WO2002055708A1

WO2002055708A1 - POLYPEPTIDE HAVING α-ISOMALTOSYLGLUCOSACCHARIDE SYNTHASE ACTIVITY

Info

Publication number: WO2002055708A1
Application number: PCT/JP2002/000052
Authority: WO
Inventors: Michio Kubota; Kazuhiko Maruta; Takuo Yamamoto; Shigeharu Fukuda
Original assignee: Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo
Priority date: 2001-01-12
Filing date: 2002-01-09
Publication date: 2002-07-18
Also published as: CA2434414C; KR100853353B1; JP3942543B2; DE60236067D1; EP1361274B1; EP1361274A1; TWI269810B; CA2434414A1; US7211422B2; JPWO2002055708A1; ATE465260T1; KR20030066801A; AU2002225387B2; EP1361274A4; US20040161835A1; CN1484701A

Description

明細書 α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素活性を有するポリベプチド技術分野

本発明は、 α—イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリぺプチド（以下、特に断りがない限り、「本発明のポリペプチド」と言う。）及び遺伝子組換え技術による当該ポリぺプチドの製造方法とその用途に関する。背景技術

グルコースを構成糖とする糖質、例えば、澱粉を原料として製造される澱粉部分分解物としては、アミロース、アミロデキス卜リン、マルトデキス卜リン、マル卜オリゴ糖、イソマルトオリゴ糖などが知られている。これらの糖質は、通常、分子の両端のいずれか一方が非還元末端で他方が還元末端であり、還元性を示すことが知られている。一般に、澱粉部分分解物は、固形物当りの還元力の大きさをデキストロース *ィクイバレント（ D e X t r o s e E q u i v a I e n t = D E ) として表される。この ·(直の大きいものは、通常、低分子、低粘度、甘味で、反応性が強く、ァミノ酸や蛋白質などのアミノ基を有する物質とァミノカルボニル反応を起し易く、褐変して悪臭を発生し、得られる製品の品質を劣化し易いとの欠点があることが知られている。斯かる欠点を改善するために、澱粉部分分解物の構成糖であるグルコースを変えることなく、その還元力を低減、若しくは消滅させる方法が古くから望まれていた。例えば、『ジャーナル · 才ブ - アメリカン ' ケミカル ' ソサイエティ一（ J o u r n a l o f A m e r i c a n C h e m i c a l S o c i e t y )』、第 7 1 卷、 3 5 3乃至 3 5 8頁（ 1 9 4 9年）に開示されているように、澱粉にマセランスァミラ一ゼ（ m a c e r a n s a m y I a s e ) を作用させることにより、 6乃至 8分子のグルコースが α— 1 ， 4グルコシル結合した α―、 β —またはァ一環状デキストリンを生成させる方法が知られている。現在では、澱粉からこれら環状デキス卜リンが工業的規模で生産され、それらが有する非還元性、無味性、包接能などの特性を生かして、各種用途に利用されている。また、先に、本出願人が、特開平 7 — 1 4 3 8 7 6号公報及び特開平 7 — 2 1 3 2 8 3号公報などに開示したように、マル卜ォリゴ糖などの澱粉部分分解物に、非還元性糖質生成酵素及びトレハロース遊離酵素を作用させることにより、 2分子のグルコースが α、 α—結合した卜レハロ —スを生成させる方法も知られている。現在では、この卜レハロースは澱粉から工業的規模で生産され、その非還元性で、温和で高品質な甘味特性などを生かしての用途に利用されている。このように、グルコースを構成糖とする非還元性糖質として、グルコース重合度が 2の α, α— 卜レハロ —ス、グルコース重合度が 6乃至 8の α—、 β―、ァ—環状デキストリンが工業的規模で生産され、それらの特性を生かして各種用途に利用されているものの、斯かる非還元性糖質の種類には限りがあり、更に多種多様な非還元性糖質乃至低還元性糖質の確立が待たれている。

—方、近年、グルコースを構成糖とする新たな環状の四糖類が報告された。即ち、『ョ一ロピアン ' ジャーナル ' 才ブ ' バイオケミストリ一（ E u r 0 p e a n J o u r n a l o f B i o c h e m i s t r y )』、 2 2 6卷、 6 4 1 乃至 6 4 8 ( 1 9 9 4年）には、主として、グルコース残基が α— 1 , 3結合と α— 1 , 6結合とが交互に連なっているアルテルナン（ a I t e r n a n ) に、加水分解酵素アルテルナナーゼ（ a I t e r n a n a s e ) を作用させることにより、サイクロ {→ 6 ) - a ~ D - ダルコピラノシルー（ 1 → 3 ) ― α― D—グルコピラノシル一（ 1 → 6 ) — α— D —ダルコピラノシル一（ 1 ~ 3 ) — α— D —グルコピラノシル一 ( 1 →} の構造を有する環状四糖（本明細書では特に断らない限り、本糖質を「環状四糖」と略称する。）が生成し、これをメタノール共存下で晶出させることが示されている。

斯かる環状構造を有する環状四糖は、非還元性の糖質で、包接能を示し、揮発性有機物を安定化する作用ゃァミノカルボニル反応を起こさず、褐変、劣化を懸念することなく、各種用途に利用、加工できるものと期待されている。

しかしながら、環状四糖の製造に必要な原料のアルテルナンや酵素のァルテルナナーゼの入手が困難であるばかりでなく、斯かる酵素を産生する微生物も容易に入手できる状態にはない。

斯かる状況下、本発明者等は、先に、国際特許出願公開第 W O 0 1 / 9 0 3 3 8 A 1 号で開示したように、非還元末端の結合様式として、 α— 1 , 6 グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式として α — 1 ， 4グルコシル結合を有するグルコース重合度が 3以上の糖質 (本明細書においては、本糖質を「α —イソマル卜シルダルコ糖質」と略称することもある。）を原料とし、これに、本糖質の -イソマル卜シル部分とそれ以外のダルコ糖質部分とを特異的に切断し、この —イソマル卜シル部分を転移して環状四糖を生成する α —イソマル卜シル転移酵素を作用させて、環状四糖を生成させることに成功した。この α —イソマルトシル転移酵素は、 α —イソマルトグルコ糖質から α —イソマル卜シル転移することによって環状四糖を生成する酵素であって、詳細には、下記の理化学的性質を有する α —ィソマル卜シル転移酵素である。

( 1 ) 作用

非還元末端の結合様式として α — 1 , 6グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式として α— 1 ， 4グルコシル結合を有するグルコ —ス重合度が 3以上の糖質から、 α—イソマル卜シル転移することによつて、サイクロ {→ 6 ) — a— D—グルコビラノシルー（ 1 →3 ) - - D —ダルコピラノシル一（ 1 → 6 ) — α— D—グルコビラノシルー（ 1 → 3 ) — α— D—ダルコピラノシル— （ 1 →} の構造を有する環状四糖を生成する。

( 2 ) 分子量

S D S —ゲル電気泳動法により、約 8 2， .0 0 0乃至約 1 3 6， 0 0 0 ダル卜ンの範囲内に分子量を有する。

( 3 ) 等電点

アンフォライン含有電気泳動法により、 p i 約 3. 7乃至約 8. 3の範囲に等電点を有する。

( ) 至適温度

P H 6. 0、 3 0分間反応の反応条件下、約 4 5乃至約 5 0 °Cの温度範囲内に至適温度を有する。

( 5 ) 至適 p H

3 5 °C 3 0分間反応の反応条件下、 p H約 5. 5乃至約 6. 5の温度範囲内に至適 p Hを有する。

( 6 ) 温度安定性

p H 6. 0、 6 0分間保持する条件において、約 4 5 °C以下に温度安定域を有する。

( 7 ) p H安定性

4 °C、 2 4時間保持する条件で下、 p H約 3. 6乃至約 1 0. 0の範囲内に安定 p H域を有する。

しかしながら、環状四糖の原料糖質についてみると、豊富で安価に供給される澱粉からの生産が望まれるものの、実際には、 α—イソマルトシル転移酵素が澱粉に直接作用しないことから、予め、澱粉を前述の特定構造を有する α —イソマルトシルグルコ糖質、例えば、パノースやイソマル卜シルマル卜一スなどの比較的低分子のィソマルトオリゴ糖に変換させ、次いで、これに α —イソマル卜シル転移酵素を作用させて環状四糖を生成させる手法が採用されている。一方、原料か.らの環状四糖の収率についてみると、パノースを用いる場合、原料パノース重量当たりの収率は約 4 4 % である。同様に、イソマル卜シルマル卜一スを用いる場合の収率は、約 3 1 %であるのに対して、澱粉を用いる場合には、予め、 α —アミラーゼ、澱粉枝切り酵素、ーアミラーゼ及び α—グルコシダーゼなどを作用させてパノースなどの比較的低分子のィソマルト才リゴ糖を生成させる必要があるだけでなく、環状四糖の収率も約 1 5 %と極めて低いことが判明している。澱粉からの環状四糖の生産は、このように低い生成率でも可能であるものの、コスト高が懸念され、澱粉を原料として、環状四糖の収率を向上させた新規製造方法の確立が望まれていた。

斯かる状況下、本発明者等は、澱粉を原料とし、澱粉から環状四糖の収率を著しく向上させることのできる α—イソマル卜シルダルコ糖質を生成する新規な酵素に期待を込めて、微生物を広く検索してきた。その結果、意外にも、国際特許出願公開第 W O 0 1 / 9 0 3 3 8 A 1 号で開示した土壌からの分離菌バチルス（ B a c i I I u s ) 属およびァルスロバクタ一（ A r t h r o b a c t e r ) 属に属する a —イソマルトシル転移酵素産生微生物 C 9株、 C I 1 株、 N 7 5株および A 1 9株が、新規な a —イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素をも併せて産生することを見出し、澱粉部分分解物をはじめとする比較的高分子のグルコ糖質に、この新規 a —イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素と a —イソマルトシル転移酵素とを作用させることにより、目指していた環状四糖の収率を著しく向上させることのできることを見出し、この a —イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素の諸性質を明らかにすると共に、その製造方法を確立し、更には、当該酵素による α —ダルコシル転移反応方法、 α —イソマルトシルグルコ糖質の製造方法、及び当該酵素と α —イソマル卜シル転移酵素とを併用した環状四糖又はこれを含む糖質及びその製造方法、併せて、これら方法により得られる環状四糖、又はこれを含む糖質を含有せしめた飲食物、化粧品、医薬品などの組成物を確立した。しかしながら、これら微生物は、 α—ィソマル卜シルグルコ糖質生成酵素産生能が充分でなく、 α —イソマルトシルグルコ糖質や環状四糖を大規模に製造する場合、斯かる当該酵素の供給源としての微生物を大量に培養しなければならないという問題がある。この点、今日では分子生物学が進展し、酵素の本質がポリペプチドであり、それを構成するアミノ酸配列がその酵素活性の発現を左右するものであり、そのアミノ酸配列は、遺伝子 D Ν Αに暗号化されていることが知られている。したがって、ポリペプチドをコードする遺伝子を単離し、その塩基配列を解明できれば、そのポリペプチドをコードする D N Aを含む組換え D N Aを作製し、これを適宜微生物や動植物細胞に導入し、得られる形質転換体を適宜栄養培地中で培養することにより、比較的容易に所望量のポリペプチドが取得できるようになった。斯かる状況に鑑み、上記酵素の本質であるポリペプチドをコ一ドする遺伝子を突き止め、その塩基配列を解明するのが急務となっている。発明の開示

本発明の第一の目的は、非還元末端の結合様式として — 1 , 4ダルコシル結合を有するグルコース重合度が 2以上の糖質から、還元力を実質的に増加することなく α —グルコシル転移することによって、非還元末端の結合様式として α— 〗， 6グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式として 4 グルコシル結合を有するグルコース重合度が 3 以上の糖質を生成する α —イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリぺプチドを創製することである。

本発明の第二の目的は、前記ポリペプチドをコードする D N Aを提供すると 1 c 。

本発明の第三の目的は、前記 D N Aを含む複製可能な組換え D N Aを提供することにある。

本発明の第四の目的は、前記組換え D N Aを導入した形質転換体を提供

9 る《_とあ "3 ο

本発明の第五の目的は、前記形質転換体を用いる、 α —イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリぺプチドの製造方法を提供することにある。

本発明の第六の目的は、前記ポリぺプチドの用途を提供することにある。本発明は、前記第一の目的を下記の理化学的性質を有する α —イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドにより解決するものである。

( 1 ) 作用非還元末端の結合様式として α— 1 , 4ダルコシル結合を有するグルコース重合度が 2以上の糖質から、還元力を実質的に増加することなく α—グルコシル転移することによって、非還元末端の結合としてな — 1 ， 6ダルコシル結合様式を有し、この非還元末端以外の結合様式として α - 1 , 4グルコシル結合を有するグルコース重合度が 3以上の糖質を生成する。

( 2 ) 分子量

S D S —ゲル電気泳動法により、約 7 4， 0 0 0乃至約 1 6 0 , 0 0 0 ダルトンの範囲内に分子量を有する。

( 3 ) 至適温度

ρ Η 6 . 0、 6 0分間反応の条件下、約 4 0乃至約 5 0 °Cの温度範囲内に至適温度を有する。

p H 6. 0、 6 0分間反応の条件下において、 1 m M C a ²⁺存在下、約 4 5乃至約 5 5°Cの温度範囲内に至適温度を有する。

p H 8. 4、 6 0分間反応の条件下、 6 0 °Cに至適温度を有する。または、

p H 8. 4、 6 0分間反応の条件下において、 1 m M C a ^{2 +}存在下、約 6 5 °Cに至適温度を有する。

( 4 ) 至適 p H

3 5 °C、 6 0分間反応の条件下、 p H約 6. 0乃至約 8. 4の温度範囲内に至適 p Hを有する。

( 5 ) 温度安定性

p H 6. 0、 6 0分間保持する条件下、約 4 5 °C以下に温度安定域を有

9 -S> o

p H 6. 0、 6 0分間保持する条件において、 1 m M C a ²⁺存在下、約 6 0 °C以下に温度安定域を有する。

p H 8. 0、 6 0分間反応の条件下、 5 5 °C以下に温度安定域を有する。または、

p H 8. 0、 6 0分間保持する条件において、 1 m M C a ²⁺存在下、約 6 0 °C以下に温度安定域を有する。

( 6 ) p H安定性

4 °C、 2 4時間保持する条件下、 p H約 5. 0乃至約 1 0. 0の範囲内に安定 P H域を有する。

本発明は、前記第二の目的を、上記ポリペプチドをコードする D N Aによリ解決するものである。

本発明は、前記第三の目的を、上記ポリペプチドをコードする D N Aと自律複製可能なベクタ一を含んでなる複製可能な D N Aにより解決するものである。

本発明は、前記第四の目的を、上記ポリペプチドをコードする D N Aと自律複製可能なベクタ一を含んでなる複製可能な組換え D N Aを適宜宿主に導入してなる形質転換体により解決するものである。

本発明は、前記第五の目的を、上記ポリペプチドをコードする D N Aと自律複製可能なベクタ一を含んでなる複製可能な組換え D N Aを適宜宿主に導入してなる形質転換体を培養し、培養物からポリベプチドを採取してなるポリぺプチドの製造方法によリ解決するものである。

本発明は、前記第六の目的を、前記ポリペプチドの種々の用途を確立することにより解決するものである。図面の簡単な説明

第 1 図は、マルトテ卜ラオースに α—イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリぺプチドを作用させたときに生成する生成物 Xの¹ Η 一 N M Rスペクトルを示す図である。

第 2図は、マル卜ペンタオースに α—イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリぺプチドを作用させたときに生成する生成物 Υの' Η 一 N M Rスぺクトルを示す図である。

第 3図は、マルトテトラオースに α—ィソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリぺプチドを作用させたときに生成する生成物 Xの^{1 3} C — N M Rスぺクトルを示す図である。

第 4図は、マル卜ペンタオースに α—イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドを作用させたときに生成する生成物 Υの' ³ C 一 N M Rスぺクトルを示す図である。

第 5図は、バチルスグロビスポルス C 1 1 株由来の α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。第 6図は、バチルスグロビスポルス N 7 5株由来の α —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。第 7図は、ァルスロバクタ一グロビホルミス A 1 9株由来の α—イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼす温度の影響を示す図である。

第 8図は、バチルスグロビスポルス C 9株由来の —イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼす Ρ Ηの影響を示す図である。

第 9図は、バチルスグロビスポルス Ν 7 5株由来の α —イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼす ρ Ηの影響を示す図である。第 1 0図は、ァルスロパクターグロビホルミス A 1 9株由来の α —イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素の酵素活性に及ぼす ρ Ηの影響を示す図である。

第 1 1 図は、本発明のバチルスグロビスポルス C 1 1 由来の α —イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素の温度安定性を示す図である。

第 1 2図は、バチルスグロビスポルス Ν 7 5 由来の α —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素の温度安定性を示す図である。

第 1 3図は、ァルスロバクタ一グロビホルミス A 1 9株由来の α —イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素の温度安定性を示す図である。

第 1 4図は、バチルスグロビスポルス C 1 1 株由来の α —イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の ρ Η安定性を示す図である。

第 1 5図は、バチルスグロビスポルス Ν 7 5株由来の α —イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素の ρ Η安定性を示す図である。

第 1 6図は、ァルスロパクターグロビホルミス A 1 9株由来の α—イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の ρ Η安定性を示す図である。

第 1 7図は、本発明による組換え D N A 『 p B G C 2』の制限酵素地図を示す図である。図中、黒い太線で示した部分は、バチルスグロビスポルス C 1 1 由来の本発明の α—イソマル卜シル転移酵素活性を有するポリペプチドをコードする D N Aである。

第 1 8図は、本発明による組換え D N Aの『 p B G N 2』の制限酵素地図を示す図である。図中、黒い太線で示した部分は、バチルスグロビスポルス N 7 5由来の本発明の α—イソマル卜シル転移酵素活性を有するポリペプチドをコードする D N Aである。

第 1 9図は、本発明による組換え D N Aの『 p A G A 1 』の制限酵素地図を示す図である。図中、黒い太線で示した部分は、ァルスロバクタ一グロビホルミス A 1 9株由来の本発明の α—イソマルトシル転移酵素活性を有するポリペプチドをコードする D Ν Αである。発明を実施するための最良の形態

本発明のポリペプチドとは、非還元末端の結合様式として α— 1 , 4グルコシル結合を有するグルコース重合度が 2以上の糖質から、還元力を実質的に増加することなく α—グルコシル転移することによって、非還元末端の結合様式として α— 1 , 6結合を有し、この非還元末端以外の結合様式として α— 1 ， 4グルコシル結合を有するグルコース重合度が 3以上の糖質を生成する酵素活性を有するポリペプチド全般を意味する。本発明のポリペプチドは、通常、解明されたアミノ酸配列を有しており、その一例としては、例えば、配列表に於ける配列番号〗に示すアミノ酸配列、若しくはそのアミノ酸配列に於いて、 1 若しくは複数個のアミノ酸、即ち、 1 個又は 2個以上、場合によっては、 1 乃至 5 0個、或いは、 1 乃至 3 0個、若しくは、 1 乃至 1 0個のァミノ酸が欠失したり、他のァミノ酸で置換されたり、更には付加されたァミノ酸配列を有するポリぺプチドを例示することができる。尚、同じ D N Aであっても、それを導入する宿主や、その D Ν Αを含む形質転換体の培養に使用する栄養培地成分、組成や培養温度、 p Hなどのよっては、宿主内外酵素による D N A発現後の修飾などにより、所期の理化学的性質は保持しているものの、配列表に於ける配列番号 1 に示すァミノ酸配列における N末端付近のァミノ酸が 1 若しくは複数個、即ち、 1 個又は 2個以上、場合によっては、 1 乃至 5 0個、 1 乃至 3 0個、或いは、 1 乃至 2 0個、若しくは、 1 乃至 1 0個欠失したり、他のアミノ酸と置換されたり、更には N末端に 1 個または 2個以上、場合によって、 1 乃至 3 0個、或いは、 1 乃至 2 0個、若しくは、 1 乃至 1 0個のアミノ酸が新たに付加した変異体が生成することがある。斯かる変異体であっても、それが所期の理化学的性質を具備している限り、当然、本発明のポリペプチドに包含されることは言うまでもない。

本発明のポリペプチドは、本発明の D N Aを適宜宿主に導入し、得られる形質転換体の培養液から採取することができる。本発明で使用する形質転換体としては、例えば、配列表における配列番号 4、 5、又は 6に示す 5 '末端からの塩基配列若しくは、それらの塩基配列において、 1 若しくは複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加した塩基配列、または、それらに相補的な塩基配列若しくはそれらの塩基配列における 1 若しくは複数個を、遺伝子の縮重に基づき、それがコードするアミノ酸配列を変えることなく他の塩基で置換した塩基配列からなる D N Aを含む形質転換体を例示できる。また、上記塩基配列として、遺伝子コードの縮重を利用して、コ —ドするアミノ酸配列を変えることなく、塩基の 1 若しくは複数個、即ち、 1 個または 2個以上、場合によっては、 1 乃至 1 5 0個、 1 乃至 9 0個、或いは 1 乃至 6 0個、若しくは、 1 乃至 3 0個を他の塩基で置き換えたものを例示できる。

本発明の D N Aは、本発明のポリペプチドをコードする塩基配列である限り、天然由来のものであろうと、人為的に合成されたものであろうとその由来は問わない。天然の給源としては、例えば、平成 1 2年 4月 2 5日付で、日本国茨城県つくば市東 1 丁目 1 番地 1 中央第 6所在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ一に、受託番号 F E R M B P— 7 1 4 3 として寄託されているバチルスグロビスポルス C 9株、平成 1 2年 4月 2 5 日付で、日本国茨城県つくば市東 1 丁目 1 番地 1 中央第 6所在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、受託番号 F E R M B P— 7 1 4 4 として寄託されているバチルスグロビスポルス C 1 1 株、及び平成 1 3年 5月 1 6 日付で、日本国茨城県つくぱ巿東 1 丁目 1 番地 1 中央第 6所在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、受託番号 F E R M B P— 7 5 9 1 として寄託されているバチルスグロビスポルス N 7 5株を含むバチラス属、または、平成 1 3年 5月 1 6 日付で、日本国茨城県つくば市東 1 丁目 1 番地 1 中央第 6所在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、受託番号 F E R M B P— 7 5 9 0 として寄託されているァルスロバクタ一 ■ グロビホルミス A 1 9株を含むァルスロパクター属の微生物が挙げられる。これら微生物の菌体からはこの発明の D N Aを含む遺伝子が得られる。すなわち、斯かる微生物を栄養培地に接種し、好気的条件下で約 1 乃至約 3 日間培養後、培養物から菌体を採取し、リゾチームや S—グルカナーゼなどの細胞壁溶解酵素や超音波で処理することにより当該 D N Aを含む遺伝子を菌体外に溶出させる。この際、プロテアーゼなどの蛋白質分解酵素を用いたり、 S D Sなどの界面活性剤の存在下で凍結融解することもできる。斯くして得られる処理物に、例えば、フエノール抽出、アルコ一ル沈殿、遠心分離、リボヌクレアーゼ処理など斯界に於ける通常一般の方法を適用することにより目的の D N Aを得ることができる。一方、本発明の D N Aを人為的に.合成するには、例えば、配列表に於ける配列番号 4、 5、又は 6に示す塩基配列に基づいて化学合成すればよい。又、当該 D N Aを含む遺伝子を錶型として、適当なプライマーとなる得る化学合成 D N Aを用いて、 P C R合成することも有利に実施できる。

これら D N Aを用いて本発明のポリペプチドを工業的に大量に、安価にかつ容易に製造することができる。即ち、当該 D N Aを、通常、自律複製可能な適宜べクターに挿入して組換え D N Aとし、これを適宜宿主に導入し、得られる形質転換体を適宜栄養培地中で培養し、その培養物から菌体を採取し、その菌体から当該 D N Aを含む組換え D N Aを得、これを、通常、容易に増殖させることのできる適宜宿主に導入して形質転換し、得られる形質転換体を適宜栄養培地中で培養することにより、本発明のポリぺプチドを製造することができる。前記組換え D N Aは、本発明のポリぺプチドをコードする D N Aが入手できさえすれば、通常一般の組換え D N A 技術により比較的容易に調製することができる。又、前記ベクターとしては、例えば、 p B R 3 2 2、 p U C 1 8、 B l u e s c r i p t I I S K (十）、 p U B 1 1 0、 p T Z 4、 p C 1 9 4、 p H V 1 4、 T R p 7、 Y E p 7 p B S 7などのプラスミドベクタ一や l g t ' l C、 Λ g t · Λ B , p 1 1 、 0 1 、 0 1 0 5などのファージベクターが挙げられる。このうち、本発明の D N Aを大腸菌で発現させるには、 p B R 3 2 2、 p U C 1 8、 B l u e s c r i p t I I S K (十）、 l g t ' A C及び； I g t · λ Bが好適であり、一方、枯草菌で発現させるには、 p U B 1 1 0、 p T Z 4 p C 1 9 4、 p 1 1 、 0 1 及び 0 1 0 5が好適である。 p H V 1 4、 T R p 7、 Y E _P 7及び _P B S 7は、組換え D N Aを二種以上の宿主内で複製させる場合に有用である。

本発明に係る D N Aを前記べクタ一に挿入するには、斯界において通常一般の方法が採用される。具体的には、先ず、 D N Aを含む遺伝子と自律複製可能なベクタ一とを制限酵素及び/又は超音波により切断し、次に、生成した D N A断片とベクタ一断片とを連結する。遺伝子及びベクターの切断にヌクレオチドに特異的に作用する制限酵素、とりわけ、 I I 型の制限酵素、詳細には、 S a u 3 A I 、 E c o R I 、 H i n d I I I 、 B a m H I 、 S a l l 、 X b a l 、 S a c l、 P s t I などを使用すれば、 D N A断片とベクタ一断片を連結するのが容易である。必要に応じて、両者をァ二一リングした後、生体内又は生体外で D N A リガ一ゼを作用させればよい。斯くして得られる組換え D N Aは、大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母等の適宜宿主に導入して形質転換体とし、これら形質転換体から所望の形質転換体をクローニングし、これを培養することによリ容易かつ大量に複製可能である。前記クローニングに際しては、コロニーハイブリダイゼーション法を適用するか、非還元末端の結合様式として α - 1 , 4グルコシル結合を有するグルコース重合度が 2以上の糖質を含む栄養培地で培養し、該糖質より、非還元末端の結合様式として — 1 , 6 結合を有し、この非還元末端以外の結合様式として α— 1 ， 4グルコシル結合を有するグルコース重合度が 3以上の糖質を生成する形質転換体を選択すればよい。

これらクロ一ニングにより得られる形質転換体は、栄養培地で培養すると、菌体内外に当該ポリペプチドを産生する。栄養培地には、通常、炭素源、窒素源、ミネラル、さらには、必要に応じて、アミノ酸やビタミンなどの微量栄養素を補足した通常一般の液体培地が使用され、個々の炭素源としては、例えば、澱粉、澱粉加水分解物、グルコース、果糖、蔗糖、卜レハロースなどの糖源が、又、窒素源としては、例えば、アンモニア乃至アンモニア塩、尿素、硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、脱脂大豆、コーンスティープリカ一、肉エキスなどの含窒素無機乃至有機物が挙げられる。形質転換体を斯かる栄養培地に接種し、栄養培地を温度 2 0乃至 4 0 °C、 1") 2乃至 1 0に保ちつつ、通気攪拌などによる好気的条件下で約 1 乃至約 6 日間培養すれば、当該ポリペプチドを含む培養物が得られる。この培養物は本発明のポリペプチドを含む粗ポリペプチドとしてそのまま使用可能であるが、通常は使用に先立ち、必要に応じて、浸透圧ショックや界面活性剤により菌体から抽出したり、超音波や細胞溶解酵素により菌体を破砕した後、濾過、違心分離などにより本発明のポリペプチドを菌体又は菌体破砕物から分離し、精製する。精製には斯界に於いてポリペプチドを精製するために用いられる通常の方法が採用でき、例えば、菌体又は菌体破砕物を除去した培養物に濃縮、塩析、透析、分別沈殿、ゲル濾過クロマ卜グラフィ一、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマ卜グラフィー、ァフィ二ティークロマ卜グラフィ一、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などから選ばれる 1 種又は 2種以上の方法を適宜組合わせて適用すればよい。本発明のポリペプチドは、非還元末端の結合様式として — 1 ， 4ダルコシル結合を有するグルコース重合度が 2以上の糖質から、還元力を実質的に増加することなく α—ダルコシル転移することによって、非還元末端の結合様式として α— 1 , 6グルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式として α— 1 ， 4グルコシル結合を有するグルコース重合度が 3以上の糖質を生成する酵素活性を有しており、詳細には、下記の理化学的性質を有する。

( 1 ) 作用

非還元末端の結合様式として α— 1 , 4グルコシル結合を有するダルコース重合度が 2以上の糖質から、還元力を実質的に増加することなく α— グルコシル転移することによって、非還元末端の結合様式としてな— 1 ， 6ダルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式として α — 1 , 4ダルコシル結合を有するグルコース重合度が 3以上の糖質を生成する

( 2 ) 分子量

S D S—ゲル電気泳動法により、約 7 4 , 0 0 0乃至約 1 6 0 , 0 0 0 ダルトンの範囲内に分子量を有する。

( 3 ) 至適温度 p H 6. 0、 6 0分間反応の条件下、約 4 0乃至約 5 0 °Cの温度範囲内に至適温度を有する。

p H 6. 0、 6 0分間反応の条件下において、 1 m M C a ^{2 +}存在下、約 4 5乃至約 5 5 °Cの温度範囲内に至適温度を有する。

( 4 ) 至適 p H

3 5 °C、 6 0分間反応の条件下、 p H約 6. 0乃至 8. 4の温度範囲内に至適 p Hを有する。

( 5 ) 温度安定性

P H 6. 0、 6 0分間保持する条件下、約 4 5 °C以下に温度安定域を有する。

p H 6. 0、 6 0分間保持する条件において、 1 m M C a ^{2 +}存在下、約 6

0 °C以下に温度安定域を有する。

p H 8. 0、 6 0分間保持する条件において、 1 m M C a ² +存在下、約 6 0 °C以下に温度安定域を有する。

( 6 ) p H安定性

4°C、 2 4·時間保持する条件下、 p H約 5. 0乃至約 1 0. 0の範囲内に安定 p H域を有する。

本発明のポリべプチドが作用する基質としては、澱粉、アミ口べクチン、アミロース、グリコーゲンなどの α— 1 , 4グルコシル結合を含む多糖や、それらをアミラーゼ又は酸などによって部分的に加水分解して得られるァミロデキストリン、マル卜デキス卜リン、マルト才リゴ糖などの部分分解物が用いられる。これら α— 1 , 4結合を含むダルコ糖質を、更にブランチングェンザィムなどの枝付け酵素（ E C 2. 4. 1 . 1 8 ) で処理した糖質を用いることも随意である。ァミラーゼで分解した部分分解物としては、例えば、『ハンドブック · ォブ · アミレーシズ · アンド · リレイテッ卜 · エノサっムズ ( H a n d b o o k o f A m y l a s e s a n d R e I a t e d E n z y m e s 』、パ一ガモン ' プレス社（東京）（ 1 9 8 8年）に記載されている、 α—アミラーゼ（ E C 3. 2. 1 . 1 )、 —アミラーゼ（ E C 3. 2. 1 . 2 )、マルトトリオース生成アミラーゼ ( E C 3. 2. 1 . 1 1 6 )、マルトテ卜ラオース生成アミラーゼ（ E C 3. 2. 1 . 6 0 )、マルトペンタ才一ス生成アミラーゼ、マルトへキサ才 —ス生成アミラーゼ（ E C 3. 2. 1 . 9 8 ) などのアミラーゼで分解した部分分解物を用いることができる。更には、部分分解物を調製する際、プルラナ一ゼ（ 3. 2. 1 . 4 1 )、イソアミラーゼ（ E C 3. 2. 1 . 6 8 ) などの澱粉枝切り酵素を作用させることも随意である。基質としての澱粉は、とうもろこし、小麦、米などの穀類に由来する地上澱粉であつても、また馬鈴薯、さつまいも、タピオ力などの地下澱粉であってもよく、好ましくは、澱粉を糊化及び Z又は液化した溶液として用いられる。その澱粉の部分分解の程度は低い程、環状四糖の生成率が高くなることから、 D E約 2 0以下、望ましくは約 1 2以下、更に望ましくは約 5以下が好適である。基質濃度は特に限定されない。例えば、基質濃度 0. 1 % ( w/ w) (以下、本明細書では、特に断らない限り、「％ ( w/w)J を単に「％」と略称する）の低濃度溶液として用いた場合でも、本発明の酵素反応は進行するが、工業的には、 1 %以上が好適である。又、基質溶液中に、完全に溶けきらない不溶性基質を含有するものであってもよい。望ましくは、濃度 4 0 %以下、更に望ましくは 2 0 %以下が好適である。反応温度は反応が進行する温度、即ち、 6 5 °C付近までの温度、好ましくは 3 0乃至 5 5 °C付近の温度で実施すればよい。反応 p Hは、通常、 4 . 5乃至 8の範囲に調整すればよい。好ましくは P H約 5 . 5乃至 7の範囲に調整する。反応時間は酵素反応の進行により適宜選択する。

本発明のポリペプチドをその基質に作用させて生成した α—イソマルトシルグルコ糖質に α—イソマル卜シル転移酵素を作用させることにより、斯界に於いて有用な環状四糖を大量かつ容易に製造することができる。 α 一イソマル卜シル転移酵素を作用させる時期は、本発明のポリぺブチドを作用させ、当該ポリペプチドを失活させた後に作用させてもよい。しかしながら、好適には、本発明のポリペプチドと α—イソマル卜シル転移酵素とを併用して作用させるのがよい。具体的には、澱粉又はその部分分解物ゃグリコ一ゲンの水溶液に本発明のポリペプチドと α—イソマル卜シル転移酵素とを併用することにより、澱粉又はその部分分解物からは環状四糖が固形物当たり約 3 0 %以上の収率で、また、グリコーゲンの場合は固形物当たり約 8 0 %以上もの収率で環状四糖を得ることができる。本発明のポリペプチドと α—イソマルトシル転移酵素との併用する場合の環状四糖の生成メカニズムは、両者の反応特性から以下のように推察される。

( 1 ) 本発明のポリぺプチドは、非還元末端の結合様式として α— 1 , 4グルコシル結合を有するグルコース重合度が 2以上の糖質、例えば、澱粉、グリコーゲン、又はこれらの部分分解物などの糖質の非還元末端の α — 1 , 4グルコシル基に作用し、グルコース基を他の非還元末端グルコ一ス基の 6位水酸基に分子間転移させ、非還元末端に α—イソマルトシル基を有する糖質が生成する。

( 2 ) 一イソマル卜シル転移酵素は、非還元末端にイソマルトシル基を有する糖質に作用し、そのイソマル卜シル基を、他の非還元末端に位置するイソマル卜シル基を有する糖質の非還元末端グルコース基の 3位水酸基に分子間転移させ、非還元末端にィソマルトシル— 1 ， 3 —イソマルトシル基を有する糖質を生成する。

( 3 ) α —イソマルトシル転移酵素は、その非還元末端にイソマルトシルー 1 , 3 —イソマルトシル基を有する糖質に作用し、分子内転移作用によってイソマルトシルー 1 , 3 —イソマル卜シル基を糖質から切り離し、これを環状化して環状四糖を生成する。

( 4 ) ( 3 ) に於いて、イソマルトシルー 1 ， 3 —イソマルトシル基を切り離された後の糖質は、再度、（ 1 ) から（ 3 ) の反応を経由することによつて、環状四糖を生成し、更にこれらの反応が繰返されて著量の環状四糖が生成し蓄積される。

以上、説明したように、本発明のポリペプチドと α —イソマル卜シル転移酵素の併用により、上記したように、両者がそれぞれの基質に繰り返し作用し、環状四糖の収率が著しく向上するものと推察される。

又、この環状四糖の生成反応に於いて、他の転移酵素を更に併用して、環状四糖の収率を向上させることも有利に実施できる。即ち、例えば、濃度約 1 5 %の澱粉部分分解物に、本発明のポリぺプチドと α —イソマルトシル転移酵素とを併用して作用させることにより、基質固形物当たり約 5 5 %の収率で環状四糖が得られるところ、同じ条件で本発明のポリベプチドと α —ィソマルトシル転移酵素並びにシクロマル卜デキス卜リングルカノトランスフヱラーゼの三者を併用して作用させることにより、基質固形物当たりの環状四糖の収率を更に約 5乃至約 1 0 %高めて約 6 0乃至約 6 5 %にまで高めることができる。

上記の反応によって得られた溶液は、環状四糖又はこれを含有する糖質を含む溶液としてこのまま用いることも可能である。しかしながら、一般的には、これら糖質は適宜手法により精製して用いられる。精製方法としては、公知の方法を適宜採用すればよく、例えば、活性炭での脱色、精製、 H型、 0 H型ィ才ン交換樹脂での脱塩、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマ卜グラフィ一、イオン交換カラムクロマ卜グラフィ一、活性炭力ラムクロマ卜グラフィ一、シリカゲルカラムクロマ卜グラフィーなどの力ラムクロマ卜グラフィ一による分画、アルコール及びァセ卜ンなど有機溶媒による分別、適度な分離性能を有する膜による分離、更には、アミラーゼ、例えば、 α—アミラーゼ、ーアミラーゼ、グルコアミラーゼ（ E C 3 . 2 . 1 . 3 ) などや α —ダルコシダーゼ（ E C 3 . 2 . 1 . 2 0 ) などの酵素を用いて残存する他の糖質を分解する方法、酵母による発酵処理、アルカリ処理などによる残存する還元性糖質の分解除去などの各種精製方法を 1 種又は 2種以上組み合せて精製することができる。とりわけ、工業的大量生産方法としては、イオン交換カラムクロマ卜グラフィ一が好適であり、例えば、特開昭 5 8— 2 3 7 9 9号公報、特開昭 5 8— 7 2 5 9 8 号公報などに開示されている強酸性力チ才ン交換樹脂を用いる力ラムクロマ卜グラフィ一により夾雑糖類を除去することにより、高純度の環状四糖又はこれを含む糖質を有利に製造することができる。この際、固定床方式、移動床方式、疑似移動床方式のいずれの方式を採用することも随意である。このようにして得られた環状四糖又はこれを含む糖質は、更に濃縮し、シラップ状製品とするか、乾燥して非晶質の環状四糖又はこれを含む粉末状糖質製品にすることも随意である。

又、環状四糖結晶を製造するには、例えば、有機溶媒存在下又は非存在下、固形物純度約 5 0 %以上、固形物濃度約 3 0 %乃至約 9 0 %の環状四糖高含有液を助晶缶にとり、固形物当たり、 0 . 1 乃至 2 0 %の環状四糖種結晶共存下で、温度 9 5 ¾以下、望ましくは、 1 0乃至 9 0 °Cの範囲で、攪拌条件下、高温から低温に徐冷し、環状四糖結晶を含有するマスキッ卜を製造する。マスキッ卜から環状四糖結晶又はこれを含有する糖質を製造する方法としては、例えば、ブロック粉砕方法、流動造粒方法、噴霧乾燥方法などの公知の方法、又は含蜜結晶を製造する方法としては、分蜜方法などを適宜採用すればよい。

斯くして得られる環状四糖は、上品で低甘味を有する非還元性の白色粉末又はシラップで、安定であり、他の素材、特にアミノ酸、オリゴぺプチド、蛋白質などのアミノ酸含有物質と混合し、加工しても、褐変することも、異臭を発生することも、又、混合した他の素材の物性を損なうことも殆どない。又、環状四糖は包接能を有していることから、香気成分、有効成分などの揮散、品質劣化を防止し、香気成分、有効成分の安定化保持に極めて優れている。この際、必要ならば、シクロ（環状）デキス卜リン類、分岐シクロデキス卜リン類、シクロデキストラン類、シクロフラクタン類などの他の環状糖質を併用することにより、包接能による各種成分の安定化を更に高めることも有利に実施できる。前記環状四糖以外にシクロデキス卜リン類などの環状糖質は、高純度のものに限る必要はなく、低純度の環状糖質、例えば、多量のマルトデキス卜リンとともに各種のシクロデキス卜リンを含有した澱粉部分分解物であっても用いることができる。

更に、本発明のポリペプチドを用いて得られる環状四糖は、アミラーゼや α—グルコシダーゼによって実質的に分解されないことから、経口摂取しても消化吸収されず、又、腸内細菌によって醱酵されにくく、極めて低カロリ一の水溶性食物繊維として利用することができ、虫歯誘発菌などによっても、酸酵されにくく、虫歯を起こしにくい甘味料として、更には、粉末状物の付着、固結防止剤としても利用することができる。更に、斯かる環状四糖自体は、無毒、無害の天然甘味料であり、安全で安定な甘味料である。環状四糖結晶製品の場合には、プルラン、ヒドロキジェチルスタ —チ、ポリビニルピロリドンなどの結合剤と併用して錠剤、糖衣錠に利用することも有利に実施できる。又、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘性、他の糖の結晶防止性、難醌酵性などの有用な性質をも具備している。

従って、本発明のポリペプチドを用いて得られる環状四糖又はこれを含む糖質は、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤などとして、飲食物、嗜好物、飼料、餌料、化粧品、医薬品などの各種組成物に有利に利用できる。

又、本発明のポリペプチドを用いて得られる環状四糖又はこれを含む糖質は、そ pまま甘味付のための調味料として使用できる。必要ならば、例えば、粉飴、ブドウ糖、果糖、乳糖、異性化糖、砂糖、麦芽糖、卜レハロ —ス（ α， α— 卜レハロース、 α , ートレハロース、 β，一トレハロース）、蜂蜜、メーブルシュガー、ソルビトール、マルチ卜一ル、ジヒドロカルコン、ステビオシド、 α —グリコシルステビオシド、ラカン力甘味物、グリチルリチン、ソ一マチン、 L ーァスパラチルフエ二ルァラニンメチルエステル、サッカリン、アセスルファム Κ、スクラロース、グリシン、ラニンなどの他の甘味料と併用することも、又、デキス卜リン、澱粉、乳糖などのような増量剤と併用することもできる。とりわけ、エリスリ卜一ル、キシリ卜一ル、マルチ卜一ルなどの低カロリー甘味料や α —グリコシルステビ才シド、ソーマチン、 Lーァスバルチルー L —フエ二ルァラニンメチルエステル、サッカリン、アセスルファム Κ及びスクラロースなどの 1種又は 2種以上の高甘味度甘味料と併用して、低カロリ一甘味料又はダィエツ卜甘味料などとして好適に利用することができる。

更に、本発明のポリペプチドを用いて得られる環状四糖又はこれを含む糖質は、そのままで、又は必要に応じて、他の増量剤、賦形剤、結合剤などと混合して、顆粒、球状、短棒状、板状、立方体、錠剤など各種形状に成形して用いることも随意である。

又、本発明のポリペプチドを用いて得られる環状四糖又はこれを含む糖質の甘味は、酸味、塩から味、渋味、旨味、苦味などの他の呈味を有する各種の物質とよく調和し、耐酸性、耐熱性も大きいので、一般の飲食物の甘味付、呈味改良に、また品質改良などに有利に利用できる。例えば、醤油、粉末醤油、味噌、粉末味噌、もろみ、ひしお、フリカケ、マヨネーズ、ドレッシング、食酢、三杯酢、粉末すし酢、中華の素、天つゆ、麵つゆ、ソース、ケチャップ、焼き肉の夕れ、カレールゥ、シチューの素、スープの素、ダシの素、複合調味料、みりん、新みりん、テーブルシュガー、コ —ヒ一シュガーなどの各種調味料への甘味料、更には、呈味改良剤、品質改良剤などとして使用することも有利に実施できる。又、例えば、せんべい、あられ、おこし、求肥、餅類、まんじゅう、ういろう、あん類、羊羹、水羊羹、錦玉、ゼリー、カステラ、飴玉などの各種和菓子、パン、ビスケット、クラッカ一、クッキー、ノィ、ブリン、バタークリーム、カス夕一ドクリーム、シュークリーム、ワッフル、スポンジケーキ、ドーナツ、チョコレート、チューインガム、キャラメル、ヌガー、キャンディ一などの各種洋菓子、アイスクリーム、シャーベットなどの氷菓、果実のシロップ漬、氷蜜などのシロップ類、フラワーペースト、ピーナッツペースト、フルーツペース卜などのペース卜類、ジャム、マーマレード、シロップ漬、糖果などの果実、野菜の加工食品類、福神漬け、べつたら潰、千枚漬、らつきよう漬などの漬物類、たくあん潰の素、白菜潰の素などの漬物の素、ハム、ソーセージなどの畜肉製品類、魚肉ハム、魚肉ソーセージ、カマボコ、チクヮ、天ぷらなどの魚肉製品、ゥニ、イカの塩辛、酢コンブ、さきするめ、ふぐのみりん干し、タラ、タイ、ェビなどの田麩などの各種珍味類、海苔、山菜、するめ、小魚、貝などで製造される佃煮類、煮豆、ポテ卜サラダ、コンブ卷などの惣菜食品、乳製品、魚肉、畜肉、果実、野菜の瓶詰、缶詰類、合成酒、增醸酒、清酒、果実酒、発泡酒、ビールなどの酒類、珈琲、ココア、ジュース、炭酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌飲料などの清涼飲料水、プリンミックス、ホッ卜ケーキミックス、即席ジユース、即席コーヒー、即席しるこ、即席スープなどの即席食品、更には、離乳食、治療食、ドリンク剤、ペプチド食品、冷凍食品などの各種飲食物への甘味付に、呈味改良に、品質改良などに有利に実施できる。又、家畜、家禽、その他は蜜蜂、蚕、魚などの飼育動物のための飼料、餌料など嗜好性を向上させる目的で使用することもできる。その他、タバコ、練歯磨、口紅、リップクリーム、内服液、錠剤、トローチ、肝油ドロップ、口中清涼剤、口中香剤、うがい剤など各種の固形物、ペース卜状、液状などで嗜好物、ィ匕粧品、医薬品などの各種組成物への甘味剤として、又は呈味改良剤、矯味剤として、さらに品質改良剤、安定剤などとして有利に利用できる。品質改良剤、安定剤としては、有効成分、活性など失い易い各種生理活性物質又はこれを含む健康食品、医薬品などに有利に適用できる。例えば、インターフェロン一、インタ一フエロン一 3、イン夕一フエロン一ァ、ツモァ · ネクロシス · ファクタ—— α、ッモア · ネクロシス ' ファクタ—— β、マクロファージ遊走阻止因子、コロニー刺激因子、卜ランスファーファク夕一、インタ一ロイキン I I などのリンホカイン含有液、インシュリン、成長ホルモン、プロラクチン、エリトロポェチン、卵細胞刺激ホルモンなどのホルモン含有液、 B C Gワクチン、日本脳炎ワクチン、はしかヮクチン、ポリ才生ヮクチン、痘苗、破傷風卜キソィド、ハブ抗毒素、ヒ卜免疫グロブリンなどの生物製剤含有液、ペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフエニコ一ル、テトラサイクリン、ストレブ卜マイシン、硫酸カナマイシンなどの抗生物質含有液、チアミン、リボフラビン、 L —ァスコルビン酸、肝油、カロチノイド、エルゴステロール、トコフエロールなどのビタミン含有液、 E P A 、 D H A、ァラキドン酸などの高度不飽和脂肪酸又はそのエステル誘導体、リパーゼ、エステラーゼ、ゥロキナーゼ、プロテァーゼ、ーアミラーゼ、イソアミラーゼ、グルカナーゼ、ラクタ一ゼなどの酵素含有液、薬用人参エキス、スッポンエキス、クロレラエキス、ァロェエキス、プロポリスエキスなどのエキス類又はローヤルゼリーなどの各種生理活性物質、更には、ウィルス、乳酸菌、酵母などの生菌ペース卜などの有効成分や活性を失うことなく、安定で高品質の液状、ペース卜状又は固状の健康食品や医薬品などを容易に製造できることとなる。

以上述べたような各種組成物に、本発明のポリペプチドを用いて得られる環状四糖又はこれを含む糖質を含有させる方法としては、その製品が完成するまでの工程に含有せしめればよく、例えば、混和、混捏、溶解、融解、浸漬、浸透、散布、塗布、被覆、噴霧、注入、晶析、固化など公知の方法が適宜選ばれる。含有させる環状四糖の量は、通常 0. 1 %以上、望ましくは、 1 %以上とするのが好適である。

以下、バチルスグロビスポルス C 1 1 株（ F E R M B P - 7 1 4 4 )、バチルスグロビスポルス N 7 5株（ F E R M B P— 7 5 9 1 )、及びァルスロノくクタ一 ' グルビホルミス A 1 9株（ F E R M B P - 7 5 9 0 ) が産生する α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素活性を有するポリぺプチドの理化学的性質の解明、及び、 α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドをコードする D Ν Αの解明、更に、その D N Aを利用した組換え型 α—イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリぺプチドの調製方法を実験例に基づいて説明する。実験例 1 バチルスグロビスポルス C 1 1 株由来 α—イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリぺプチドの調製

実験例 1 一 1 α—イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の調製

澱粉部分分解物『パインデックス # 4』 4. 0 % ( w/ V 酵母抽出物『アサヒミース卜』 1 . 8 % (wZ v )、リン酸二カリウム 0. 1 % (wZ V )、リン酸一ナトリウム · 1 2水塩 0. 0 6 % ( w/ v )、硫酸マグネシゥム · 7水塩 0. 0 5 % ( w / V )、及び水からなる液体培地を、 5 0 0 m I 容三角フラスコに〗 0 0 m I ずつ入れ、才一卜クレーブで 1 2 1 °C、 2 0分間滅菌し、冷却して、バチルスグロビスポルス C 1 1 株を接種し、 2 7 °C、 2 3 0 r p mで 4 8時間回転振盪培養したものを種培養とした。容量 3 0 しのフアーメンターに種培養の場合と同組成の培地を約 2 0 I 入れて、加熱滅菌、冷却して温度 2 7 °Cとした後、種培養液 1 % ( V / V ) を接種し、温度 2 7 °C、 p H 6. 0乃至 8. 0に保ちつつ、 4 8時間通気攪拌培養した。培養後、培養物中の酵素活性を測定したところ、 α—イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は約 0. 5 5単位 /m l で、 α—イソマルトシル転移酵素活性は約 1 . 8単位 /m I であった。この培養物を遠心分離（ 1 0， 0 0 0 r p m、 3 0分間）して回収した上清約 1 8 Lの酵素活性を測定したところ、 —イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は約 0. 5 1 単位 Z m I (総活性約 9 , 1 8 0単位）で、 α—イソマルトシル転移酵素活性は約 1 . 7単位/ m I (総活性約 3 0 , 4 0 0単位）であリ、両酵素活性とも主に培養上清中に検出され、両酵素とも培養液に分泌される分泌型酵素であることが判明した。

尚、前記に種類の酵素活性は次のようにして測定した。即ち、 α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素活性の測定は、マル卜卜リオ一スを濃度 2 % ( w/ V ) となるよう 1 0 0 m M酢酸緩衝液（ p H 6. 0 ) に溶解させ基質液とし、その基質液 0. 5 m I に酵素液 0. 5 m l 加えて、 3 5 °C で 6 0分間酵素反応し、その反応液を 1 0分間煮沸して反応を停止させた後、その反応液中のマルトース含量を高速液体クロマトグラフィー（ H P L C法で定量することによって行った。 α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素の活性 1 単位は、上記の条件下で 1 分間に 1 モルのマルトースを生成する酵素量と定義した。尚、 H P L Cは、『 S h o d _{e x} K S — 8 0 1 』カラム（昭和電工（株）製）を用い、力ラム温度 6 0 °C、溶離液として水の流速 0.. 5 m I Zm i n水の条件で行い、検出は示差屈折計『 R I — 8 0 1 2』（東ソ一（株）製）を用いて行なった。

又、 α—ィソマル卜シル転移酵素活性の測定は、パノースを濃度 2 % ( w / V ) となるように 1 O O m M酢酸緩衝液（ p H 6. 0 ) に溶解させて基質液とし、その基質液 0. 5 m l に酵素液 0. 5 m l 加えて、 3 5 °Cで 3 0分間酵素反応し、その反応液を 1 0分間煮沸して反応を停止させた後、その反応停止液中のグルコース量をグルコース才キシダ一ゼ法で定量することにより行った。 α—イソマルトシル転移酵素の活性 1 単位は、上記の条件下で 1 分間に 1 ζモルのグルコースを生成する酵素量と定義した。実験例 1 - 2 部分精製酵素標品の調製

実験例 1 一 1 の方法で得た培養上清約 1 8 Lを 8 0 %飽和硫安液で塩析して 4 °C、 2 4時間放置した後、その塩析沈殿物を遠心分離（ 1 0， 0 0 0 r p m、 3 0分間）して回収し 1 0 m Mリン酸緩衝液（ p H 7. 5 ) に溶解後、同緩衝液に対して透析して粗酵素液約 4 1 6 m l を得た。この粗酵素液は、 α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素活性を約 8 , 4 4 0単位、 α—イソマル卜シル転移酵素活性を約 2 8 , 0 0 0単位含んでいた。この粗酵素液を『セフアビ一ズ（ S e p a b e a d s ) F P— D A 1 3』ゲル（三菱化学（株）製）を用いたィオン交換クロマ卜グラフィ一に供した。 α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素活性成分、 α—イソマルトシル転移酵素活性成分は、何れも、『セパビーズ（ S e p a b e a d s ) F P — D A 1 3』ゲルには吸着^ずに、両酵素活性は非吸着画分に検出された。この非吸着画分を回収し、 1 M硫安を含む 1 0 m Mリン酸緩衝液（ p H 7. 0 ) に対して透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セファクリル（ S e p h a c r y l ) H R S — 2 0 0』ゲル（アマシャム . ファルマシア ' バイオテク（株）製を用いたァフィ二ティ一クロマ卜グラフィ ― (ゲル量 5 0 0 m l ) に供した。酵素活性成分は、『セフアクリル（ S e p h a c r y l ) H R S — 2 0 0』ゲルに吸着し、硫安 1 Mから O M に濃度低下するリニアグラジェント、これに続いて、マルトテ卜ラオ一ス 0 m Mから 1 0 0 m Mに濃度上昇するリニアグラジェン卜で溶出させたところ、 α—イソマルトシル転移酵素活性成分と α—イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素活性成分は分離して溶出し、 α—イソマル卜シル転移酵素活性は硫安リニアグラジェン卜濃度が約 0. 3 Μ付近の画分に検出され、 α 一イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素活性は、マル卜テ卜ラオースのリニアグラジェント濃度が約 3 0 m Μ付近の画分に検出された。そこで、 o — イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素活性画分と α—イソマル卜シル転移酵素活性画分とを個別に回収し、 α—イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素活性を有する部分精製酵素標品、 α—イソマルトシル転移酵素活性を有する部分精製酵素標品としてそれぞれ回収し、これら酵素檩品を別々に精製した。実験例 1 — 3 α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドの精製

実験例 1 一 2の方法で得た α—イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素活性を有する部分精製酵素標品を 1 Μ硫安を含む 1 0 m Μリン酸緩衝液（ p H 7. 0 ) に対して透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『プチルートヨパール（ B u t y l - T o y o p e a r I ) 6 5 0 MJ ゲル（東ソ一（株）製）を用いた疎水クロマトグラフィー（ゲル量 3 5 0 m I ) に供した。本酵素活性成分は、『プチルートヨパール（ B u t y' I — T 0 y o p e a r I ) 6 5 0 M』ゲルに吸着し、硫安 1 Mから O Mに濃度低下するリニアグラジェントで溶出させたところ、硫安濃度約 0. 3 M付近で吸着した酵素活性成分が溶出し、本酵素活性を示す画分を回収した。再度、この回収画分を 1 M硫安を含む 1 0 m M リン酸緩衝液（ p H 7. 0 ) に対して透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セフアクリル（ S e p h a c r y l ) H R S — 2 0 0』ゲルを用いたァフィ二ティークロマ卜グラフィーを用いて精製した。この精製の各ステップにおける α— イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素活性を有する酵素標品の酵素活性量、比活性、収率を表 1 に示す。表 1

精製した α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素ポリペプチド標品を 7. 5 % ( w / V ) 濃度ポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高いポリぺプチドであった。実験例 1 — 4 α—イソマルトシル転移酵素活性を有するポリペプチドの実験例 1 一 2の方法で得た α—ィソマル卜シル転移酵素活性を有する部分精製酵素標品を、 1 Μ硫安を含む 1 0 m Μリン酸緩衝液（ ρ Η 7. 0 ) に対して透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『プチルートヨパール（ B u t y l - T o y o p e a r I ) 6 5 0 M』ゲル（東ソ一（株）製）を用いた疎水クロマ卜グラフィ一（ゲル量 3 5 0 m I ) に供した。本酵素活性成分は、『プチルートヨパール（ B u t y l — T o y o p e a r

1 ) 6 5 0 M』ゲルに吸着し、硫安 1 Mから 0 Mに濃度減少するリニアグラジェン卜で溶出させたところ、硫安濃度約 0. 3 M付近で溶出した。この本酵素活性を示す画分を集め回収した。再度、この回収液を 1 M硫安を含む 1 O m M リン酸緩衝液（ p H 7. 0 ) に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セフアクリル（ S e p h a c r y l ) H R S -

2 0 0』ゲルを用いたァフィ二ティークロマ卜グラフィ一を用いて精製した。この精製の各ステツプに於ける α—イソマル卜シル転移酵素活性を有する酵素標品の酵素活性量、比活性、収率を表 2に示す。

表 2

α—イソマルト α—イソマルトシ

ェ程シル転移酵素ポル転移酵素ポリぺ収率

リぺプチド活性プチド比活性 (%) 量（単 (i ) (_単 1^ / m g蚩白

培養上清 3 0， 0 0 0. 45 1 0 0 硫安塩析後の透析液 2 8 , 0 0 0 1 . 9 8 9 2. 1 イオン交換カラム溶 2 1 , 8 0 0 3. 5 6 7 1 . 7 出液

ァフィ二ティカラム 1 3， 7 0 0 2 1 . 9 4 5. 1 溶出液疎水カラム溶出液 1 0 , 3 0 0 23. 4 3 3. 9 ァフィ二ティカラム 5 , 5 1 0 2 9. 6 1 8. 1 溶出液

精製した α—ィソマル卜シル転移酵素活性有する酵素標品を 7. 5 % ( w / V ) 濃度ポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動によリその純度を検定したところ、その蛋白バンドは単一で純度の高いポリぺプチドであった。

実験例 2 バチルスグロビスポルス Ν 7 5株由来 α—イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリぺプチドの調製

実験例 2— 1 α—イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素の調製

澱粉部分分解物『パインデックス # 4』 4. 0 % ( w / V )、酵母抽出物『アサヒミース卜』 1 . 8 % ( w / V ), リン酸二カリウム 0. 1 % ( w / V ), リン酸一ナトリウム . 1 2水塩 0. 0 6 % ( \^ ）、硫酸マグネシゥム . 7水塩 0. 0 5 % ( wZ v )、及び水からなる液体培地を、 5 0 0 m I 容三角フラスコに 1 0 0 m I ずつ入れ、オートクレープで 1 2 1 °C、 2 0分間滅菌し、冷却して、バチルスグロビスポルス N 7 5株を接種し、 2 7 ¾、 2 3 0 r p mで 4 8時間回転振盪培養したものを種培養とした。容量 3 0 Lのファーメンターに種培養の場合と同組成の培地を約 2 0 L入れて、加熱滅菌、冷却して温度 2 7 °Cとした後、種培養液 1 % ( V / V ) を接種し、温度 2 7 °C、 p H 6. 0乃至 8. 0に保ちつつ、 4 8時間通気攪拌培養した。培養後、培養物中の酵素活性を測定したところ、 "一イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素活性は約 0. 3 4単位/ m I で、 α—イソマル卜シル転移酵素活性は約 1 . 1 単位/ m I であった。この培養物を遠心分離（ 1 0 , 0 0 0 r p m、 3 0分間）して回収した上清約 1 8 Lの酵素活性を測定したところ、 α—イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素活性は約 0. 3 3単位/ m I (総活性約 5、 9 4 0単位）で、 α—イソマルトシル転移酵素活性は約 1 . 1 単位 I (総活性約 1 9 , 8 0 0単位）であり、両酵素活性とも主に培養上清中に検出され、両酵素とも培養液に分泌される分泌型酵素であることが判明した。実験例 2 - 2 部分精製酵素標品の調製

実験例 2 ― 1 の方法で得た培養上清約 1 8 Lを 8 0 %飽和硫安液で塩析して 4 °C、 2 4時間放置した後、その塩析沈殿物を遠心分離（ 1 0 , 0 0 O r p m、 3 0分間）して回収し 1 0 m M 卜リス一塩酸緩衝液（ p H 8. 3 ) に溶解後、同緩衝液に対して透析して粗酵素液約 4 5 0 m I を得た。この粗酵素液は、 α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素活性を約 4， 7 1 0単位、 —イソマルトシル転移酵素活性を約 1 5， 7 0 0単位含んでいた。この粗酵素液を『セフアビ一ズ（ S e p a b e a d s ) F P— D A 1 3』ゲル（三菱化学（株）製）を用いたィ才ン交換クロマ卜グラフィーに供した。 α:—ィソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性成分は、『セファビ —ズ（ S e p a b e a d s ) F P— D A 1 3 J ゲルには吸着し、 α—ィソマル卜シル転移酵素活性成分は、『セファビーズ（ S e p a b e a d s ) F P— D A 1 3』ゲルには吸着せずに非吸着画分に検出された。続いて、 N a C I 濃度 0 Mから 1 Mのリニアグラジェン卜で溶出させたところ、 α —イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素活性成分は、 N a C I のリニアグラジェン卜でその濃度が約 0. 2 5 M付近で溶出した。そこで、 α—イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素活性画分と α—イソマル卜シル転移酵素活性画分とを個別に回収し、 α—イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素活性を有する部分精製酵素標品、 α—イソマルトシル転移酵素活性を有する部分精製酵素標品としてそれぞれ回収し、これら酵素標品を別々に精製した。実験例 2 — 3 α—イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリぺプチドの精製

実験例 2 — 2の方法で得た α—イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有する部分精製酵素標品を 1 Μ硫安を含む 1 0 m Μ リン酸緩衝液（ p H 7. 0〉に対して透析し、この透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セフアクリル（ S e p h a c r y l ) H R S — 2 0 0』ゲル（アマシャム ' フアルマシア ' バイオテク（株）製）を用いたァフィ二ティークロマ卜グラフィー（ゲル量 5 0 0 m I ) に供した。酵素活性成分は、『セフアクリル ( S e p h a c r y l H R S — 2 0 0』ゲルに吸着し、硫安 1 Mから 0 Mに濃度低下するリニアグラジェン卜、これに続いて、マル卜テトラ才 —ス O m Mから 1 0 0 m Mに濃度上昇するリニアグラジェン卜で溶出させたところ、 α—イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は、マル卜テトラオースのリニアグラジェン卜濃度が約 3 0 m M付近の画分に検出された。そこで、本酵素活性画分を回収した。この回収液を 1 M硫安を含む〗 O m Mリン酸緩衝液（ p H 7. 0 ) に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『プチルートヨパール（ B u t y l - T o y o p e a r I ) 6 5 0 M』ゲル（東ソ一（株）製）を用いた疎水クロマ卜グラフィー（ゲル量 3 5 0 m l ) に供した。本酵素は、『プチルー卜ョパール（ B u t y I - T ο y ο ρ e a r I ) 6 5 0 M』ゲルに吸着し、硫安 1 Mから O Mのリニアグラジェン卜で溶出させたところ、硫安濃度約 0. 3 M付近で吸着した酵素が溶出し、本酵素活性を示す画分を集め回収した。再度、この回収液を 1 M硫安を含む 1 O m M リン酸緩衝液（ p H 7. 0 ) に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セフアクリル（ S e p h a c r y I ) H R S— 2 0 0』ゲルを用いたァフィ二ティ一クロマトグラフィーを用いて精製した。この精製の各ステップにおける α—イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素活性を有する酵素標品の酵素活性量、比活性、収率を表 3に示す。表 3

精製した α—ィソマル卜シルダルコ糖質生成酵素ポリぺプチド標品を 7. 5 % ( w / V ) 濃度ポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動により酵素檩品の純度を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高いポリベプチドであった。実験例 2 — 4 α—イソマルトシル転移酵素活性を有するポリペプチドの精製

実験例 2 — 2の方法で得た α—イソマルトシル転移酵素活性を有する部分精製酵素標品を、 1 Μ硫安を含む 1 0 m Μ リン酸緩衝液（ ρ Η 7. 0 ) に対して透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セフアクリル ( S e p h a c r y l ) H R S — 2 0 0』ゲル（アマシャム ' フアルマシァ ' バイオテク（株）製）を用いたァフィ二ティ一クロマトグラフィー (ゲル量 5 0 0 m l ) に供した。酵素活性成分は、『セフアクリル（ S e p h a c r y I H R S — 2 0 0』ゲルに吸着し、硫安 1 Mから 0 Mに濃度低下するリニアグラジェン卜で溶出させたところ、硫安濃度約 0. 3 M 付近の画分に本酵素活性が検出された。そこで、本酵素活性画分を回収した。この回収液を 1 M硫安を含む 1 0 m M リン酸緩衝液（ p H 7. 0 ) に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『プチルートヨパール

( B u t y l - T o y o p e a r I ) 6 5 0 M』ゲル（東ソ一（株）製）を用いた疎水クロマ卜グラフィ一（ゲル量 3 5 0 m l ) に供した。本酵素活性成分は、『ブチル— トヨパール（ B u t y l - T o y o p e a r I ) 6 5 0 M』ゲルに吸着し、硫安 1 Mから 0 Mに濃度減少するリニアグラジェン卜で溶出させたところ、硫安濃度約 0. 3 M付近で溶出した。この本酵素活性を示す画分を集め回収した。この回収液を 1 0 m M トリスー塩酸緩衝液（ p H 8. 0 ) に透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、

『スーパ一 Q— トヨパール（ S u p e r Q— T o y o p e a r I ) 6 5 0 C』ゲル（東ソ一（株）製）を用いたイオン交換カラムクロマ卜グラフィ一（ゲル量 3 8 0 m l ) に供した。本酵素は、『スーパー Q— 卜ョパール

( S u p e r Q— T o y o p e a r I ) 6 5 0 C』ゲルに吸着せずに、非吸着画分に溶出し、得られた溶出画分を回収し、精製酵素檩品とした。この精製の各ステップに於ける α—ィソマル卜シル転移酵素活性を有する酵素標品の酵素活性量、比活性、収率を表 4に示す。

表 4

精製した α—イソマル卜シル転移酵素活性有する酵素標品を 7. 5 % ( w / V ) 濃度ポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動によりその純度を検定したところ、その蛋白バンドは単一で純度の高いポリペプチドであった。実験例 3 ァルスロノくクタ一グロビホルミス A 1 9株由来 α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素活性を有するポリぺプチドの調製

実験例 3— 1 α—イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素の調製

澱粉部分分解物『パインデックス # 4』 4. 0 % ( wZv )、酵母抽出物『アサヒミース卜』 1 . 8 % (w// v：)、リン酸二カリウム 0. 1 % (w// V )_N リン酸ーナトリウム . 1 2水塩 0. 0 6 % ( w/ v )、硫酸マグネシゥム . 7水塩 0. 0 5 % ( w/ V ) 及び水からなる液体培地を、 5 0 0 m I 容三角フラスコに 1 0 0 m I ずつ入れ、才一トクレーブで 1 2 1 °C、 2 0分間滅菌し、冷却して、ァルスロバクタ一 ' グロビホルミス A 1 9株を接種し、 2 7 °C、 2 3 0 r p mで 4 8時間回転振盪培養したものを種培養とした。容量 3 0 Lのファーメン夕一に種培養の場合と同組成の培地を約 2 0 L入れて、加熱滅菌、冷却して温度 2 7 °Cとした後、種培養液 1 % ( V Z V ) を接種し、温度 2 7 °C、 p H 6. 0乃至 9. 0に保ちつつ、 4 8時間通気攪拌培養した。培養後、培養物中の酵素活性を測定したところ、 α— イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性は約 1 . 1 単位 Zm l で、 α—ィソマル卜シル転移酵素活性は約 1 . 7単位/ m I であった。この培養物を遠心分離（ 1 0， 0 0 0 r p m、 3 0分間）して回収した上清約 1 8 しの酵素活性を測定したところ、 α—イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素活性は約 1 . 0 6単位 m I (総活性約 1 9 , 1 0 0単位）で、 α—イソマル卜シル転移酵素活性は約 1 . 6単位 Zm l (総活性約 2 8， 8 0 0単位）であり、両酵素活性とも主に培養上清中に検出され、両酵素とも培養液に分泌される分泌型酵素であることが判明した。

尚、ァルスロパクターグロビ木ルミス A 1 9株由来の α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素の活性測定は、基質のための緩衝液として 1 0 0 m Μグリシン一 N a 0 Η緩衝液（ p H 8. 4 ) を用いた以外、実験例 1 に記載の方法と同様に行った。実験例 3— 2 部分精製酵素檁品の調製

実験例 3 - 1 の方法で得た培養上清約 1 8 Lを 6 0 %飽和硫安液で塩析して 4 °C、 2 4時間放置した後、その塩析沈殿物を遠心分離（ 1 0 , 0 0

0 r p m、 3 0分間）して回収し 1 O m M トリスー塩酸緩衝液（ p H 7.

0 ) に溶解後、同緩衝液に対して透析して粗酵素液約 8 5 0 m I を得た。この粗酵素液は、 α—イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素活性を約 8， 2

1 0単位、 α—イソマル卜シル転移酵素活性を約 1 5 , 7 0 0単位含んでいた。この粗酵素液を『 D E A E — トヨパール（ T o y o p e a r I ) 6 5 0 S』ゲル（東ソ一（株）製）を用いたイオン交換クロマトグラフィー (ゲル量 3 8 0 m l )に供した。両酵素活性は、『 D E A E— 卜ョパール（ T 0 y 0 p e a r I ) 6 5 0 S』ゲルゲルには吸着し、 N a C I 濃度 0 Mから 1 Mのリニアグラジェン卜で溶出させたところ、 α—イソマルトシルク' ルコ糖質生成酵素活性成分は、 N a C I のリニアグラジェン卜でその濃度が約 0 . 2 M付近で溶出し、 α—イソマル卜シル転移酵素活性成分は、 Ν a C I のリ二アグラジェン卜でその濃度が約 0. 3 M付近で溶出した。そこで、 α—イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性画分と α—イソマル卜シル転移酵素活性画分とを個別に回収し、 α—イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有する部分精製酵素標品、 α—イソマル卜シル転移酵素活性を有する部分精製酵素標品としてそれぞれ回収し、これら酵素標品を別々に精製した。実験例 3 — 3 α—イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリぺプチドの精製

実験例 3 — 2の方法で得た α—イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有する部分精製酵素標品を 1 Μ硫安を含む 1 O m Mリン酸緩衝液（ p H 7. 0 ) に対して透析し、この透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セフアクリル（ S e p h a c r y l ) H R S — 2 0 0』ゲル（アマシャム ' フアルマシア · バイオテク（株）製）を用いたァフィ二ティークロマトグラフィー（ゲル量 5 0 0 m I ) に供した。酵素活性成分は、『セフアクリル ( S e p h a c r y l H R S — 2 0 0』ゲルに吸着し、硫安 1 Mから 0 Mに濃度低下するリニアグラジェン卜で溶出させたところ、一イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素活性は、硫安のリニアグラジェン卜濃度が約 0. 2 M付近の画分に検出された。そこで、本酵素活性画分を回収し、精製酵素標品とした。この精製の各ステツプにおける α—ィソマル卜シルグルコ糖質生成酵素活性を有する酵素檩品の酵素活性量、比活性、収率を表 5に示す。

表 5

精製した α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素ポリぺプチド檁品を 7. 5 % ( w / V ) 濃度ポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動により酵素標品の純度を検定したところ、蛋白パンドは単一で純度の高いポリぺプチドであった。実験例 3 — 4 α—イソマル卜シル転移酵素活性を有するポリペプチドの部分精製

実験例 3 — 2の方法で得た α—イソマルトシル転移酵素活性を有する部分精製酵素標品を、 1 Μ硫安を含む 1 0 m Μ リン酸緩衝液（ ρ Η 7. 0 ) に対して透析し、その透析液を遠心分離して不溶物を除き、『セフアクリル ( S e p h a c r y l ) H R S — 2 0 0』ゲル（アマシャム . フアルマシァ · バイオテク (株) 製）を用いたァフィ二ティークロマ卜グラフィ一 (ゲル量 5 0 0 m l ) に供した。酵素活性成分は、『セフアクリル（ S e p a c r y I H R S— 2 0 0』ゲルに吸着し、硫安 1 Mから O Mに濃度低下するリ二アグラジェン卜で溶出させたところ、硫安濃度約 0 M付近の画分に本酵素活性が検出された。そこで、本酵素活性画分を回収し、部分精製酵素標品とした。この精製の各ステップに於ける α—イソマルトシル転移酵素活性を有する酵素檩品の酵素活性量、比活性、収率を表 6に示す。表 6

部分精製した α —イソマル卜シル転移酵素活性有する酵素標品を 7 . 5 % ( w / V ) 濃度ポリアクリルアミドを含むゲル電気泳動によりその純度を検定したところ、メインの蛋白バンド以外に、 3種のマイナーな蛋白バンドが認められた。実験例 4 一 1 各種糖質への作用

各種糖質を用いて、本発明の α—イソマルトシルグルコ糖質生成酵素ポリペプチドの基質になりうるかどうかの試験をした。マルトース、マルトトリオース、マルトテ卜ラオースマルトペン夕オース、マル卜へキサォース、マルトへプタオース、イソマルト一ス、イソマル卜トリオース、パノース、イソパノース、卜レハロース、コ一ジビオース、ニゲロース、ネオトレハロース、セロビオース、ゲンチビオース、マルチトール、マル卜トリイト一ル、ラク卜ース、スクロース、エルロース、セラギノース、マル卜シルグルコシド、イソマル卜シルダルコシドを含む溶液を調製した。これらの溶液に、実験例 1 一 3の方法で得たバチルスグロビスポルス C 1 1 株由来の精製 α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素ポリぺプチド標品、又は実験例 2 — 3の方法で得たバチルスグロビスポルス Ν 7 5株由来の精製 α—イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素ポリぺプチド標品、実験例 3— 3の方法で得たァルスロパクターグロビホルミス A 1 9株由来の精製 α—イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素ポリペプチド標品を基質固形物 1 グラム当たりそれぞれ 2単位ずつ加え、基質濃度を 2 % ( w / V ) になるように調整し、これを 3 0 °C 、 p H 6 . 0 (ァルスロバクタ一グロビホルミス A 1 9株由来の酵素の場合、 p H 8 . 4 ) で 2 4時間作用させた。酵素反応前後の反応液中の糖質を調べるため、シリカゲル薄層クロマ卜グラフィ一（以下、「T L C」と略す。）を行なった。展開溶媒として n —ブタノ一ル、ピリジン、水混液（容量比 6 : 4 : 1 )、薄層プレー卜として『キーゼルゲル 6 0』（アルミプレー卜、 2 0 X 2 0 c m、メルク社製）を用い 2回展開した後、硫酸一メタノール法で糖質を発色し検出し、それそれの糖質に対する酵素作用の有無を確認した。結果を表 7に示す。酵素作用

基質 C 1 1 株酵素 N 7 5株酵素 A 1 9株酵素マルトース + + +

マルトトリオ一ス + + + + + +

マルトテトラ才ー + + + + + + + + +

ス

マルトペンタ才ース + + + + + + + + + マル卜へキサ才一 + + + + + + + + + y 3 *~ 4卞- 4卞- 4卞- _ "11_" 卞 4卞- リし

*1 ノノレ r リ ^" ヾノ ―

* ノメヽノ一 1 1 1 1

十十

レハ u―

」一一ン A ――つ！

十十十ニゲロース + +

ネ才卜レ /、ロース + +

1—

セロヒオース

ヮ、ノ . r匕才ース

1

リレチ卜一レ

ソレ卜卜リイ卜一十 + +

ル

フク卜ース

スクロース ― 一エル口一 1

十 +

セラギノース

マルトシルグルコ + + + + + +

シド

イソマルトシルグ

ルコシド

注）酵素反応前後で、

—は、変化無しを示し、

+は、基質のスポッ卜が僅かに減少し、他の生成物が認められるを示し、

+ +は、基質のスポットがかなり減少し、他の生成物が認められるを示し、

+ + +は、基質のスポッ卜がほとんど消失し、他の生成物が認められるを示す。の結果から明らかなように、 α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドは、試験した各種糖質の内、グルコース重合度が 3以上で、非還元末端にマルトース構造を有する糖質によく作用することが判明した。又、グルコース重合度が 2の糖質では、マル卜一ス、コ一ジビ才一ス、ニゲロース、ネオ卜レハロース、マル.卜卜リイトール、ェルロースにも僅かに作用することが判明した。実験例 4— 2 マルトオリゴ糖からの生成物

最終固形物濃度 1 %のマルト一ス、マルトトリオース、マルトテ卜ラオ —ス又はマル卜ペンタ才一ス水溶液に、実験例 1 — 3の方法で得た α—ィソマル卜シルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドを、固形物グラム当たリ 2単位（マルトース及びマル卜卜リ才一ス水溶液の場合）、 0. 2単位（マルトテトラオース水溶液の場合）、 0. 1 単位（マルトペンタオース水溶液の場合）加えて、 3 5 °C、 p H 6. 0で 8時間作用させ、 1 0 0 °0で 1 0分間保持して反応を停止した。その酵素反応液の糖組成を H P L C法を用いて測定した。 H P L Cは、『Y M C P a c k O D S - A Q 3 0 3』カラム（（株）ヮイエムシ一製）を用い、カラム温度 4 0 °C、溶離液としての水の流速 0. 5 m I /m i nの条件で行い、検出は示差屈折計『 R I - 8 0 1 2』（東ソ一（株）製）を用いて行なった。その結果を表 8に示す。表 8 ^Λ 反応で生成した糖基質マルト基質マルトトリ基質マルト基質マルトペン ―スオーステトラオ一タオース質の種類

ス

グルコ一ス 8. 5 0. 1 0. 0 0. 0 マルト一ス 7 8. 0 1 7. 9 0. 3 0. 0 マルトトリオース 0. 8 4 5. 3 2 2. 7 1 . 9 マルトテトラオース 0. 0 1 . 8 3 5. 1 1 9. 2 マ Jレ卜ペン夕才一 0 . 0 0 . 0 3 . 5 3 4 . 4 ス

マリレト 1 へギサォ一 0 . 0 0 . 0 0 . 0 4 . 6 ス

つ、ノノ · II 1, k ― フ 0 . 5 0 0 0 0 0 0 ノノレ ~ 1 ノレノレ「 8 2 1 2 0 0 0 0 ― "7 ノf ノ IIレ. つ ~ 1 ；ノ IIレ. 7 ノ Jしレ k 2 4 3 1 5 6 8 0 , 0 k リノ才一ス

X 0 . 0 2 . 1 3 0 . 0 1 1 . 4

Y 0 . 0 0 . 0 1 . 4 2 6 . 8

Z 0 . 0 0 . 0 0 . 0 1 . 7 その他 0 . 6 0 . 1 0 . 2 0 . 0

表中の

グルコシルマル卜ースは、 α—イソマルトシルグルコース (別名、 6 ² - σ一 α—グルコシルマル卜ース、パノース）、

グルコシルマル卜卜リオースは、 α—イソマルトジルマル卜ース（別名、 6 ³ -— < _ —ダルコシルマルト卜リオース）、

Xは、本実験例で構造を明らかにした —イソマル卜シルマルト卜リオース (別名、 6 ⁴— < — α—グルコシルマル卜テトラオース）、

Υは、本実験例で構造を明らかにしたーィソマル卜シルマルトテ卜ラオ一ス（別名、 6 ⁵— < — α—グルコシルマル卜ペンタオース）、 ζは、未同定の糖質である。

表 8の結果から明らかなように、 α—イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリぺプチドを作用させた結果、基質としてのマル卜ースからは、主にグルコースと α—イソマル卜シルグルコース（別名、 6 ²— O 一 α—ダルコシルマル卜一ス）とが生成し、基質としてのマルト卜リオ一スからは、主にマルトースと α—イソマル卜シルマルトース（別名、 6 ³— り一 α—グルコシルマルトトリオース）とが生成し、その他、少量ながらグルコース、マルトテ卜ラオース、 α—イソマル卜シルグルコース（別名、 6²— Ο— α—グルコシルマルトース）、及び生成物 Xが生成することが判明した。基質としてのマルトテ卜ラオースからは、主にマル卜トリオースと生成物 Xとが生成し、その他、少量ながらマル卜一ス、マルトペンタ才 —ス、 —イソマル卜シルマルト一ス (別名、 6³— O— α—グルコシルマル卜トリオース）、及び生成物 Υが生成することが判明した。基質としてのマルトペンタオースからは、主にマル卜テ卜ラオースと生成物 Υとが生成し、その他、少量ながらマル卜トリオース、マル卜へキサ才一ス、生成物 X、及び生成物 Ζが生成することが判明した。

次いで、基質としてのマルトテ卜ラオ一スからの主生成物である生成物 Xと、基質としてのマル卜ペンタオースからの主生成物である生成物 Υの精製と単離を行った。分取用 H P L Cカラム『Y M C— P a c k O D S — A R 3 5 5 - 1 5 S - 1 5 1 2 A』（（株）ヮイエムシィ製）を用いて生成物 X、 Yを精製し単離することにより、上記マル卜テトラオースからの反応物から、純度 9 9. 9 %以上の生成物 X標品を固形物収率約 8. 3 % で、また上記マルトペンタオースからの反応物から、純度 9 9. 9 %以上の生成物 Yを固形物収率約 1 1 . 5 %で単離した。

これら生成物 X及び生成物 Yについて、常法に従ってメチル化分析と N M R分析とを行なった。メチル化分析結果は表 9にまとめた。 N M R分析の結果については、生成物 Xと生成物 Yの ¹ H— N M Rスぺクトルを第 1 図および第 2図にそれぞれ示した。又、生成物 Xと生成物 Yの ' ³ C— N M R スぺク卜ルを第 3図及び第 4図にそれぞれ示し、それらの帰属を表 1 0にまとめた。表 9

これらの結果から、 α—イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリべプチドによるマルトテトラオースからの生成物 Xは、マル卜テ卜ラオースの非還元末端グルコースの 6位水酸基にグルコース基が α—結合した 5糖で、構造式 1 で表わされる α—イソマル卜シルマル卜卜リオ一ス (別名、 6⁴— ひ一 α—グルコシルマル卜テ卜ラオース）であることが判明した。構造式 1

α -D-Glcp— ( 1 → 6 ) — α - D-Glcp - ( 1 -^4 ) - α - D-Glc - ( 1 → 4 ) - α -D-Glcp - ( 1 →4 ) -D-Glcp 又、マル卜ペンタオースからの生成物 Yは、マル卜ペンタオースの非還元末端グルコースの 6位水酸基にダルコシル基が α結合した 6糖で、構造式 2で表わされるな一イソマル卜シルマル卜テ卜ラオース（別名、 6⁵— 一 α—グルコシルマル卜ペンタオース）であることが判明した。構造式 2

α -D-Glc p - ( 1 → 6 ) α -D-Glc - ( 1 → 4 ) - D- G I c p ( 1 → 4 ) - α - D- Glc ( 1 → 4 ) - a - D- G I c ( 1 → 4 ) 一 D. G I c p 表 1 o

N M R化学シフ卜値（ p p m ) グルコース炭素番生成物 X 生成物 Υ 奋

1 a 1 0 0. 8 1 0 0. 8

2 a 7 4. 2 7 4. 2

3 a 7 5. 8 7 5. 7 a

4 a 7 2. 2 7 2. 2

5 a 7 4. 5 7 4. 5

6 a 6 3. 2 6 3. 1

1 b 1 0 2. 6 1 0 2. 6

2 b 7 4. 2 7 4. 2

3 b 7 5. 8 7 5. 7 b

4 b 72. 1 72. 1

5 b 7 4. 0 7 4. 0

6 b 6 8. 6 6 8. 6

1 c 1 0 2. 3 1 0 2. 3

2 c 7 4. 2 7 4. 2

3 c 7 6. 0 7 6. 0 c 4 c 7 9. 6 7 9. 5

5 c 7 3. 9 7 3. 9

6 c 6 3. 2 6 3. 1

1 d 1 0 2. 2 1 0 2. 3

2 d 7 4. 0 ( α ), 7 4. A { β ) 7 4. 2

3 d 7 6. 0 7 6. 0 d

4 d 7 9. 8 7 9. 5

5 d 7 3 9 7 3. 9

6 d 6 3. 2 6 3. 1 1 e 9 4. 6 ( a ), 9 8. 5 ( yS ) 1 0 2. 1

2 e 7 4. 2 ( a ), 7 6. 7 ( β ) 7 A C) ( ry ) 7 A Λ ί' ? *) c 7 5 . 9 ( a ), 7 8. 9 ( β ) 7 6. 0

e

7 9. 6 ( a ), 7 9. A { β ) 7 9. 8

7 2 6 ( a ) 7 7 2 ί β ) 7 3. 9

Ό 6 6 3 Λ ( a ) 6 3 Λ ( β ) o o . I

1 I f T

ク l 7 A 2 ( a ) 1 6 7 ( 8 )

3 f 7 6 . 0 ( a ), 7 8. 9 ( /3 ) f

4 f 7 9. 6 ( a ), 7 9. 5 ( β )

5 f 7 2. 6 ( a ), 7 7. 2 ( /3 )

6 f 6 3 . 3 ( a ), 6 3. 3 ( β )

以上のことから、 α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素活性を有するポリぺプチドのマル卜ォリゴ糖に対する作用を以下のように判断された。 1 ) α—イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドは、基質として、非還元末端の結合様式として α— 1 ， 4グルコシル結合を有するグルコース重合度が 2以上の糖質に作用し、その非還元末端のダルコシル残基を他の分子の非還元末端のダルコシル残基の 6位に転移する作用を有する分子間の 6—グルコシル転移を触媒して、非還元末端に 6— O— α—グルコシル基を有するグルコース重合度が 1 增加した α—イソマルトシルグルコ糖質（別名、 6— O— α—グルコシルマルトオリゴ糖）と、グルコ一ス重合度が 1 減じたマルトオリゴ糖とを生成する。

2 ) α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素活性を有するポリぺプチドは、 4ーグルコシル転移も僅かに触媒し、マルト才リゴ糖から、グルコース重合度が 1 増加したマル卜才リゴ糖と、グルコース重合度が〗減じたマル卜オリゴ糖とを僅かに生成する。実験例 4 - 3 還元力生成試験

α—イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリベプチドが、還元力生成能を有するか否かを調べることを目的として以下の試験を行つた。即ち、最終濃度 1 %のマル卜テ卜ラオース水溶液に、実験例〗一 3の方法で得たバチルスグロビスポルス C 1 1 株由来の精製 α—イソマルトシルグルコ糖質生成酵素ポリベプチド標品、又は実験例 2 — 3の方法で得たバチルスグロビスポルス Ν 7 5株由来の精製 α—イソマルトシルグルコ糖質生成酵素ポリぺプチド檁品、実験例 3 — 3の方法で得たアルスロバクタ一グロビホルミス A 1 9株由来の精製 α—イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素ポリペプチド標品を、基質固形物 1 グラム当たり 0 . 2 5単位加え、 3 5 °C、 p H 6 . 0 (ァルスロバクタ一グロビホルミス A 1 9株由来の酵素の場合、 p H 8 . 4 ) で作用させ、その反応液の一部を経時的に採り、 1 0 0 °Cで 1 0分間保持して反応を停止し、反応液の還元力を測定した。即ち、その酵素反応前後の溶液の還元糖量をソモギー · ネルソン法で測定し、また、同時にその酵素反応前後の溶液の全糖量をアン卜ロン硫酸法で測定し、還元力生成率（％) は以下の計算式を用いて算出した。計算式：反応後の還元糖量反応前の還元糖量

還元力生成率 (%) X 1 0 0

反応後の全糖量反応前の全糖量

結果を表 1 1 に示す。表 1 1

表 1 1 の結果から明らかなように、 α —イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドは、マル卜テ卜ラオースを基質として作用させると、反応物の還元力は増加しないことがわかり、当該 α —イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリぺプチドは加水分解作用を示さない若しくは検出できないほど僅かなものであることが判明した。実験例 4 一 4 分子量

実験例 1 一 3の方法で精製して得たバチルスグロビスポルス C 1 1 株由来 α —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチド、実験例 2 — 3の方法で精製して得たバチルスグロビスポルス Ν 7 5株由来 α —イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリぺプチド、または、実験例 3— 3の方法で精製して得たアルスロパクタ一グロビホルミス Α 1 9株由来 α —イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドを、 S D S —ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度 7 . 5 % ( w Z V ) に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ ' ラッド · ラボラトリーズ（株）製）と比較して当該酵素ポリぺプチドの分子量を測定した。 C I 1 株由来の当該ポリペプチドの分子量は約 1 3 7， 0 0 0 土 2 0， 0 0 0ダルトンで、 N 7 5株由来の当該ポリペプチドの分子量は約 1 3 6 , 0 0 0 ± 2 0， 0 0 0ダルトンで、 A 1 9株由来の当該ポリぺプチドの分子量は約 9 4 , 0 0 0 ± 2 0 , 0 0 0ダルトンであった。実験例 4一 5 等電点

実験例 1 一 3の方法で精製して得た C 1 1 株由来 α—イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチド、実験例 2— 3の方法で精製して得た Ν 7 5株由来 α—イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチド、または、実験例 3 — 3の方法で精製して得た A 1 9株由来 α—イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドを、 2 % ( w / V ) アンフ才ライン (アマシャム · フアルマシア · バイオテク (株）製）含有等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に供し、電気泳動後の蛋白バンド及びゲルの p Hを測定して当該酵素ポリぺプチドの等電点を求めた。その結果、 C 1 〗株由来の当該ポリペプチドの等電点は p I 約 5 . 2 ± 0 . 5で、 N 7 5株由来の当該ポリぺプチドの等電点は p I 約 7 . 3 ± 0 . 5で、 A 1 9株由来の当該ポリベプチドの等電点は p I 約 4 . 3土 0 . 5で、あった。実験例 4一 6 作用温度及び p H

α—イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素活性に及ぼす温度と ρ Ηの影響について、各種温度、 ρ Η条件下、実験例 1 一 1 に示す α—イソマルトシルグルコ糖質生成酵素の活性測定法に準じて調べた。温度の影響については、 C a ^{2 +}非存在下と 1 m M存在下で測定した。これらの結果を第 5図 [温度の影響（ C 1 1 株由来ポリぺプチド）]、第 6図 [温度の影響（ N 7 5株由来のポリぺプチド）.]、第 7図 [温度の影響（ A 1 9株由来のポリぺプチド）]、第 8図 [ p Hの影響（ C 1 1 株由来ポリペプチド）]、第 9図 [ p H の影響（ N 7 5株由来のポリペプチド）]、第 1 0図 [ p Hの影響（ A 1 9 株由来のポリぺプチド）] に示した。その結果、 C 1 1 株由来の α—イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素活性を有する酵素標品の至適温度は、 ρ Η 6. 0、 6 0分間反応で、約 4 5 °C ( C a ^{2 +}非存在）又は約 5 0 °C ( 1 m M C a ^{2 +}存在）で、その至適 p Hは、 3 5 °C、 6 0分間反応で約 6. 0で、 N 7 5株由来の α—イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリぺプチドの至適温度は、 ρ Η 6. 0、 6 0分間反応で、約 5 0 °C ( C a ^{2 +}非存在）又は約 5 5 °C ( 1 m M C a ^{2 +}存在）で、その至適 p Hは、 3 5 °C、 6 0分間反応で約 6. 0で、 A 1 9株由来の α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドの至適温度は、 ρ Η 8. 4、 6 0分間反応で、約 6 0 °C ( C a ^{2 +}非存在）又は約 6 5 °C ( 1 m M C a ^{2 +}存在）で、その至適 p Hは、 3 5 °C、 6 0分間反応で約 8. 4であった。実験例 4一 7 安定性

α—イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリぺプチドの温度安定性は、当該ポリペプチド含有溶液 [ 2 0 m Μ酢酸緩衝液、 p H 6.

0 ( A 1 9株由来のポリペプチドの場合、 2 0 m Mグリシン一 N a O H緩衝液、 P H 8. 0 )] を C a ^{2 +}非存在下または 1 m M C a ^{2 +}存在下で各温度に 6 0分間保持し、水冷した後、残存する α—イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素活性を測定することにより求めた。又、 p H安定性は、 α—ィソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドを各 p Hの 5 0 1\/1緩衝液中で4 °0、 2 4時間保持した後、 p Hを 6. 0 ( Α 1 9株由来のポリペプチドの場合、 ρ Η 8. 0 ) に調整し、残存する酵素活性を測定することにより求めた。これらの結果を第 1 1 図 [温度安定性（ C 1 1 株由来のポリペプチド）]、第 1 2図 [温度安定性（ Ν 7 5株由来のポリべプチド）]、第 1 3図 [温度安定性（ A 1 9株由来のポリペプチド）]、第 1 4図 [ p H安定性（ C 1 1 株由来ポリペプチド）]、第 1 5図 [ p H安定性 ( N 7 5株由来のポリペプチド）]、第 1 6図 [ p H安.定性（ A 1 9株由来のポリペプチド）] に示した。 C 1 1 株由来の α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドの温度安定性は約 4 0 °Cまで（ C a ² ⁺非存在）又は約 4 5 °Cまで（ 1 m M C a ^{2 +}存在）で、当該ポリぺプチドの p H安定性は約 5. 0乃至 1 0. 0で、 N 7 5株由来のな一イソマルトシルダルコ糖質生成酵素活性を有するポリぺプチドの温度安定性は約 4 5 °C まで（ C a ^{2 +}非存在）又は約 5 0 ¾まで（ 1 m M C a ^{2 +}存在）で、当該ポリペプチドの P H安定性は約 5. 0乃至 9. 0で、 A 1 9株由来の α—ィソマル卜シルダルコ糖質生成酵素活性を有するポリぺプチドの温度安定性は約 5 5 °Cまで（ C a ^{2 +}非存在）又は約 6 0 °Cまで（ 1 m M C a ^{2 +}存在）で、当該ポリペプチドの p H安定性は約 5. 0乃至 9. 0であった。実験例 5 部分アミノ酸配列

実験例 5 — 1 N末端アミノ酸配列

実験例 1 一 3の方法で精製して得た C 1 1 株由来の α—イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチド、実験例 2 — 3の方法で精製して得た Ν 7 5株由来の α—ィソマル卜シルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチド、または、実験例 3 — 3の方法で精製して得た A 1 9 株由来の α—イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリぺプチドについて、その Ν末端アミノ酸配列を、プロテインシーケンサ一『モデル 4 7 3 Α』（アプライドバイ才システムズ社製）を用いて分析したところ、 C 1 1 株由来の α—ィソマル卜シルダルコ糖質生成酵素活性を有するポリぺプチドは配列表に於ける配列番号 7に示すァミノ酸配列を有し、 Ν 7 5 株由来の α—イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリべプチドは配列表に於ける配列番号 1 9に示すアミノ酸配列を有し、 Α 1 9株由来の α —イソマルトシルダルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドは配列表に於ける配列番号 2 6に示すアミノ'酸配列を有することが判明した。実験例 5 — 2 C 1 1 株由来のポリペプチドの内部アミノ酸配列

実験例 1 一 3の方法で精製して得た α—イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドの一部を 1 0 m Μ トリス—塩酸緩衝液（ p H 9. 0 ) に対して、透析した後、得られた透析液を同緩衝液で約 1 m g /m I の濃度になるように希釈した。この試料液（ 1 m I ) に 1 0 i g のトリブシン（和光純薬（株）販売）を加え、 3 ◦ °C、 2 2時間反応させることによりペプチド化した。生成したペプチドを単離するため、逆相 H P L Cを行なった。即ち、『マイクロボンダパック C 1 8カラム』（直径 2. 1 m m X長さ 1 5 0 m m、ウォーターズ（株）製）を用い、室温下、流速 0. 9 m I Z分の条件で、 0. 1 % トリフルォロ酢酸一 8 %ァセ卜二卜リル溶液から 0. 1 % トリフル才ロ酢酸— 4 0 %ァセトニトリル溶液の 1 2 0分間かけて移行するリ二アグラジェン卜条件下、ぺプチドをカラム分画した。カラムから溶出してくるペプチドは、波長 2 1 0 n mの吸光度を測定することにより検出した。他のペプチドとよく分離した 1 0ペプチド [ P 8 (保持時間約 8分）、 P 2 0 (保持時間約 2 0分）、 P 5 6 (保持時間約 5 6分）、 P 6 0 (保持時間約 6 0分）、 P 6 2 (保持時間約 6 2分）、 P 6 4 (保持時間約 6 4分）、 P 7 5 (保持時間約 7 5分）、 P 8 2 (保持時間約 8 2分）、 P 8 8 (保持時間約 8 8分）、 P 9 9 (保持時間約 9 9分）] を分取し、それぞれのペプチド含有画分を真空乾燥した後、 2 0 0 1 の 0. 1 % トリフル才ロ酢酸— 5 0 %ァセ卜二トリル溶液に溶解した後、個々のべプチドをプロティンシーケンサーに供し、それぞれァミノ酸配列を分析したところ、配列表に於ける配列番号 8乃至 1 7に示すアミノ酸配列が得られた。実験例 5 — 3 N 7 5株由来ポリペプチドの内部アミノ酸配列実験例 2 — 3の方法で精製して得た α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素活性を有するポリペプチドの一部を 1 0 m Μ トリス—塩酸緩衝液（ p H 9. 0 ) に対して、透析した後、得られた透析液を同緩衝液で約 1 m g ノ m I の濃度になるように希釈した。この試料液（ 1 m l ) に 2 0 9 のリジルエンドぺプチダーゼ（和光純薬（株）販売）を加え、 3 0 ¾、 2 4 時間反応させることによりペプチド化した。生成したペプチドを単離するため、逆相 H P L Cを行なった。即ち、『マイクロボンダスフエアー C 1 8 カラム』（直径 3. 9 m m X長さ 1 5 0 m m、ウォーターズ（株）製）を用い、室温下、流速 0. 9 m l Z分の条件で、 0. 1 % トリフル才ロ酢酸— 8 %ァセ卜二卜リル溶液から 0. 1 % トリフル才ロ酢酸一 3 6 %ァセ卜二卜リル溶液の 1 2 0分間かけて移行するリニアグラジェン卜条件下、ぺプチドをカラム分画した。カラムから溶出してくるペプチドは、波長 2 1 0 n mの吸光度を測定することにより検出した。他のぺプチドとよく分離した 5ペプチド [ P N 4 7 (保持時間約 4 7分）、 P N 5 9 (保持時間約 5 9 分）、 P N 6 7 (保持時間約 6 7分）、 P N 8 7 (保持時間約 8 7分）、 P N 8 9 (保持時間約 8 9分）] を分取し、それぞれのペプチド含有画分を真空乾燥した後、 2 0 0 I の 0. 1 % トリフル才ロ酢酸— 5 0 %ァセ卜二卜リル溶液に溶解した後、個々のぺプチドをブロティンシーケンサ一に供し、それぞれァミノ酸配列を分析したところ、配列表に於ける配列番号 2 0乃至 2 4に示すアミノ酸配列が得られた。実験例 5— 4 A 1 9株由来のポリペプチドの内部アミノ酸配列

実験例 3 — 3の方法で精製して得た α—ィソマル卜シルダルコ糖質生成酵素活性を有するポリぺプチドの一部を 1 0 m Μ トリスー塩酸緩衝液（ p H 9. 0 ) に対して、透析した後、得られた透析液を同緩衝液で約 1 m g / m I の濃度になるように希釈した。この試料液（ 1 m l ) に 2 0 i g のリジルエンドぺプチダーゼ（和光純薬（株）販売）を加え、 3 0 °C、 2 4 時間反応させることによリベプチド化した。生成したぺプチドを単離するため、逆相 H P L Cを行なった。即ち、『マイクロボンダスフエア一 C 1 8 カラム』（直径 2. I m m X長さ 1 5 0 m m、ウォーターズ（株）製）を用い、室温下、流速 0. 9 m I ノ分の条件で、 0. 1 % トリフル才ロ酢酸— 1 6 %ァセトニトリル溶液から 0. 1 % トリフル才ロ酢酸一 3 6 %ァセ卜二卜リル溶液の 1 2 0分間かけて移行するリニアグラジェン卜条件下、ぺプチドをカラム分画した。カラムから溶出してくるぺプチドは、波長 2 1 0 n mの吸光度を測定することにより検出した。他のぺプチドとよく分離した 5ペプチド [ P A 3 9 (保持時間約 3 9分）、 P A 8 1 (保持時間約 8 1 分）、 P A 8 6 (保持時間約 8 6分）、 P A 9 2 (保持時間約 9 2分）、 P N 1 0 4 (保持時間約 1 0 4分）] を分取し、それぞれのペプチド含有画分を真空乾燥した後、 2 0 0 μ Ι の 0. 1 % トリフル才ロ酢酸— 5 0 %ァセ卜二卜リル溶液に溶解した後、個々のペプチドをプロテインシーケンサ一に供し、それぞれアミノ酸配列を分析したところ、配列表に於ける配列番号 2 7乃至 3 1 に示すァミノ酸配列が得られた。実験例 6 バチルスグロビスポルス C 1 1 株由来のポリペプチドをコードする D N Aを含む組換え D N Aと形質転換体の調製実験例 6— 1 染色体 D N Aの調製

澱粉部分分解物『パインデックス # 4』 2. 0 % (wZv )、酵母抽出物『アサヒミース卜』 1 . 0 % ( w/ V ), リン酸二カリウム 0. I CwZ V )_s リン酸一ナトリウム · 1 2水塩 0. 0 6 % ( w / v )、硫酸マグネシゥム · 7水塩 0. 0 5 % ( wZ V ) 及び水からなる液体培地を、 5 0 0 m I 容三角フラスコに 1 0 0 m I ずつ入れ、才一トクレーブで 1 2 1 °C、 2 0分間滅菌し、冷却して、バチルスグロビスポルス C 1 1 株を接種し、 2 7 °C、 2 3 0 r p mで 2 4時間回転振盪培養した。その後、遠心分離によリ培養物から採取した菌体を T E S緩衝液（ p H 8. 0 ) に浮遊させ、リゾチームを 0. 0 5 % ( w/ V ) 加え、 3 7 ¾で 3 0分間インキュベートした。処理物を一 8 0 °Cで 1 時間凍結後、丁 3 3緩衝液（ 1"1 9. 0 ) を加えて 6 0 °Cに加温し、 T E S緩衝液 Zフエノール混液を加え、氷水中で冷却しながら 5分間激しく振盪した後、遠心分離により上清を採取した。この上清に 2倍容の冷エタノールを加え、沈殿した粗染色体 D N Aを採取し、 S S C緩衝液（ p H 7. 1 ) に溶解後、リボヌクレア一ゼとプロティナーゼをそれぞれ 7. 5 μ g又は 1 2 5 9加え、 3 7 °Cで 1 時間インキュべ一卜して反応させた。反応物にクロ口ホルムイソアミルアルコール混液を加えて染色体 D N Aを抽出し、冷エタノールを加え、生成した染色体 D N Aを含む沈殿を採取した。このようにして得た精製染色体 D N Aを濃度約 1 m g /m I になるように S S C緩衝液（ p H 7. 1 ) に溶解し、溶液を一 8 0 °Cで凍結した。実験例 6 — 2 形質転換体 B G C 2の調製

実験例 6 — 1 で調製した精製染色体 D N A溶液を 1 m I とり、これに制限酵素 S a u 3 1 を約 3 5単位加ぇ、 3 7 °Cで 2 0分間反応させて染色体 D N Aを部分分解した後、蔗糖密度勾配超遠心法により約 2 , 0 0 0 乃至 6 , 0 0 0塩基対からなる D N A断片を採取した。別途、プラスミドベクタ一『 B l u e s c r i p t I I S K (十）』（ストラタジーン ' クローニング ' システム（株）製）を常法により制限酵素 B a m H I を作用させて完全に切断した後、その切断されたプラスミドベクタ一 0 . 5 g と先に得た D N A断片約 5 ₉ とを『 D N Aライゲージヨン ' キット』 (宝酒造（株）製）を用いて、添付の説明書にしたがって操作し連結し、得られた組換え D N Aを用いて、通常のコンビテン卜セル法によりコンビテントセル『 E p i c u r i a n C o I i X L 2 — B l u e』（ストラタジーン ' クローニング ' システム（株）製）を 1 0 0 i I を形質転換して遺伝子ライブラリ一を作製した。得られた遺伝子ライブラリーとしての形質転換体を、常法により調製した、トリプトン 1 0 g / L、酵母エキス 5 g /し、塩化ナトリウム 5 g /し、アンピシリンナトリウム塩 1 0 0 m g Zし、及び 5 —ブロモ一 4—クロ口— 3 —インドリル一 S—ガラクトシド 5 0 m g Lを含む寒天平板培地（ p H 7. 0 ) に植菌し、 3 7 °Cで 2 4時間培養後、培地上に形成された白色のコロニー約 5， 0 0 0個をアマシャム製ナイロン膜『 H y b o n d — N十』上に固定した。別途、実験例 5 — 2の方法で明らかにした、配列表に於ける配列番号 1 6に示すアミノ酸配列における第 4番目より第 1 1 番目までのアミノ酸配列に基づき 5 ' - G G N T T Y A T G A A Y T T Y A G R T G G G A - 3 ' で表わされる塩基配列の才リゴヌクレオチドを化学合成し、常法にしたがい [ァ一 ^{3 2} P] A T P及び T 4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて同位体標識してプロ一ブ 1 としての合成 D N Aを得た。先に得たナイロン膜上に固定したコロニ一のうち、プローブ 1 と顕著な会合を示すコロニーにっき、通常のコロニ一ハイブリダイゼーション法を適応して 2種類の形質転換体を選択した。常法によリ、これら 2種類の形質転換体から組換え D N Aを採取する一方、配列表に於ける配列番号 1 7に示すアミノ酸配列における第 4番目より第 1 1 番目までのアミノ酸配列に基づき 5' - G A Y G C N T G G A T G T T Y G G N G A Y T G G - 3 ' で表わされる塩基配列のプローブ 2 を化学合成し、同様に同位体標識後、通常のサザーン · ハイブリダィズを適応して、顕著な会合を示した組換え D N Aを選択し、当該形質転換体を『 B G C 2』と命名した。実験例 6 — 3 D N A配列の解明

実施例 6— 2の方法で得た形質転換体『 B G C 2』を常法に従い、アンピシリンナトリウムを 1 0 0 i g /m I 含む L—ブロス培地（ p H 7. 0 ) に植菌し、 3 7 °Cで 2 4時間回転振盪培養した。培養終了後、遠心分離により培養物から菌体を採取し、通常のアル力リー S D S法により組換え D N Aを抽出した。この組換え D N Aの塩基配列を、通常のジデォキシ法により分析したところ、当該組換え D N Aは、バチルスグロビスポルス C 1 1 株に由来する、鎖長 5 2 9 4塩基対の、配列表に於ける配列番号 1 8 に示す塩基配列の D N Aを含んでいた。第 1 7図に示すように、この組換え D N Aにおいて、当該 D N Aは、制限酵素 X b a I による認識部位の下流に連結されていた。一方、この塩基配列から推定されるアミノ酸配列は、その配列番号 1 8に併記したとおりであり、このアミノ酸配列と、実験例 5 - 〗の方法で確認された本発明のポリぺプチドの N末端ァミノ酸配列及び実験例 5 — 2の方法で明らかにされた中間部部分ァミノ酸配列である、配列表に於ける配列番号 7及び配列番号 8乃至 1 7に示すアミノ酸配列と比較したところ、配列表に於ける配列番号 7に示すァミノ酸配列は、配列番号 1 8に併記したァミノ酸配列に於ける第 3 6乃至 4 4番目のァミノ酸配列と完全に一致した。また、配列表における配列番号 8、 9、〗 0、 1 1 、 1 2、 1 3、 1 4、 1 5、 1 6及び 1 7に示すァミノ酸配列は、それぞれ、配列表に於ける配列番号 1 8に併記したアミノ酸配列に於ける第 8 2 3乃至 8 3 2番目、第 5 7 6乃至 5 8 9番目、第 8 7 4乃至 9 0 4番目、第 1 1 1 7乃至 1 1 4 1 番目、第 6 5 7乃至 6 7 0番目、第 3 6 7乃至 3 9 9番目、第 9 7 0乃至 9 9 3番目、第 9 3 8乃至 9 5 3番目、第 2 7 9乃至 2 9 5番目及び第 6 3 2乃至 6 5 1 番目のアミノ酸配列と完全に —致した。尚、配列表に於ける配列番号 1 8に於ける第 4 7 8 3乃至 4 7 8 5番目の塩基配列は、翻訳終止コドン（ 5 ' — T A A— 3 ' ) をコードしていることから、本発明のポリペプチドの c末端は、その直前のグルタミン酸（配列表に於ける配列番号 1 8に於ける第 1 2 8 4番目のアミノ酸）であることが判明した。

これらの結果は、本発明のポリペプチドが配列表における配列番号 1 に示すアミノ酸配列を有し、本発明のポリペプチドは、バチルスグロビスポルス C 1 1 株に於いては、配列表における配列番号 4に示す塩基配列の D N Aによりコードされていることを示している。又、配列表における配列番号 1 8に併記したアミノ酸配列における第 1 乃至 3 5番目のアミノ酸配列は、当該ポリペプチドの分泌シグナル配列と推定された。これらのことから、当該ポリペプチドの分泌前の前駆体ペプチドは、配列表に於ける配列番号 1 8に併記されたァミノ酸配列からなり、そのアミノ酸配列は、配列表における配列番号 1 8に示す塩基配列にコードされていることが判明した。このようにして、その塩基配列を確認した組換え D N Aを『 p B G C 2』と命名した。実験例 7 バチルスグロビスポルス N 7 5株由来のポリペプチドをコ一ドする D N Aを含む組換え D N Aと形質転換体の調製

実験例 7 — 1 染色体 D N Aの調製

澱粉部分分解物『パインデックス # 4』 2. 0 % ( w/v )、酵母抽出物『アサヒミース卜』 1 . 0 % ( w/ v )、リン酸二カリウム 0. 1 % (WZ V )、リン酸一ナトリウム . 1 2水塩 0. 0 6 % ( w/v；)、硫酸マグネシゥム . 7水塩 0. 0 5 % ( w/ V ) 及び水からなる液体培地を、 5 0 0 m I 容三角フラスコに 1 0 0 m I ずつ入れ、才一トクレーブで 1 2 1 °C、 2 0分間滅菌し、冷却して、バチルスグロビスポルス N 7 5株を接種し、 2 7 °C、 2 3 0 r p mで 2 4時間回転振盪培養した。その後、遠心分離により培養物から採取した菌体を T E S緩衝液（ P H 8. 0 ) に浮遊させ、リゾチームを 0. 0 5 % ( w Z V ) 加え、 3 7 °Cで 3 0分間インキュベー卜した。処理物を— 8 0 °Cで 1 時間凍結後、 T S S緩衝液（ p H 9. 0 ) を加えて 6 0 °Cに加温し、 T E S緩衝液フエノール混液を加え、氷水中で冷却しながら 5分間激しく振盪した後、遠心分離により上清を採取した。この上清に 2倍容の冷エタノールを加え、沈殿した粗染色体 D N Aを採取し、 S S C緩衝液（ p H 7. 1 ) に溶解後、リボヌクレアーゼとプロティナ一ゼをそれぞれ 7. 5 i g又は 1 2 5 i g加え、 3 7 °Cで 1 時間インキュベー卜して反応させた。反応物にクロ口ホルム Zイソアミルアルコール混液を加えて染色体 D N Aを抽出し、冷エタノールを加え、生成した染色体 D N Aを含む沈殿を採取した。このようにして得た精製染色体 D N Aを濃度約 I m g Zm l になるように S S C緩衝液（ p H 7. 1 ) に溶解し、溶液を一 8 0 °Cで凍結した。実験例 7 — 2 形質転換体 B G N 2の調製

実験例 7 — 1 で調製した精製染色体 D N A溶液を 1 m I とり、これに制限酵素 K p n I を約 2 0 0単位加え、 3 7 °Cで 1 6時間反応させて染色体 D N Aを分解した後、蔗糖密度勾配超遠心法により約 3， 0 0 0乃至 7 , 0 0 0塩基対からなる D N A断片を採取した。別途、プラスミドベクタ一『 B l u e s c r i p t I I S K (十）』（ストラタジーン ' クロ一ニング ' システム社製）を常法により制限酵素 K p π I を作用させて完全に切断した後、その切断されたプラスミドベクタ一 0. 5 9 と先に得た D N A断片約 5 9 とを『D N Aライゲーシヨン 'キット』（宝酒造（株）製）を用いて、添付の説明書にしたがって操作し連結し、得られた組換え D N Aを用いて、通常のコンビテントセル法によりコンビテン卜セル『 E p i c u r i a n C o l i X L 2— B l u e』（ストラタジーン ' クロー二ング ' システム社製）を 1 0 0 I を形質転換して遺伝子ライブラリーを作製した。得られた遺伝子ライブラリーとしての形質転換体を、常法により調製した、卜リプトン 1 0 g /し、酵母ェキス 5 g /し、塩化ナ卜リゥム 5 g /し、アンピシリンナトリウム塩 1 O O m g ZL及び 5—プロモ一 4—クロ口一 3 —インドリル一 S—ガラクトシド 5 0 m g /しを含む寒天平板培地（ p H 7. 0 ) に植菌し、 3 7 °Cで 2 4時間培養後、培地上に形成された白色のコロニー約 2， 5 0 0個をナイロン膜『 H y b o n d - N +』（アマシャム製）上に固定した。別途、実験例 5— 3の方法で明らかにした、配列表に於ける配列番号 2 4に示すァミノ酸配列における第 4番目より第 1 1 番目までのアミノ酸配列に基づき 5 ' — G A Y G C N T G G A T G T T Y G G N G A Y T G G - 3 ' で表わされる塩基配列のオリゴヌクレ才チドを化学合成し、常法にしたがい [ァ— ^{3 2} P ] A T P及び T 4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて同位体標識してプローブ 1 としての合成 D N Aを得た。先に得たナイロン膜上に固定したコロニーのうち、プローブ 1 と顕著な会合を示すコロニーにっき、通常のコロニーハイブリダィゼ一ジョン法を適応して 3種類の形質転換体を選択した。常法により、これら 3種類の形質転換体から組換え D N Aを採取する一方、配列表に於ける配列番号 2 3に示すァミノ酸配列における第 1 4番目より第 2 1 番目までのアミノ酸配歹 IJに基づき 5 ' - G T N A A Y C A R A A Y C A Y T G G T T Y T A— 3 ' で表わされる塩基配列のプロ一ブ 2を化学合成し、同様に同位体檩識後、通常のサザ一ン · ハイブリダィズを適応して、顕著な会合を示した組換え D N Aを選択し、当該形質転換体を『 B G N 2』と命名した。実験例 7— 3 D N A配列の解明

実施例 7 — 2の方法で得た形質転換体『 B G N 2』を常法に従い、ァンピシリンナトリウムを 1 0 0 g Z m I 含む L—ブロス培地（ p H 7.

0 ) に植菌し、 3 7 °Cで 2 4時間回転振盪培養した。培養終了後、遠心分離により培養物から菌体を採取し、通常のアルカリ一 S D S法によリ組換え D N Aを抽出した。この組換え D N Aの塩基配列を、通常のジデ才キシ法により分析したところ、当該組換え D N Aは、バチルスグロビスポルス N 7 5株に由来する、鎖長 4 9 9 1 塩基対の、配列表に於ける配列番号 2 5に示す塩基配列の D N Aを含んでいた。第 1 8図に示すように、この組換え D N Aにおいて、当該 D N Aは、制限酵素 K p n I による認識部位の下流に連結されていた。一方、この塩基配列から推定されるアミノ酸配列は、その配列番号 2 5に併記したとおりであり、このアミノ酸配列と、実験例 5— 1 の方法で確認された本発明のポリぺプチドの N末端ァミノ酸配列及び実験例 5 — 3の方法で明らかにされた中間部部分ァミノ酸配列である、配列表に於ける配列番号 1 9及び配列番号 2 0乃至 2 4に示すアミノ酸配列と比較したところ、配列表に於ける配列番号 1 9に示すアミノ酸配列は、配列番号 2 5に併記したァミノ酸配列に於ける第 3 6乃至 4 3番目のアミノ酸配列と完全に一致した。また、配列表における配列番号 2 0、 2 1 、 2 2、 2 3、及び 2 4に示すァミノ酸配列は、それぞれ、配列表に於ける配列番号 2 5に併記したァミノ酸配列に於ける第 9 0 7乃至 9 2 5 番目、第 3 6 7乃至 3 8 6番目、第 1 0 3 4乃至 1 0 5 8番目、第 9 9 6 乃至 1 0 2 0番目、及び第 6 3 2乃至 6 4 2番目のアミノ酸配列と完全に —致した。尚、配列表に於ける配列番号 2 5に於ける第 4 2 9 4乃至 4 2 9 6番目の塩基配列は、翻訳終止コドン（ 5 ' - T A A - 3 ' ) をコードしていることから、本発明のポリペプチドの C末端は、その直前のグルタミン（配列表に於ける配列番号 2 5に於ける第 1 2 8 6番目のアミノ酸）であることが判明した。

これらの結果は、本発明のポリペプチドが配列表における配列番号 2に示すアミノ酸配列を有し、本発明のポリペプチドは、バチルスグロビスポルス N 7 5株に於いては、配列表における配列番号 5に示す塩基配列の D N Aによりコードされていることを示している。又、配列表における配列番号 2 5に併記したァミノ酸配列における第 1 乃至 3 5番目のァミノ酸配列は、当該ポリペプチドの分泌シグナル配列と推定された。これらのことから、当該ポリペプチドの分泌前の前駆体ペプチドは、配列表に於ける配列番号 2 5に併記されたアミノ酸配列からなり、そのアミノ酸配列は、配列表における配列番号 2 5に示す塩基配列にコ一ドされていることが判明した。このようにして、その塩基配列を確認した組換え D N Aを『 _P B G N 2』と命名した。実験例 8 ァルスロバクタ一グロビホルミス A 1 9株由来のポリぺプチドをコードする D N Aを含む組換え D N Aと形質転換体の調製

実験例 8 — 1 染色体 D N Aの調製

澱粉部分分解物『パインデックス # 4』 2. 0 % ( w/ v )、酵母抽出物『アサヒミース卜』 1 . 0 % ( w/ V ), リン酸ニ力リウム 0. 1 % ( w/ V ) リン酸一ナトリウム ' 1 2水塩 0. 0 6 % ( w / V )、硫酸マグネシゥム · 7水塩 0. 0 5 % ( w/ V ) 及び水からなる液体培地を、 5 0 0 m I 容三角フラスコに 1 0 0 m I ずつ入れ、才一トクレーブで 1 2 1 °C、 2 0分間滅菌し、冷却して、ァルスロバクタ一グロビホルミス A 1 9株を接種し、 2 7 °C、 2 3 0 r p mで 2 4時間回転振盪培養した。その後、遠心分離により培養物から採取した菌体を T E S緩衝液（ p H 8. 0 ) に浮遊させ、リゾチームを 0. 0 5 % ( w/ V ) 加え、 3 7 °Cで 3 0分間インキュベ一卜した。処理物を一 8 0 °Cで 1 時間凍結後、 T S S緩衝液（ p H 9. 0 ) を加えて 6 0 °Cに加温し、 T E S緩衝液/フエノール混液を加え、氷水中で冷却しながら 5分間激しく振盪した後、遠心分離により上清を採取した。この上清に 2倍容の冷エタノールを加え、沈殿した粗染色体 D N Aを採取し、 S S C緩衝液（ p H 7. 1 ) に溶解後、リボヌクレア一ゼとプロティナーゼをそれぞれ 7. 5 i g又は 1 2 5 z g加え、 3 7 °Cで 1 時間インキュベートして反応させた。反応物にクロ口ホルム/イソアミルァルコール混液を加えて染色体 D N Aを抽出し、冷エタノールを加え、生成した染色体 D N Aを含む沈殿を採取した。このようにして得た精製染色体 D N Aを濃度約 1 m g I になるように S S C緩衝液（ p H 7. 1 ) に溶解し、溶液を— 8 0 °Cで凍結した。実験例 8— 2 形質転換体 A G A 1 の調製

実験例 8 — 1 で調製した精製染色体 D N A溶液を〗 m I とり、これに制限酵素 K p n I を約 1 0単位加え、 3 7 °Cで 3 0分間反応させて染色体 D N Aを部分分解した後、蔗糖密度勾配超違心法により約 4, 0 0 0乃至 8， 0 0 0塩基対からなる D N A断片を採取した。別途、プラスミドべク夕一『 B l u e s c r i p t I I S K (十）』（ストラタジーン ' クロ一ニング · システム（株）製）を常法により制限酵素 K p n I を作用させて完全に切断した後、その切断されたプラスミドベクタ一 0. 5 /i g と先に得た D N A断片約 5 i g とを『 D N Aライゲージヨン · キッ卜』（宝酒造 (株）製）を用いて、添付の説明書にしたがって操作し連結し、得られた組換え D N Aを用いて、通常のコンピテン卜セル法によリコンピテントセ『 E p i c u r i a n C o l i X L 2 — B l u e J (ストラタジ一ン · クローニング · システム（株）製）を 1 0 0 μ I を形質転換して遺伝子ライブラリ一を作製した。得られた遺伝子ライブラリーとしての形質転換体を、常法により調製した、卜リプトン 1 0 g /し、酵母ェキス 5 g Z し、塩化ナトリウム 5 g /し、アンピシリンナトリウム塩 1 0 0 m g /し、及び 5 —ブロモー 4—クロ口一 3 —インドリルーーガラクトシド 5 0 m g /しを含む寒天平板培地（ p H 7. 0 ) に植菌し、 3 7 °Cで 2 4時間培養後、培地上に形成された白色のコロニー約 6， 0 0 0個をナイロン膜『 H y b o n d — N +』（アマシャム（株）製）上に固定した。別途、実験例 5 - 4の方法で明らかにした、配列表に於ける配列番号 2 7に示すァミノ酸配列における第 1 番目より第 1 1 番目までのアミノ酸配列に基づき 5 ' — C A R G A R T G G A A Y Y T N A C N G G N G A Y C C N T G G A C - 3 ' で表わされる塩基配列の才リゴヌクレオチドを化学合成し、常法にしたがい [T一 ^{3 2} P ] A T P及び T 4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて同位体標識してプローブ 1 としての合成 D N Aを得た。先に得たナイロン膜上に固定したコロニーのうち、プローブ 1 と顕著な会合を示すコロニーにつき、通常のコロニーハイブリダイゼーション法を適応して 2種類の形質転換体を選択した。常法により、これら 3種類の形質転換体から組換え D N Aを採取する一方、配列表に於ける配列番号 2 9 に示すァミノ酸配列における第 6番目より第 1 6番目までのアミノ酸配列に基づき 5 ' — T G G A C N C A R C C N G A G C N G G N G C N G T N T T G C A - 3 ' で表わされる塩基配列のプローブ 2を化学合成し、同様に同位体標識後、通常のサザーン ' ハイブリダィズを適応して、顕著な会合を示した組換え D N Aを選択し、当該形質転換体を『A G A 1 』と命名した。実験例 8— 3 D N A配列の解明

実施例 8— 2の方法で得た形質転換体『 A G A 1 』を常法に従い、ァンピシリンナトリウムを 1 0 0 g /m I 含む L—ブロス培地（ p H 7.

0 ) に植菌し、 3 7 °Cで 2 4時間回転振盪培養した。培養終了後、遠心分離により培養物から菌体を採取し、通常のアル力リー S D S法により組換え D N Aを抽出した。この組換え D N Aの塩基配列を、通常のジデ才キシ法により分析したところ、当該組換え D N Aは、ァルスロパクターグロビホルミス A 1 9株に由来する、鎖長 5 8 1 1 塩基対の、配列表に於ける配列番号 3 2に示す塩基配列の D N Aを含んでいた。第 1 9図に示すように、この組換え D N Aにおいて、当該 D N Aは、制限酵素 K p n I による認識部位の下流に連結されていた。一方、この塩基配列から推定されるアミノ酸配列は、その配列番号 3 2に併記したとおりであり、このアミノ酸配列と、実験例 5 — 1 の方法で確認された本発明のポリペプチドの N末端ァミノ酸配列及び実験例 5 — 4の方法で明らかにされた中間部部分ァミノ酸配列である、配列表に於ける配列番号 2 6及び配列番号 2 7乃至 3 1 に示すァミノ酸配列と比較したところ、配列表に於ける配列番号 2 6に示すアミノ酸配列は、配列番号 3 2に併記したァミノ酸配列に於ける第 3 7 乃至 4 9番目のアミノ酸配列と完全に一致した。また、配列表における配列番号 2 7、 2 8、 2 9、 3 0、及び 3 1 に示すァミノ酸配列は、それぞれ、配列表に於ける配列番号 3 2に併記したァミノ酸配列に於ける第 2 2 7乃至 2 3 9番目、第 3 4 5乃至 3 7 4番目、第 4 0 1 乃至 4 3 0番目、第 8 9乃至 1 1 5番目、及び第 6 4 1 乃至 6 6 7番目のアミノ酸配列と完全に一致した。尚、配列表に於ける配列番号 3 2に於ける第 4 5 5 0乃至 4 5 5 2番目の塩基配列は、翻訳終止コドン（ 5 ' - T G A - 3 ' ) をコ一ドしていることから、本発明のポリペプチドの C末端は、その直前のフエ二ルァラニン（配列表に於ける配列番号 3 2に於ける第 9 6 5番目のアミノ酸）であることが判明した。

これらの結果は、本発明のポリべプチドが配列表における配列番号 3に示すアミノ酸配列を有し、本発明のポリペプチドは、ァルスロパクターグロビホルミス A 1 9株（ F E R M B P— 7 5 9 0 ) に於いては、配列表における配列番号 6に示す塩基配列の D N Aによりコードされていることを示している。又、配列表における配列番号 3 2に併記したアミノ酸配列における第 1 乃至 3 6番目のアミノ酸配列は、当該ポリべプチドの分泌シグナル配列と推定された。これらのことから、当該ポリペプチドの分泌前の前駆体ぺプチドは、配列表に於ける配列番号 3 2に併記されたァミノ酸配列からなり、そのアミノ酸配列は、配列表における配列番号 3 2に示す塩基配列にコードされていることが判明した。このようにして、その塩基配列を確認した組換え D N Aを『 p A G A 1 』と命名した。実験例 9 本発明の形質転換体によるポリペプチドの産生

実験例 9 一 1 形質転換体 B G C 2

澱粉部分物『パインデックス # 4』 5 g /し、ポリペプトン 2 0 g Zし、酵母エキス 2 0 g / L及びリン酸一水素ナトリウム 1 g しを含む水溶液を 5 0 0 m I 容三角フラスコに 1 0 0 m I 入れ、オートクレーブで 1 2 1 °Cで 1 5分間処理し、冷却し、無菌的に p H 7. 0に調製した後、アンピシリンナトリウム塩 1 0 m g を無菌的に添加して液体培地を調製した。この液体培地に実験例 6 - 2の方法で得た形質転換体『 B G C 2』を接種し、 2 7 ¾で約 4 8時間通気攪拌培養した。この培養物中の当該ポリぺプチドの有無を調べるために、常法にしたがい、この培養物を遠心分離して培養上清と菌体とに分離して個別に回収した。菌体については、超音波破砕法による細胞からの全抽出物と、浸透圧ショック法による細胞べリプラズムからの抽出物とを別々に調製した。前記超音波破砕法は、菌体を 1 0 m Mリン酸緩衝液（ p H 7. 0 ) に懸濁した後、その菌体懸濁液を氷水中で冷却しながら超音波ホモゲナイザー（『モデル U H— 6 0 0』）（（株）ェスェ厶テ一製）で細胞を破砕し、その破砕物を細胞全抽出物とする方法を採用した。前記浸透圧ショック法は、菌体を 3 0 m M塩化ナ卜リウムを含む 1 0 m M トリス—塩酸緩衝液（ p H 7. 3 ) で洗浄した後、洗浄菌体を 2 0 0 g / I スクロース及び 1 m M— E D T Aを含む 3 3 m M 卜リス一塩酸緩衝液（ p H 7. 3 ) に懸濁し 2 7 °Cで 2 0分間振盪し、続いて、遠心分離して菌体を回収し、その菌体を、予め約 4 °Cに冷却しておいた 0. 5 m M塩化マグネシウム水溶液に懸濁し、氷水中で 2 0分間振盪して細胞ぺリブラズ厶から抽出する方法を採用した。その後、遠心分離して、上清を回収し、その上清を細胞ペリブラズム抽出物とした。

このようにして得た培養上清、細胞全抽出物、細胞ペリブラズム抽出物それぞれについて、 α —イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素活性を測定し、それぞれの活性値を培養物 1 m I 当りに換算した。結果を表 1 2に示す。表 1 2

表 1 2の結果から明らかなように、形質転換体『 B G C 2』は本発明のポリぺブチドを細胞内に産生し、その大部分は細胞ぺリブラズムに分泌されることが判明した。尚、第一の対照として、大腸菌『X L 2 — B i u e』株を、培地にアンピシリンを添加していないこと以外は全て上記形質転換体の場合と同一条件で、培養し、培養物から培養上清と菌体破砕物を調製した。第二の対照として、バチルスグロビスポルス C 1 1 株を、アンピシリンを含有していないこと以外はすべて上記形質転換体の場合と同一条件で培養し、培養物から培養上清と菌体破砕物を調製した。第一の対照の培養上清、菌体破砕物とも α —イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素活性は全く認められなかった。第二の対照の培養上清及び菌体破砕物には α—ィソマル卜シルグルコ糖質生成酵素活性が認められたが、この場合は、それそれ、培養物当り約 0 . 3 7単位、約 0 . 0 2単位であり、形質転換体『 Β G C 2』の場合に比較して明らかに低い値であった。

上記で得だ細胞ぺリブラズム抽出物を、更に実験例 1 の方法に準じて、塩析、透析し、『セパビーズ（ S e p a b e a d s ) F P - D A 1 3』ゲル、『セフアクリル（ S e p h a c r y l ) H R S — 2 0 0』ゲル、『ブチル一トヨパール（ B u t y l — T o y o p e a r I ) 6 5 0 M』ゲルを用いたカラムクロマ卜グラフィ一に供して精製し、本発明のポリペプチドを実験例 1 に示した方法に準じて分析した。 S D S—ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量約 1 3 7 , 0 0 0 ± 2 0 , 0 0 0ダルトン、等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による等電点約 5. 2 ± 0. 5、 α ーィソマル卜シル転移酵素活性の至適温度約 4 5 °C ( C a ^{2 +}ィオン非存在）、約 5 0 °C ( C a ^{2 +}ィ才ン存在）、至適 p H約 6. 0、温度安定性は約 4 0 °C まで（ C a ^{2 +}ィ才ン非存在）、約 5 0 °C ( C a ^{2 +}イオン存在）、 p H安定性は約 5. 0乃至 1 0. 0であった。これらの結果から、本組換え型ポリべプチドは、実験例 1 の方法で得た α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素活性を有するポリぺプチドの理化学的性質と実質的に同一であった。実験例 9— 2 形質転換体 B G Ν 2

澱粉部分物『パインデックス # 4』 5 g L、ポリペプトン 2 0 g し、酵母エキス 2 0 g / L及びリン酸一水素ナトリウム 1 g Z Lを含む水溶液を 5 0 0 m I 容三角フラスコに 1 0 0 m I 入れ、才一トクレーブで 1 2 1 °Cで 1 5分間処理し、冷却し、無菌的に p H 7. 0に調製した後、 7ンピシリンナ卜リゥム塩 1 0 m g を無菌的に添加して液体培地を調製した。この液体培地に実験例 7 — 2の方法で得た形質転換体『 B G N 2』を接種し、 2 7 °Cで約 4 8時間通気攪拌培養した。この培養物中の当該ポリぺプチドの有無を調べるために、実験例 9一 1 の方法と同様に培養上清と細胞全抽出物と細胞ペリブラズム抽出物とを別々に調製した。培養上清、細胞全抽出物、細胞ペリブラズム抽出物それぞれについて、 α—イソマルトシルグルコ糖質生成酵素活性を測定し、それぞれの活性値を培養物 1 m I 当りに換算した。結果を表 1 3に示す。

表 1 3

表 1 3の結果から明らかなように、形質転換体『 B G N 2』は本発明のポリペプチドを培養上清及び細胞内に産生し、その細胞内のうちの大部分は細胞ペリブラズムに分泌されることが判明した。尚、第一の対照として、大腸菌『X L 2 — B I u _e』株を、培地にアンピシリンを添加していないこと以外は全て上記形質転換体の場合と同一条件で、培養し、培養物から培養上清と菌体破砕物を調製した。第二の対照として、バチルスグロビスポルス N 7 5株を、，アンピシリンを含有していないこと以外はすべて上記形質転換体の場合と同一条件で培養し、培養物から培養上清と菌体破砕物を調製した。第一の対照の培養上清、菌体破砕物とも α—イソマルトシルダルコ糖質生成酵素活性は全く認められなかった。第二の対照の培養上清及び菌体破砕物には α—イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素活性が認められたが、この場合は、それぞれ、培養物当り約 0. 2 1 単位、約 0. 0 1 単位であり、形質転換体『 B G Ν 2』の場合に比較して明らかに低い値であった。

上記で得た培養上清と細胞べリブラズム抽出物との混合物を、更に実験例 2の方法に準じて、塩析、透析し、『セパビーズ（ S e p a b e a d s ) F P— D A 1 3』ゲル、『セフアクリル（ S e p h a c r y l ) H R S 一 2 0 0』ゲル、『ブチルートヨパール（ B u t y l - T o y o p e a r I ) 6 5 0 M』ゲルを用いたカラムクロマトグラフィーに供して精製し、本発明のポリぺプチドを実験例 2に示した方法に準じて分析した。 S D S —ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量約 1 3 6 , 0 0 0 ± 2 0 , 0 0 0ダル卜ン、等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による等電点約 7. 3 ±0. 5、 α—イソマルトシル転移酵素活性の至適温度約 5 0。C ( C a ² +非存在下）、約 5 5 ¾ ( C a ^{2 +}存在下）、至適 p H約 6. 0、温度安定性は約 4 5°Cまで（ C a ^{2 +}非存在下）、約 5 0°C ( C a ^{2 +}存在下）、 p H安定性は約 5. 0乃至 9. 0であった。これらの結果から、本組換え型ポリペプチドは、実験例 2の方法で得た α—イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリベプチドの理化学的性質と実質的に同一であった。実験例 9 一 3 形質転換体 A G A 1

澱粉部分物『パインデックス # 4』 5 gノ L、ポリペプトン 2 0 g Zし、酵母エキス 2 0 g / L及びリン酸一水素ナトリウム 1 g しを含む水溶液を 5 0 0 m I 容三角フラスコに 1 0 0 m I 入れ、才一トクレーブで 1 2 1 °Cで 1 5分間処理し、冷却し、無菌的に p H 7. 0に調製した後、アンピシリンナトリウム塩 1 0 m g を無菌的に添加して液体培地を調製した。この液体培地に実験例 8一 2の方法で得た形質転換体『 A G A 1 』を接種し、 2 7 °Cで約 4 8時間通気攪拌培養した。この培養物中の当該ポリぺプチドの有無を調べるために、実験例 9 一 1 の方法と同様に培養上清と細胞全抽出物と細胞ペリブラズム抽出物とを別々に調製した。培養上清、細胞全抽出物、細胞ペリブラズム抽出物それぞれについて、 α—イソマル卜シルダルコ糖質生成酵素活性を測定し、それぞれの活性値を培養物 1 m I 当りに換算した。結果を表 1 4に示す。表 1 4

表 1 4の結果から明らかなように、形質転換体『 A G A 1 』は本発明のポリべプチドを培養上清及び細胞内に産生し、その細胞内のうちの大部分は細胞ペリブラズムに分泌されることが判明し/こ。尚、第一の対照として、大腸菌『 X L 2 — B I u e』株を、培地にアンピシリンを添加していないこと以外は全て上記形質転換体の場合と同一条件で、培養し、培養物から培養上清と菌体破砕物を調製した。第二の対照として、ァルスロパクターグロビホルミス A 1 9株を、アンピシリンを含有していないこと以外はすベて上記形質転換体の場合と同一条件で培養し、培養物から培養上清と菌体破砕物を調製した。第一の対照の培養上清、菌体破砕物とも α—イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素活性は全く認められなかった。第二の対照の培養上清及び菌体破砕物には α—イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素活性が認められたが、この場合は、それぞれ、培養物当り約 0. 3 3単位、約 0. 0 1 単位であり、形質転換体『 A G A 2』の場合に比較して明らかに低い値であった。

上記で得た培養上清と細胞べリブラズム抽出物との混合物を、更に実験例 3の方法に準じて、塩析、透析し、『 0 £ £ ートョパ一ル（丁 0 0 e a r I ) 6 5 0 M』ゲル、『セフアクリル（ S e p h a c r y I ) H R S — 2 0 0』ゲルを用いたカラムクロマトグラフィーに供して精製し、本発明のポリぺプチドを実験例 3に示した方法に準じて分析した。 S D S — ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量約 9 4， 0 0 0 ± 2 0 , 0 0 0ダル卜ン、等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による等電点約 4 . 3 ± 0 . 5、 α —イソマルトシル転移酵素活性の至適温度約 6 0 °C ( C a ² +非存在下）、約 6 5 °C ( C a ^{2 +}存在下）、至適 p H約 8 . 4、温度安定性は約 5 5 °Cまで（ C a ^{2 +}非存在下）、約 6 0 °C ( C a ^{2 +}存在下）、 p H安定性は約 5 . 0乃至 9 . 0であった。これらの結果から、本組換え型ポリペプチドは、実験例 3の方法で得た α —イソマル卜シルグルコ糖質生成酵素活性を有するポリぺプチドの理化学的性質と実質的に同一であった。

これらの結果から、本発明のポリペプチドは、組換え D N Α技術によつて製造できると共に、ポリぺプチドの生産性も著しく向上することが判明した。

以下、実施例により、本発明のポリペプチドの製造方法と、本発明のポリペプチドつを用いた環状四糖又はそれを含む糖質の製造方法について具体的に説明する。実施例 1 本発明のポリペプチドの製造

澱粉部分物『パインデックス # 4』 5 gノし、ポリペプトン 2 0 g Z し、酵母エキス 2 0 g Zし及びリン酸一水素ナトリウム 1 g /しを含む水溶液を 5 0 0 m l 容三角フラスコに 1 0 0 m 1 入れ、才一トクレーブで 1 2 1 °Cで 1 5分間処理し、冷却し、無菌的に p H 7 . 0に調製した後、ァンピシリンナトリウム塩を 1 0 0 yti g m I 加えた。この液体培地に実験例 5 — 2の方法で得た形質転換体『 B G C 2』を接種し、 2 7 °C、 2 3 0 r p mで 2 4時間回転振盪培養して種培養液を得た。次に、 3 0 I 容ファーメンターに上記と同じ組成の液体培地を約 1 8 I とり、同様に滅菌し、 3 7 °Cまで冷却後、アンピシリンナトリウム塩を 5 0 i g / m I 加え、種培養液を 1 % ( v / v ) 接種し、 2 7 ¾で 4 8時間通気培養した。培養物を遠心分離して菌体を回収し、 1 0 m Mリン酸緩衝液（ p H 7 . 0 ) に懸濁した後、超音波処理して菌体を破砕し、遠心分離によリ不溶物を除去し

1：上清を得た。この上清中の酵素活性を測定したところ、培養物 1 I 当り、約 1 , 1 0 0単位の酵素活性が検出された。この上清を用いて実験例 1 の方法により精製したところ、比活性約 1 3 . 5単位 / m g蛋白質の本発明のポリペプチドを 1 m I 当り約 6 1 単位含む水溶液が約 7 0 m l 得られた。実施例 2 本発明のポリペプチドの製造

澱粉部分物『パインデックス # 4』 5 g し、ポリペプトン 2 0 g Z L、酵母エキス 2 0 g L及びリン酸一水素ナトリウム 1 g Z Lを含む水溶液を 5 0 0 m l 容三角フラスコに 1 0 0 m I 入れ、才一トクレーブで 1 2 1 °Cで 1 5分間処理し、冷却し、無菌的に p H 7 . 0に調製した後、ァンピシリンナ卜リゥム塩を 1 0 0 g / m I 加えた。この液体培地に実験例 6— 2の方法で得た形質転換体『 B G N 2』を接種し、 3 7 °C、 2 3 0 r p mで 2 4時間回転振盪培養して種培養液を得た。次に、 3 0 I 容ファ —メンターに上記と同じ組成の液体培地を約 1 8 I とり、同様に滅菌し、 2 7 °Cまで冷却後、アンピシリンナトリウム塩を 5 0 /i g Z m I 加え、種培養液を 1 % ( V / V ) 接種し、 2 7 °Cで 4 8時間通気培養した。培養物を遠心分離して培養上清を得た。この培養上清中の酵素活性を測定したところ、培養物 1 し当り、約 7 5 0単位の酵素活性が検出された。この上清を用いて実験例 2の方法により精製したところ、比活性約〗 2 . 6単位 Z m g蛋白質の本発明のポリペプチドを 1 m I 当り約 7 2単位含む水溶液が約 7 5 m I 得られた。実施例 3 環状四糖を含むシラップ状物の製造

タピ才力澱粉を濃度約 2 5 %澱粉乳とし、これに α —アミラーゼ（商品名『ネオスピターゼ』、ナガセ生化学工業（株）製）を澱粉固形物グラム当り 0 . 2 %加え、 8 5乃至 9 0 °Cで約 2 0分間反応させ、次いで 1 2 0 °C に 2 0分間才一トクレーブし、更に約 3 5 °Cに急冷して D E約 4の液化溶液を得、これに実施例 1 の方法で得た本発明のポリペプチドと、実験例 1 一 4の方法で得た α—ィソマルトシル転移酵素を澱粉固形物グラム当りそれそれ 2 . 2単位と 6 . 6単位の割合になるように加え、更にシクロマル卜デキストリングルカノトランスフヱラーゼ（（株）林原生物化学研究所製）を澱粉固形物グラム当り 1 0単位になるように加え、 ρ Η 6 . 0、温度 3 5 °Cで 4 8時間反応させた。その反応液を 9 5 °Cで 3 0分間保った後、 p H 5 . 0、温度 5 0 °Cに調整した後、一グルコシダ一ゼ剤（商品名『卜ランスダルコシダーゼ L 「ァマノ」』、天野製薬（株）製）を固形物 1 グラム当たり 3 0 0単位加え、 2 4時間反応させ、更にグルコアミラーゼ剤 (商品名『ダルコチーム』、ナガセ生化学工業（株）製）を固形物 1 グラム当たり 3 0単位加え、 1 7時間反応させ、その反応液を 9 5 °Cに加熱し 3 0分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を、常法に従って、活性炭で脱色し、 H型および 0 H型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度 6 0 %の環状四糖含有シラップを原料澱粉固形物当たリ収率約 9 0 %で得た。

本シラップは、固形物当り、グルコース 3 8 . 4 %、環状四糖 5 8 . 1 % . その他の糖質を 3 . 5 %含有しており、温和な甘味、適度の粘度、保湿性、包接性を有し、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。実施例 4 環状四糖結晶性粉末の製造

とうもろこし澱粉を濃度約 2 0 %の澱粉乳とし、これに炭酸カルシウム 0 . 1 %加え、 p H 6 . 5に調整し、 α—アミラーゼ（商品名『ターマミール 6 0 し』、ノボ社製）を澱粉グラム当たり 0 . 3 %加え、 9 5 °Cで 1 5 分間反応させ、次いで 1 2 0 °Cに 2 0分間才ー卜クレーブし、更に約 3 5 °C に急冷して D E約 4の液化溶液を得、これに実施例〗の方法で得たポリぺプチドと実験例 1 一 4の方法で得た α—イソマル卜シル転移酵素を澱粉固形物グラム当りそれそれ 2 . 5単位と 7 . 0単位の割合になるように加え、更にシクロマルトデキストリン . グルカノ卜ランスフェラ一ゼ（（株）林原生物化学研究所製）を澱粉固形物グラム当り 1 0単位になるように加え、 ρ Η 6 . 0、温度 3 5で 4 8時間反応させた。その反応液を 9 5 °Cで 3 0 分間保った後、 P H 5 . 0、温度 5 0 °Cに調整した後、 α—グルコシダーゼ剤（商品名『卜ランスグルコシダーゼ L 「ァマノ』、天野製薬（株）製）を固形物グラム当たり 3 0 0単位加え、 2 4時間反応させ、更にダルコアミラ一ゼ剤（商品名『ダルコチーム』、ナガセ生化学工業（株）製）を固形物グラム当たり 3 0単位加え、 1 7時間反応させ、その反応液を 9 5 °Cに加熱し 3 0分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を、常法に従つて、活性炭で脱色し、 H型および 0 H型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して、固形物当り、グルコース 3 4 . 2 %、環状四糖 6 2 . 7 %、その他の糖質を 3 . 1 %含有する濃度 6 0 %の環状四糖含有シラップを得た。

この環状四糖含有シラップを、強酸性力チ才ン交換樹脂（商品名『アンバーライ卜 C R— 1 3 1 0 ( N a型）』、オルガノ（株）製）を用いたカラム分画を行なった。樹脂を内径 5 . 4 c mのジャケッ卜付きステンレス製カラム 4本に充填し、直列につなぎ樹脂層全長 2 0 mとした。カラム内温度 6 0 °Cに維持しつつ、糖液を樹脂に対して 5 % ( V / V ) 加え、これに 6 0 °Cの温水を S V 0 . 1 3で流して分画し、溶出液の糖組成を H P L C 法でモニターし、環状四糖高含有画分を採取し、精製して、固形物当たり約 9 8 %の環状四糖を含有する環状四糖高含有液を得た。本溶液を濃度約 7 0 %に濃縮した後、助晶缶にとり、種晶として環状四糖 5乃至 6含水結晶約 2 %を加えて徐冷し、晶出率約 4 5 %のマスキットを得た。本マスキットを乾燥搭上のノズルより 1 5 0 k g / c m ²の高圧にて噴霧した。これと同時に 8 5 °Cの熱風を乾燥搭の上部より送風し、底部に設けた移送用金網コンベア上に結晶粉末を捕集し、コンベアの下より 4 5 °Cの温風を送りつつ、該粉末を乾燥搭外に徐々に移動させて、取り出した。この結晶粉末を熟成搭に充填して温風を送りつつ、 1 0時間熟成させ、結晶化と乾燥を完了し、原料澱粉固形物当たリ収率約 2 0 %で環状四糖 5 乃至 6含水結晶粉末を得た。

本品は、還元性が極めて低く、ァミノカルボニル反応を起こしにくく、吸湿性も示さず、取扱いが容易であり、温和な低甘味、適度の粘度、保湿性、包接性、難消化性を有し、甘味料、低カロリー食品素材、呈味改良剤、風味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。実施例 5 環状四糖結晶性粉末の製造

とうもろこし澱粉を濃度約 3 0 %の澱粉乳とし、これに炭酸カルシウム 0 . 1 %加え、 p H 6 . 5に調整し、 α—アミラーゼ（商品名『タ一マミール 6 0 し』（ノボ社製）を澱粉グラム,当たり 0 . 3 %加え、 9 5 °Cで 1 5 分間反応させ、次いで 1 2 0 °Cに 2 0分間才一トクレーブし、更に約 5 1 °C に急冷して D E約 4の液化溶液を得、これに実施例 2の方法で得たポリぺプチドと実験例 2 — 4の方法で得た α —イソマル卜シル転移酵素を澱粉固形物グラム当りそれそれ 2 . 4単位と 8 . 0単位の割合加え、更にシクロマル卜デキス卜リン · グルカノ卜ランスフェラ一ゼ（（株）林原生物化学研究所製）を澱粉固形物グラム当り 3単位になるように加え、 ρ Η 5 . 5、温度 5 1 °Cで 4 8時間反応させた。その反応液を 9 5 °Cで 3 0分間保った後、 p H 5 . 0、温度 5 0 °Cに調整した後、 α—ダルコシダ一ゼ剤（商品名『卜ランスグルコシダーゼ L 「ァマノ」』、天野製薬（株）製）を固形物グラム当たり 3 0 0単位加え、 2 4時間反応させ、更にグルコアミラ一ゼ剤（商品名『グルコチーム』、ナガセ生化学工業（株）製）を固形物グラム当たり 3 0単位加え、 1 7時間反応させ、その反応液を 9 5 °Cに加熱し 3 0分間保った後、冷却し、濾過して得られる濾液を常法に従って活性炭で脱色し、 H型および 0 H型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮して、固形物当り、グルコース 4 6 . 8 %、環状四糖 4 4 . 0 %、その他の糖質を 9 . 8 %含有する濃度 6 0 %の環状四糖含有シラップを得た。得られた環状四糖含有シラップを原糖液とし、環状四糖の含量を高めるため、実施例 5の方法に準じて強酸性力チ才ン交換樹脂を用いる力ラムクロマ卜グラフィーを行なって、環状四糖高含有画分を採取し、精製して、濃縮し、噴霧乾燥して、環状四糖含有粉末を原料澱粉固形物当たり収率約 4 5 %で得た。

本品は、固形物当たり、グルコース 3 . 7 %、環状四糖 8 0 . 5 %、及びその他の糖質を 1 5 . 8 %含有しており、温和な甘味、適度の粘度、保湿性、包接性を有し、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、離水防止剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤、包接剤、粉末化基材などとして、各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用できる。

本発明は斯くも顕著な作用効果を奏する発明であり、斯界に貢献すること誠に多大な意義ある発明と言える。

Claims

請求の範囲

1 . 非還元末端の結合様式として α— 1 ， 4グルコシル結合を有するグルコース重合度が 2以上の糖質から、還元力を実質的に増加することなく α—ダルコシル転移することによって、非還元末端の結合としてな一 1 ， 6グルコシル結合様式を有し、この非還元末端以外の結合様式として α— 1 , 4グルコシル結合を有するグルコース重合度が 3以上の糖質を生成する酵素活性を有し、かつ、配列表に於ける配列番号 1 、 2、若しくは 3に示すアミノ酸配列、若しくはそれらのァミノ酸配列に於いて、 1 若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加したアミノ酸配列を有するポリぺプチド。

2. 下記の理化学的性質を有する請求の範囲第 1項記載のポリべプチド。

( 1 ) 分子量

( 2 ) 至適温度

Ρ Η 6. 0、 6 0分間反応の条件下、約 4 0乃至約 5 0 °Cの温度範囲内に至適温度を有する。

P H 8. 4、 6 0分間反応の条件下、 6 0 °Gに至適温度を有する。または、

( 3 ) 至適 p H

( 4 ) 温度安定性

p H 6 . 0 、 6 0分間保持する条件下、約 4 5 °C以下に温度安定域を有す。

p H 6 . 0、 6 0分間保持する条件において、 1 m M C a ^{2 +}存在下、約 6

0 ΐ以下に温度安定域を有する。

ρ Η 8 . 0 、 6 0分間反応の条件下、 5 5 °C以下に温度安定域を有する。または、

p H 8 . 0、 6 0分間保持する条件において、 1 m M C a ^{2 +}存在下、約 6 0 °C以下に温度安定域を有する。

( 5 ) p H安定性

4 °C、 2 4時間保持する条件下、 p H約 5 . 0乃至約 1 0 . 0の範囲内に安定 p H域を有する。

3 . 請求の範囲第 1 項又は第 2項記載のポリぺプチドをコ一ドする D N A。

4 . 配列表に於ける配列番号 4、 5、若しくは 6に示す塩基配列若しくはそれらの塩基配列に於いて、 1 若しくは複数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加した塩基配列、又は、それらに相補的な塩基配列若しくはそれらの塩基配列に於ける 1 若しくは複数個の塩基を、遺伝子の縮重に基づき、それがコードするアミノ酸配列を変えることなく他の塩基で置換した塩基配列を有する請求の範囲第 3項記載の DNA。 '

5 . 遺伝子の縮重に基づき、配列表における配列番号 1 、 2又は 3に示すァミノ酸配列を変えることなく、配列表における配列番号 4、 5、若しくは 6に示す塩基配列における塩基の 1 若しくは複数個の塩基を他の塩基で置換した塩基配列を有する請求の範囲第 3項又は第 4項記載の D N A。

6 . バチルス属の微生物に由来する請求の範囲第 3項、第 4項又は第 5 項記載の D N A。

7. ァルスロパクター属の微生物に由来する請求の範囲第 3項、第 4項又は第 5項記載の D N A。

8. 請求の範囲第 3項乃至第 7項のいずれかに記載の D N Aと、自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換え D N A。

9. 自律複製可能なべクタ一がプラスミドベクター B l u e s c r i p t I I S K ( + ) である請求の範囲第 8項記載の複製可能な組換え D N A o

1 0. 請求の範囲第 8項又は第 9項記載の複製可能な組換え D N Aを適宜宿主に導入してなる形質転換体。

1 1 . 宿主が大腸菌である請求の範囲第 1 0項記載の形質転換体。

1 2. 請求の範囲第 1 0項又は第 1 1 項記載の形質転換体を栄養培地中で培養し、その培養物から請求項 1 又は 2記載のポリぺプチドを採取することを特徴とするポリぺプチドの製造方法。

1 3. 培養物中の請求の範囲第 1 項又は第 2項記載のポリペプチドを、遠心分離、濾過、濃縮、塩析、透析、分別沈殿、イオン交換クロマ卜グラフィ一、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ァフィ二ティークロマ卜グラフィ一、ゲル電気泳動及び等電点電気泳動から選ばれる 1 種又は 2種以上の方法により採取することを特徴とする請求項 1 2 記載のポリペプチドの製造方法。

1 4. 請求の範囲第 1 項又は第 2項記載のポリペプチドを、非還元末端の結合様式として α— 〗， 4ダルコシル結合を有するグルコース重合度が 2以上の糖質に作用させ、前記糖質の還元力を実質的に増加することなく a一グルコシル転移することによって、非還元末端の結合として α— 1 , 6グルコシル結合様式を有し、この非還元末端以外の結合様式として α— 1 ， 4グルコシル結合を有するグルコース重合度が 3以上の糖質を生成させる方法。

1 5 . 請求の範囲第 1 項又は第 2項記載のポリペプチドを、非還元末端の結合様式として α— 1 ， 4グルコシル結合を有するグルコース重合度が 2以上の糖質に作用させ、前記糖質の還元力を実質的に増加することなく α—グルコシル転移することによって、非還元末端の結合として α— 1 ， 6グルコシル結合様式を有し、この非還元末端以外の結合様式として α— 1 , 4 グルコシル結合を有するグルコース重合度が 3以上の糖質の製造方法。

1 6 . 請求の範囲第 1 項又は第 2項記載のポリペプチドを、非還元末端の結合様式として α— 1 , 4グルコシル結合を有するグルコース重合度が

2以上の糖質に作用させ、前記糖質の還元力を実質的に増加することなくーグルコシル転移することによって、非還元末端の結合として α— 1 , 6 グルコシル結合様式を有し、この非還元末端以外の結合様式として α— 1 ， 4 グルコシル結合を有するグルコース重合度が 3以上の糖質を生成させ、次いで、非還元末端の結合様式として α— 1 ， 6ダルコシル結合を有し、この非還元末端以外の結合様式として α―、 4ダルコシル結合を有するグルコース重合度が 3以上の糖質から、 α—イソマル卜シル転移することによって、サイクロ {→ 6 ) — a— D—グルコビラノシルー（ 1 →3 ) — α— D—グルコピラノシル一（ 1 ~ 6 ) — α— D—グルコピラノシル一（ 1 →3 ) — α— D—グルコビラノシルー（ 1 →}の構造を有する環状四糖を生成する酵素を作用させて、サイクロ {→ 6 ) — 一 D—グルコビラノシルー ( 1 → 3 ) — な一 D—グルコピラノシル一（ 1 → 6 ) — α— D —グルコピラノシルー（ 1 →3 ) — α— D—グルコビラノシルー（ 1 →}の構造を有する環状四糖を生成させ、これを採取することを特徴とする環状四糖の製造方法。

1 7 . 環状四糖を結晶化させる工程を含むことを特徴とする請求の範囲第 1 6項記載の環状四糖の製造方法。

1 8 . 環状四糖がシラップ又は結晶であることを特徴とする請求の範囲第 1 6項又は第 1 7項記載の環状四糖の製造方法。