式会社制造)，反应24小时，再按照每1g固态物30单位比例加入葡糖淀粉酶(商品名『グルコチ-ム』ナガセ生物化学工业株式会社制造)，反应17小时，将该反应液加热到95℃，保持30分钟后，利用常规方法将冷却、过滤后得到的滤液用活性炭进行脱色、通过H型和OH型离子交换树脂进行脱盐纯化，进一步浓缩之后得到每克固态物含有葡萄糖46.8％、环状四糖44.0％、其他糖9.8％的浓度为60％的含环状四糖的糖浆。将得到的含有环状四糖的糖浆作为原糖液，为了提高环状四糖的含量，按照实施例5的方法进行使用强酸性阳离子交换树脂的柱层析，收集含有环状四糖量高的级分，进行纯化、浓缩、喷雾干燥后得到收率约为原料淀粉固态物45％的环状四糖粉末。
得到的本品每份固态物含有葡萄糖3.7％、环状四糖80.5％以及15.8％其他糖，有温和甜味、适度的粘度、保湿性、包合性，作为甜味料、味道改良剂、品质改良剂、脱水防止剂、稳定剂、防止变色剂、赋形剂、包合剂、粉末化基体材料等可以在各种饮食、化妆品、药品等各种组成物中有效利用。
本发明是起到如此显著作用效果的发明，可以说是对该领域有重大意义的发明。
序列表<110>Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsukagaku Kenkyujo<120>具有a-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的多肽<130>WO879<160>32<210>1<211>1249<212>PRT<213>微生物<220><400>1Tyr Val Ser Ser Leu Gly Asn Leu Ile Ser Ser Ser Val Thr Gly Asp1 5 10 15Thr Leu Thr Leu Thr Val Asp Asn Gly Ala Glu Pro Ser Asp Asp Leu
20 25 30Leu Ile Val Gln Ala Val Gln Asn Gly Ile Leu Lys Val Asp Tyr Arg
35 40 45Pro Asn Ser Ile Thr Pro Ser Ala Lys Thr Pro Met Leu Asp Pro Asn
50 55 60Lys Thr Trp Ser Ala Val Gly Ala Thr Ile Asn Thr Thr Ala Asn Pro65 70 75 80Met Thr Ile Thr Thr Ser Asn Met Lys Ile Glu Ile Thr Lys Asn Pro
85 90 95Val Arg Met Thr Val Lys Lys Ala Asp Gly Thr Thr Leu Phe Trp Glu
100 105 110Pro Ser Gly Gly Gly Val Phe Ser Asp Gly Val Arg Phe Leu His Ala
115 120 125Thr Gly Asp Asn Met Tyr Gly Ile Arg Ser Phe Asn Ala Phe Asp Ser
130 135 140Gly Gly Asp Leu Leu Arg Asn Ser Ser Asn His Ala Ala His Ala Gly145 150 155 160Glu Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ile Trp Ser Thr Ala Gly Tyr
165 170 175Gly Leu Leu Val Asp Ser Asp Gly Gly Tyr Pro Tyr Thr Asp Ser Thr
180 185 190Thr Gly Gln Met Glu Phe Tyr Tyr Gly Gly Thr Pro Pro Glu Gly Arg
195 200 205Arg Tyr Ala Lys Gln Asn Val Glu Tyr Tyr Ile Met Leu Gly Thr Pro
210 215 220Lys Glu Ile Met Thr Asp Val Gly Glu Ile Thr Gly Lys Pro Pro Met225 230 235 240Leu Pro Lys Trp Ser Leu Gly Phe Met Asn Phe Glu Trp Asp Thr Asn
245 250 255Gln Thr Glu Phe Thr Asn Asn Val Asp Thr Tyr Arg Ala Lys Asn Ile
260 265 270Pro Ile Asp Ala Tyr Ala Phe Asp Tyr Asp Trp Lys Lys Tyr Gly Glu
275 280 285Thr Asn Tyr Gly Glu Phe Ala Trp Asn Thr Thr Asn Phe Pro Ser Ala
290 295 300Ser Thr Thr Ser Leu Lys Ser Thr Met Asp Ala Lys Gly Ile Lys Met305 310 315 320Ile Gly Ile Thr Lys Pro Arg Ile Val Thr Lys Asp Ala Ser Ala Asn
325 330 335Val Thr Thr Gln Gly Thr Asp Ala Thr Asn Gly Gly Tyr Phe Tyr Pro
340 345 350Gly His Asn Glu Tyr Gln Asp Tyr Phe Ile Pro Val Thr Val Arg Ser
355 360 365Ile Asp Pro Tyr Asn Ala Asn Glu Arg Ala Trp Phe Trp Asn His Ser
370 375 380Thr Asp Ala Leu Asn Lys Gly Ile Val Gly Trp Trp Asn Asp Glu Thr385 390 395 400Asp Lys Val Ser Ser Gly Gly Ala Leu Tyr Trp Phe Gly Asn Phe Thr
405 410 415Thr Gly His Met Ser Gln Thr Met Tyr Glu Gly Gly Arg Ala Tyr Thr
420 425 430Ser Gly Ala Gln Arg Val Trp Gln Thr Ala Arg Thr Phe Tyr Pro Gly
435 440 445Ala Gln Arg Tyr Ala Thr Thr Leu Trp Ser Gly Asp Ile Gly Ile Gln
450 455 460Tyr Asn Lys Gly Glu Arg Ile Asn Trp Ala Ala Gly Met Gln Glu Gln465 470 475 480Arg Ala Val Met Leu Ser Ser Val Asn Asn Gly Gln Val Lys Trp Gly
485 490 495Met Asp Thr Gly Gly Phe Asn Gln Gln Asp Gly Thr Thr Asn Asn Pro
500 505 510Asn Pro Asp Leu Tyr Ala Arg Trp Met Gln Phe Ser Ala Leu Thr Pro
515 520 525Val Phe Arg Val His Gly Asn Asn His Gln Gln Arg Gln Pro Trp Tyr
530 535 540Phe Gly Ser Thr Ala Glu Glu Ala Ser Lys Glu Ala Ile Gln Leu Arg545 550 555 560Tyr Ser Leu Ile Pro Tyr Met Tyr Ala Tyr Glu Arg Ser Ala Tyr Glu
565 570 575Asn Gly Asn Gly Leu Val Arg Pro Leu Met Gln Ala Tyr Pro Thr Asp
580 585 590Ala Ala Val Lys Asn Tyr Thr Asp Ala Trp Met Phe Gly Asp Trp Leu
595 600 605Leu Ala Ala Pro Val Val Asp Lys Gln Gln Thr Ser Lys Asp Ile Tyr
610 615 620Leu Pro Ser Gly Ser Trp Ile Asp Tyr Ala Arg Gly Asn Ala Ile Thr625 630 635 640Gly Gly Gln Thr Ile Arg Tyr Ser Val Asn Pro Asp Thr Leu Thr Asp
645 650 655Met Pro Leu Phe Ile Lys Lys Gly Ala Ile Ile Pro Thr Gln Lys Val
660 665 670Gln Asp Tyr Val Gly Gln Ala Ser Val Thr Ser Val Asp Val Asp Val
675 680 685Phe Pro Asp Thr Thr Gln Ser Ser Phe Thr Tyr Tyr Asp Asp Asp Gly
690 695 700Ala Ser Tyr Asn Tyr Glu Ser Gly Thr Tyr Phe Lys Gln Asn Met Thr705 710 715 720Ala Gln Asp Asn Gly Ser Gly Ser Leu Ser Phe Thr Leu Gly Ala Lys
725 730 735Ser Gly Ser Tyr Thr Pro Ala Leu Gln Ser Tyr Ile Val Lys Leu His
740 745 750Gly Ser Ala Gly Thr Ser Val Thr Asn Asn Ser Ala Ala Met Thr Ser
755 760 765Tyr Ala Ser Leu Glu Ala Leu Lys Ala Ala Ala Gly Glu Gly Trp Ala
770 775 780Thr Gly Lys Asp Ile Tyr Gly Asp Val Thr Tyr Val Lys Val Thr Ala785 790 795 800Gly Thr Ala Ser Ser Lys Ser Ile Ala Val Thr Gly Val Ala Ala Val
805 810 815Ser Ala Thr Thr Ser Gln Tyr Glu Ala Glu Asp Ala Ser Leu Ser Gly
820 825 830Asn Ser Val Ala Ala Lys Ala Ser Ile Asn Thr Asn His Thr Gly Tyr
835 840 845Thr Gly Thr Gly Phe Val Asp Gly Leu Gly Asn Asp Gly Ala Gly Val
850 855 860Thr Phe Tyr Pro Lys Val Lys Thr Gly Gly Asp Tyr Asn Val Ser Leu865 870 875 880Arg Tyr Ala Asn Ala Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Ser Ile Phe Val
885 890 895Asn Gly Lys Arg Val Lys Ser Thr Ser Leu Ala Asn Leu Ala Asn Trp
900 905 910Asp Thr Trp Ser Thr Gln Ser Glu Thr Leu Pro Leu Thr Ala Gly Val
915 920 925Asn Val Val Thr Tyr Lys Tyr Tyr Ser Asp Ala Gly Asp Thr Gly Asn
930 935 940Val Asn Ile Asp Asn Ile Thr Val Pro Phe Ala Pro Ile Ile Gly Lys945 950 955 960Tyr Glu Ala Glu Ser Ala Glu Leu Ser Gly Gly Ser Ser Leu Asn Thr
965 970 975Asn His Trp Tyr Tyr Ser Gly Thr Ala Phe Val Asp Gly Leu Ser Ala
980 985 990Val Gly Ala Gln Val Lys Tyr Asn Val Asn Val Pro Ser Ala Gly Ser
995 1000 1005Tyr Gln Val Ala Leu Arg Tyr Ala Asn Gly Ser Ala Ala Thr Lys Thr
1010 1015 1020Leu Ser Thr Tyr Ile Asn Gly Ala Lys Leu Gly Gln Thr Ser Phe Thr1025 1030 1035 1040Ser Pro Gly Thr Asn Trp Asn Val Trp Gln Asp Asn Val Gln Thr Val
1045 1050 1055Thr Leu Asn Ala Gly Ala Asn Thr Ile Ala Phe Lys Tyr Asp Ala Ala
1060 1065 1070Asp Ser Gly Asn Ile Asn Val Asp Arg Leu Leu Leu Ser Thr Ser Ala
1075 1080 1085Ala Gly Thr Pro Val Ser Glu Gln Asn Leu Leu Asp Asn Pro Gly Phe1090 1095 1100Glu Arg Asp Thr Ser Gln Thr Asn Asn Trp Ile Glu Trp His Pro Gly1105 1110 1115 1120Thr Gln Ala Val Ala Phe Gly Val Asp Ser Gly Ser Thr Thr Asn Pro
1125 1130 1135Pro Glu Ser Pro Trp Ser Gly Asp Lys Arg Ala Tyr Phe Phe Ala Ala
1140 1145 1150Gly Ala Tyr Gln Gln Ser Ile His Gln Thr Ile Ser Val Pro Val Asn
1155 1160 1165Asn Val Lys Tyr Lys Phe Glu Ala Trp Val Arg Met Lys Asn Thr Thr1170 1175 1180Pro Thr Thr Ala Arg Ala Glu Ile Gln Asn Tyr Gly Gly Ser Ala Ile1185 1190 1195 1200Tyr Ala Asn Ile Ser Asn Ser Gly Val Trp Lys Tyr Ile Ser Val Ser
1205 1210 1215Asp Ile Met Val Thr Asn Gly Gln Ile Asp Val Gly Phe Tyr Val Asp
1220 1225 1230Ser Pro Gly Gly Thr Thr Leu His Ile Asp Asp Val Arg Val Thr Lys
1235 1240 1245Gln<210>2<211>1251<212>PRT<213>微生物<220><400>2His Val Ser Ala Leu Gly Asn Leu Leu Ser Ser Ala Val Thr Gly Asp1 5 10 15Thr Leu Thr Leu Thr Ile Asp Asn Gly Ala Glu Pro Asn Asp Asp Ile
20 25 30Leu Val Leu Gln Ala Val Gln Asn Gly Ile Leu Lys Val Asp Tyr Arg
35 40 45Pro Asn Gly Val Ala Pro Ser Ala Asp Thr Pro Met Leu Asp Pro Asn
50 55 60Lys Thr Trp Pro Ser Ile Gly Ala Val Ile Asn Thr Ala Ser Asn Pro65 70 75 80Met Thr Ile Thr Thr Pro Ala Met Lys Ile Glu Ile Ala Lys Asn Pro
85 90 95Val Arg Leu Thr Val Lys Lys Pro Asp Gly Thr Ala Leu Leu Trp Glu
100 105 110Pro Pro Thr Gly Gly Val Phe Ser Asp Gly Val Arg Phe Leu His Gly
115 120 125Thr Gly Asp Asn Met Tyr Gly Ile Arg Ser Phe Asn Ala Phe Asp Ser
130 135 140Gly Gly Asp Leu Leu Arg Asn Ser Ser Thr Gln Ala Ala Arg Ala Gly145 150 155 160Asp Gln Gly Asn Ser Gly Gly Pro Leu Ile Trp Ser Thr Ala Gly Tyr
165 170 175Gly Val Leu Val Asp Ser Asp Gly Gly Tyr Pro Phe Thr Asp Glu Ala
180 185 190Thr Gly Lys Leu Glu Phe Tyr Tyr Gly Gly Thr Pro Pro Glu Gly Arg
195 200 205Arg Tyr Thr Lys Gln Asp Val Glu Tyr Tyr Ile Met Leu Gly Thr Pro
210 215 220Lys Glu Ile Met Ser Gly Val Gly Glu Ile Thr Gly Lys Pro Pro Met225 230 235 240Leu Pro Lys Trp Ser Leu Gly Phe Met Asn Phe Glu Trp Asp Leu Asn
245 250 255Glu Ala Glu Leu Lys Asn His Val Asp Thr Tyr Arg Ala Lys Asn Ile
260 265 270Pro Ile Asp Gly Tyr Ala Ile Asp Phe Asp Trp Lys Lys Tyr Gly Glu
275 280 285Asn Asn Tyr Gly Glu Phe Ala Trp Asn Thr Ala Asn Phe Pro Ser Ala
290 295 300Ala Thr Thr Ala Leu Lys Ser Gln Met Asp Ala Lys Gly Ile Lys Met305 310 315 320Ile Gly Ile Thr Lys Pro Arg Ile Ala Thr Lys Asp Phe Ser Asn Asn
325 330 335Pro Thr Val Gln Gly Thr Asp Ala Ala Ser Gly Gly Tyr Phe Tyr Pro
340 345 350Gly His Ser Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe Ile Pro Val Phe Val Arg Ser
355 360 365Ile Asp Pro Tyr Asn Pro Ala Ala Arg Ser Trp Phe Trp Asn His Ser
370 375 380Lys Asp Ala Phe Asp Lys Gly Ile Val Gly Trp Trp Asn Asp Glu Thr385 390 395 400Asp Ala Val Ser Ser Gly Gly Ala Ser Tyr Trp Phe Gly Asn Phe Thr
405 410 415Thr Gly His Met Ser Gln Ala Leu Tyr Glu Gly Gln Arg Ala Tyr Thr
420 425 430Ser Asn Ala Gln Arg Val Trp Gln Thr Ala Arg Thr Phe Tyr Pro Gly
435 440 445Ala Gln Arg Tyr Ala Thr Thr Leu Trp Ser Gly Asp Ile Gly Ile Gln
450 455 460Tyr Thr Lys Gly Glu Arg Ile Asn Trp Ala Ala Gly Met Gln Glu Gln465 470 475 480Arg Ala Val Met Leu Ser Ser Ile Asn Asn Gly Gln Val Lys Trp Gly
485 490 495Met Asp Thr Gly Gly Phe Asn Gln Gln Asp Gly Thr Thr Asn Asn Pro
500 505 510Asn Pro Asp Leu Tyr Ala Arg Trp Met Gln Phe Ser Ala Leu Thr Pro
515 520 525Val Phe Arg Val His Gly Asn Asn His Gln Gln Arg Gln Pro Trp Tyr
530 535 540Tyr Gly Ser Thr Ala Glu Glu Ala Ser Lys Glu Ala Leu Gln Leu Arg545 550 555 560Tyr Ser Leu Ile Pro Tyr Met Tyr Ala Tyr Glu Arg Ser Ala Tyr Glu
565 570 575Asn Gly Asn Gly Leu Val Arg Pro Leu Met Gln Glu Tyr Pro Ala Asp
580 585 590Ala Asn Ala Lys Asn Tyr Leu Asp Ala Trp Met Phe Gly Asp Trp Leu
595 600 605Leu Ala Ala Pro Val Val Glu Lys Gln Gln Thr Ser Lys Glu Ile Tyr
610 615 620Leu Pro Ala Gly Thr Trp Ile Asp Tyr Asn Arg Gly Thr Val Leu Thr625 630 635 640Gly Gly Gln Lys Ile Ser Tyr Ala Val Asn Pro Asp Thr Leu Thr Asp
645 650 655Ile Pro Leu Phe Ile Lys Lys Gly Ala Ile Ile Pro Ser Gln Lys Val
660 665 670Gln Asp Tyr Val Gly Gln Ala Pro Val Gln Thr Val Asp Val Asp Val
675 680 685Phe Pro Asn Thr Ala Gln Ser Ser Phe Thr Tyr Tyr Asp Asp Asp Gly
690 695 700Ser Ser Tyr Asn Tyr Glu Ser Gly Ala Tyr Phe Lys Gln Leu Met Thr705 710 715 720Ala Gln Asp Asn Gly Ser Gly Ala Leu Ser Phe Thr Leu Gly Ala Lys
725 730 735Thr Gly Thr Tyr Ser Pro Ala Leu Gln Ser Tyr Ile Val Lys Leu His
740 745 750Gly Ala Ala Gly Ala Ser Val Thr Ser Asn Gly Ala Ala Leu Ala Ser
755 760 765Tyr Ala Ser Leu Gln Ala Leu Lys Ala Ser Ala Ser Glu Gly Trp Ala
770 775 780Lys Gly Lys Asp Ile Tyr Gly Asp Val Thr Tyr Val Lys Leu Ser Ala785 790 795 800Gly Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ile Ala Val Thr Gly Asn Ser Pro Val
805 810 815Ser Val Ala Asp Val Gln Tyr Glu Ala Glu Glu Ala Ser Leu Ser Gly
820 825 830Asn Thr Thr Ala Thr Lys Ala Thr Val Asn Thr Asn His Ala Gly Tyr
835 840 845Thr Gly Ser Gly Phe Val Asp Gly Leu Ser Asn Pro Gly Ala Ala Val
850 855 860Thr Phe Tyr Pro Lys Val Lys Thr Gly Gly Asp Tyr Asn Val Ser Leu865 870 875 880Arg Tyr Ala Asn Ser Thr Gly Ala Ala Lys Ser Val Ser Ile Phe Val
885 890 895Asn Gly Lys Arg Val Lys Ser Thr Ser Leu Ala Asn Leu Pro Asn Trp
900 905 910Asp Thr Trp Gly Thr Gln Ala Glu Thr Leu Pro Leu Thr Ala Gly Thr
915 920 925Asn Val Val Thr Tyr Lys Phe Tyr Ser Asp Ala Gly Asp Thr Gly Ser
930 935 940Val Asn Leu Asp Asn Ile Thr Val Pro Phe Ala Pro Ala Ile Gly Lys945 950 955 960Tyr Glu Ala Glu Ser Ala Glu Leu Ser Gly Gly Ser Thr Val Asn Gln
965 970 975Asn His Trp Phe Tyr Ser Gly Thr Ala Phe Val Asp Gly Leu Thr Ala
980 985 990Pro Gly Ala Gln Val Lys Tyr Thr Val Asn Ala Pro Ala Ala Gly Ser
995 1000 1005Tyr Gln Ile Ala Leu Arg Tyr Ala Asn Gly Thr Gly Ala Ala Lys Thr1010 1015 1020Leu Ser Thr Tyr Val Asn Gly Thr Lys Leu Gly Gln Thr Ala Phe Ala1025 1030 1035 1040Ser Pro Gly Gly Asn Trp Asn Val Trp Gln Asp Ser Val Gln Thr Val
1045 1050 1055Ala Leu Ala Ala Gly Thr Asn Thr Ile Ala Phe Lys Tyr Asp Ala Gly
1060 1065 1070Asp Ser Gly Ser Gly Ser Val Asn Leu Asp Arg Leu Leu Leu Ser Ala
1075 1080 1085Ala Ala Pro Gly Val Pro Val Ser Glu Gln Asn Leu Leu Asp Asn Gly1090 1095 1100Gly Phe Glu Arg Asp Pro Ser Gln Ser Ser Asn Trp Thr Glu Trp His1105 1110 1115 1120Pro Ala Ser Gln Ala Ile Ala Tyr Gly Ile Asp Ser Gly Ser Gly Met
1125 1130 1135Asn Pro Pro Glu Ser Pro Trp Ala Gly Asp Lys Arg Ala Tyr Phe Tyr
1140 1145 1150Ala Ala Gly Pro Tyr Gln Gln Ser Ile His Gln Thr Val Ser Val Pro
1155 1160 1165Val Asn Asn Ala Lys Tyr Lys Phe Glu Ala Trp Val Leu Leu Lys Asn1170 1175 1180Thr Thr Pro Thr Thr Ala Arg Val Glu Ile Gln Asn Tyr Gly Gly Ser1185 1190 1195 1200Pro Ile Phe Thr Asn Ile Ser Lys Asp Gly Val Trp Lys Tyr Ile Ser
1205 1210 1215Val Ser Asp Ile Gln Val Thr Asn Gly Gln Ile Asp Ile Gly Phe Tyr
1220 1225 1230Val Asp Ser Pro Gly Gly Thr Thr Leu His Ile Asp Asp Val Arg Val
1235 1240 1245Thr Lys Gln1250<210>3<211>929<212>PRT<213>微生物<220><400>3Ala Pro Leu Gly Val Gln Arg Ala Gln Phe Gln Ser Gly Ser Ser Tyr1 5 10 15Leu Val Val Glu Val Leu Asp Asp Asp Leu Val His Phe Glu Leu Ala
20 25 30Gly Gly Gly Thr Ala Pro Gly Thr Gly Ser Pro Leu Phe Thr Thr Pro
35 40 45Gln Val Ala Lys His Asp Tyr Ala Gly Pro Asp Val Phe Thr Gln Thr
50 55 60Gly Ser Val Leu Gln Thr Ala Ala Met Arg Ile Glu Val Asp Pro Ala65 70 75 80Asp Leu Cys Val Thr Ala Thr Asp Ile Thr Arg Thr Pro Asn Leu Val
85 90 95Leu His Glu Ala Cys Pro Ala Asp Leu Gly Gln Ala Trp Lys Gly Leu
100 105 110Asn Ile Thr Arg Ser Ala Met Glu Asn Ala Tyr Gly Leu Gly Gln Gln
115 120 125Phe Phe Thr Gly Gly Ser Ala Asp Gly Asp Trp Val Gly Arg Thr Arg
130 135 140Thr Pro Gly Gly Thr Tyr Gly Asn Ala Met Val Phe Asp Pro Glu Asn145 150 155 160Gly Pro Val Gly Asn Thr Gln Ile Pro Val Leu Phe Ala Val Gly Asp
165 170 175Asp Asn Ala Asn Tyr Gly Leu Phe Val Asp Gln Leu Tyr Lys Gln Glu
180 185 190Trp Asn Leu Thr Gly Asp Pro Trp Thr Val Arg Met Trp Gly Asp Gln
195 200 205Val Arg Trp Tyr Leu Met Ser Gly Asp Asp Leu Pro Asp Leu Arg His
210 215 220Asp Tyr Met Glu Leu Thr Gly Thr Pro Pro Val Pro Pro Lys Lys Ala225 230 235 240Phe Gly Leu Trp Val Ser Glu Phe Gly Tyr Asp Asn Trp Ser Glu Val
245 250 255Asp Asn Thr Ile Ala Gly Leu Arg Ser Ala Asp Phe Pro Val Asp Gly
260 265 270Ala Met Leu Asp Val Gln Trp Phe Gly Gly Val Thr Ala Asp Ser Asp
275 280 285Asp Thr Arg Met Gly Thr Leu Asp Trp Asp Thr Ser Arg Phe Pro Asp
290 295 300Pro Ala Gly Lys Ile Ala Asp Leu Ala Glu Asp Gly Val Gly Ile Ile305 310 315 320Pro Ile Glu Glu Ser Tyr Val Gly Arg Asn Leu Pro Glu His Ala Arg
325 330 335Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Val Arg Ser Gly Cys Ala Thr Cys Pro
340 345 350Pro Val Tyr Leu Thr Gly Asn Pro Trp Trp Gly Lys Gly Gly Met Ile
355 360 365Asp Trp Thr Gln Pro Glu Ala Gly Ala Val Trp His Asp Glu Gln Arg
370 375 380Gln His Leu Val Asp Glu Gly Val Leu Gly His Trp Leu Asp Leu Gly385 390 395 400Glu Pro Glu Met Tyr Asp Pro Asn Asp Trp Thr Ala Gly Val Ile Pro
405 410 415Gly Lys His Ala His Ala Asp Tyr His Asn Ala Tyr Asn Leu Leu Trp
420 425 430Ala Gln Ser Ile Ala Asp Gly Tyr Ala Asp Asn Gly Val Gln Lys Arg
435 440 445Pro Phe Met Leu Thr Arg Ala Ala Ala Ala Gly Ile Gln Arg His Gly
450 455 460Ala Gly Met Trp Ser Ala Asp Ile Gly Ser Thr Met Lys Ala Leu Gly465 470 475 480Ser Gln Gln Asn Ala Gln Met His Met Ser Met Ser Gly Ile Asp Tyr
485 490 495Tyr Gly Ser Asp Ile Gly Gly Phe Arg Arg Glu Met Ala Asp Gly Asp
500 505 510Val Asn Glu Leu Tyr Thr Gln Trp Phe Ala Asp Ser Ala Trp Phe Asp
515 520 525Thr Pro Leu Arg Pro His Thr Asp Asn Leu Cys Asn Cys Leu Glu Thr
530 535 540Ser Pro Asp Ser Ile Gly Asp Val Ala Ser Asn Arg Glu Asn Leu Val545 550 555 560Arg Arg Tyr Glu Leu Ala Pro Tyr Tyr Tyr Ser Leu Ala His Arg Ala
565 570 575His Gln Phe Gly Glu Pro Leu Ala Pro Pro Leu Val Tyr Tyr Tyr Gln
580 585 590Asn Asp Asp His Val Arg Glu Met Gly His Gln Lys Met Leu Gly Arg
595 600 605Asp Leu Leu Ile Ala Ile Val Ala Gly Glu Gly Glu Arg Glu Arg Asp
610 615 620Val Tyr Leu Pro Ala Gly Glu Trp Ile Asp Ile His Thr Asn Glu Arg625 630 635 640Ile Gln Ser Thr Gly Gln Trp Ile Asp Asn Val Pro Leu Trp Arg Asp
645 650 655Gly Val Phe Thr Leu Pro Ala Tyr Ala Arg Ala Gly Ala Ile Ile Pro
660 665 670Lys Ala Phe Val Asp Ala Ser Thr Lys Asp Ile Thr Gly Lys Arg Glu
675 680 685Asp Ala Ala Val Arg Asn Glu Leu Ile Ala Thr Val Tyr Ala Asp Asp
690 695 700Val Ala Ser Asp Phe Thr Leu Tyr Glu Asp Asp Gly Ala Thr Thr Ala705 710 715 720Tyr Ala Asp Gly Ala Val Arg Thr Thr Gln Ile Ser Gln Ser Leu Thr
725 730 735Asn Gly Val Ala Thr Val Thr Val Gly Ala Ala Ser Gly Thr Tyr Ser
740 745 750Gly Ala Pro Ser Thr Arg Pro Thr Val Val Glu Leu Val Thr Asp Gly
755 760 765Thr Gln Ala Ser Thr Val Ser Leu Gly Ser Val Pro Leu Thr Glu His
770 775 780Ala Asn Lys Ala Ala Phe Asp Ala Ala Ser Ser Gly Trp Tyr Asn Ala785 790 795 800Gly Gly Gly Leu Val Val Ala Lys Ala Ala Ser Ser Ser Val Asn Thr
805 810 815Ala Lys Thr Phe Ser Phe Thr Leu Gly Glu Glu Ser Val Trp Ala Thr
820 825 830Phe Ser Cys Glu Asn Ala Thr Thr Thr Phe Gly Gln Ser Val Tyr Val
835 840 845Val Gly Asn Val Pro Gln Leu Gly Asn Trp Ser Pro Ala Asp Ala Val
850 855 860Lys Leu Glu Pro Ser Ala Tyr Pro Thr Trp Thr Gly Val Val Arg Asn865 870 875 880Leu Pro Pro Ser Ser Thr Val Glu Trp Lys Cys Ile Lys Arg Gln Glu
885 890 895Ala Gly Leu Pro Asn Thr Ala Asp Ala Trp Glu Pro Gly Gly Asn Asn
900 905 910Ile Leu Ser Thr Pro Pro Ser Gly Ser Ala Gly Ile Thr Thr Gly Ala
915 920 925Phe<210>4<211>3747<212>DNA<213>微生物<400>4tatgtcagca gcctaggaaa tctcatttct tcgagtgtca ccggagatac cttgacgcta 60actgttgata acggtgcgga gccgagtgat gacctcttga ttgttcaagc ggtgcaaaac 120ggtattttga aggtggatta tcgtccaaat agcataacgc cgagcgcgaa gacgccgatg 180ctggatccga acaaaacttg gtcagctgta ggagctacga ttaatacgac agccaatcca 240atgaccatca cgacttccaa tatgaagatt gagattacca agaatccagt acgaatgacg 300gtcaagaagg cggacggcac tacgctattc tgggaaccat caggcggagg ggtattctca 360gacggtgtgc gcttccttca tgccacaggg gataatatgt atggcatccg gagcttcaat 420gcttttgata gcgggggtga cctgctgcgg aattcgtcca atcatgccgc ccatgcgggt 480gaacagggag attccggtgg tccgcttatt tggagtacgg caggatatgg actattagtc 540gatagcgatg gcggctaccc ctatacagat agcacaaccg gtcaaatgga gttttattat 600ggtgggaccc ctcctgaggg acgtcgttat gcgaaacaaa acgtggaata ttatattatg 660ctcggaaccc ccaaggaaat tatgaccgac gtaggggaaa tcacagggaa accgcctatg 720ctgcctaagt ggtcgcttgg attcatgaac tttgagtggg atacgaatca aacggagttt 780acgaataatg tggatacgta tcgtgccaaa aatatcccca tagatgctta cgccttcgac 840tatgactgga aaaagtacgg ggaaaccaac tatggtgaat tcgcgtggaa tacgactaat 900ttcccttctg cgtcaacgac ttctttaaag tcaacaatgg atgctaaagg catcaaaatg 960atcggaatta caaaaccccg catcgttacg aaggatgctt cagcgaatgt gacgacccaa 1020gggacggacg cgacaaatgg cggttatttt tatccaggcc ataacgagta tcaggattat 1080ttcattcccg taactgtgcg tagtatcgat ccttacaatg ctaacgaacg tgcttggttc 1140tggaatcatt ccacagatgc gcttaataaa gggatcgtag gttggtggaa tgacgagacg 1200gataaagtat cttcgggtgg agcgttatat tggtttggca atttcacaac aggccacatg 1260tctcagacga tgtacgaagg ggggcgggct tacacgagtg gagcgcagcg tgtttggcaa 1320acggctagaa ccttctaccc aggtgcccag cggtatgcga ctacgctttg gtctggcgat 1380attggcattc aatacaataa aggcgaacgg atcaattggg ctgccgggat gcaggagcaa 1440agggcagtta tgctatcctc cgtgaacaat ggccaggtga aatggggcat ggataccggc 1500ggattcaatc agcaggatgg cacgacgaac aatccgaatc ccgatttata cgctcggtgg 1560atgcagttca gtgccctaac gcctgttttc cgagtgcatg ggaacaacca tcagcagcgc 1620cagccatggt acttcggatc gactgcggag gaggcctcca aagaggcaat tcagctgcgg 1680tactccctga tcccttatat gtatgcctat gagagaagtg cttacgagaa tgggaatggg 1740ctcgttcggc cattgatgca agcctatcca acagatgcgg ccgtcaaaaa ttacacggat 1800gcttggatgt ttggtgactg gctgctggct gcacctgtgg tagataaaca gcagacgagt 1860aaggatatct atttaccgtc tgggtcatgg attgactatg cgcgaggcaa tgcaataact 1920ggcggtcaaa ccatccgata ttcggttaat ccggacacgt tgacagacat gcctctcttt 1980attaaaaaag gtgccattat tccaacacag aaagtgcagg attacgtagg gcaggcttcc 2040gtcacttccg ttgatgtgga tgtgtttccg gatacgacgc agtcgagttt cacgtactac 2100gatgatgatg gcgccagtta taactatgag agcggcactt attttaagca aaatatgact 2160gctcaggata atgggtcagg ctcgttaagt tttactttag gagcaaagag tggcagttac 2220acgccggctc tccaatccta tatcgttaag ctgcacggtt ctgctggaac ttctgttacg 2280aataacagcg cagctatgac atcttatgca agcttggaag cattaaaagc tgctgctggg 2340gaaggctggg cgactgggaa ggacatttat ggggatgtca cctatgtgaa agtgacggca 2400ggtacagctt cttctaaatc tattgctgtt acaggtgttg ctgccgtgag cgcaactact 2460tcgcaatacg aagctgagga tgcatcgctt tctggcaatt cggttgctgc aaaggcgtcc 2520ataaacacga atcataccgg atatacggga actggatttg tagatggttt ggggaatgat 2580ggcgctggtg tcaccttcta tccaaaggtg aaaactggcg gtgactacaa tgtctccttg 2640cgttatgcga atgcttcagg cacggctaag tcagtcagta tttttgttaa tggaaaaaga 2700gtgaagtcca cctcgctcgc taatctcgca aattgggaca cttggtctac acaatctgag 2760acactgccgt tgacggcagg tgtgaatgtt gtgacctata aatattactc cgatgcggga 2820gatacaggca atgttaacat cgacaacatc acggtacctt ttgcgccaat tatcggtaag 2880tatgaagcag agagtgctga gctttctggt ggcagctcat tgaacacgaa ccattggtac 2940tacagtggta cggcttttgt agacggtttg agtgctgtag gcgcgcaggt gaaatacaac 3000gtgaatgtcc ctagcgcagg aagttatcag gtagcgctgc gatatgcgaa tggcagtgca 3060gcgacgaaaa cgttgagtac ttatatcaat ggagccaagc tggggcaaac cagttttacg 3120agtcctggta cgaattggaa tgtttggcag gataatgtgc aaacggtgac gttaaatgca 3180ggggcaaaca cgattgcgtt taaatacgac gccgctgaca gcgggaacat caacgtagat 3240cgtctgcttc tttcaacttc ggcagcggga acgccggttt ctgagcagaa cctgctagac 3300aatcccggtt tcgagcgtga cacgagtcaa accaataact ggattgagtg gcatccaggc 3360acgcaagctg ttgcttttgg cgttgatagc ggctcaacca ccaatccgcc ggaatccccg 3420tggtcgggtg ataagcgtgc ctacttcttt gcagcaggtg cctatcaaca aagcatccat 3480caaaccatta gtgttcctgt taataatgta aaatacaaat ttgaagcctg ggtccgcatg 3540aagaatacga cgccgacgac ggcaagagcc gaaattcaaa actatggcgg atcagccatt 3600tatgcgaaca taagtaacag cggtgtttgg aaatatatca gcgtaagtga tattatggtg 3660accaatggtc agatagatgt tggattttac gtggattcac ctggtggaac tacgcttcac 3720attgatgatg tgcgcgtaac caaacaa 3747<210>5<211>3753<212>DNA<213>微生物<400>5catgtgagcg cgctgggcaa cctgctttcc tcggcggtga ccggggatac gctcacgctg 60acgatcgata acggcgcgga accgaatgac gatattctag ttctgcaagc agtccagaac 120ggtattctga aggtggacta ccggccgaac ggtgtagctc caagcgcgga tacgccgatg 180ctggatccca ataaaacctg gccgtccata ggcgccgtta tcaatacagc ctctaatccg 240atgacgatca caacgccggc gatgaagatt gagattgcca aaaatccggt gcgcctgacc 300gtgaaaaaac cggacggcac cgctctgtta tgggaacccc cgaccggcgg cgtcttctcg 360gacggcgtcc gtttcttgca cgggacgggc gacaatatgt acggcatccg cagcttcaat 420gcttttgaca gcggcgggga tctgctgcgc aacagctcca cccaagccgc ccgtgcaggc 480gaccagggca actccggcgg cccgctgatc tggagcacag ccgggtacgg ggtgctcgtt 540gacagcgacg gtgggtatcc gttcacggac gaggctaccg gcaagctgga gttctattac 600ggcggcacgc ctccggaagg ccggcgctat acgaagcagg atgtggagta ctacatcatg 660ctcggcacgc cgaaagagat catgtccggc gtcggggaaa ttacgggcaa accgccgatg 720ctgcccaagt ggtccctggg ctttatgaac ttcgagtggg atctgaatga agctgagctc 780aagaaccatg tggatacgta ccgggccaaa aatattccga tcgacggcta tgcgatcgat 840ttcgattgga agaagtacgg cgagaataat tacggcgaat tcgcttggaa tacggccaat 900ttcccttccg ccgccacgac ggcgctgaag tcgcagatgg acgccaaggg cattaaaatg 960atcggcataa ccaagcctcg catcgcgacg aaggattttt cgaacaatcc taccgtgcag 1020ggaacggacg cggcgagcgg cggttatttt tatccgggac atagcgaata caaggactac 1080ttcatcccgg tctttgtgcg cagcatcgac ccttataacc ctgctgcacg ctcctggttc 1140tggaaccact ccaaggatgc gttcgataaa ggcatcgtag gctggtggaa cgacgagacg 1200gatgcggtat cgtcgggagg ggcctcctac tggttcggca attttacgac cggccatatg 1260tcccaggcgc tttacgaggg acagcgggca tatacgtcga acgcccagcg cgtctggcag 1320acagcgcgca cgttctatcc cggggcgcag cgttatgcga cgacgctctg gtcgggagac 1380atcgggattc agtataccaa gggggaaaga atcaactggg ctgccggcat gcaggagcag 1440cgggcggtga tgctttcttc gatcaacaac ggccaggtca aatggggaat ggacacaggc 1500ggcttcaacc agcaggacgg cacgacgaac aatccgaatc cggacctgta cgccagatgg 1560atgcagttca gcgcgctgac tccggtgttc cgcgtgcatg gcaacaatca ccagcagcgc 1620cagccttggt attatggctc gacagccgag gaggcatcca aggaagcgct ccagctccgt 1680tactccctga ttccttatat gtatgcttac gaaagaagcg cctacgagaa cggtaacgga 1740cttgtccggc cgctgatgca ggaataccct gccgatgcca acgccaaaaa ctatctcgat 1800gcctggatgt tcggcgattg gctgctggcg gcgcctgtgg tcgagaagca gcagacctcc 1860aaggaaatct atctccctgc aggcacttgg attgactaca accggggcac ggtgctcacc 1920ggcggccaga agatcagcta cgccgtcaat cccgacacgc tgacggatat tccgctcttc 1980attaagaagg gcgcgattat cccttcgcag aaggtgcagg actacgtggg ccaggctccc 2040gtccaaacgg tggatgtgga tgtattcccg aatacggcac aatcgagctt tacctattat 2100gacgatgacg gcagcagcta caattatgaa agcggagctt acttcaagca attgatgacg 2160gctcaggaca acggatccgg tgcgctgagc tttacgctgg gcgccaaaac cggcacgtac 2220agccccgcac tgcaatccta tatcgtcaag cttcacgggg ccgcaggcgc gtcggtgaca 2280agcaatgggg cggcgctggc ctcctatgcc agcctgcaag cgctgaaagc ctcagccagt 2340gaaggctggg ccaagggcaa ggacatctac ggcgatgtca cgtatgtcaa gctatccgcg 2400ggggcagcgg cggccaaggc gattgccgtc accggcaaca gcccggtcag cgtggcggat 2460gtgcagtacg aagccgaaga agcttcgctg tccggcaata cgacagcaac caaggcgacc 2520gtgaatacga accacgcagg ctacacgggc agcggcttcg tggatggact gagtaatccg 2580ggagcggcgg ttacgttcta tccgaaggtg aaaacgggcg gagactacaa tgtctcgctg 2640cgctacgcta attcgacggg agcggcaaag agcgtcagca tcttcgttaa cggcaagcgc 2700gtcaaatcca cgtcgctggc gaacctgccg aactgggata cgtgggggac gcaggctgag 2760acactgccgc tgacggcggg gacgaacgtt gtcacctaca agttctactc ggatgccgga 2820gatacgggct cggttaacct ggacaacatc acggtgccct tcgctccggc catcggcaaa 2880tacgaggcgg agagcgccga gctgagcggc ggcagcacgg tcaaccagaa tcattggttc 2940tacagcggca cggcatttgt agatggctta accgcaccgg gcgcccaagt caaatatacc 3000gtgaacgccc cggccgcagg cagctaccag atcgcgcttc gctatgcgaa cggcacgggt 3060gctgcgaaga cgctcagcac gtatgtgaac gggacgaagc tggggcaaac ggccttcgcc 3120agccctggcg gcaactggaa cgtgtggcag gacagcgtgc agaccgtcgc gctcgccgcc 3180ggtacgaaca cgatcgcgtt caagtacgat gccggcgaca gcggcagcgg cagcgtcaat 3240ctggaccgtc tgttgctctc tgccgcagcg ccaggcgtgc ccgtgtccga gcagaacctg 3300ctcgataacg ggggctttga acgcgatccg tcgcagagca gcaactggac cgagtggcat 3360ccggcttcgc aggcgattgc ttacggcatc gacagcggct ccgggatgaa tccgcctgaa 3420tcgccatggg caggcgataa gcgcgcctat ttctatgcgg caggcccgta tcagcaaagc 3480atccatcaaa cagtcagcgt gcctgtcaat aatgccaagt acaagttcga agcctgggta 3540ttgctgaaga atacaacacc gacaacggcc cgggtggaga ttcaaaatta cggcggttcg 3600ccgatcttca cgaacatcag taaagacggc gtctggaaat acatcagcgt cagcgatatt 3660caggtcacga acggccaaat cgatattggc ttctatgtgg attcgcccgg aggcaccacg 3720ctccacatcg acgatgtgcg ggtcaccaag caa 3753<210>6<211>2787<212>DNA<213>微生物<400>6gctcccctgg gcgtgcaacg cgcgcagttc cagtcggggt cgagctacct cgtcgtcgag 60gtgctcgatg acgacctcgt ccacttcgag ctggccgggg gcggcaccgc ccccggcacg 120ggctccccgc tgttcacgac gcctcaggtc gcgaagcacg actacgcggg acccgacgtg 180ttcacccaga ccgggtctgt tctgcagacc gcggcgatgc gcatcgaggt cgatcccgcg 240gatctgtgcg tgacggccac cgacatcacc cgcaccccga accttgtact gcacgaggcg 300tgtcccgccg acctcggcca ggcgtggaag gggctgaaca tcacgaggtc ggcgatggag 360aacgcctacg gtctcgggca gcagttcttc acgggcggca gcgcggacgg cgactgggtg 420ggccgcaccc gcaccccggg tggcacctac ggcaacgcga tggtgttcga ccccgagaac 480gggccggtcg gcaacacgca gatcccggtg ctcttcgcgg tcggcgatga caacgcgaac 540tacgggctgt tcgtcgatca gctgtacaag caggaatgga acctcaccgg cgacccgtgg 600acggtgcgca tgtggggcga ccaggtgcgc tggtacctca tgagcggcga cgacctgccc 660gaccttcgcc acgactacat ggagctgacg ggcaccccgc ccgtgccgcc gaagaaggcg 720ttcgggctct gggtgtcgga gttcggctac gacaactgga gcgaggtcga caatacgatc 780gcgggcctgc gctcggccga ctttccggtc gatggcgcga tgctcgacgt acagtggttc 840gggggcgtca ccgccgactc ggacgacacc cgcatgggca ccctcgattg ggacacgtcg 900aggtttcccg accctgcggg aaagatcgcc gacctcgccg aggacggcgt cggcatcatc 960ccgatcgagg agtcgtacgt cggtcgcaac ctgccggagc acgcccggat ggcggcggac 1020ggttacctcg tgcgctccgg ctgcgctacg tgcccgccgg tgtacctgac ggggaacccc 1080tggtggggca agggcgggat gatcgactgg acgcagccgg aagccggcgc cgtctggcac 1140gacgagcagc gccagcatct cgtcgacgag ggcgtactgg gccactggct cgatctcggc 1200gaaccggaga tgtacgaccc gaacgactgg accgccggcg tcatccccgg caagcacgcg 1260cacgccgact atcacaacgc gtacaacctg ctgtgggcgc agagcatcgc cgacgggtac 1320gccgacaacg gcgtgcagaa gcgtcccttc atgctgacgc gcgccgcggc cgccggcatc 1380cagcgtcatg gcgcgggcat gtggtcagcc gacatcgggt cgaccatgaa ggcgctcggg 1440agccagcaga acgcgcagat gcacatgtcg atgtcgggga tcgactatta cggctccgac 1500atcggcgggt tccggcggga gatggccgac ggcgacgtga acgagctcta cacccagtgg 1560ttcgccgaca gcgcgtggtt cgacactccg ctccggccgc acaccgacaa tctctgcaac 1620tgcctcgaga cgagccccga ctcgatcggc gacgtcgcga gcaaccgcga gaacctggtg 1680cgccgctacg agctggctcc gtactactac tcgctcgcgc accgcgctca ccagttcggc 1740gagccgctcg ctcccccgct cgtgtactac taccagaacg acgaccacgt tcgcgagatg 1800gggcatcaga agatgctcgg gcgcgacctg ctgatcgcga tcgtcgccgg agagggcgag 1860cgggaacgcg acgtgtacct tccggcgggc gagtggatcg acatccacac gaacgagcgc 1920atccagagca cgggtcagtg gatcgacaac gtgccgctgt ggcgtgacgg cgtcttcacc 1980ctgccggcgt acgcccgggc gggggcgatc atcccgaagg ccttcgtcga cgcctccacg 2040aaggacatca ccggcaagcg cgaggatgcc gcggtgcgca acgagctgat cgcaaccgtt 2100tacgccgacg acgtcgcgag cgacttcacc ctgtacgagg atgacggcgc gacgaccgca 2160tacgccgacg gggctgtcag gaccacgcag atcagccaat cgctcacgaa cggcgtggcc 2220acggtgacgg tgggagcggc atctggaacc tactccggtg cgccctccac ccgtcccacg 2280gtcgtcgagc ttgtcactga cggcacgcag gcctcgaccg tctccctcgg cagcgttccg 2340ctgacggagc acgcgaacaa ggcggcgttc gacgcggcga gcagcggctg gtacaacgcc 2400ggcggggggc tcgttgtggc caaggcggcg agcagttcgg tgaacaccgc caagaccttc 2460tcgttcacgc tcggtgagga gtcggtctgg gcgacgttct cctgcgagaa cgccacgacg 2520accttcggtc agtcagtgta cgtcgtcgga aatgttccgc agctcggcaa ctggtcgccg 2580gcggatgccg tgaagctcga gccgagcgcc taccccacct ggaccggggt ggtgcggaac 2640ctgccgccgt cgagcacggt cgaatggaag tgcatcaaac gtcaggaggc cggcctgccg 2700aacacggcgg atgcgtggga gcccggcggg aacaacatcc tctcgacgcc accttccggc 2760tcggcgggga taaccaccgg cgccttc 2787<210>7<211>9<212>PRT<213>微生物<400>7Tyr Val Ser Ser Leu Gly Asn Leu Ile1 5<210>8<211>10<212>PRT<213>微生物<400>8Asp Ile Tyr Gly Asp Val Thr Tyr Val Lys1 5 10<210>9<211>14<212>PRT<213>微生物<400>9Gln Pro Trp Tyr Phe Gly Ser Thr Ala Glu Glu Ala Ser Lys1 5 10<210>10<211>31<212>PRT<213>微生物<400>10Ala Ser Ile Asn Thr Asn His Thr Gly Tyr Thr Gly Thr Gly Phe Val1 5 10 15Asp Gly Leu Gly Asn Asp Gly Ala Gly Val Thr Phe Tyr Pro Lys
20 25 30<210>11<211>25<212>PRT<213>微生物<400>11Leu Leu Leu Ser Thr Ser Ala Ala Gly Thr Pro Val Ser Glu Gln Asn1 5 10 15Leu Leu Asp Asn Pro Gly Phe Glu Arg
20 25<210>12<211>14<212>PRT<213>微生物<400>12Asp Ile Tyr Leu Pro Ser Gly Ser Trp Ile Asp Tyr Ala Arg1 5 10<210>13<211>33<212>PRT<213>微生物<400>13Asp Ala Ser Ala Asn Val Thr Thr Gln Gly Thr Asp Ala Thr Asn Gly1 5 10 15Gly Tyr Phe Tyr Pro Gly His Asn Glu Tyr Gln Asp Tyr Phe Ile Pro
20 25 30Val<210>14<211>24<212>PRT<213>微生物<400>14Tyr Tyr Ser Asp Ala Gly Asp Thr Gly Asn Val Asn Ile Asp Asn Ile1 5 10 15Thr Val Pro Phe Ala Pro Ile Ile
20<210>15<211>16<212>PRT<213>微生物<400>15Ser Thr Ser Leu Ala Asn Leu Ala Asn Trp Asp Thr Trp Ser Thr Gln1 5 10 15<210>16<211>17<212>PRT<213>微生物<400>16Trp Ser Leu Gly Phe Met Asn Phe Glu Trp Asp Thr Asn Gln Thr Glu1 5 10 15Phe<210>17<211>20<212>PRT<213>微生物<400>17Asn Tyr Thr Asp Ala Trp Met Phe Gly Asp Trp Leu Leu Ala Ala Pro1 5 10 15Val Val Asp Lys
20<210>18<211>5294<212>DNA<213>微生物<220><221>CDS<222>(937)...(4785)<400>18atctaccggt ttttgtgaag tttggcagta ttcttccgat gaatttgaac gcgcaatatc 60aagtgggcgg gaccattggc aacagcttga cgagctacac gaatctcgcg ttccgcattt 120atccgcttgg gacaacaacg tacgactgga atgatgatat tggcggttcg gtgaaaacca 180taacttctac agagcaatat gggttgaata aagaaaccgt gactgttcca gcgattaatt 240ctaccaagac attgcaagtg tttacgacta agccttcctc tgtaacggtg ggtggttctg 360tgatgacaga gtacagtact ttaactgccc taacgggagc gtcgacaggc tggtactatg 420atactgtaca gaaattcact tacgtcaagc ttggttcaag tgcatctgct caatccgttg 480tgctaaatgg cgttaataag gtggaatatg aagcagaatt cggcgtgcaa agcggcgttt 540caacgaacac gaaccatgca ggttatactg gtacaggatt tgtggacggc tttgagactc 600ttggagacaa tgttgctttt gatgtttccg tcaaagccgc aggtacttat acgatgaagg 660ttcggtattc atccggtgca ggcaatggct caagagccat ctatgtgaat aacaccaaag 720tgacggacct tgccttgccg caaacaacaa gctgggatac atgggggact gctacgttta 780gcgtctcgct gagtacaggt ctcaacacgg tgaaagtcag ctatgatggt accagttcac 840ttggcattaa tttcgataac atcgcgattg tagagcaata aaaggtcggg agggcaagtc 900cctcccttaa tttctaatcg aaagggagta tccttg 936atg cgt cca cca aac aaa gaa att cca cgt att ctt gct ttt ttt aca 978Met Arg Pro Pro Asn Lys Glu Ile Pro Arg Ile Leu Ala Phe Phe Thr1 5 10 15gcg ttt acg ttg ttt ggt tca acc ctt gcc ttg ctt cct gct ccg cct 1026Ala Phe Thr Leu Phe Gly Ser Thr Leu Ala Leu Leu Pro Ala Pro Pro
20 25 30gcg cat gcc tat gtc agc agc cta gga aat ctc att tct tcg agt gtc 1074Ala His Ala Tyr Val Ser Ser Leu Gly Asn Leu Ile Ser Ser Ser Val
35 40 45acc gga gat acc ttg acg cta act gtt gat aac ggt gcg gag ccg agt 1122Thr Gly Asp Thr Leu Thr Leu Thr Val Asp Asn Gly Ala Glu Pro Ser
50 55 60gat gac ctc ttg att gtt caa gcg gtg caa aac ggt att ttg aag gtg 1170Asp Asp Leu Leu Ile Val Gln Ala Val Gln Asn Gly Ile Leu Lys Val65 70 75 80gat tat cgt cca aat agc ata acg ccg agc gcg aag acg ccg atg ctg 1218Asp Tyr Arg Pro Asn Ser Ile Thr Pro Ser Ala Lys Thr Pro Met Leu
85 90 95gat ccg aac aaa act tgg tca gct gta gga gct acg att aat acg aca 1266Asp Pro Asn Lys Thr Trp Ser Ala Val Gly Ala Thr Ile Asn Thr Thr
100 105 110gcc aat cca atg acc atc acg act tcc aat atg aag att gag att acc 1314Ala Asn Pro Met Thr Ile Thr Thr Ser Asn Met Lys Ile Glu Ile Thr
115 120 125aag aat cca gta cga atg acg gtc aag aag gcg gac ggc act acg cta 1362Lys Asn Pro Val Arg Met Thr Val Lys Lys Ala Asp Gly Thr Thr Leu
130 135 140ttc tgg gaa cca tca ggc gga ggg gta ttc tca gac ggt gtg cgc ttc 1410Phe Trp Glu Pro Ser Gly Gly Gly Val Phe Ser Asp Gly Val Arg Phe145 150 155 160ctt cat gcc aca ggg gat aat atg tat ggc atc cgg agc ttc aat gct 1458Leu His Ala Thr Gly Asp Asn Met Tyr Gly Ile Arg Ser Phe Asn Ala
165 170 175ttt gat agc ggg ggt gac ctg ctg cgg aat tcg tcc aat cat gcc gcc 1506Phe Asp Ser Gly Gly Asp Leu Leu Arg Asn Ser Ser Asn His Ala Ala
180 185 190cat gcg ggt gaa cag gga gat tcc ggt ggt ccg ctt att tgg agt acg 1554His Ala Gly Glu Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ile Trp Ser Thr
195 200 205gca gga tat gga cta tta gtc gat agc gat ggc ggc tac ccc tat aca 1602Ala Gly Tyr Gly Leu Leu Val Asp Ser Asp Gly Gly Tyr Pro Tyr Thr
210 215 220gat agc aca acc ggt caa atg gag ttt tat tat ggt ggg acc cct cct 1650Asp Ser Thr Thr Gly Gln Met Glu Phe Tyr Tyr Gly Gly Thr Pro Pro225 230 235 240gag gga cgt cgt tat gcg aaa caa aac gtg gaa tat tat att atg ctc 1698Glu Gly Arg Arg Tyr Ala Lys Gln Asn Val Glu Tyr Tyr Ile Met Leu
245 250 255gga acc ccc aag gaa att atg acc gac gta ggg gaa atc aca ggg aaa 1746Gly Thr Pro Lys Glu Ile Met Thr Asp Val Gly Glu Ile Thr Gly Lys
260 265 270ccg cct atg ctg cct aag tgg tcg ctt gga ttc atg aac ttt gag tgg 1794Pro Pro Met Leu Pro Lys Trp Ser Leu Gly Phe Met Asn Phe Glu Trp
275 280 285gat acg aat caa acg gag ttt acg aat aat gtg gat acg tat cgt gcc 1842Asp Thr Asn Gln Thr Glu Phe Thr Asn Asn Val Asp Thr Tyr Arg Ala
290 295 300aaa aat atc ccc ata gat gct tac gcc ttc gac tat gac tgg aaa aag 1890Lys Asn Ile Pro Ile Asp Ala Tyr Ala Phe Asp Tyr Asp Trp Lys Lys305 310 315 320tac ggg gaa acc aac tat ggt gaa ttc gcg tgg aat acg act aat ttc 1938Tyr Gly Glu Thr Asn Tyr Gly Glu Phe Ala Trp Asn Thr Thr Asn Phe
325 330 335cct tct gcg tca acg act tct tta aag tca aca atg gat gct aaa ggc 1986Pro Ser Ala Ser Thr Thr Ser Leu Lys Ser Thr Met Asp Ala Lys Gly
340 345 350atc aaa atg atc gga att aca aaa ccc cgc atc gtt acg aag gat gct 2034Ile Lys Met Ile Gly Ile Thr Lys Pro Arg Ile Val Thr Lys Asp Ala
355 360 365tca gcg aat gtg acg acc caa ggg acg gac gcg aca aat ggc ggt tat 2082Ser Ala Asn Val Thr Thr Gln Gly Thr Asp Ala Thr Asn Gly Gly Tyr
370 375 380ttt tat cca ggc cat aac gag tat cag gat tat ttc att ccc gta act 2130Phe Tyr Pro Gly His Asn Glu Tyr Gln Asp Tyr Phe Ile Pro Val Thr385 390 395 400gtg cgt agt atc gat cct tac aat gct aac gaa cgt gct tgg ttc tgg 2178Val Arg Ser Ile Asp Pro Tyr Asn Ala Asn Glu Arg Ala Trp Phe Trp
405 410 415aat cat tcc aca gat gcg ctt aat aaa ggg atc gta ggt tgg tgg aat 2226Asn His Ser Thr Asp Ala Leu Asn Lys Gly Ile Val Gly Trp Trp Asn
420 425 430gac gag acg gat aaa gta tct tcg ggt gga gcg tta tat tgg ttt ggc 2274Asp Glu Thr Asp Lys Val Ser Ser Gly Gly Ala Leu Tyr Trp Phe Gly
435 440 445aat ttc aca aca ggc cac atg tct cag acg atg tac gaa ggg ggg cgg 2322Asn Phe Thr Thr Gly His Met Ser Gln Thr Met Tyr Glu Gly Gly Arg
450 455 460gct tac acg agt gga gcg cag cgt gtt tgg caa acg gct aga acc ttc 2370Ala Tyr Thr Ser Gly Ala Gln Arg Val Trp Gln Thr Ala Arg Thr Phe465 470 475 480tac cca ggt gcc cag cgg tat gcg act acg ctt tgg tct ggc gat att 2418Tyr Pro Gly Ala Gln Arg Tyr Ala Thr Thr Leu Trp Ser Gly Asp Ile
485 490 495ggc att caa tac aat aaa ggc gaa cgg atc aat tgg gct gcc ggg atg 2466Gly Ile Gln Tyr Asn Lys Gly Glu Arg Ile Asn Trp Ala Ala Gly Met
500 505 510cag gag caa agg gca gtt atg cta tcc tcc gtg aac aat ggc cag gtg 2514Gln Glu Gln Arg Ala Val Met Leu Ser Ser Val Asn Asn Gly Gln Val
515 520 525aaa tgg ggc atg gat acc ggc gga ttc aat cag cag gat ggc acg acg 2562Lys Trp Gly Met Asp Thr Gly Gly Phe Asn Gln Gln Asp Gly Thr Thr
530 535 540aac aat ccg aat ccc gat tta tac gct cgg tgg atg cag ttc agt gcc 2610Asn Asn Pro Asn Pro Asp Leu Tyr Ala Arg Trp Met Gln Phe Ser Ala545 550 555 560cta acg cct gtt ttc cga gtg cat ggg aac aac cat cag cag cgc cag 2658Leu Thr Pro Val Phe Arg Val His Gly Asn Asn His Gln Gln Arg Gln
565 570 575cca tgg tac ttc gga tcg act gcg gag gag gcc tcc aaa gag gca att 2706Pro Trp Tyr Phe Gly Ser Thr Ala Glu Glu Ala Ser Lys Glu Ala Ile
580 585 590cag ctg cgg tac tcc ctg atc cct tat atg tat gcc tat gag aga agt 2754Gln Leu Arg Tyr Ser Leu Ile Pro Tyr Met Tyr Ala Tyr Glu Arg Ser
595 600 605gct tac gag aat ggg aat ggg ctc gtt cgg cca ttg atg caa gcc tat 2802Ala Tyr Glu Asn Gly Asn Gly Leu Val Arg Pro Leu Met Gln Ala Tyr
610 615 620cca aca gat gcg gcc gtc aaa aat tac acg gat gct tgg atg ttt ggt 2850Pro Thr Asp Ala Ala Val Lys Asn Tyr Thr Asp Ala Trp Met Phe Gly625 630 635 640gac tgg ctg ctg gct gca cct gtg gta gat aaa cag cag acg agt aag 2898Asp Trp Leu Leu Ala Ala Pro Val Val Asp Lys Gln Gln Thr Ser Lys
645 650 655gat atc tat tta ccg tct ggg tca tgg att gac tat gcg cga ggc aat 2946Asp Ile Tyr Leu Pro Ser Gly Ser Trp Ile Asp Tyr Ala Arg Gly Asn
660 665 670gca ata act ggc ggt caa acc atc cga tat tcg gtt aat ccg gac acg 2994Ala Ile Thr Gly Gly Gln Thr Ile Arg Tyr Ser Val Asn Pro Asp Thr
675 680 685ttg aca gac atg cct ctc ttt att aaa aaa ggt gcc att att cca aca 3042Leu Thr Asp Met Pro Leu Phe Ile Lys Lys Gly Ala Ile Ile Pro Thr
690 695 700cag aaa gtg cag gat tac gta ggg cag gct tcc gtc act tcc gtt gat 3090Gln Lys Val Gln Asp Tyr Val Gly Gln Ala Ser Val Thr Ser Val Asp705 710 715 720gtg gat gtg ttt ccg gat acg acg cag tcg agt ttc acg tac tac gat 3138Val Asp Val Phe Pro Asp Thr Thr Gln Ser Ser Phe Thr Tyr Tyr Asp
725 730 735gat gat ggc gcc agt tat aac tat gag agc ggc act tat ttt aag caa 3186Asp Asp Gly Ala Ser Tyr Asn Tyr Glu Ser Gly Thr Tyr Phe Lys Gln
740 745 750aat atg act gct cag gat aat ggg tca ggc tcg tta agt ttt act tta 3234Asn Met Thr Ala Gln Asp Asn Gly Ser Gly Ser Leu Ser Phe Thr Leu
755 760 765gga gca aag agt ggc agt tac acg ccg gct ctc caa tcc tat atc gtt 3282Gly Ala Lys Ser Gly Ser Tyr Thr Pro Ala Leu Gln Ser Tyr Ile Val
770 775 780aag ctg cac ggt tct gct gga act tct gtt acg aat aac agc gca gct 3330Lys Leu His Gly Ser Ala Gly Thr Ser Val Thr Asn Asn Ser Ala Ala785 790 795 800atg aca tct tat gca agc ttg gaa gca tta aaa gct gct gct ggg gaa 3378Met Thr Ser Tyr Ala Ser Leu Glu Ala Leu Lys Ala Ala Ala Gly Glu
805 810 815ggc tgg gcg act ggg aag gac att tat ggg gat gtc acc tat gtg aaa 3428Gly Trp Ala Thr Gly Lys Asp Ile Tyr Gly Asp Val Thr Tyr Val Lys
820 825 830gtg acg gca ggt aca gct tct tct aaa tct att gct gtt aca ggt gtt 3474Val Thr Ala Gly Thr Ala Ser Ser Lys Ser Ile Ala Val Thr Gly Val
835 840 845gct gcc gtg agc gca act act tcg caa tac gaa gct gag gat gca tcg 3522Ala Ala Val Ser Ala Thr Thr Ser Gln Tyr Glu Ala Glu Asp Ala Ser
850 855 860ctt tct ggc aat tcg gtt gct gca aag gcg tcc ata aac acg aat cat 3570Leu Ser Gly Asn Ser Val Ala Ala Lys Ala Ser Ile Asn Thr Asn His865 870 875 880acc gga tat acg gga act gga ttt gta gat ggt ttg ggg aat gat ggc 3618Thr Gly Tyr Thr Gly Thr Gly Phe Val Asp Gly Leu Gly Asn Asp Gly
885 890 895gct ggt gtc acc ttc tat cca aag gtg aaa act ggc ggt gac tac aat 3666Ala Gly Val Thr Phe Tyr Pro Lys Val Lys Thr Gly Gly Asp Tyr Asn
900 905 910gtc tcc ttg cgt tat gcg aat gct tca ggc acg gct aag tca gtc agt 3714Val Ser Leu Arg Tyr Ala Asn Ala Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Ser
915 920 925att ttt gtt aat gga aaa aga gtg aag tcc acc tcg ctc gct aat ctc 3762Ile Phe Val Asn Gly Lys Arg Val Lys Ser Thr Ser Leu Ala Asn Leu
930 935 940gca aat tgg gac act tgg tct aca caa tct gag aca ctg ccg ttg acg 3810Ala Asn Trp Asp Thr Trp Ser Thr Gln Ser Glu Thr Leu Pro Leu Thr945 950 955 960gca ggt gtg aat gtt gtg acc tat aaa tat tac tcc gat gcg gga gat 3858Ala Gly Val Asn Val Val Thr Tyr Lys Tyr Tyr Ser Asp Ala Gly Asp
965 970 975aca ggc aat gtt aac atc gac aac atc acg gta cct ttt gcg cca att 3906Thr Gly Asn Val Asn Ile Asp Asn Ile Thr Val Pro Phe Ala Pro Ile
980 985 990atc ggt aag tat gaa gca gag agt gct gag ctt tct ggt ggc agc tca 3954Ile Gly Lys Tyr Glu Ala Glu Ser Ala Glu Leu Ser Gly Gly Ser Ser
995 1000 1005ttg aac acg aac cat tgg tac tac agt ggt acg gct ttt gta gac ggt 4002Leu Asn Thr Asn His Trp Tyr Tyr Ser Gly Thr Ala Phe Val Asp Gly
1010 1015 1020ttg agt gct gta ggc gcg cag gtg aaa tac aac gtg aat gtc cct agc 4050Leu Ser Ala Val Gly Ala Gln Val Lys Tyr Asn Val Asn Val Pro Ser1025 1030 1035 1040gca gga agt tat cag gta gcg ctg cga tat gcg aat ggc agt gca gcg 4098Ala Gly Ser Tyr Gln Val Ala Leu Arg Tyr Ala Asn Gly Ser Ala Ala
1045 1050 1055acg aaa acg ttg agt act tat atc aat gga gcc aag ctg ggg caa acc 4146Thr Lys Thr Leu Ser Thr Tyr Ile Asn Gly Ala Lys Leu Gly Gln Thr
1060 1065 1070agt ttt acg agt cct ggt acg aat tgg aat gtt tgg cag gat aat gtg 4194Ser Phe Thr Ser Pro Gly Thr Asn Trp Asn Val Trp Gln Asp Asn Val
1075 1080 1085caa acg gtg acg tta aat gca ggg gca aac acg att gcg ttt aaa tac 4242Gln Thr Val Thr Leu Asn Ala Gly Ala Asn Thr Ile Ala Phe Lys Tyr 1090 1095 1100gac gcc gct gac agc ggg aac atc aac gta gat cgt ctg ctt ctt tca 4290Asp Ala Ala Asp Ser Gly Asn Ile Asn Val Asp Arg Leu Leu Leu Ser1105 1110 1115 1120act tcg gca gcg gga acg ccg gtt tct gag cag aac ctg cta gac aat 4338Thr Ser Ala Ala Gly Thr Pro Val Ser Glu Gln Asn Leu Leu Asp Asn
1125 1130 1135ccc ggt ttc gag cgt gac acg agt caa acc aat aac tgg att gag tgg 4386Pro Gly Phe Glu Arg Asp Thr Ser Gln Thr Asn Asn Trp Ile Glu Trp
1140 1145 1150cat cca ggc acg caa gct gtt gct ttt ggc gtt gat agc ggc tca acc 4434His Pro Gly Thr Gln Ala Val Ala Phe Gly Val Asp Ser Gly Ser Thr
1155 1160 1165acc aat ccg ccg gaa tcc ccg tgg tcg ggt gat aag cgt gcc tac ttc 4482Thr Asn Pro Pro Glu Ser Pro Trp Ser Gly Asp Lys Arg Ala Tyr Phe1170 1175 1180ttt gca gca ggt gcc tat caa caa agc atc cat caa acc att agt gtt 4530Phe Ala Ala Gly Ala Tyr Gln Gln Ser Ile His Gln Thr Ile Ser Val1185 1190 1195 1200cct gtt aat aat gta aaa tac aaa ttt gaa gcc tgg gtc cgc atg aag 4578Pro Val Asn Asn Val Lys Tyr Lys Phe Glu Ala Trp Val Arg Met Lys
1205 1210 1215aat acg acg ccg acg acg gca aga gcc gaa att caa aac tat ggc gga 4626Asn Thr Thr Pro Thr Thr Ala Arg Ala Glu Ile Gln Asn Tyr Gly Gly
1220 1225 1230tca gcc att tat gcg aac ata agt aac agc ggt gtt tgg aaa tat atc 4674Ser Ala Ile Tyr Ala Asn Ile Ser Asn Ser Gly Val Trp Lys Tyr Ile
1235 1240 1245agc gta agt gat att atg gtg acc aat ggt cag ata gat gtt gga ttt 4722Ser Val Ser Asp Ile Met Val Thr Asn Gly Gln Ile Asp Val Gly Phe1250 1255 1260tac gtg gat tca cct ggt gga act acg ctt cac att gat gat gtg cgc 4770Tyr Val Asp Ser Pro Gly Gly Thr Thr Leu His Ile Asp Asp Val Arg1265 1270 1275 1280gta acc aaa caa taa 4785Val Thr Lys Gln
1284acaaacaacc agctctcccg ttaatgggag ggctggttgt ttgttatgat aatccatcta 4845tttagagtgg attaaacgtt ttgaagtgct tgctgaactt cttgcacaat ggataacgcc 4905gcggtgcggg cacttgagaa agcacgttct gcaagctctc ccttacctgt acagccgtct 4965ccgcagaagt agaaaggaac gttttccacg cgtatcggca gcagattatt ggaagcaatg 5025tttttcacgc tggaaaccat cgctttcttg gaaacccgtt tcacggctgt gacatcgcgc 5085cagcctggat aatgtttatc aaataaggct tccatttgga ggttcttctc ttccaggtac 5145gctttgcgct gctcctcgtt atcaaagcgg tcgcttaagt atgcgatacc ttgcagcagc 5265tgcccgcctt ctggtactag tgtgtgatc 5294<210>19<211>8<212>PRT<213>微生物<400>19His Val Ser Ala Leu Gly Asn Leu1 5<210>20<211>19<212>PRT<213>微生物<400>20Thr Gly Gly Asp Tyr Asn Val Ser Leu Arg Tyr Ala Asn Ser Thr Gly1 5 10 15Ala Ala Lys<210>21<211>20<212>PRT<213>微生物<400>21Asp Phe Ser Asn Asn Pro Thr Val Gln Gly Thr Asp Ala Ala Ser Gly1 5 10 15Gly Tyr Phe Tyr
20<210>22<211>25<212>PRT<213>微生物<400>22Tyr Thr Val Asn Ala Pro Ala Ala Gly Ser Tyr Gln Ile Ala Leu Arg1 5 10 15Try Ala Asn Gly Thr Gly Ala Ala Lys
20 25<210>23<211>25<212>PRT<213>微生物<400>23Tyr Glu Ala Glu Ser Ala Glu Leu Ser Gly Gly Ser Thr Val Asn Gln1 5 10 15Asn His Trp Phe Tyr Ser Gly Thr Ala
20 25<210>24<211>11<212>PRT<213>微生物<400>24Asn Tyr Leu Asp Ala Trp Met Phe Gly Asp Trpl 5 10<210>25<211>4991<212>DNA<213>微生物<220><221>CDS<222>(466)...(4326)<400>25ggtaccggct ttgtcgacgg cttcgatgcg gcaggcgatg cagtgacctt cgacgtatcc 60gtcaaagcgg ccggcacgta tgcgctcaag gtccggtacg cttccgctgg tggcaacgct 120tcacgcgcta tctatgtcaa caacgccaag gtgaccgatc tggcgcttcc ggcaacggcc 180aactgggaca cctgggggac ggcaaccgtc aacgtagcct taaacgccgg ctacaactcg 240atcaaggtca gctacgacaa caccaatacg ctcggcatta atctcgataa cattgcgatc 300gtggagcatt gacagcagga atcttcgcga ggaatgagtt agcgaagagt tcatgcaggc 360agaggggtta cccataattg taaagcccgg cgcagccagg caccaagtat gcccgggagg 420gccgccggcc ctccctttat ttcaatgatg aaaggcggca tcgat atg ggt cta tgg 477
Met Gly Leu Trp
1aac aaa cga gtc act cgc atc ctc tcc gta ctc gca gca agc gcg ctg 525Asn Lys Arg Val Thr Arg Ile Leu Ser Val Leu Ala Ala Ser Ala Leu5 10 15 20atc ggc tct acc gta cct tct cta gcg cca cct ccc gct caa gcc cat 573Ile Gly Ser Thr Val Pro Ser Leu Ala Pro Pro Pro Ala Gln Ala His
25 30 35gtg agc gcg ctg ggc aac ctg ctt tcc tcg gcg gtg acc ggg gat acg 621Val Ser Ala Leu Gly Asn Leu Leu Ser Ser Ala Val Thr Gly Asp Thr
40 45 50ctc acg ctg acg atc gat aac ggc gcg gaa ccg aat gac gat att cta 669Leu Thr Leu Thr Ile Asp Asn Gly Ala Glu Pro Asn Asp Asp Ile Leu
55 60 65gtt ctg caa gca gtc cag aac ggt att ctg aag gtg gac tac cgg ccg 717Val Leu Gln Ala Val Gln Asn Gly Ile Leu Lys Val Asp Tyr Arg Pro
70 75 80aac ggt gta gct cca agc gcg gat acg ccg atg ctg gat ccc aat aaa 765Asn Gly Val Ala Pro Ser Ala Asp Thr Pro Met Leu Asp Pro Asn Lys85 90 95 100acc tgg ccg tcc ata ggc gcc gtt atc aat aca gcc tct aat ccg atg 813Thr Trp Pro Ser Ile Gly Ala Val Ile Asn Thr Ala Ser Asn Pro Met
105 110 115acg atc aca acg ccg gcg atg aag att gag att gcc aaa aat ccg gtg 861Thr Ile Thr Thr Pro Ala Met Lys Ile Glu Ile Ala Lys Asn Pro Val
120 125 130cgc ctg acc gtg aaa aaa ccg gac ggc acc gct ctg tta tgg gaa ccc 909Arg Leu Thr Val Lys Lys Pro Asp Gly Thr Ala Leu Leu Trp Glu Pro
135 140 145ccg acc ggc ggc gtc ttc tcg gac ggc gtc cgt ttc ttg cac ggg acg 957Pro Thr Gly Gly Val Phe Ser Asp Gly Val Arg Phe Leu His Gly Thr
150 155 160ggc gac aat atg tac ggc atc cgc agc ttc aat gct ttt gac agc ggc 1005Gly Asp Asn Met Tyr Gly Ile Arg Ser Phe Asn Ala Phe Asp Ser Gly165 170 175 180ggg gat ctg ctg cgc aac agc tcc acc caa gcc gcc cgt gca ggc gac 1053Gly Asp Leu Leu Arg Asn Ser Ser Thr Gln Ala Ala Arg Ala Gly Asp
185 190 195cag ggc aac tcc ggc ggc ccg ctg atc tgg agc aca gcc ggg tac ggg 1101Gln Gly Asn Ser Gly Gly Pro Leu Ile Trp Ser Thr Ala Gly Tyr Gly
200 205 210gtg ctc gtt gac agc gac ggt ggg tat ccg ttc acg gac gag gct acc 1149Val Leu Val Asp Ser Asp Gly Gly Tyr Pro Phe Thr Asp Glu Ala Thr
215 220 225ggc aag ctg gag ttc tat tac ggc ggc acg cct ccg gaa ggc cgg cgc 1197Gly Lys Leu Glu Phe Tyr Tyr Gly Gly Thr Pro Pro Glu Gly Arg Arg
230 235 240tat acg aag cag gat gtg gag tac tac atc atg ctc ggc acg ccg aaa 1245Tyr Thr Lys Gln Asp Val Glu Tyr Tyr Ile Met Leu Gly Thr Pro Lys245 250 255 260gag atc atg tcc ggc gtc ggg gaa att acg ggc aaa ccg ccg atg ctg 1293Glu Ile Met Ser Gly Val Gly Glu Ile Thr Gly Lys Pro Pro Met Leu
265 270 275ccc aag tgg tcc ctg ggc ttt atg aac ttc gag tgg gat ctg aat gaa 1341Pro Lys Trp Ser Leu Gly Phe Met Asn Phe Glu Trp Asp Leu Asn Glu
280 285 290gct gag ctc aag aac cat gtg gat acg tac cgg gcc aaa aat att ccg 1389Ala Glu Leu Lys Asn His Val Asp Thr Tyr Arg Ala Lys Asn Ile Pro
295 300 305atc gac ggc tat gcg atc gat ttc gat tgg aag aag tac ggc gag aat 1437Ile Asp Gly Tyr Ala Ile Asp Phe Asp Trp Lys Lys Tyr Gly Glu Asn
310 315 320aat tac ggc gaa ttc gct tgg aat acg gcc aat ttc cct tcc gcc gcc 1485Asn Tyr Gly Glu Phe Ala Trp Asn Thr Ala Asn Phe Pro Ser Ala Ala325 330 335 340acg acg gcg ctg aag tcg cag atg gac gcc aag ggc att aaa atg atc 1533Thr Thr Ala Leu Lys Ser Gln Met Asp Ala Lys Gly Ile Lys Met Ile
345 350 355ggc ata acc aag cct cgc atc gcg acg aag gat ttt tcg aac aat cct 1581Gly Ile Thr Lys Pro Arg Ile Ala Thr Lys Asp Phe Ser Asn Asn Pro
360 365 370acc gtg cag gga acg gac gcg gcg agc ggc ggt tat ttt tat ccg gga 1629Thr Val Gln Gly Thr Asp Ala Ala Ser Gly Gly Tyr Phe Tyr Pro Gly
375 380 385cat agc gaa tac aag gac tac ttc atc ccg gtc ttt gtg cgc agc atc 1677His Ser Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe Ile Pro Val Phe Val Arg Ser Ile
390 395 400gac cct tat aac cct gct gca cgc tcc tgg ttc tgg aac cac tcc aag 1725Asp Pro Tyr Asn Pro Ala Ala Arg Ser Trp Phe Trp Asn His Ser Lys405 410 415 420gat gcg ttc gat aaa ggc atc gta ggc tgg tgg aac gac gag acg gat 1773Asp Ala Phe Asp Lys Gly Ile Val Gly Trp Trp Asn Asp Glu Thr Asp
425 430 435gcg gta tcg tcg gga ggg gcc tcc tac tgg ttc ggc aat ttt acg acc 1821Ala Val Ser Ser Gly Gly Ala Ser Tyr Trp Phe Gly Asn Phe Thr Thr
440 445 450ggc cat atg tcc cag gcg ctt tac gag gga cag cgg gca tat acg tcg 1869Gly His Met Ser Gln Ala Leu Tyr Glu Gly Gln Arg Ala Tyr Thr Ser
455 460 465aac gcc cag cgc gtc tgg cag aca gcg cgc acg ttc tat ccc ggg gcg 1917Asn Ala Gln Arg Val Trp Gln Thr Ala Arg Thr Phe Tyr Pro Gly Ala
470 475 480cag cgt tat gcg acg acg ctc tgg tcg gga gac atc ggg att cag tat 1965Gln Arg Tyr Ala Thr Thr Leu Trp Ser Gly Asp Ile Gly Ile Gln Tyr485 490 495 500acc aag ggg gaa aga atc aac tgg gct gcc ggc atg cag gag cag cgg 2013Thr Lys Gly Glu Arg Ile Asn Trp Ala Ala Gly Met Gln Glu Gln Arg
505 510 515gcg gtg atg ctt tct tcg atc aac aac ggc cag gtc aaa tgg gga atg 2061Ala Val Met Leu Ser Ser Ile Asn Asn Gly Gln Val Lys Trp Gly Met
520 525 530gac aca ggc ggc ttc aac cag cag gac ggc acg acg aac aat ccg aat 2109Asp Thr Gly Gly Phe Asn Gln Gln Asp Gly Thr Thr Asn Asn Pro Asn
535 540 545ccg gac ctg tac gcc aga tgg atg cag ttc agc gcg ctg act ccg gtg 2157Pro Asp Leu Tyr Ala Arg Trp Met Gln Phe Ser Ala Leu Thr Pro Val
550 555 560ttc cgc gtg cat ggc aac aat cac cag cag cgc cag cct tgg tat tat 2205Phe Arg Val His Gly Asn Asn His Gln Gln Arg Gln Pro Trp Tyr Tyr565 570 575 580ggc tcg aca gcc gag gag gca tcc aag gaa gcg ctc cag ctc cgt tac 2253Gly Ser Thr Ala Glu Glu Ala Ser Lys Glu Ala Leu Gln Leu Arg Tyr
585 590 595tcc ctg att cct tat atg tat gct tac gaa aga agc gcc tac gag aac 2301Ser Leu Ile Pro Tyr Met Tyr Ala Tyr Glu Arg Ser Ala Tyr Glu Asn
600 605 610ggt aac gga ctt gtc cgg ccg ctg atg cag gaa tac cct gcc gat gcc 2349Gly Asn Gly Leu Val Arg Pro Leu Met Gln Glu Tyr Pro Ala Asp Ala
615 620 625aac gcc aaa aac tat ctc gat gcc tgg atg ttc ggc gat tgg ctg ctg 2397Asn Ala Lys Asn Tyr Leu Asp Ala Trp Met Phe Gly Asp Trp Leu Leu
630 635 640gcg gcg cct gtg gtc gag aag cag cag acc tcc aag gaa atc tat ctc 2445Ala Ala Pro Val Val Glu Lys Gln Gln Thr Ser Lys Glu Ile Tyr Leu645 650 655 660cct gca ggc act tgg att gac tac aac cgg ggc acg gtg ctc acc ggc 2493Pro Ala Gly Thr Trp Ile Asp Tyr Asn Arg Gly Thr Val Leu Thr Gly
665 670 675ggc cag aag atc agc tac gcc gtc aat ccc gac acg ctg acg gat att 2541Gly Gln Lys Ile Ser Tyr Ala Val Asn Pro Asp Thr Leu Thr Asp Ile
680 685 690ccg ctc ttc att aag aag ggc gcg att atc cct tcg cag aag gtg cag 2589Pro Leu Phe Ile Lys Lys Gly Ala Ile Ile Pro Ser Gln Lys Val Gln
695 700 705gac tac gtg ggc cag gct ccc gtc caa acg gtg gat gtg gat gta ttc 2637Asp Tyr Val Gly Gln Ala Pro Val Gln Thr Val Asp Val Asp Val Phe
710 715 720ccg aat acg gca caa tcg agc ttt acc tat tat gac gat gac ggc agc 2685Pro Asn Thr Ala Gln Ser Ser Phe Thr Tyr Tyr Asp Asp Asp Gly Ser725 730 735 740agc tac aat tat gaa agc gga gct tac ttc aag caa ttg atg acg gct 2733Ser Tyr Asn Tyr Glu Ser Gly Ala Tyr Phe Lys Gln Leu Met Thr Ala
745 750 755cag gac aac gga tcc ggt gcg ctg agc ttt acg ctg ggc gcc aaa acc 2781Gln Asp Asn Gly Ser Gly Ala Leu Ser Phe Thr Leu Gly Ala Lys Thr
760 765 770ggc acg tac agc ccc gca ctg caa tcc tat atc gtc aag ctt cac ggg 2829Gly Thr Tyr Ser Pro Ala Leu Gln Ser Tyr Ile Val Lys Leu His Gly
775 780 785gcc gca ggc gcg tcg gtg aca agc aat ggg gcg gcg ctg gcc tcc tat 2877Ala Ala Gly Ala Ser Val Thr Ser Asn Gly Ala Ala Leu Ala Ser Tyr
790 795 800gcc agc ctg caa gcg ctg aaa gcc tca gcc agt gaa ggc tgg gcc aag 2925Ala Ser Leu Gln Ala Leu Lys Ala Ser Ala Ser Glu Gly Trp Ala Lys805 810 815 820ggc aag gac atc tac ggc gat gtc acg tat gtc aag cta tcc gcg ggg 2973Gly Lys Asp Ile Tyr Gly Asp Val Thr Tyr Val Lys Leu Ser Ala Gly
825 830 835gca gcg gcg gcc aag gcg att gcc gtc acc ggc aac agc ccg gtc agc 3021Ala Ala Ala Ala Lys Ala Ile Ala Val Thr Gly Asn Ser Pro Val Ser
840 845 850gtg gcg gat gtg cag tac gaa gcc gaa gaa gct tcg ctg tcc ggc aat 3069Val Ala Asp Val Gln Tyr Glu Ala Glu Glu Ala Ser Leu Ser Gly Asn
855 860 865acg aca gca acc aag gcg acc gtg aat acg aac cac gca ggc tac acg 3117Thr Thr Ala Thr Lys Ala Thr Val Asn Thr Asn His Ala Gly Tyr Thr
870 875 880ggc agc ggc ttc gtg gat gga ctg agt aat ccg gga gcg gcg gtt acg 3165Gly Ser Gly Phe Val Asp Gly Leu Ser Asn Pro Gly Ala Ala Val Thr885 890 895 900ttc tat ccg aag gtg aaa acg ggc gga gac tac aat gtc tcg ctg cgc 3213Phe Tyr Pro Lys Val Lys Thr Gly Gly Asp Tyr Asn Val Ser Leu Arg
905 910 915tac gct aat tcg acg gga gcg gca aag agc gtc agc atc ttc gtt aac 3261Tyr Ala Asn Ser Thr Gly Ala Ala Lys Ser Val Ser Ile Phe Val Asn
920 925 930ggc aag cgc gtc aaa tcc acg tcg ctg gcg aac ctg ccg aac tgg gat 3309Gly Lys Arg Val Lys Ser Thr Ser Leu Ala Asn Leu Pro Asn Trp Asp
935 940 945acg tgg ggg acg cag gct gag aca ctg ccg ctg acg gcg ggg acg aac 3357Thr Trp Gly Thr Gln Ala Glu Thr Leu Pro Leu Thr Ala Gly Thr Asn
950 955 960gtt gtc acc tac aag ttc tac tcg gat gcc gga gat acg ggc tcg gtt 3405Val Val Thr Tyr Lys Phe Tyr Ser Asp Ala Gly Asp Thr Gly Ser Val965 970 975 980aac ctg gac aac atc acg gtg ccc ttc gct ccg gcc atc ggc aaa tac 3453Asn Leu Asp Asn Ile Thr Val Pro Phe Ala Pro Ala Ile Gly Lys Tyr
985 990 995gag gcg gag agc gcc gag ctg agc ggc ggc agc acg gtc aac cag aat 3501Glu Ala Glu Ser Ala Glu Leu Ser Gly Gly Ser Thr Val Asn Gln Asn
1000 1005 1010cat tgg ttc tac agc ggc acg gca ttt gta gat ggc tta acc gca ccg 3549His Trp Phe Tyr Ser Gly Thr Ala Phe Val Asp Gly Leu Thr Ala Pro
1015 1020 1025ggc gcc caa gtc aaa tat acc gtg aac gcc ccg gcc gca ggc agc tac 3597Gly Ala Gln Val Lys Tyr Thr Val Asn Ala Pro Ala Ala Gly Ser Tyr1030 1035 1040cag atc gcg ctt cgc tat gcg aac ggc acg ggt gct gcg aag acg ctc 3645Gln Ile Ala Leu Arg Tyr Ala Asn Gly Thr Gly Ala Ala Lys Thr Leu1045 1050 1055 1060agc acg tat gtg aac ggg acg aag ctg ggg caa acg gcc ttc gcc agc 3693Ser Thr Tyr Val Asn Gly Thr Lys Leu Gly Gln Thr Ala Phe Ala Ser
1065 1070 1075cct ggc ggc aac tgg aac gtg tgg cag gac agc gtg cag acc gtc gcg 3741Pro Gly Gly Asn Trp Asn Val Trp Gln Asp Ser Val Gln Thr Val Ala
1080 1085 1090ctc gcc gcc ggt acg aac acg atc gcg ttc aag tac gat gcc ggc gac 3789Leu Ala Ala Gly Thr Asn Thr Ile Ala Phe Lys Tyr Asp Ala Gly Asp
1095 1100 1105agc ggc agc ggc agc gtc aat ctg gac cgt ctg ttg ctc tct gcc gca 3837Ser Gly Ser Gly Ser Val Asn Leu Asp Arg Leu Leu Leu Ser Ala Ala1110 1115 1120gcg cca ggc gtg ccc gtg tcc gag cag aac ctg ctc gat aac ggg ggc 3885Ala Pro Gly Val Pro Val Ser Glu Gln Asn Leu Leu Asp Asn Gly Gly1125 1130 1135 1140ttt gaa cgc gat ccg tcg cag agc agc aac tgg acc gag tgg cat ccg 3933Phe Glu Arg Asp Pro Ser Gln Ser Ser Asn Trp Thr Glu Trp His Pro
1145 1150 1155gct tcg cag gcg att gct tac ggc atc gac agc ggc tcc ggg atg aat 3981Ala Ser Gln Ala Ile Ala Tyr Gly Ile Asp Ser Gly Ser Gly Met Asn
1160 1165 1170ccg cct gaa tcg cca tgg gca ggc gat aag cgc gcc tat ttc tat gcg 4029Pro Pro Glu Ser Pro Trp Ala Gly Asp Lys Arg Ala Tyr Phe Tyr Ala
1175 1180 1185gca ggc ccg tat cag caa agc atc cat caa aca gtc agc gtg cct gtc 4077Ala Gly Pro Tyr Gln Gln Ser Ile His Gln Thr Val Ser Val Pro Val 1190 1195 1200aat aat gcc aag tac aag ttc gaa gcc tgg gta ttg ctg aag aat aca 4125Asn Asn Ala Lys Tyr Lys Phe Glu Ala Trp Val Leu Leu Lys Asn Thr1205 1210 1215 1220aca ccg aca acg gcc cgg gtg gag att caa aat tac ggc ggt tcg ccg 4173Thr Pro Thr Thr Ala Arg Val Glu Ile Gln Asn Tyr Gly Gly Ser Pro
1225 1230 1235atc ttc acg aac atc agt aaa gac ggc gtc tgg aaa tac atc agc gtc 4221Ile Phe Thr Asn Ile Ser Lys Asp Gly Val Trp Lys Tyr Ile Ser Val
1240 1245 1250agc gat att cag gtc acg aac ggc caa atc gat att ggc ttc tat gtg 4269Ser Asp Ile Gln Val Thr Asn Gly Gln Ile Asp Ile Gly Phe Tyr Val
1255 1260 1265gat tcg ccc gga ggc acc acg ctc cac atc gac gat gtg cgg gtc acc 4317Asp Ser Pro Gly Gly Thr Thr Leu His Ile Asp Asp Val Arg Val Thr1270 1275 1280aag caa taa 4326Lys Gln1285tccggtaaca ctagccctcc cccgccttgc ggcaggaggg ctttttgctt ctgtaggttg 4386tgaaggcgat accgagcgat gagaattcga ttctgaacag ctcgccctgt gtcctgctaa 4446attcctctcc tccctggcag ggaagccgct tccacatgtc gaattgggga ggtactatga 4506gaagttagta ctaccgtctg caacggcttt cgctacaatg gaaccaataa gacatcgcga 4566aggtttggga ggattcggca tgcagagacg cgaggttaaa gtaataggca cgggcaaata 4626tttgcccgcc catcgagtga ctgcgcagga gatggaccgg cggctaggag tgcccgacgg 4686atgggtgctg aagaagtcgg atgtggccgt tcgttatttc gccggtacgg agaaggcctc 4746ggagatgggg gcgagagcgg ctgaggcggc gctggcttcc gcaggcctgg ccttcacgga 4806tatcgactgc ctgatgtgcg ccagcgggac gatggaacag ccgattccat gcacggcggc 4866gctcattcag aaggcgatag gccaaggaca ctccggagtg ccggcactgg atttgaatac 4926aacctgtctg agctttgtgg cggctctgga catggtttct tatatggtga cggcgggaag 4986gtacc 4991<210>26<211>13<212>PRT<213>微生物<400>26Ala Pro Leu Gly Val Gln Arg Ala Gln Phe Gln Ser Gly1 5 10<210>27<211>13<212>PRT<213>微生物<400>27Gln Glu Trp Asn Leu Thr Gly Asp Pro Trp Thr Val Arg1 5 10<2l0>28<211>30<212>PRT<213>微生物<400>28Ile Ala Asp Leu Ala Glu Asp Gly Val Gly Ile Ile Pro Ile Glu Glu1 5 10 15Ser Tyr Val Gly Arg Asn Leu Pro Glu His Ala Arg Met Ala
20 25 30<210>29<211>30<212>PRT<213>微生物<400>29Gly Gly Met Ile Asp Trp Thr Gln Pro Glu Ala Gly Ala Val Trp His1 5 10 15Asp Glu Gln Arg Gln His Leu Val Asp Glu Gly Val Leu Gly
20 25 30<210>30<211>27<212>PRT<213>微生物<400>30His Asp Tyr Ala Gly Pro Asp Val Phe Thr Gln Thr Gly Ser Val Leu1 5 10 15Gln Thr Ala Ala Met Arg Ile Glu Val Asp Pro
20 25<210>31<211>27<212>PRT<213>微生物<400>31Met Leu Gly Arg Asp Leu Leu Ile Ala Ile Val Ala Gly Glu Gly Glu1 5 10 15Arg Glu Arg Asp Val Tyr Leu Pro Ala Gly Glu
20 25<210>32<211>5811<212>DNA<213>微生物<220><221>CDS<222>(1655)...(4552)<400>32ggtacctcgt cgaggagctc ggtgtcgacg gcttcaagac cgacgggagc gaggcgctct 60tcgggcgtga cctgatcgtc agcgacgggc gccgcggtga cgagatgcac aacgcctacc 120cgaacgagta cacctccgcc tacaacgact tcgtgcagga gacgacgggc gccgacggca 180cgatcttcag ccgggcgggc acctccggcg gccagagcga atccatcttc tgggccgggg 240accaggcgtc gacgttcggc gctttccagg aggccgtccg ggccgggcag agcgcgggcc 300agtcgggagt gccgttctgg gcctgggacc tcggcggctt caccgggtcg ttcccaagcg 360cggagctgta tctgcgctcg accgctcagg cggtgttctc gccgatcatg cagtaccact 420cggagaaggc cgaccccagt ccgtccgagg cgcgcacgcc ctggaacgtg caggcgcgca 480ccgggaacac cactgtcgtc cccaccttcg cccgttacgc gaacgtacgg atgaacctcg 540tgccctatct gtacacggag gcggacgaca gcgcgacgac gggtgtgccg atgatgcgcg 600cgatgagcct cgcgttcccc gacgacccgg atgccgcgca gtacgaccag cagtacatgt 660tcgggtctca gctgctggtc gcaccgatta cgaaccaggg ccagaccgtg aaagacgtct 720acctgcccgc gggcgagtgg tacgacttct ggaacggcgg acgcgcgagc ggcgagggcg 780tgaagatgta cgacgccgga cccgacggca tccccgtata cgctcgcgcc ggagcggtca 840tcccgctcaa cctcaacgac gcgtatgagg tgggcggcac gatcggcaac gacgtggaga 900gctacgacaa ccttgtgttc cgcgtttacc cctccggtga gagcagctac gagtacttcg 960aagaccaagc gaacgcgcac cgccggatcg atgtctcggc cgaccgcgca gcgcgcacgg 1020tcgaggtgtc tgctcccgcg ctcacgaccg cgagcacctt ccaggtgtcg ggcaccaagc 1080ccgacaccgt gaccgtcgcg ggctcggcac tgcctgaggt caacagcgtg agcgcgctgg 1140ccgcatccac cgaggcctgg tactgggatg cgaagcagca gctgacgtac gtgaaggtcg 1200gtgcgagcac cggcgagcgc acgatcctcc tgctgggcgt cgacaaggcc gggtacgagg 1260ccgagttcgc gggtcatacg gccgtctcga cgaacgccga ccacccgggc tacaccgggc 1320tcggcttcgt cgacggcttc gcgaacgcag gagacgcggt ggagttcgac gtgtgggccg 1380aggagaacgg cgcgcaccag ctccgcttcc gctacggaaa cggagcggcg acccccgcca 1440cccgcacgat ccgggtcgac ggagcgcctc tgggaacgct gtcgcttccg cccaccgggt 1500cgtggagttc gtggggcacg gcctcgatcg acgtgaccct cccacccgga cgccacgccg 1560tacggatcga gtacgccgga ggcgattccg gcggcgtcaa cctcgacaac ctcgtcctcg 1620cgcgctgagc gcacacggga aagggagaag aacc atg cct gct ctt ccg tgg cgc 1675
Met Pro Ala Leu Pro Trp Arg
1 5cgc acg acg gcg ctc gcg ctc acc acg gcg gtg acg gcc gcg acc ctg 1723Arg Thr Thr Ala Leu Ala Leu Thr Thr Ala Val Thr Ala Ala Thr Leu
10 15 20gtc gcc gtc ggg gtg aac gac gcc ggt cag gcg gcg gct gct ccc ctg 1771Val Ala Val Gly Val Asn Asp Ala Gly Gln Ala Ala Ala Ala Pro Leu
25 30 35ggc gtg caa cgc gcg cag ttc cag tcg ggg tcg agc tac ctc gtc gtc 1819Gly Val Gln Arg Ala Gln Phe Gln Ser Gly Ser Ser Tyr Leu Val Val40 45 50 55gag gtg ctc gat gac gac ctc gtc cac ttc gag ctg gcc ggg ggc ggc 1867Glu Val Leu Asp Asp Asp Leu Val His Phe Glu Leu Ala Gly Gly Gly
60 65 70acc gcc ccc ggc acg ggc tcc ccg ctg ttc acg acg cct cag gtc gcg 1915Thr Ala Pro Gly Thr Gly Ser Pro Leu Phe Thr Thr Pro Gln Val Ala
75 80 85aag cac gac tac gcg gga ccc gac gtg ttc acc cag acc ggg tct gtt 1963Lys His Asp Tyr Ala Gly Pro Asp Val Phe Thr Gln Thr Gly Ser Val
90 95 100ctg cag acc gcg gcg atg cgc atc gag gtc gat ccc gcg gat ctg tgc 2011Leu Gln Thr Ala Ala Met Arg Ile Glu Val Asp Pro Ala Asp Leu Cys
105 110 115gtg acg gcc acc gac atc acc cgc acc ccg aac ctt gta ctg cac gag 2059Val Thr Ala Thr Asp Ile Thr Arg Thr Pro Asn Leu Val Leu His Glu120 125 130 135gcg tgt ccc gcc gac ctc ggc cag gcg tgg aag ggg ctg aac atc acg 2107Ala Cys Pro Ala Asp Leu Gly Gln Ala Trp Lys Gly Leu Asn Ile Thr
140 145 150agg tcg gcg atg gag aac gcc tac ggt ctc ggg cag cag ttc ttc acg 2155Arg Ser Ala Met Glu Asn Ala Tyr Gly Leu Gly Gln Gln Phe Phe Thr
155 160 165ggc ggc agc gcg gac ggc gac tgg gtg ggc cgc acc cgc acc ccg ggt 2203Gly Gly Ser Ala Asp Gly Asp Trp Val Gly Arg Thr Arg Thr Pro Gly
170 175 180ggc acc tac ggc aac gcg atg gtg ttc gac ccc gag aac ggg ccg gtc 2251Gly Thr Tyr Gly Asn Ala Met Val Phe Asp Pro Glu Asn Gly Pro Val
185 190 195ggc aac acg cag atc ccg gtg ctc ttc gcg gtc ggc gat gac aac gcg 2299Gly Asn Thr Gln Ile Pro Val Leu Phe Ala Val Gly Asp Asp Asn Ala200 205 210 215aac tac ggg ctg ttc gtc gat cag ctg tac aag cag gaa tgg aac ctc 2347Asn Tyr Gly Leu Phe Val Asp Gln Leu Tyr Lys Gln Glu Trp Asn Leu
220 225 230acc ggc gac ccg tgg acg gtg cgc atg tgg ggc gac cag gtg cgc tgg 2395Thr Gly Asp Pro Trp Thr Val Arg Met Trp Gly Asp Gln Val Arg Trp
235 240 245tac ctc atg agc ggc gac gac ctg ccc gac ctt cgc cac gac tac atg 2443Tyr Leu Met Ser Gly Asp Asp Leu Pro Asp Leu Arg His Asp Tyr Met
250 255 260gag ctg acg ggc acc ccg ccc gtg ccg ccg aag aag gcg ttc ggg ctc 2491Glu Leu Thr Gly Thr Pro Pro Val Pro Pro Lys Lys Ala Phe Gly Leu
265 270 275tgg gtg tcg gag ttc ggc tac gac aac tgg agc gag gtc gac aat acg 2539Trp Val Ser Glu Phe Gly Tyr Asp Asn Trp Ser Glu Val Asp Asn Thr280 285 290 295atc gcg ggc ctg cgc tcg gcc gac ttt ccg gtc gat ggc gcg atg ctc 2587Ile Ala Gly Leu Arg Ser Ala Asp Phe Pro Val Asp Gly Ala Met Leu
300 305 310gac gta cag tgg ttc ggg ggc gtc acc gcc gac tcg gac gac acc cgc 2635Asp Val Gln Trp Phe Gly Gly Val Thr Ala Asp Ser Asp Asp Thr Arg
315 320 325atg ggc acc ctc gat tgg gac acg tcg agg ttt ccc gac cct gcg gga 2683Met Gly Thr Leu Asp Trp Asp Thr Ser Arg Phe Pro Asp Pro Ala Gly
330 335 340aag atc gcc gac ctc gcc gag gac ggc gtc ggc atc atc ccg atc gag 2731Lys Ile Ala Asp Leu Ala Glu Asp Gly Val Gly Ile Ile Pro Ile Glu
345 350 355gag tcg tac gtc ggt cgc aac ctg ccg gag cac gcc cgg atg gcg gcg 2779Glu Ser Tyr Val Gly Arg Asn Leu Pro Glu His Ala Arg Met Ala Ala360 365 370 375gac ggt tac ctc gtg cgc tcc ggc tgc gct acg tgc ccg ccg gtg tac 2827Asp Gly Tyr Leu Val Arg Ser Gly Cys Ala Thr Cys Pro Pro Val Tyr
380 385 390ctg acg ggg aac ccc tgg tgg ggc aag ggc ggg atg atc gac tgg acg 2875Leu Thr Gly Asn Pro Trp Trp Gly Lys Gly Gly Met Ile Asp Trp Thr
395 400 405cag ccg gaa gcc ggc gcc gtc tgg cac gac gag cag cgc cag cat ctc 2923Gln Pro Glu Ala Gly Ala Val Trp His Asp Glu Gln Arg Gln His Leu
410 415 420gtc gac gag ggc gta ctg ggc cac tgg ctc gat ctc ggc gaa ccg gag 2971Val Asp Glu Gly Val Leu Gly His Trp Leu Asp Leu Gly Glu Pro Glu
425 430 435atg tac gac ccg aac gac tgg acc gcc ggc gtc atc ccc ggc aag cac 3019Met Tyr Asp Pro Asn Asp Trp Thr Ala Gly Val Ile Pro Gly Lys His440 445 450 455gcg cac gcc gac tat cac aac gcg tac aac ctg ctg tgg gcg cag agc 3067Ala His Ala Asp Tyr His Asn Ala Tyr Asn Leu Leu Trp Ala Gln Ser
460 465 470atc gcc gac ggg tac gcc gac aac ggc gtg cag aag cgt ccc ttc atg 3115Ile Ala Asp Gly Tyr Ala Asp Asn Gly Val Gln Lys Arg Pro Phe Met
475 480 485ctg acg cgc gcc gcg gcc gcc ggc atc cag cgt cat ggc gcg ggc atg 3163Leu Thr Arg Ala Ala Ala Ala Gly Ile Gln Arg His Gly Ala Gly Met
490 495 500tgg tca gcc gac atc ggg tcg acc atg aag gcg ctc ggg agc cag cag 3211Trp Ser Ala Asp Ile Gly Ser Thr Met Lys Ala Leu Gly Ser Gln Gln
505 510 515aac gcg cag atg cac atg tcg atg tcg ggg atc gac tat tac ggc tcc 3259Asn Ala Gln Met His Met Ser Met Ser Gly Ile Asp Tyr Tyr Gly Ser520 525 530 535gac atc ggc ggg ttc cgg cgg gag atg gcc gac ggc gac gtg aac gag 3307Asp Ile Gly Gly Phe Arg Arg Glu Met Ala Asp Gly Asp Val Asn Glu
540 545 550ctc tac acc cag tgg ttc gcc gac agc gcg tgg ttc gac act ccg ctc 3355Leu Tyr Thr Gln Trp Phe Ala Asp Ser Ala Trp Phe Asp Thr Pro Leu
555 560 565cgg ccg cac acc gac aat ctc tgc aac tgc ctc gag acg agc ccc gac 3403Arg Pro His Thr Asp Asn Leu Cys Asn Cys Leu Glu Thr Ser Pro Asp
570 575 580tcg atc ggc gac gtc gcg agc aac cgc gag aac ctg gtg cgc cgc tac 3451Ser Ile Gly Asp Val Ala Ser Asn Arg Glu Asn Leu Val Arg Arg Tyr
585 590 595gag ctg gct ccg tac tac tac tcg ctc gcg cac cgc gct cac cag ttc 3499Glu Leu Ala Pro Tyr Tyr Tyr Ser Leu Ala His Arg Ala His Gln Phe600 605 610 615ggc gag ccg ctc gct ccc ccg ctc gtg tac tac tac cag aac gac gac 3547Gly Glu Pro Leu Ala Pro Pro Leu Val Tyr Tyr Tyr Gln Asn Asp Asp
620 625 630cac gtt cgc gag atg ggg cat cag aag atg ctc ggg cgc gac ctg ctg 3595His Val Arg Glu Met Gly His Gln Lys Met Leu Gly Arg Asp Leu Leu
635 640 645atc gcg atc gtc gcc gga gag ggc gag cgg gaa cgc gac gtg tac ctt 3643Ile Ala Ile Val Ala Gly Glu Gly Glu Arg Glu Arg Asp Val Tyr Leu
650 655 660ccg gcg ggc gag tgg atc gac atc cac acg aac gag cgc atc cag agc 3691Pro Ala Gly Glu Trp Ile Asp Ile His Thr Asn Glu Arg Ile Gln Ser
665 670 675acg ggt cag tgg atc gac aac gtg ccg ctg tgg cgt gac ggc gtc ttc 3739Thr Gly Gln Trp Ile Asp Asn Val Pro Leu Trp Arg Asp Gly Val Phe680 685 690 695acc ctg ccg gcg tac gcc cgg gcg ggg gcg atc atc ccg aag gcc ttc 3787Thr Leu Pro Ala Tyr Ala Arg Ala Gly Ala Ile Ile Pro Lys Ala Phe
700 705 710gtc gac gcc tcc acg aag gac atc acc ggc aag cgc gag gat gcc gcg 3835Val Asp Ala Ser Thr Lys Asp Ile Thr Gly Lys Arg Glu Asp Ala Ala
715 720 725gtg cgc aac gag ctg atc gca acc gtt tac gcc gac gac gtc gcg agc 3883Val Arg Asn Glu Leu Ile Ala Thr Val Tyr Ala Asp Asp Val Ala Ser
730 735 740gac ttc acc ctg tac gag gat gac ggc gcg acg acc gca tac gcc gac 3931Asp Phe Thr Leu Tyr Glu Asp Asp Gly Ala Thr Thr Ala Tyr Ala Asp
745 750 755ggg gct gtc agg acc acg cag atc agc caa tcg ctc acg aac ggc gtg 3979Gly Ala ValArg Thr Thr Gln Ile Ser Gln Ser Leu Thr Asn Gly Val760 765 770 775gcc acg gtg acg gtg gga gcg gca tct gga acc tac tcc ggt gcg ccc 4027Ala Thr Val Thr Val Gly Ala Ala Ser Gly Thr Tyr Ser Gly Ala Pro
780 785 790tcc acc cgt ccc acg gtc gtc gag ctt gtc act gac ggc acg cag gcc 4075Ser Thr Arg Pro Thr Val Val Glu Leu Val Thr Asp Gly Thr Gln Ala
795 800 805tcg acc gtc tcc ctc ggc agc gtt ccg ctg acg gag cac gcg aac aag 4123Ser Thr Val Ser Leu Gly Ser Val Pro Leu Thr Glu His Ala Asn Lys
810 815 820gcg gcg ttc gac gcg gcg agc agc ggc tgg tac aac gcc ggc ggg ggg 4171Ala Ala Phe Asp Ala Ala Ser Ser Gly Trp Tyr Asn Ala Gly Gly Gly
825 830 835ctc gtt gtg gcc aag gcg gcg agc agt tcg gtg aac acc gcc aag acc 4219Leu Val Val Ala Lys Ala Ala Ser Ser Ser Val Asn Thr Ala Lys Thr840 845 850 855ttc tcg ttc acg ctc ggt gag gag tcg gtc tgg gcg acg ttc tcc tgc 4267Phe Ser Phe Thr Leu Gly Glu Glu Ser Val Trp Ala Thr Phe Ser Cys
860 865 870gag aac gcc acg acg acc ttc ggt cag tca gtg tac gtc gtc gga aat 4315Glu Asn Ala Thr Thr Thr Phe Gly Gln Ser Val Tyr Val Val Gly Asn
875 880 885gtt ccg cag ctc ggc aac tgg tcg ccg gcg gat gcc gtg aag ctc gag 4363Val Pro Gln Leu Gly Asn Trp Ser Pro Ala Asp Ala Val Lys Leu Glu
890 895 900ccg agc gcc tac ccc acc tgg acc ggg gtg gtg cgg aac ctg ccg ccg 4411Pro Ser Ala Tyr Pro Thr Trp Thr Gly Val Val Arg Asn Leu Pro Pro
905 910 915tcg agc acg gtc gaa tgg aag tgc atc aaa cgt cag gag gcc ggc ctg 4459Ser Ser Thr Val Glu Trp Lys Cys Ile Lys Arg Gln Glu Ala Gly Leu920 925 930 935ccg aac acg gcg gat gcg tgg gag ccc ggc ggg aac aac atc ctc tcg 4507Pro Asn Thr Ala Asp Ala Trp Glu Pro Gly Gly Asn Asn Ile Leu Ser
940 945 950acg cca cct tcc ggc tcg gcg ggg ata acc acc ggc gcc ttc tga 4552Thr Pro Pro Ser Gly Ser Ala Gly Ile Thr Thr Gly Ala Phe
955 960 965cccagggggg ctcgatcccg gtcgccagcg caagcgcggc gcccggggtc gacgcgtgtt 4612aggccagtac gcgaaggaac cagccctcta cgacaccggc ctcgaccccg ccgaaggact 4672ctggcaccgg tcaggctgga tcggacaaca ctgacacgcc ccgacgccat ccactctttt 4732tggcctacaa cccgttgtcg cacgtgcgcc tcttggcccg ggcacgacga aacccccgcg 4792atccagggat cggcgggggt ttcggatggc ggtgacggtg ggatttgaac ccacggtagg 4852gggttaccct acacaacttt tcgagagttg caccttcggc cgctcggaca cgtcaccggg 4912gtcgagttta cgcgacgttc tcctggcgcg ccaatcggcg gcgccccgcc cgcgagaatc 4972caggcccgcg ccgagaatcc gcgggcgcct ggattctcag cacggggatg gattctcgcc 5032gctcatccga gccccgcggc gagcgggctc agtgctcgtc ctccatgagc atgccgaccg 5092aggtggcgca ggcgtcgccg cgccaggcct cgatgccctc gcgcacggcg aaggcggcga 5152tgatgaggcc ggtgatcgcg tcggcccacc accagcccag gaggctgttg agcacgaggc 5212ccgcgagcac ggccgccgac aggtaggtgc agatgagggt ctgcttcgag tcggccacgg 5272cggtggccga tccgagctcg cggccggcgc ggcgctcggc gaacgacagg aacggcatga 5332tcgccacgct gagcgccgtg atgacgatgc cgagcgtcga gtgctccacg tccgcgccgc 5392cgacgagggc caggaccgac gtgacggtga cgtacgcggc gagcgcgaag aaggccacgg 5452cgatgacgcg cagcgtgccg cgctcccagc gctccgggtc gcgccgcgtg aactgccacg 5512cgacggcggc ggccgagagc acctcgatgg tcgagtccag gccgaacgcg acgagcgcgg 5572ccgacgaggc cgcagctccc gcggcgatcg cgacgaccgc ctcgacgacg ttataggcga 5632tggtcgcggc gacgatccag cggatgcgcc gctgcaggac ggatcgccga tcggcagacg 5692cggtggcggt catgcgcagg tgcagctctc tccggcgcag cagccgggct cgacgtacag 5752gacgacgcgc agcagctcgt cgagcgcggg cgcgaggtgg gcgtcggcca gccggtacc 5811
Claims (18)
1.一种多肽，具有通过从非还原末端结合样式具有α-1，4糖苷键的葡萄糖聚合度在2以上的糖，通过在实质上不增加还原力情况下进行α-葡糖基转移，生成非还原末端的结合样式具有α-1，6糖苷键，该非还原末端以外的结合样式为具有α-1，4糖苷键的葡萄糖聚合度在3以上的糖的酶活性，而且具有序列表中序列号1、2或3所示氨基酸序列、或在这些氨基酸序列中缺失、置换或附加了1或数个氨基酸的氨基酸序列。
2.根据权利要求1记载的多肽，其是具有以下理化性质的多肽，
(1)分子量
通过SDS-凝胶电泳法确定，具有处于约74,000至约160,000道尔顿范围内的分子量，
(2)最适温度
在pH6.0、反应60分钟的条件下，最适温度处于约40℃至约50℃的温度范围内，
在pH6.0、反应60分钟的条件下，有1mM Ca2+存在下，最适温度处于约45℃至约55℃的温度范围内，
在pH8.4、反应60分钟的条件下，最适温度为60℃，
在pH8.4、反应60分钟的条件下，有1mM Ca2+存在下，最适温度约为65℃，
(3)最适pH
在35℃、反应60分钟的条件下，最适pH处于约6.0至8.4的pH范围内，
(4)温度稳定性
在pH6.0下保持60分钟的条件下，在约45℃以下具有温度稳定区域，
在pH6.0下保持60分钟的条件下，有1mM Ca2+存在下，在约60℃以下具有温度稳定区域，
在pH8.0下反应60分钟的条件下，在约55℃以下具有温度稳定区域，
在pH8.0下保持60分钟的条件下，有1mM Ca2+存在下，在约60℃以下具有温度稳定区域，
(5)pH稳定性
于4℃下保持24小时的条件下，在pH约为5.0至10.0的pH范围内具有稳定pH区域。
3.DNA，其编码权利要求1或2记载的多肽。
4.根据权利要求3记载的DNA，其中，含有序列表中序列号4、5或6所示碱基序列或在那些碱基序列中缺失、置换或附加1或数个碱基的碱基序列，或者与这些序列互补的碱基序列，或在这些碱基序列中根据基因的简并性，在不改变他编码的氨基酸序列情况下用其他碱基置换了其中的1个或数个碱基的碱基序列。
5.根据权利要求3或4记载的DNA，其中，含有根据基因的简并性，不改变序列表中序列号1、2或3所示氨基酸序列，序列表中序列号4、5或6所示碱基序列中1或数个碱基被其他碱基置换了的碱基序列。
6.根据权利要求3、4或5记载的DNA，其来自于杆菌属微生物。
7.根据权利要求3、4或5记载的DNA，其来自于节杆菌属微生物。
8.可复制重组DNA，其中，含有权利要求3至7中任一项记载的DNA和可自我复制载体。
9.根据权利要求8记载的可复制重组DNA，其中可自我复制的载体是质粒载体Bluescript II SK(+)。
10.转化体，是将权利要求8或9记载的可复制重组DNA导入适宜宿主形成的。
11.根据权利要求10记载的转化体，其中宿主是大肠菌。
12.多肽的制备方法，其特征是将权利要求10或11记载的转化体于营养培养基中培养，从其培养物中采集权利要求1或2记载的多肽。
13.根据权利要求12记载的多肽制备方法，其特征是通过采用将从离心分离、过滤、浓缩、盐析、透析、分级沉淀、凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水层析、亲和层析、凝胶电泳和等电点电泳中选择出来的1种或2种以上的方法提取培养物中的权利要求1或2记载的多肽。
14.一种生成糖的方法，是使权利要求1或2记载的多肽作用于非还原末端结合样式具有α-1，4糖苷键的葡萄糖聚合度在2以上的糖，通过实质上不增加上述糖的还原力进行α-葡糖基转移，使非还原末端的结合样式具有α-1，6糖苷键，该非还原末端以外的结合样式为具有α-1，4糖苷键的葡萄糖聚合度在3以上的糖生成的方法。
15.一种糖的制备方法，是使权利要求1或2记载的多肽作用于非还原末端结合样式具有α-1，4糖苷键的葡萄糖聚合度在2以上的糖，通过实质上不增加上述糖的还原力进行α-葡糖基转移，生成作为非还原末端的结合样式具有α-1，6糖苷键，作为该非还原末端以外的结合样式具有α-1，4糖苷键的葡萄糖聚合度在3以上的糖的制造方法。
16.环状四糖的制造方法，其特征是：使权利要求1或2记载的多肽作用于非还原末端结合样式具有α-1，4糖苷键的葡萄糖聚合度在2以上的糖，通过实质上不增加上述糖的还原力进行α-葡糖基转移，使非还原末端的结合样式具有α-1，6糖苷键，该非还原末端以外的结合样式为具有α-1，4糖苷键的葡萄糖聚合度在3以上的糖生成，然后通过从非还原末端结合样式具有α-1，6糖苷键、该非还原末端以外的结合样式为α-1，4糖苷键的葡萄糖聚合度在3以上的糖转移α-异麦芽糖基，使具有环{→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}结构的环状四糖与生成的酶作用，使具有环{→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}结构的环状四糖生成，进行提取。
17.根据权利要求16记载的环状四糖的制备方法，其特征是包括使环状四糖结晶的工序。
18.根据权利要求16或17记载的环状四糖的制备方法，其特征是环状四糖为糖浆或结晶。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5441/2001 | 2001-01-12 | ||
| JP2001005441 | 2001-01-12 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1484701A true CN1484701A (zh) | 2004-03-24 |
Family
ID=18873487
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNA028036573A Pending CN1484701A (zh) | 2001-01-12 | 2002-01-09 | 具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的多肽 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7211422B2 (zh) |
| EP (1) | EP1361274B1 (zh) |
| JP (1) | JP3942543B2 (zh) |
| KR (1) | KR100853353B1 (zh) |
| CN (1) | CN1484701A (zh) |
| AT (1) | ATE465260T1 (zh) |
| AU (1) | AU2002225387B2 (zh) |
| CA (1) | CA2434414C (zh) |
| DE (1) | DE60236067D1 (zh) |
| TW (1) | TWI269810B (zh) |
| WO (1) | WO2002055708A1 (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102459624A (zh) * | 2009-05-08 | 2012-05-16 | 格罗宁根大学 | 包含（α1→4）和（α1→6）糖苷键的葡萄糖-低聚糖、其用途、及其制备方法 |
| CN111778231A (zh) * | 2020-07-29 | 2020-10-16 | 珠海冀百康生物科技有限公司 | 一种赖氨酰肽链内切酶的纯化方法 |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TWI312369B (en) * | 2000-08-01 | 2009-07-21 | Hayashibara Biochem Lab | A-isomaltosylglucosaccharide synthase,process for producing the same and use thereof |
| WO2002072594A1 (fr) | 2001-03-09 | 2002-09-19 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Tetrasaccharide cyclique ramifie et procede de production correspondant |
| US7709230B2 (en) | 2001-04-27 | 2010-05-04 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Process for producing isomaltose and uses thereof |
| TWI324635B (en) | 2001-10-18 | 2010-05-11 | Hayashibara Biochem Lab | Process for producing isomaltitol and uses thereof |
| JP4568035B2 (ja) | 2003-08-28 | 2010-10-27 | 株式会社林原生物化学研究所 | 環状マルトシルマルトース及び環状マルトシルマルトース生成酵素とそれらの製造方法並びに用途 |
| EP1808497B1 (en) * | 2004-09-27 | 2014-10-08 | Hayashibara Co., Ltd. | Isocyclomaltooligosaccharide, isocyclomaltooligosaccharide synthase, process for producing them and use thereof |
| US9101160B2 (en) | 2005-11-23 | 2015-08-11 | The Coca-Cola Company | Condiments with high-potency sweetener |
| JP2009526785A (ja) | 2006-02-14 | 2009-07-23 | ウラディミール，ベレジン | メタロチオネイン由来ペプチド断片 |
| US8017168B2 (en) | 2006-11-02 | 2011-09-13 | The Coca-Cola Company | High-potency sweetener composition with rubisco protein, rubiscolin, rubiscolin derivatives, ace inhibitory peptides, and combinations thereof, and compositions sweetened therewith |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5823799A (ja) | 1981-08-03 | 1983-02-12 | 株式会社林原生物化学研究所 | 高純度マルト−スの製造方法 |
| JPS5872598A (ja) * | 1981-10-26 | 1983-04-30 | Hayashibara Biochem Lab Inc | 高純度イソマルト−スの製造方法 |
| EP0691344B1 (en) | 1992-12-28 | 2003-03-19 | Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo | Purification of trehalose |
| JP3559585B2 (ja) | 1993-06-03 | 2004-09-02 | 株式会社林原生物化学研究所 | トレハロース遊離酵素とその製造方法並びに用途 |
| US5786196A (en) * | 1995-06-12 | 1998-07-28 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Bacteria and enzymes for production of alternan fragments |
| TWI315741B (en) | 2000-05-22 | 2009-10-11 | Hayashibara Biochem Lab | A-isomaltosyltransferase, process for producing the same and use thereof |
| TWI312369B (en) * | 2000-08-01 | 2009-07-21 | Hayashibara Biochem Lab | A-isomaltosylglucosaccharide synthase,process for producing the same and use thereof |
-
2002
- 2002-01-09 AT AT02715715T patent/ATE465260T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-01-09 DE DE60236067T patent/DE60236067D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-09 JP JP2002556754A patent/JP3942543B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-09 US US10/466,085 patent/US7211422B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-09 WO PCT/JP2002/000052 patent/WO2002055708A1/ja active Application Filing
- 2002-01-09 EP EP02715715A patent/EP1361274B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-09 CN CNA028036573A patent/CN1484701A/zh active Pending
- 2002-01-09 KR KR1020037009100A patent/KR100853353B1/ko active IP Right Grant
- 2002-01-09 CA CA2434414A patent/CA2434414C/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-01-09 AU AU2002225387A patent/AU2002225387B2/en not_active Ceased
- 2002-01-11 TW TW091100311A patent/TWI269810B/zh active
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102459624A (zh) * | 2009-05-08 | 2012-05-16 | 格罗宁根大学 | 包含（α1→4）和（α1→6）糖苷键的葡萄糖-低聚糖、其用途、及其制备方法 |
| CN102459624B (zh) * | 2009-05-08 | 2015-05-27 | 格罗宁根大学 | 包含(α1→4)和(α1→6)糖苷键的葡萄糖-低聚糖、其用途、及其制备方法 |
| CN111778231A (zh) * | 2020-07-29 | 2020-10-16 | 珠海冀百康生物科技有限公司 | 一种赖氨酰肽链内切酶的纯化方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20040161835A1 (en) | 2004-08-19 |
| ATE465260T1 (de) | 2010-05-15 |
| AU2002225387B2 (en) | 2007-02-01 |
| JP3942543B2 (ja) | 2007-07-11 |
| DE60236067D1 (en) | 2010-06-02 |
| TWI269810B (en) | 2007-01-01 |
| JPWO2002055708A1 (ja) | 2004-05-20 |
| EP1361274A1 (en) | 2003-11-12 |
| CA2434414A1 (en) | 2002-07-18 |
| US7211422B2 (en) | 2007-05-01 |
| EP1361274B1 (en) | 2010-04-21 |
| KR20030066801A (ko) | 2003-08-09 |
| WO2002055708A1 (en) | 2002-07-18 |
| CA2434414C (en) | 2013-08-06 |
| EP1361274A4 (en) | 2005-10-12 |
| KR100853353B1 (ko) | 2008-08-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN1281744C (zh) | 麦芽糖/海藻糖转化酶及其制备和应用 | |
| CN101044244A (zh) | 异环麦芽寡糖和异环麦芽寡糖合酶以及其制备方法和用途 | |
| CN1091470A (zh) | 非还原性糖类生成酶及其制备和应用 | |
| CN1061089C (zh) | 支链淀粉酶、产生它的微生物、其制备方法和用途 | |
| CN1209188C (zh) | 脱水剂和使用该脱水剂的含水物的脱水方法,以及利用该方法得到的脱水物品 | |
| CN1392900A (zh) | α－异麦芽糖基葡糖基糖形成酶,其制备方法和用途 | |
| CN1081903C (zh) | 食品或饮料 | |
| CN1668755A (zh) | 半乳糖苷基异麦芽酮糖醇、其生产方法及应用 | |
| CN1324038C (zh) | 缩合的帕拉金糖及其生产方法 | |
| CN1234070A (zh) | 隔孢伏革菌植酸酶 | |
| CN1553957A (zh) | 聚羟基丁酸生成缺陷的鞘氨醇单胞菌属突变型细菌菌株和澄清鞘氨糖的方法及其组合物 | |
| CN1484701A (zh) | 具有α-异麦芽糖基葡糖生成酶活性的多肽 | |
| CN1324039C (zh) | 氢化形式的缩合帕拉金糖 | |
| CN1462310A (zh) | 异麦芽糖的制备方法及用途 | |
| CN1271203C (zh) | 一种海藻糖释放酶及利用该酶制备糖的方法 | |
| TW494136B (en) | DNA encoding enzyme, recombinant DNA and enzyme, transformant, and their preparations and uses | |
| TW588110B (en) | Polypeptide having alpha-isomaltosyl-transferring enzyme activity | |
| CN108138152A (zh) | 贝壳杉烯酸羟化酶 | |
| JP2660836B2 (ja) | マルトテトラオース生成アミラーゼ活性を有するポリペプチドとその用途 | |
| CN107164435A (zh) | 一种莱鲍迪苷ka的制备方法 | |
| CN100347183C (zh) | 非还原性糖类生成酶及其制备和应用 | |
| CN1151253C (zh) | 海藻糖基水解酶及其制备和用途 | |
| JP3650632B2 (ja) | マルトースをトレハロースに変換する組換え型酵素 | |
| CN1845931A (zh) | 环状麦芽糖基麦芽糖以及环状麦芽糖基麦芽糖合成酶和它们的制造方法及其用途 | |
| CN1283804C (zh) | 海藻糖－释放酶及其制备和用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |