CN1845931A

CN1845931A - 环状麦芽糖基麦芽糖以及环状麦芽糖基麦芽糖合成酶和它们的制造方法及其用途

Info

Publication number: CN1845931A
Application number: CNA2004800248815A
Authority: CN
Inventors: 向井和久; 渡边光; 西本友之; 久保田伦夫; 福田惠温; 三宅俊雄
Original assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 2003-08-28
Filing date: 2004-08-26
Publication date: 2006-10-11
Anticipated expiration: 2024-08-26
Also published as: JP2010195830A; JP5255603B2; CN100422197C; CN101323847B; CN101323847A

Abstract

本发明将提供以葡萄糖作为构成糖的新型非还原性糖，在扩展非还原性糖选择范围的同时，提供生成该非还原性糖的新酶，以及它们的生成方法和制造方法、编码该酶的DNA、含有该DNA的重组DNA和转化体、以及含有该非还原性糖的组成物及其用途作为课题，通过提供具有环{→6)－α－D－吡喃葡萄糖基－(1→4)－α－D－吡喃葡萄糖基－(1→6)－α－D－吡喃葡萄糖基－(1→4)－α－D－吡喃葡萄糖基－(1→}结构的新的环状糖、即环状麦芽糖基麦芽糖和生成该糖的新的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶和它们的生成方法和制造方法、编码该酶的DNA和含有该DNA的重组DNA和转化体、以及环状麦芽糖基麦芽糖或含有该糖的糖类的组成物及其用途，解决上述课题。

Description

环状麦芽糖基麦芽糖以及环状麦芽糖基麦芽糖合成酶和它们的制造方法及其用途

技术领域

本发明涉及到具有环{→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}结构的环状麦芽糖基麦芽糖(以下、在本说明书中有时也简单略称为“环状麦芽糖基麦芽糖”)和环状麦芽糖基麦芽糖合成酶以及它们的制造方法及其用途和编码该酶的DNA与含有该DNA的重组DNA，具体而言，涉及到环状麦芽糖基麦芽糖和环状麦芽糖基麦芽糖合成酶及其制造方法、生产环状麦芽糖基麦芽糖合成酶的微生物、编码该酶的DNA和含有该DNA的重组DNA和转化体、使用该酶的环状麦芽糖基麦芽糖的生成方法和制造方法、以及含有环状麦芽糖基麦芽糖的组成物。

背景技术

作为以葡萄糖为构成糖的糖，例如，已知有以淀粉作为原料制造的淀粉部分分解物的直链淀粉、淀粉糊精、麦芽糖糊精、麦芽低聚糖、异麦芽低聚糖等。已知这些糖通常在分子的两端含有非还原性末端和还原性末端，表现出还原性。一般来说，淀粉部分分解物将每单位该固形物的还原能力的大小以作为葡萄糖当量(Dextrose Equivalent、DE)表示。已知该值大的糖通常分子小，粘度低，甜味浓，但反应性强，具有容易与氨基酸或蛋白质等带有氨基的物质发生氨基羰基反应，进行褐变，发生恶臭，使品质易劣化的性质。为了改善这样的缺点，人们从很早就期盼不改变淀粉部分分解物的构成糖的葡萄糖，而使其还原能力降低或消除的方法。例如已知有象Journal of AmericanChemical Society、美国、1949年、第71卷、353至358页报道的那样，通过使macerans淀粉酶(macerans amylase)作用于淀粉，使6至8分子的葡萄糖生成通过α-1，4糖苷键键合的α-、β-或γ-环糊精的方法。现在可从淀粉在工业化规模生产这些环糊精，这些环糊精可用于充分发挥它们具有的非还原性，而且无味，具有包合能力等特性的用途。另外，就像先前本申请人在特开平7-143876号公报、特开平7-213283号公报等中公开的那样，已知有通过使非还原性糖合成酶以及海藻糖水解酶作用于麦芽低聚糖等淀粉部分分解物，使2分子葡萄糖生成通过α，α-1，1糖苷键结合的海藻糖的方法。现在，已知由淀粉可以工业规模生产海藻糖，由于其非还原性温和，可以在产生高品质的甜味特性等用途中利用。另外，就像先前本申请人在国际公开WO01/90338A1号说明书、国际公开WO02/055708A1号说明书、国际公开WO02/40659A1号说明书等中公开的那样，已知有通过使α-异麦芽糖基葡糖合成酶和α-异麦芽糖基转移酶作用于淀粉或其部分分解物，生成具有4分子的葡萄糖通过α-1，3糖苷键和α-1，6糖苷键交互结合的结构、即具有环{→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}结构的环状四糖的方法。该环状四糖由于具有环状结构，所以具有包合能力，在表现出可使挥发性有机物稳定的作用的同时，还由于是非还原性糖，使氨基羰基反应不发生，可预期在利用、加工中不用担心褐变、劣化。

这样一来，作为以葡萄糖为构成糖的非还原性糖，具有葡萄糖聚合度为6至8的α-、β-、γ-环糊精、葡萄糖聚合度为2的α，α-海藻糖以及葡萄糖聚合度为4的环{→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}结构的环状四糖，由于可充分发挥各自的特性，所以可以在各种领域中利用，如果在这些糖以外还可以提供以葡萄糖为构成糖的非还原性糖，那么非还原性糖的选择的范围变宽，预期可以用于更多样的用途中。

发明内容

本发明课题在于提供以葡萄糖为构成糖的新型非还原性糖，在使非还原性糖的选择范围扩展的同时，提供生成这样的非还原性糖的新型酶以及它们的生成方法和制造方法、编码该酶的DNA、含有该DNA的重组DNA和转化体、以及含有这样非还原性糖的组成物及其用途。

本发明人等为了解决上述课题，寄希望于可由淀粉部分分解物生成新型非还原性糖的全新的酶，所以一直在广泛寻找产生这样的酶的微生物。结果发现从冈山县冈山市的土壤新分离到了新的微生物、属于节杆菌(Arthrobacter)属的新型微生物M6株生产新的酶，通过这个新酶的作用，可以由淀粉或其部分分解物等α-1，4葡聚糖大量生成具有环{→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}结构的新的环状糖、即环状麦芽糖基麦芽糖。另外，在阐明环状麦芽糖基麦芽糖合成酶的诸性质的同时，确立了其制造方法，另外还确立了编码该酶的DNA和含有该DNA的重组DNA和转化体，以及确立了通过本酶生成环状麦芽糖基麦芽糖的生成方法、以及使用本酶的环状麦芽糖基麦芽糖或含有该糖的糖类的制造方法。另外还发现环状麦芽糖基麦芽糖可以很容易地从其过饱和水溶液中析出结晶、采集结晶，另外发现环状麦芽糖基麦芽糖具有包合甲醇、乙醇或醋酸等挥发成分的作用，不发生氨基羰基反应，褐变或劣化少，对热和pH稳定，具有难消化性-难发酵性等有用的特性，可以很容易地制造环状麦芽糖基麦芽糖、或含有该糖的糖类的组成物，例如，味道好的高品质食品、低热量饮食食品或者减肥食品、稳定且高品质的化妆品、以及高活性且稳定的医药品等，完成了本发明。

本发明通过提供具有环{→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}结构的新的环状糖、即环状麦芽糖基麦芽糖和生成该糖的新的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶及其生成方法和制造方法、还有编码该酶的DNA和含有该DNA的重组DNA和转化体、以及环状麦芽糖基麦芽糖或含有该糖的糖类的组成物和其用途，解决上述课题。

通过本发明在使以葡萄糖为构成糖的非还原性糖的选择范围扩展的同时，也可以大量地供应以往未知的新的环状糖、环状麦芽糖基麦芽糖，可用于以饮食物、化妆品、医药品为首的各种各样的领域中。

附图说明

图1是表示非还原糖标准品的HPLC洗脱图。

图2是表示分离的非还原性糖的¹H-NMR谱图。

图3是表示法分离的非还原性糖质的¹³C-NMR谱图。

图4是表示本发明的环状麦芽糖基麦芽糖结构的图。

图5是表示环状麦芽糖基麦芽糖合成酶的最适温度的图。

图6是表示环状麦芽糖基麦芽糖合成酶的最适pH的图。

图7是表示环状麦芽糖基麦芽糖合成酶的温度稳定性的图。

图8是表示环状麦芽糖基麦芽糖合成酶的pH稳定性的图。

图9是表示重组DNA、pBMB1的图。图中，黑粗线表示的部分是编码来自球形节杆菌M6(FERM BP-8448)的本发明的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶的DNA。

图10是表示结晶环状麦芽糖基麦芽糖的粉末X射线衍射图。

图11是表示结晶环状麦芽糖基麦芽糖的热重量曲线的图。

符号说明

a：1位进行α-1，4糖苷键结合的葡萄糖残基

b：1位进行α-1，6糖苷键结合的葡萄糖残基

f1(+)ori：f1噬菌体复制起点

Amp：氨苄青霉素抗性基因

ColE1 ori：大肠杆菌素E1复制起点

具体实施方式

本发明所说的环状麦芽糖基麦芽糖指的是4分子的葡萄糖通过α-1，4糖苷键和α-1，6糖苷键交互结合的环状四糖、即具有环{→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}结构的环状四糖。本糖是本发明人等在从土壤中得到的微生物的培养液中首次发现的以往未知的新糖，以葡萄糖为构成糖的环状的四糖只要是具有上述结构不管其来源、形态、纯度、制造方法都包含在本发明中。

本发明所说的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶指的是作用于葡萄糖聚合度3以上的α-1，4葡聚糖，通过将麦芽糖移到其它的α-1，4葡聚糖的非还原末端葡萄糖的6位的α-1，6转移，生成6-α-麦芽糖基α-1，4葡聚糖，然后使其进行环化反应，生成具有环{→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}结构的环状麦芽糖基麦芽糖的整个酶。催化上述反应的酶没有其来源、形态、粗酶或纯化酶之分都包含在本发明的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶。

本发明的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶的酶活性可以象以下那样进行测定。使可溶性淀粉按照终浓度2w/v％那样溶解于含有2mM氯化钙的50mM醋酸缓冲液(pH6.0)，作为底物液，向该底物液0.5ml中加入0.5ml酶液，于40℃下进行30分钟酶反应，将该反应液于约100℃下加热10分钟，使反应停止后，为了分解残存可溶性淀粉或夹杂寡糖，按照每1克固形物添加α-糖苷酶4000单位，和按照1克固形物添加250单位葡萄糖淀粉酶后，于50℃下处理1小时，对该处理液中的环状麦芽糖基麦芽糖量用后述实验1所述HPLC法进行定量。环状麦芽糖基麦芽糖合成酶的1个活性单位定义为在上述条件下，1分钟内生成1μ摩尔环状麦芽糖基麦芽糖的酶量。

作为本发明的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶具体例子，例如，具有下述理化性质的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶。

(1)分子量

通过SDS-凝胶电泳法测得72000±20000道尔顿。

(2)等电点

通过含有两性电解质的等电点电泳法测得pI3.6±0.5。

(3)最适温度

在pH6.0、反应30分钟的条件下，最适温度在50℃至55℃范围。

(4)最适pH

在40℃、反应30分钟的条件下，最适pH在pH5.5至6.5范围。

(5)温度稳定性

在pH6.0、保持60分钟的条件下，直至30℃都稳定。

在1mM钙离子存在下，直至50℃都稳定。

(6)pH稳定性

在4℃、保持24小时的条件下，在pH5.0至9.0下稳定。

而具有上述理化性质的一个环状麦芽糖基麦芽糖合成酶不仅要具有上述理化性质，而且作为N末端氨基酸序列，往往具有序列表中序列编号1所示的氨基酸序列。

本发明的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶通常具有所定的氨基酸序列，作为其中一例，例如序列表中序列编号2表示的氨基酸序列或与其相同的氨基酸序列。作为具有与序列表中序列编号2所示氨基酸序列相同的氨基酸序列的变异体酶，在作用于葡萄糖聚合度3以上的α-1，4葡聚糖，生成环状麦芽糖基麦芽糖的保持酶活性的范围内序列编号2所示氨基酸序列中缺失、置换或添加1个或2个以上氨基酸的氨基酸序列的酶通常对于序列编号2所示氨基酸序列具有60％以上、优选70％以上、更优选80％以上、进一步优选90％以上同源性的氨基酸序列的酶合适。

不过具有上述理化性质或氨基酸序列的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶，说到底作为一个例子，具有与上述不同的理化学的性质或氨基酸序列的酶只要是生成环状麦芽糖基麦芽糖，不用说也都包含在本发明中。

本发明的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶虽然不受其来源限制，但作为理想的来源如微生物，特别是本发明人等从土壤分离的微生物M6株最适合。以下给出了具有环状麦芽糖基麦芽糖合成酶产生能力的微生物M6株的鉴定试验结果。而鉴定试验是按照《微生物的分类和鉴定》(长谷川武治编、学会出版中心、1985年)进行的。

<A：细胞形态>

(1)肉汁琼脂培养、27℃

通常0.4×1.0至0.8×3.0μm的短杆菌～球菌。有多形性。具有运动性。无胞子。革兰氏阳性。

(2)EYG琼脂培养基、27℃

表现出杆菌-球菌的繁殖周期。

<B：培养性质>

(1)肉汁琼脂平板培养、27℃

形状：圆形大小在3天为1至2mm。

边缘：边缘完整

隆起：半透镜状

光泽：钝光(鈍光)

表面：平滑

色调：不透明、淡黄色

(2)肉汁琼脂斜面培养、27℃

生育：中等程度

形状：线状

(3)肉汁明胶穿刺培养、27℃

没有液化。

<C：生理学性质>

(1)VP试验：阴性

(2)吲哚的生成：阴性

(3)淀粉的水解：阳性

(5)色素生成：没有可溶性色素生成

(6)脲酶：阴性

(7)氧化酶：阳性

(8)过氧化氢酶：阳性

(9)繁殖范围：pH5.5至10.0、温度 15至37℃

(10)对氧的态度：好氧性

(11)细胞壁的主要二氨基酸：赖氨酸

(12)细胞壁的肽聚糖型：赖氨酸-丙氨酸

(13)细胞壁的N-酰基型：乙酰基

(14)细胞壁的构成糖：半乳糖、葡萄糖、鼠李糖

(15)维生素的需求性：无

(16)DNA的GC含量：70％

(17)DNA-DNA同源性：与球形节杆菌(ATCC8010)之间、表现出69.3％的DNA-DNA同源性。

根据以上菌学性质，参考Bergey’s Manual of SystematicBacteriology、第2卷(1986年)，研究与公知菌的异同。结果判明本菌是属于球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)的微生物。根据这些结果本发明人等将本菌命名为新的微生物球形节杆菌M6，于平成15年8月6日，保藏于日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6所在的独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心，以保藏编号FERM BP-8448保藏。

在本发明的具有环状麦芽糖基麦芽糖合成酶产生能力的微生物中，上述菌包括原始菌、其变异株、还包括具有环状麦芽糖基麦芽糖合成酶产生能力的重组体微生物的其它微生物、以及这些微生物的变异株等。

所谓本发明的DNA指的是编码上述环状麦芽糖基麦芽糖合成酶的所有DNA。本发明的DNA只要是编码环状麦芽糖基麦芽糖合成酶的DNA，无论是来自天然的，还是人为合成的DNA都可以。作为天然的来源，例如，包括球形节杆菌M6(FERM BP-8448)在内的节杆菌属的微生物，从这些菌体可以获得包含本发明DNA的基因DNA。就是说，将这样的微生物接种于营养培养基，于好氧条件下培养约1至3日后，从培养物采集菌体，通过溶菌酶或β-葡聚糖酶等细胞壁溶解酶或超声波进行处理，使含有该DNA的基因DNA溶出到菌体外。此时可并用蛋白酶等蛋白质水解酶，也可以在使SDS等表面活性剂共存，进行冻融。对这样得到的处理物运用例如酚抽提、醇沉淀、离心分离、核糖核酸酶处理等常规方法，可以得到目的基因DNA。对于人为合成本发明的DNA，例如，可以根据序列表中序列编号2所示氨基酸序列进行化学合成。另外也可以有利实施将含有该DNA的基因DNA作为模板，使用可作为适当引物的化学合成DNA，进行PCR合成。

本发明的DNA通常具有所定碱基序列，作为其中一例，例如，序列表中序列编号3所示碱基序列或与其同源的碱基序列。作为具有与序列表中序列编号3所示碱基序列同源的碱基序列的变异体DNA，如具有在保持编码的酶的活性的范围内，在序列编号3所示的碱基序列中缺失、置换或添加1个或2个以上碱基的碱基序列的DNA，通常可见相对于序列编号3所示碱基序列具有60％以上、优选70％以上、更优选80％以上、进一步优选90％以上同源性的碱基序列的DNA。另外、根据基因编码的简并性，不改变该编码的酶的氨基酸序列，将1个或2个以上碱基置换为其它碱基的DNA当然也包含在本发明的DNA中。

也可有利地实施将本发明的DNA插入到可自我复制的适当载体后做成重组DNA。重组DNA通常由DNA和可自我复制的载体构成，只要能够获得DNA，就可通过常规方法的重组DNA技术，比较容易地制备。作为这样载体的例子，如pBR322、pUC18、Bluescript II SK(+)、pUB110、pTZ4、pC194、pHV14、TRp7、YEp7、pBS7等质粒载体和λgt-λC、λgt-λB、ρ11、φ1、φ105等噬菌体载体。其中为了使本发明的DNA在大肠杆菌中表达，可优选pBR322、pUC18、Bluescript IISK(+)、λgt-λC以及λgt-λB，另外为了在枯草菌中表达，可优选pUB110、pTZ4、pC194、ρ11、φ1以及φ105。pHV14、TRp7、YEp7以及pBS7在使重组DNA于二种以上宿主内复制时有用。为了将DNA插入到这样的载体，通常采用在该领域中一般的方法。具体来说，首先将含有DNA的基因DNA和可自我复制的载体用制限酶和/或超声波切断，然后将生成的DNA片段和载体片段连接。如果使用特异作用于核苷酸的制限酶、特别是II型制限酶、详细讲，Sau 3AI、Eco RI、HindIII、Bam HI、Sal I、Xba I、Sac I、Pst I等切断基因DNA和载体的切断，容易对DNA片段和载体片段进行连接。根据需要，将两者进行退火后，可以在生物体内或生物体外经DNA连接酶作用。这样得到的重组DNA导入到适当宿主后作为转化体，通过对转化体进行培养，可以无限复制。

这样得到的重组DNA可以导入到以大肠杆菌、枯草菌、放线菌、酵母为首的适当宿主微生物。为了获得转化体，可以运用菌落杂交法，或在含有葡萄糖聚合度在3以上的α-1，4葡聚糖的营养培养基中进行培养，选择由该糖生成环状麦芽糖基麦芽糖的菌体。

在培养含有具有本发明的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶产生能力的转化体的微生物中使用的培养基只要是微生物能够繁殖、可以产生环状麦芽糖基麦芽糖合成酶的营养培养基就可以，无论是合成培养基，还是天然培养基都可以。作为碳源只要是微生物在繁殖中可利用的物质都可以，例如，来自植物的淀粉或植物糖原、来自动物或微生物的糖原或支链淀粉，这些物质的部分分解物或葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、糖蜜等糖，另外也可以使用柠檬酸、琥珀酸等有机酸。培养基中的这些碳源的浓度可以根据碳源的种类适当选择。作为氮源，例如，可以适当使用铵盐、硝酸盐等无机氮化合物以及，例如，尿素、玉米浆、酪蛋白、胨、酵母提取物、肉汁等含有机氮物。此外，作为无机成分，例如可以适当使用钙盐、镁盐、钾盐、钠盐、磷酸盐、锰盐、锌盐、铁盐、铜盐、钼盐、钴盐等盐类。另外根据需要也可以适当使用氨基酸、维生素等。

培养通常从在温度15至37℃、pH5.5至10的范围、优选温度20至34℃、pH5.5至8.5的范围中选出的条件下，进行好氧培养。培养时间只要是该微生物可增殖的时间就可以，优选10小时至150小时。另外对于培养条件中培养液的溶氧浓度没有特别限制，通常0.5至20ppm比较好。为了进行培养可以适当采用调节通气量，进行搅拌等手段。另外培养方式无论是分批培养还是连续培养，哪一种都可以。

通过上述那样操作对具有环状麦芽糖基麦芽糖合成酶产生能力的微生物进行培养后，对含有本发明的酶的培养物进行回收。环状麦芽糖基麦芽糖合成酶活性在所培养的微生物为球形节杆菌M6(FERMBP-8448)时，主要在培养物的除菌液中确认，可以将除菌液作为粗酶液采取，也可以将培养物全体用作粗酶液。为了从培养物中除去菌体，可以采用常规方法的固液分离法。例如，可以适当采用对培养物本身进行离心分离的方法、或使用多孔质滤层过滤机等进行过滤分离的方法、通过平膜、中空丝膜等膜过滤进行分离的方法等。虽然可以将除菌液直接作为粗酶液使用，但一般都是浓缩后使用。作为浓缩法，可以采用硫铵盐析法、丙酮和醇沉淀法、使用平膜、中空膜等膜浓缩法等。

另外使用具有环状麦芽糖基麦芽糖合成酶活性的除菌液及其浓缩液，也可以将环状麦芽糖基麦芽糖合成酶通过在该领域中常用的适当方法进行固定化。例如，可以适当采用对离子交换体的结合法、与树脂及膜等的共价结合法-吸附法、使用高分子物质的包埋法等。

象上述那样，本发明的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶可以直接使用粗酶液或浓缩后使用，根据需要，也可以通过该领域中常用的适当的方法再进行分离、纯化后利用。例如，培养液的上清或粉碎处理物进行硫铵盐析、对浓缩的酶标准品透析后、通过使用DEAE-Toyopearl650S树脂的阴离子交换柱层析、接下来使用Phenyl-Toyopearl 650M树脂的疏水层析进行纯化，可以得到作为在电泳后表现出单一带的纯化酶的本发明的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶。

对于环状麦芽糖基麦芽糖合成酶为重组型酶时，因宿主种类不同有时酶会在菌体内蓄积。这种情况下，也可以直接使用菌体或培养物，通常在使用之前，根据需要，也可适当地实施通过浸透压冲击或表面活性剂从菌体提取后，通过超声波或细胞壁溶解酶破碎菌体，通过过滤、离心分离等将重组型酶从菌体或菌体破碎物分离后使用。

象上述那样得到的本发明环状麦芽糖基麦芽糖合成酶作用于葡萄糖聚合度3以上的α-1，4葡聚糖，可以生成具有环{→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}结构的环状麦芽糖基麦芽糖。本酶作用于葡萄糖聚合度3以上的α-1，4葡聚糖，推测通过在分子间进行α-麦芽糖基转移反应，可生成在非还原性末端葡萄糖的6位结合了α-麦芽糖基残基的6-α-麦芽糖基-α-1，4葡聚糖，通过对该葡聚糖进行环化，可以生成具有环{→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}结构的环状麦芽糖基麦芽糖。本发明的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶具体来说往往具有下述理化性质。

(1)分子量

通过SDS-凝胶电泳法测得72000±20000道尔顿。

(2)等电点

通过含有两性电解质的等电点电泳法测得pI3.6±0.5。

(3)最适温度

在pH6.0、反应30分钟的条件下，最适温度范围在50℃至55℃。

(4)最适pH

在40℃、反应30分钟的条件下，最适pH范围在pH5.5至6.5。

(5)温度稳定性

在pH6.0、保持60分钟的条件下，至30℃稳定。

在1mM钙离子存在下，至50℃稳定。

(6)pH稳定性

在4℃、保持24小时的条件下，在pH5.0至9.0稳定。

(7)N末端氨基酸序列

具有序列表中序列编号1所示氨基酸序列、即天冬氨酸-脯氨酸-苏氨酸-苏氨酸-丝氨酸的氨基酸序列。

作为本发明环状麦芽糖基麦芽糖合成酶底物的葡萄糖聚合度3以上的α-1，4葡聚糖，如淀粉、直链淀粉、支链淀粉、糖原等，以及用淀粉酶或酸等对它们进行部分水解后得到的淀粉糊精、麦芽糖糊精、麦芽低聚糖等部分分解物。作为用淀粉酶分解的部分分解物，例如，可以使用用Handbook of Amylases and Related Enzymes(1988年)Pergamon Press公司(东京)所报道的α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、麦芽四糖生成淀粉酶(EC 3.2.1.60)、麦芽五糖生成淀粉酶、麦芽六糖生成淀粉酶(EC 3.2.1.98)等淀粉酶将淀粉、直链淀粉、支链淀粉、糖原等分解后得到的部分分解物。另外，在制备部分分解物时，也可任选使用支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)、异淀粉酶(EC 3.2.1.68)等淀粉去分枝酶进行作用。

作为底物的淀粉，例如，可以是来自玉米、小麦、米等地上淀粉，也可以是来自马铃薯、甘薯、木薯等地下淀粉，最好是将淀粉做成糊化和/或液化的溶液使用。由于该淀粉的部分分解的程度越低，环状麦芽糖基麦芽糖生成率越高，DE约20以下、优选约12以下、更优选约5以下的部分分解物合适。而本说明书中所谓的环状麦芽糖基麦芽糖生成率指的是用公式：环状麦芽糖基麦芽糖生成率(％)＝{(生成的环状麦芽糖基麦芽糖的质量)/(反应液中的全糖的质量)}×100算出的值。

在使本发明的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶作用于底物时，该底物浓度没有特别限定，例如，即使在使用底物浓度0.1％(w/v)的比较低浓度的溶液的情况下，进行本发明的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶反应也可生成环状麦芽糖基麦芽糖。工业上底物浓度在1％(w/v)以上合适，在这样的条件下，有利生成环状麦芽糖基麦芽糖。而作为底物溶液，即使是含有不能完全溶解的不溶性底物的高浓度底物溶液也可以。反应温度可以在反应进行的温度、即直至60℃附近进行。优选使用30至50℃附近的温度。反应pH通常调整到5至9范围、优选pH5至7范围。酶的使用量和反应时间关系密切，可以通过目的酶反应的进行适当选择。

例如，通过使本发明的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶作用于底物浓度1％(w/v)的淀粉或其部分分解物或直链淀粉的水溶液，可以由淀粉或其部分分解物以约30％以上、由直链淀粉以约44％的高的环状麦芽糖基麦芽糖生成率得到本发明的环状麦芽糖基麦芽糖。通过该环状麦芽糖基麦芽糖合成酶生成环状麦芽糖基麦芽糖的生成机制推测如下。

1)本酶作用于作为底物的葡萄糖聚合度为3以上的α-1，4葡聚糖，催化该非还原性末端的麦芽糖基残基转移到另外的分子的非还原性末端葡萄糖残基的6位羟基的分子间的6-α-麦芽糖基转移，生成在非还原末端具有6-α-麦芽糖基的葡萄糖聚合度增加2的6-α-麦芽糖基-α-1，4葡聚糖以及葡萄糖聚合度减少2的α-1，4葡聚糖。

2)本酶另外作用于6-α-麦芽糖基-α-1，4葡聚糖，催化环化反应，生成具有环{→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}结构的环状麦芽糖基麦芽糖以及由6-α-麦芽糖基-α-1，4葡聚糖出发计算，葡萄糖聚合度减少4的α-1，4葡聚糖。

3)有1)以及2)中新生成的α-1，4葡聚糖再度进行1)至2)的反应，据此生成环状麦芽糖基麦芽糖。

另外，该环状麦芽糖基麦芽糖生成反应时，也可同时并用其它的酶，有利于使环状麦芽糖基麦芽糖生成率提高。例如，也可通过同时并用环状麦芽糖基麦芽糖合成酶和异淀粉酶等淀粉去分枝酶，使它们作用于淀粉可以有利于进一步使环状麦芽糖基麦芽糖的生成率提高。

通过上述反应得到的反应液也可以直接作为环状麦芽糖基麦芽糖含有糖液使用。另外根据需要，使从α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶以及α-糖苷酶中选择的1种或2种以上酶作用于环状麦芽糖基麦芽糖含有糖液，也可以作为对夹杂的寡糖进行水解的环状麦芽糖基麦芽糖含有糖液使用。一般来说，环状麦芽糖基麦芽糖含有糖液可以进一步精制后使用。作为精制方法，可以适当采用糖精制中使用的通常方法，例如，适当采用通过活性碳进行脱色、通过H型、OH型离子交换树脂的脱盐、通过离子交换柱层析、活性碳柱层析、硅胶柱层析等柱层析的分级、通过醇和丙酮等有机溶剂的分级、通过具有适度分离性能的膜进行分离、以及通过不能利用环状麦芽糖基麦芽糖的可对夹杂糖消化吸收、分解的微生物、例如酵母等进行发酵处理或通过碱处理等对残存的还原性糖进行分解除去等1种或2种以上的精制方法。

特别是作为工业大量生产方法，采用离子交换柱层析合适，例如，通过使用特开昭58-23799号公报、特开昭58-72598号公报等报道的强酸性阳离子交换树脂的柱层析除去夹杂糖，可以有利于制造使目的物含量提高的环状麦芽糖基麦芽糖、或含有该糖的糖类。此时可任选采用固定床方式、移动床方式、模拟移动床方式中的任一种方式。

含有通过这样操作得到的环状麦芽糖基麦芽糖的水溶液、或使其含量提高的糖水溶液通常是每单位固形物含有10质量％以上、最好是40质量％以上环状麦芽糖基麦芽糖的糖水溶液，通常对其进行浓缩，做成糖浆状制品。该糖浆状制品也可以随意再进行干燥做成粉末状制品。

为了制造环状麦芽糖基麦芽糖的结晶，例如，将每单位固形物的环状麦芽糖基麦芽糖纯度约50％以上、浓度约5至90质量％的环状麦芽糖基麦芽糖含有液放到助晶罐，在每单位固形物0.1至20质量％的种晶共存下，于温度95℃以下、优选10至90℃范围下，边搅拌边慢慢冷却，制造含有环状麦芽糖基麦芽糖结晶的结晶浆液。作为由结晶浆液制造环状麦芽糖基麦芽糖结晶的方法，如分蜜，另外作为制造环状麦芽糖基麦芽糖的含蜜结晶的方法，例如，块粉碎、流动造粒、喷雾干燥等众所周知的方法。这样制造的本发明的环状麦芽糖基麦芽糖结晶或含蜜结晶为上品，而且是具有低甜味的非还原性白色粉末，是稳定的糖，即使是与其它原料、特别是氨基酸、寡肽、蛋白质等含有氨基酸的物质进行混合、加工，也不褐变，也不产生异臭，对混合的其它原料损害也少。

另外由于本发明的环状麦芽糖基麦芽糖具有包合能力，可防止包合的香气成分、有效成分等挥散、品质劣化，所以可非常稳定地保持香气成分、有效成分。此时根据需要，也可有利实施通过并用环糊精类、支化环糊精类，本申请人在专利文献国际公开WO01/90338A1号说明书、国际公开WO02/055708A1号说明书、国际公开WO02/40659A1号说明书中公开的具有环{→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}结构的环状四糖、分岐环状四糖类、环糊精类、环果聚糖类等其它环状糖，通过包合能力强化稳定性。作为环糊精类等环状糖，不必限定于高纯度的糖，也可以有效利用低纯度的环状糖，例如，大量的麦芽糖糊精以及含有各种环状糖的淀粉部分分解物等。

另外，本发明的环状麦芽糖基麦芽糖由于实质上不能被淀粉酶或α-糖苷酶分解，所以即使经口摄取也不能被消化吸收，另外难于被肠内细菌发酵，作为极低热量的糖，可以作为水溶性食物纤维样物质利用。本发明的环状麦芽糖基麦芽糖为粉末制品时，其本身的吸湿性低，不仅难于付着、固结，而且也可以防止与其它粉末混合后得到的粉末状物的付着、固结。另外环状麦芽糖基麦芽糖本身是无毒、无害的新的甜味料。

另外本发明的环状麦芽糖基麦芽糖由于是稳定的甜味料，在制作结晶制品时，也可与支链淀粉、羟乙基淀粉、聚乙烯基吡咯烷酮等结合剂并用，作为片剂或糖衣片利用。另外，具备浸透压调节性、赋形性、增光性、保湿性、粘性、防止其它糖的结晶性、难发酵性等性质。

因此，本发明的环状麦芽糖基麦芽糖、或含有该糖的糖类作为甜味料、呈味改良剂、品质改良剂、稳定剂、变色防止剂、赋形剂等，在饮食物、嗜好物、饲料、饵料、化妆品、医药品等各种组成物中有效利用。

本发明的环状麦芽糖基麦芽糖、或含有该糖的糖类以直接作为用于赋与甜味的调味料使用。如果需要，也可以与例如：粉饴、葡萄糖、异构化糖、砂糖、麦芽糖、海藻糖、蜂蜜、枫糖、山梨糖醇、麦芽糖醇、二氢查尔酮、蛇菊甙、α-葡糖基蛇菊甙、罗汉果甜味物、甘草甜、奇(异果)甜蛋白、蔗糖、L-天冬氨酰苯丙氨酸甲酯、糖精、甘氨酸、丙氨酸等那样的其它甜味料，以及与糊精、淀粉、乳糖等那样的增量剂混合使用。

另外，本发明的环状麦芽糖基麦芽糖、或含有该糖的糖类的粉末状制品可直接、或根据需要随意与增量剂、赋形剂、结合剂等混合后，做成颗粒、球状、短棒状、板状、立方体、片剂等各种形状后使用。

本发明的环状麦芽糖基麦芽糖、或含有该糖的糖类的甜味可以与具有酸味、咸味、涩味、鲜味、苦味等其它呈味的各种物质充分调和，由于耐酸性、耐热性都大，所以可以有效利用在一般饮食物的赋与甜味、呈味改良或品质改良等中。

例如，在作为酱油、粉末酱油、豆酱、粉末豆酱、未过滤的酱油、酱菜、日式料酒、蛋黄酱、调味汁、食醋、三杯醋、粉末醋饭团、中餐基料、天麸罗汁、面卤、调味汁、番茄酱、烧肉的佐料汁、咖喱卤、焖炖菜的佐料、汤的佐料、海味煎出的佐料、复合调味料、蜜柑、日式佐料酒、餐用糖、咖啡糖等各种调味料的甜味料、以及呈味改良剂、品质改良剂等使用也可有利实施。另外在例如日式米饼、糯米点心、加糖点心、皮糖样点心、饼类、馒头、米粉糕、馅类、羊羹、水羊羹、锦玉、果冻、蛋糕、圆糖等各种日本点心，面包、饼干、椒盐饼干、小糖饼、西式馅饼、布丁、奶油冰淇淋、蛋奶羹、奶油泡芙、华夫饼干、松糕、油炸饼、巧克力、口香糖、焦糖、果仁奶糖、糖果等各种西式点心，冰淇淋、雪糕等冰点心，果实的果子露汁，冰蜜等的糖浆类，花酱、花生酱、水果糊等糊类，果酱、桔子果酱、果脯、糖果等果实、野菜的加工食品类，什锦酱菜、暴腌的甜面罗卜、千层咸菜、腌野韭菜等腌物类，腌罗卜的佐料、腌白菜的佐料等腌物的佐料、火腿、香肠等畜肉制品类、鱼肉火腿、鱼肉香肠、鱼糕、筒状鱼卷、炸虾(鱼)等鱼肉制品，海胆、咸墨斗鱼、醋海带、干鱿鱼丝、河豚的浸日式料酒风干、大头鱼、加级鱼、虾等的鱼松等各种海珍类，用海苔、山菜、墨鱼干、小鱼、贝等制造的用调料煮的鱼类，煮豆、土豆色拉、海带卷等家常菜食品，乳制品、鱼肉、畜肉、果实、蔬菜的瓶装、罐头类，合成酒、酿造酒、清酒、果实酒、发泡酒、啤酒等酒类、咖啡、可可、果汁、炭酸饮料、乳酸饮料、乳酸菌饮料等清凉饮料水，什锦布丁、什锦热点心、速成的果汁、速成的咖啡、速成的粘糕小豆汤、速成的汤等速成食品，以及离乳食、治疗食、饮剂、肽食品、冷冻食品等各种饮食物的赋与甜味、呈味改良、品质改良等中也可以有利施用。

另外，使用于家畜、家禽、以及蜜蜂、蚕、鱼等饲育动物的饲料、饵料等的以嗜好性提高为目的，也可以使用。此外，作为向香烟、牙膏、口红、唇膏、内服液、片剂、口含片、肝油滴液、口中清凉剂、口中香剂、漱口剂等各种固形物、糊状、液状等中嗜好物、化妆品、医药品等各种组成物添加的甜味剂，或作为呈味改良剂、矫味剂，以及作为品质改良剂、稳定剂等有效利用。

作为品质改良剂、稳定剂，在含有有效成分、活性等易丧失的各种生理活性物质或含有这些成分的健康食品、功能性食品、医药品等中有利运用。例如，干扰素-α、-β、-γ、肿瘤坏死因子-α、-β、巨噬细胞游走抑制因子、菌落刺激因子、转移因子、白介素II等淋巴因子含有液、胰岛素、成长激素、催乳激素、促红细胞生成素、卵细胞刺激激素等激素含有液、BCG疫苗、日本脑炎疫苗、麻疹疫苗、小儿麻痹疫苗、痘苗、破伤风类毒素、眼镜蛇抗毒素、人免疫球蛋白等生物制剂含有液、青霉素、红霉素、氯霉素、四环素、链霉素、硫酸卡那霉素等抗生素含有液、硫胺素、核黄素、L-抗坏血酸、肝油、类胡萝卜素、麦角固醇、生育酚等维生素含有液、EPA、DHA、花生四烯酸等高度不饱和脂肪酸或其酯衍生物、含有脂肪酶、酯酶、尿激酶、蛋白酶、β-淀粉酶、异淀粉酶、葡聚糖酶、乳糖酶等的含酶液、药用人参提取物、甲鱼提取物、小球藻提取物、芦荟提取物、蜂胶提取物等提取物类、病毒、乳酸菌、酵母等活菌糊、蜂乳等各种生理活性物质都不丧失其有效成分、活性，而且稳定、高品质的液状、糊状或固状健康食品、功能性食品和医药品等可以容易地制造。

作为使上述那样的各种组成物中含有环状麦芽糖基麦芽糖、或含有该糖的糖类的方法，包括直至其制品完成为止的工序，例如，可以适当选择混和、混捏、溶解、融解、浸渍、浸透、散布、涂布、被覆、喷雾、注入、晶析、固化等众所周知的方法。其量通常含有0.1质量％以上、优选1质量％以上为好。

以下、通过实验对本发明进行详细说明。

<实验1：非还原性糖的制备>

将由淀粉部分分解物(商品名パインデックス#4、松谷化学工业株式会社制造)1.5w/v％、酵母提取物(商品名聚胨、日本制药株式会社制造)0.5w/v％、酵母提取物(商品名酵母提取物S、日本制药株式会社制造)0.1w/v％、磷酸氢二钾0.1w/v％、磷酸钠二水和物0.06w/v％、硫酸镁七水和物0.05w/v％、碳酸钙0.3w/v％以及水构成的液体培养基加入到12个500ml容量的三角烧瓶中，每个烧瓶100ml，用高压灭菌器于121℃、进行20分钟灭菌，冷却。然后接种球形节杆菌M6(FERM BP-8448)，于27℃、用230rpm进行120小时旋转振荡培养。培养后、将培养液通过离心分离(8,000rpm、20分钟)除去菌体，得到培养上清(约1.1L)。将得到的1L培养上清用作酶液，将该酶液添加到含有2w/v％可溶性淀粉以及2mM氯化钙的1L 50mM醋酸缓冲液中，于40℃下反应24小时后、通过于约100℃下热处理10分钟停止反应。

为了研究得到的反应物中的糖，作为展开溶剂使用n-丁醇、吡啶、水混液(容量比6∶4∶1)，薄层板使用Merk公司生产的キ一ゼルゲル60(铝板、10×20cm)，进行2次展开的硅胶薄层层析(以下、略为TLC)，分离糖。通过硫酸-甲醇法使其显色，对分离的糖进行检测，除了葡萄糖(Rg值为1.00)、麦芽糖(Rg值为0.82)之外，还检测到Rg值为约0.44的糖以及Rg值为约0.21的糖。这些糖被认为是球形节杆菌M6的培养上清中的酶作用于可溶性淀粉生成的糖。而这里所说的Rg值表示的是TLC中葡萄糖的移动距离与溶质的移动距离的比值，可通过公式Rg值＝(溶质从原点出发移动的距离)/(葡萄糖离开从原点出发移动的距离)算出。

然后将上述反应物用盐酸调整到pH5.0后，按照1克固形物添加4000单位的α-糖苷酶(商品名：转糖苷酶L“Amano”、Amano Enzyme株式会社制造)和按照1克固形物添加250单位葡萄糖淀粉酶(Nagase生化学工业株式会社销售)，于50℃下使其反应16小时。反应后、在约100℃下进行10分钟热处理，使反应停止。当对得到的反应液中的糖用TLC进行分析时，只检测到葡萄糖以及Rg值约0.44的糖，而麦芽糖、Rg值约0.21的糖都没有检测到。由这些结果判明虽然麦芽糖以及Rg值约0.21的糖被α-糖苷酶和葡萄糖淀粉酶分解为葡萄糖，但Rg值约0.44的糖没有被这些酶分解。

接下来向上述反应液添加氢氧化钠，将pH调整到12，通过于98℃下保持1小时，分解还原糖。将不溶物过滤除去后，使用三菱化学制造的离子交换树脂Diaion SK-1B和Diaion WA30以及Organo制造的阴离子交换树脂IRA411进行脱色、脱盐，精密过滤后，用蒸发器浓缩，进行真空干燥，得到固形物约4.0g的糖粉末。

用高效液相层析法(以下、略称为HPLC。)研究得到的糖的组成，就像图1所示的那样，可知在洗脱时间10.61分外检测到峰，纯度在97％以上，纯度极高。HPLC在使用“Shodex SUGAR KS-801”为柱(昭和电工株式会社制造)，洗脱液使用水，柱温度60℃、流速0.5ml/分的条件下进行，检测使用差示折射计RI-8012东洋曹达株式会社制造)进行。

得到的糖的还原能力用Somogyi糖定量法进行测定，其还原能力在检测界限以下，本标准品被判断为实质上是非还原性糖。

<实验2：非还原性糖的结构解析>

<实验2-1：质量分析>

对于通过实验1方法得到的非还原性糖，使用质量分析装置“LCQAdvantage”(Thermoelectron公司制造)进行质量分析时，显著地检测到质量数671的带有钠分子的离子，判明本发明的非还原性糖的质量数为648。

<实验2-2：构成糖分析>

对于通过实验1方法得到的非还原性糖按照常规方法使用硫酸一直水解到单糖，用气相色谱法研究构成糖时，只检测到D-葡萄糖，判明本发明的非还原性糖的构成糖是D-葡萄糖。考虑到上述的质量数，可知本发明的非还原性糖是由4分子D-葡萄糖构成的环状糖。

<实验2-3：甲基化分析>

对于通过实验1方法得到的非还原性糖，按照常规方法进行甲基化分析，用气相色谱法研究甲基化物。结果总结在表1中。

[表1]

分析甲基化物的种类	比率
分析甲基化物的种类	比率	2，3，4-三甲基化物	1.03
2，3，6-三甲基化物	1.00	2，3，4-三甲基化物	1.03

就像表1结果所表明的那样，由于2，3，4-三甲基化物和2，3，6-三甲基化物几乎等量，判明构成本发明的非还原性糖的4分子D-葡萄糖中，2分子在1位和6位通过糖苷键结合，而其它2分子在1位和4位通过糖苷键结合。

<实验2-4：核磁共振分析>

对于通过实验1方法得到的非还原性糖，按照常规方法进行核磁共振(NMR)分析。¹H-NMR谱如图2所示，¹³C-NMR谱如图3所示た。由实验2-1以及2-2的结果判明本非还原性糖质是由4分子葡萄糖构成的糖，而在¹³C-NMR谱中只确认12条碳信号，判明本非还原性糖质是具有对称结构的环状四糖。而在¹H-NMR谱的约4.93ppm的信号以及约5.26ppm的信号归属为D-葡萄糖残基的1位质子，求其自旋-自旋结合常数，为约3.309Hz(约4.93ppm的信号)以及约3.677Hz(约5.26ppm的信号)，所以可判明1，4糖苷键结合的D-葡萄糖残基的1位的异头物构型以及1，6糖苷键结合的D-葡萄糖残基的1位的异头物构型两方都为α型。

由以上结果判明本发明的非还原性糖质是图4所示的环状麦芽糖基麦芽糖、即具有环{→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}结构的环状四糖。具有该结构的糖到目前为止尚且完全未知，所以本发明的环状麦芽糖基麦芽糖是新的环状糖。

<实验3：环状麦芽糖基麦芽糖合成酶的生产>

将实验1所述的液体培养基装入到2个500ml容量的三角烧瓶中，每瓶100ml，用高压灭菌器在121℃下进行20分钟灭菌，冷却后接种球形节杆菌M6(FERM BP-8448)，于27℃下用230rpm进行48小时旋转振荡培养，以之作为种子培养。

将与种子培养同样组成的液体培养基约20L加入到容量30L的发酵罐中，加热灭菌、冷却到温度27℃后、接种种种培养液约200ml，于温度27℃下持续保持pH5.5至8.0，进行96小时通气搅拌培养。培养后将培养液从发酵罐取出，离心分离(8000rpm，20分钟)除去菌体，得到培养上清约18L。对于培养液和培养上清测定环状麦芽糖基麦芽糖合成酶活性，可知在培养液中含有该酶活性约0.028单位/ml，在上清中含有该酶活性约0.026单位/ml，判明通过球形节杆菌M6生产的本发明的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶其大部分存在于菌体外。

<实验4：环状麦芽糖基麦芽糖合成酶的纯化>

向实验3中得到的培养上清中的约9.2L(总活性约240单位)添加最终浓度为60％饱和硫铵，通过在4℃下放置24小时进行盐析。生成的盐析沉淀物通过离心分离(11000rpm，30分钟)回收，然后将该沉淀物溶解于10mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.5)后，对同一缓冲液进行透析，得到粗酶液约240ml。粗酶液中的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶活性约0.83单位/ml(总活性约200单位)。将该粗酶液供给到通过使用东曹株式会社制的DEAE-Toyopearl 650S凝胶的阴离子交换层析(凝胶容量100ml)进行分离。环状麦芽糖基麦芽糖合成酶活性吸附于用10mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.5)平衡的DEAE-Toyopearl650S凝胶，在用食盐浓度0M至0.4M的线性梯度洗脱时，在食盐浓度约0.22M付近洗脱。回收该活性级分，按照终浓度1M那样添加硫铵，于4℃下放置24小时后，通过离心分离除去不溶物，通过供给到使用东曹株式会社制造的Pheny1-Toyopearl 650M凝胶的疏水层析(凝胶容量10ml)进行分离。本发明的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶活性吸附于用含有1M硫铵的20mM醋酸缓冲液(pH6.0)平衡的Pheny1-Toyopearl 650M凝胶上，用硫铵浓度1M至0M的线性梯度洗脱时，在硫铵浓度约0.1M付近洗脱。表2给出了纯化的各步骤中的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶活性量、环状麦芽糖基麦芽糖合成酶比活性以及收率。

[表2]

工序	环状麦芽糖基麦芽糖合成酶(单位)	环状麦芽糖基麦芽糖合成酶比活性(单位/mg蛋白)	收率(％)
工序	环状麦芽糖基麦芽糖合成酶(单位)	环状麦芽糖基麦芽糖合成酶比活性(单位/mg蛋白)	收率(％)	培养上清	240	0.13	100
硫铵盐析后的透析液	200	0.66	83	培养上清	240	0.13	100
硫铵盐析后的透析液	200	0.66	83	离子交换柱洗脱液	140	7.3	58
疏水柱洗脱液	96	10	40	离子交换柱洗脱液	140	7.3	58

将疏水层析后纯化的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶标准品通过5至20w/v％浓度梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定酶标准品的纯度，蛋白带单一，是纯度高的标准品。

<实验5：环状麦芽糖基麦芽糖合成酶的性质>

<实验5-1：分子量>

将以实验4方法得到的精制环状麦芽糖基麦芽糖合成酶标准品通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(5乃至20w/v％浓度梯度)与同时电泳的分子量标准(日本Bio-Rad Laboratories公司)进行比较，测定分子量，判明本发明的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶的分子量为72000±20000道尔顿。

<实验5-2：等电点>

将通过实验4方法得到的纯化环状麦芽糖基麦芽糖合成酶标准品供给含有2.2w/v％两性电解质(Amersham Biosciences公司制)的等电点聚丙烯酰胺凝胶电泳法，与同时电泳的等电点标准(AmershamBiosciences公司制)进行比较求等电点，判明本发明的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶的等电点为pI3.6±0.5。

<实验5-3：酶反应的最适温度以及最适pH>

使用通过实验4方法得到的纯化环状麦芽糖基麦芽糖合成酶标准品，在本酶的活性测定法中分别使温度、pH变化，测定温度、pH对酶活性的影响。这些结果如图5(最适温度)、图6(最适pH)所示。本发明的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶的最适温度在pH6.0、30分钟反应的条件下为50至55℃，最适pH在40℃、30分钟反应的条件下为5.5至6.5。

<实验5-4：酶的温度稳定性以及pH稳定性>

使用通过实验4方法得到的纯化环状麦芽糖基麦芽糖合成酶标准品，研究本酶的温度稳定性以及pH稳定性。温度稳定性是通过将酶溶液(10mM醋酸缓冲液、pH6.0)在不存在氯化钙或存在1mM条件下于各个温度保持60分钟，水冷后测定残存的酶活性求得的。pH稳定性是通过将本酶在各pH 100mM缓冲液中于4℃下保持24小时后，将pH调整到6.0，测定残存的酶活性求得的。这些结果如第7图(温度稳定性)、第8图(pH稳定性)所示。就像图7表明的那样，判明本发明的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶的温度稳定性在没有氯化钙存在下在30℃之前稳定，在1mM氯化钙存在下一直到50℃仍然稳定，可知钙离子可提高本酶的温度稳定性。另外就像图8表明的那样，本发明的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶的pH稳定性处于pH5.0至9.0范围。

<实验5-5：金属盐对酶活性的影响>

使用通过实验4方法得到的纯化环状麦芽糖基麦芽糖合成酶标准品，在浓度1mM的各种金属盐存在下，根据活性测定的方法研究金属盐对酶活性的影响。结果如表3所示。

表3

金属盐	相对活性(％)	金属盐	相对活性(％)
金属盐	相对活性(％)	金属盐	相对活性(％)	无添加	100	NiCl₂	90
MgCl₂	98	CuCl₂	1	无添加	100	NiCl₂	90
MgCl₂	98	CuCl₂	1	AlCl₃	13	ZnCl₂	73
CaCl₂	99	SrCl₂	90	AlCl₃	13	ZnCl₂	73
CaCl₂	99	SrCl₂	90	MnCl₂	97	BaCl₂	90
FeCl₂	95	HgCl₂	2	MnCl₂	97	BaCl₂	90
FeCl₂	95	HgCl₂	2	FeCl₃	32	PbCl₂	36
CoCl₂	95	EDTA	25	FeCl₃	32	PbCl₂	36

就像3的结果表明的那样，判明本发明的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶活性受Cu2+以及Hg2+离子显著抑制，也受Al³⁺、Fe³⁺和Pb²⁺离子抑制。另外判明也受金属离子螯合剂EDTA的抑制。

<实验5-6：N末端氨基酸序列>

使用通过实验4方法得到的纯化环状麦芽糖基麦芽糖合成酶标准品，使用蛋白质测序仪型号492HT(Applied Biosystems公司制)分析本酶的N末端氨基酸序，判明了序列表中序列编号1表示的氨基酸序列、即具有天冬氨酸-脯氨酸-苏氨酸-苏氨酸-丝氨酸的N末端氨基酸序列。

<实验5-7：部分氨基酸序列>

取适量通过实验4方法得到的纯化环状麦芽糖基麦芽糖合成酶标准品，对10mM Tris-盐酸缓冲液(pH9.0)在4℃下透析18小时后，加同一缓冲液，将蛋白浓度调整到约1mg/ml。取约1ml该溶液，加赖氨酰内肽酶(和光纯药株式会社销售)20μg，于30℃下保持16小时，对酶蛋白进行水解。将水解物注入到预先用含有8％(v/v)乙腈的0.1％(v/v)三氟乙酸平衡的HPLC用柱(商品名：マイクロボンダパックC18、直径3.9mm×长150mm、Waters公司生产)，在流速0.9ml/分钟、室温的条件下，用0.1％(v/v)三氟乙酸-8％(v/v)乙腈溶液至0.1％(v/v)三氟乙酸-40％(v/v)乙腈溶液的120分钟线性梯度洗脱，对肽段进行分级。从柱上洗脱的肽段通过测定波长210nm的吸光度进行检测。对在通液开始后约12分、约18分、约20分、约36分、约39分和约66分时洗脱的6种肽段的氨基酸序列分别用与实验5-6同样的方法进行分析，结果其分别具有序列表中序列编号4至9所示的氨基酸序列。

<实验6：编码环状麦芽糖基麦芽糖合成酶的DNA的克隆以及含有该DNA的重组DNA和转化体的制备>

从球形节杆菌M6(FERM BP-8448)克隆编码环状麦芽糖基麦芽糖合成酶的DNA，制作可自我复制的重组DNA、确定编码酶的DNA的碱基序列、以及进行转化体的制备。

<实验6-1：染色体DNA的制备>

将由淀粉部分分解物(商品名：パインデックス#4、松谷化学工业株式会社制造)2.0w/v％、酵母提取物(商品名：アサヒミ一スト、アサヒフ一ドアンドヘルスケア株式会社销售)1.0w/v％、磷酸氢二钾0.1w/v％、磷酸二氢钠十二水盐0.06w/v％、硫酸镁七水盐0.05w/v％以及水构成的液体培养基加入到500ml容量的三角烧瓶中，每个烧瓶100ml，用高压灭菌器于121℃、进行20分钟灭菌，冷却。然后接种球形节杆菌M6(FERM BP-8448)，于27℃、用230rpm进行24小时旋转振荡培养。

将通过离心分离从培养物采集的菌体悬浮于TES缓冲液(pH8.0)中，加0.05％(w/v)溶菌酶，于37℃下温育30分钟。将处理物于-80℃下冷冻1小时后，加TSS缓冲液(pH9.0)，加温到60℃，加TES缓冲液/酚混合液，于冰水中边冷却，边激烈振荡5分钟后，通过离心分离收集上清。向该上清加2倍容量的冷乙醇，收集沉淀的粗染色体DNA，溶解于SSC缓冲液(pH7.1)后，分别加7.5μg和125μg的核糖核酸酶以及蛋白酶，于37℃下保持1小时，使其反应。向反应物中加氯仿/异戊醇混合液，提取染色体DNA，加冷乙醇，收集含有生成的染色体DNA的沉淀。将上述得到的精制染色体DNA按照浓度约1mg/ml那样溶解于SSC缓冲液(pH7.1)中，在-80℃下冷冻。

<实验6-2：重组DNApBMB 1和转化体BMB1的制备>

取0.1ml实验6-1制备的纯化染色体DNA溶液，向该溶液中加约100单位制限酶BamHI，于37℃下反应1小时，对染色体DNA进行水解后，通过琼脂糖凝胶电泳法获得由约3000至6000碱基对构成的DNA片段。另外，按照常规方法，使制限酶BamHI作用于质粒载体(Stratagene·cloning·system制、注册商标：Bluescript II SK(+))，将载体完全切断后使用市售的试剂盒(宝酒造制、商品名：DNA连接试剂盒)按照附带的说明书进行操作，将切断的质粒载体0.5μg与先前得到的DNA片段约5μg连接。使用得到的重组DNA，通过通常的感受态细胞法对感受态细胞(商品名：Epicurian ColiXL2-Blue、Stratagene·cloning·system制)100μl进行转化，制作基因文库。

将作为上述那样得到的基因文库的转化体接种于通过常规方法制备的含有10g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物、5g/l氯化钠、100mg/l氨苄青霉素钠盐、50mg/l的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷的琼脂平板培养基(pH7.0)上，于37℃培养24小时后，将培养基上形成的白色菌落约4000个固定在尼龙膜(商品名：Hybond-N+、Amersham制)上。另外根据在实验5-7方法中说明的序列表中序列编号7所示氨基酸序列中的第4至第13位的氨基酸序列，化学合成具有5′-GACGTSGTSCCSAACCACACSGCSGACTAC-3′所示的碱基序列的寡核苷酸，根据常规方法使用[γ-³²P]ATP以及T4聚核苷酸激酶进行同位素标记，得到作为探针1的合成DNA。运用通常的菌落杂交法，选择先前得到的固定在尼龙膜上的菌落中的表现出与探针1显著结合的菌落，得到5种转化体。

然后根据序列表中序列编号8所示氨基酸序列中的第1至第10位的氨基酸序列，化学合成具有5′-GACTGGGTSGACATGGGSTTCGACGGSATC-3′所示碱基序列的寡核苷酸，与上述同样进行同位素标记，得到作为探针2的合成DNA。通过常规方法从上述5种转化体中提取重组DNA，运用通常的Southern杂交，选择表现出与探针2显著结合的重组DNA，将具有该重组DNA的转化体命名为BMB1。

将该转化体BMB1根据常规方法接种于含有100μg/ml氨苄青霉素钠盐的L-肉汤培养基(pH7.0)，于37℃下进行24小时旋转振荡培养。培养结束后，通过离心分离从培养物中收集菌体，运用通常的碱-SDS法提取重组DNA。通过通常的双脱氧法分析这个重组DNA的碱基序列，该重组DNA含有来自球形节杆菌M6(FERM BP-8448)的带有序列表中序列编号10所示链长4467碱基对的碱基序列的DNA。就像图9所示那样，在这个重组DNA中，该DNA连接在被制限酶BamHI识别部位的下游。另外，由该碱基序列推定的氨基酸序列就像并记在那个序列编号10那样，该氨基酸序列与用实验5-6的方法确认的本发明的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶的N末端氨基酸序列以及用实验5-7的方法阐明的部分氨基酸序列的序列表中序列编号1以及序列编号4至9所示氨基酸序列进行比较，序列表中序列编号1所示氨基酸序列与并记在序列表中序列编号10的氨基酸序列中的第41至第45位的氨基酸序列完全一致。而序列表中序列编号4、5、6、7、8以及9所示氨基酸序列分别与并记在序列表中序列编号10所示碱基序列的氨基酸序列中的第418至第426位、第405至第417位、第323至第332位、第164至第190位、第241至265位和第333至第362位的氨基酸序列完全一致。以上事实表明本发明的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶是含有序列表中序列编号2所示氨基酸序列的酶，该酶表示在球形节杆菌M6(FERM BP-8448)中是被序列表中序列编号3所示碱基序列的DNA编码的酶。而并记在序列表中序列编号10中的氨基酸序列的第1至第40位的氨基酸序列推定为该酶的分泌信号配列。由这些事实可以判明该酶分泌前的前体由并记在序列表中序列编号10的氨基酸序列构成，该氨基酸序列由序列表中序列编号10所示碱基序列编码。象以上那样制备的、确认碱基序列的重组DNA被命名为pBMB1。

<实验7：通过转化体生产环状麦芽糖基麦芽糖合成酶>

将由10g/l淀粉部分分解物(商品名：パインデックス#4、松谷化学工业株式会社销售)、20g/l聚胨、20g/l酵母提取物以及1g/l磷酸氢二钠十二水盐和水构成的液体培养基加入到500ml容量的三角烧瓶，每个瓶100ml，用高压灭菌器在121℃下进行20分钟灭菌，冷却后有无菌条件下调整到pH7.0后，在无菌条件下添加氨苄青霉素钠盐10mg，制备液体培养基。在该液体培养基中接种用实验6-2的方法得到的转化体BMB1，于27℃下进行约48小时旋转振荡培养。按照常规方法对得到的培养物进行离心分离，分离为培养上清和菌体，进行回收。对于菌体通过超声波破碎法制备来自细胞的全提取物。超声波破碎法是通过将菌体悬浮于10mM磷酸缓冲液(pH7.0)后，将该菌体悬浊液在冰水中冷却，通过超声波匀浆器(型号UH-600、株式会社SMT制)进行细胞破碎，该破碎物作为全细胞提取物。

对于上述那样制备的培养上清和全细胞提取物，测定各自的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶活性，将各自的活性值按照每1ml培养物换算。另外，作为对照，将大肠杆菌XL2-Blue株在与上述转化体情况的同一条件进行培养，由培养物制备培养上清和全细胞提取物，同样测定环状麦芽糖基麦芽糖合成酶活性。表4给出了这些测定结果。

[表4]

菌株	环状麦芽糖基麦芽糖合成酶活性(单位/ml-培养物)
	环状麦芽糖基麦芽糖合成酶活性(单位/ml-培养物)		培养上清	全细胞提取物
	BMB1(本发明)	0.00	培养上清	全细胞提取物	0.05
E.coli(对照)	BMB1(本发明)	0.00	0.00	0.00	0.05

表中BMBI以及E.coli分别指的是转化体BMB1和大肠杆菌XL2-Blue株。

就像表4的结果所表明的那样，判明转化体BMB1在细胞内产生本发明的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶。在作为宿主对照的大肠杆菌中，培养上清、全细胞提取物任一部分都没有表现出该酶活性。

将用实验7的方法得到的全细胞提取物再按照实验4所示的方法，进行盐析、透析，供给到使用DEAE-Toyopearl 650S凝胶、Phenyl-Toyopearl 650M凝胶的柱层析进行纯化，再根据实验5所示的方法对这个纯化酶标准品进行分析。结果通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测得的分子量约72000±20000道尔顿、通过等电点聚丙烯酰胺凝胶电泳法测得的等电点约3.6±0.5、环状麦芽糖基麦芽糖合成酶活性的最适温度约50至55℃、最适pH约5.5至6.5、温度稳定性在没有氯化钙存在下在30℃之前稳定，而在有1mM氯化钙存在下在约50℃之前稳定，pH稳定性在约5.0至9.0的范围内稳定。这些理化性质与用实验4所示方法制备的酶的性质实质上一致。以上结果表明运用重组DNA技术可以很好地制造本发明的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶，而且酶的产率也有意义提高。

<实验8：对各种糖的作用>

使用各种糖，研究本发明的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶的底物特异性。制备含有麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖、新海藻糖、海藻糖、曲二糖、黑曲霉糖、异麦芽糖、异麦芽三糖、潘糖、异潘糖、麦芽糖醇、麦芽三糖醇、α-、β-或γ-环糊精、直链淀粉、可溶性淀粉、糖原、支链淀粉或糊精的水溶液。向这些底物溶液添加最终浓度20mM醋酸缓冲液(pH6.0)和最终浓度1mM氯化钙后，按照每1克固形物分别加1单位向底物中加通过实验4方法得到的纯化环状麦芽糖基麦芽糖合成酶标准品，将底物浓度调整到2w/v％，使其在40℃、pH6.0条件下作用24小时。将酶反应前后的反应液用实验1所述的TLC法进行分析，确认酶对各个糖有无作用或作用的强度。结果如表5所示。

[表5]

底物	作用	底物	作用
底物	作用	底物	作用	麦芽糖	-	潘糖	-
麦芽三糖	+	异潘糖	-	麦芽糖	-	潘糖	-
麦芽三糖	+	异潘糖	-	麦芽四糖	+++	麦芽糖醇	-
麦芽五糖	+++	麦芽三糖醇	-	麦芽四糖	+++	麦芽糖醇	-
麦芽五糖	+++	麦芽三糖醇	-	麦芽六糖	+++	α-环糊精	-
麦芽七糖	+++	β-环糊精	-	麦芽六糖	+++	α-环糊精	-
麦芽七糖	+++	β-环糊精	-	新海藻糖	-	γ-环糊精	-
海藻糖	-	直链淀粉	+++	新海藻糖	-	γ-环糊精	-
海藻糖	-	直链淀粉	+++	曲二糖	-	可溶性淀粉	+++
黑曲霉糖	-	糖原	++	曲二糖	-	可溶性淀粉	+++
黑曲霉糖	-	糖原	++	异麦芽糖	-	支链淀粉	-
异麦芽三糖	-	糊精	-	异麦芽糖	-	支链淀粉	-

注)在酶反应前后

-表示：没有变化

+表示：底物的点稍有减少，确认有其它生成物

++表示：底物的点减少很多，确认有其它生成物

+++表示：底物的点几乎消失，确认有其它生成物

就像表5的结果所表明的那样，本发明的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶很好地作用于试验的糖中的麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖，而对麦芽三糖稍有作用。另外，本发明的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶对于直链淀粉、淀粉、糖原也能很好作用。由这些结果判明本酶作用于葡萄糖聚合度3以上的α-1，4葡聚糖。

<实验9：作用机制>

<实验9-1：由麦芽四糖生成的生成物>

将最终浓度20mM醋酸缓冲液(pH6.0)和最终浓度1mM氯化钙加到最终浓度1w/v％的麦芽四糖水溶液后，按照每1克底物固形物加1单位的通过实验4方法得到的纯化环状麦芽糖基麦芽糖合成酶，在40℃、pH6.0下使其作用，按照一定时间间隔取样，于100℃下保持10分钟，停止反应。采用HPLC法测定该酶反应液的糖组成。HPLC使用YMC Pack ODS-AQ303(株式会社ヮイ·ェム·シ一制造)柱、洗脱液使用水，在柱温度40℃、流速0.5ml/分的条件下进行，检测使用差示折射计RID-10A(株式会社岛津制作所制造)。表6给出了其结果。

[表6]

反应时间(小时)	糖组成(％)
	糖组成(％)							麦芽糖	环状麦芽糖基麦芽糖	麦芽四糖	麦芽糖基麦芽糖	麦芽六糖	糖X	其它糖
	0	0.0	0.0	97.3	0.0	0.0	0.0	麦芽糖	环状麦芽糖基麦芽糖	麦芽四糖	麦芽糖基麦芽糖	麦芽六糖	糖X	其它糖	2.7
1	0	0.0	0.0	97.3	0.0	0.0	0.0	9.0	2.6	69.5	0.5	3.9	11.3	1.8	2.7
1	2	15.6	6.6	51.7	0.9	5.6	14.0	9.0	2.6	69.5	0.5	3.9	11.3	1.8	2.6
4	2	15.6	6.6	51.7	0.9	5.6	14.0	22.8	12.5	35.5	1.8	5.4	14.7	3.5	2.6
4	8	31.7	21.3	19.1	3.8	4.1	10.8	22.8	12.5	35.5	1.8	5.4	14.7	3.5	5.7
16	8	31.7	21.3	19.1	3.8	4.1	10.8	36.3	25.6	10.9	6.9	2.5	8.2	6.5	5.7
16	24	38.7	28.6	6.9	9.6	1.2	7.1	36.3	25.6	10.9	6.9	2.5	8.2	6.5	6.1

表中的环状麦芽糖基麦芽糖指的是6²-O-α-环状麦芽糖基麦芽糖，判明糖X为来自下面实验9-3的α-麦芽糖基麦芽四糖(别名6⁴-O-α-环状麦芽糖基麦芽糖)。

就像表6的结果所表明的那样，可以判明本酶作用的结果由底物麦芽四糖在反应初期(反应1小时)显著生成麦芽糖和糖X。另外也知道可生成少量的麦芽六糖、环状麦芽糖基麦芽糖以及麦芽糖基麦芽糖苷(6²-α-麦芽糖基麦芽糖苷、非环状)。随着反应的进行，这些生成糖中麦芽糖和环状麦芽糖基麦芽糖蓄积量显著，麦芽糖基麦芽糖量也有少量增加。另外判明糖质X以及麦芽六糖的生成量在反应4小时之前增加，4小时以后减少。如果由这些结果推测，在反应初期，本发明的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶作用于麦芽四糖，主要生成麦芽糖和糖X，随着反应进行，本酶作用于糖质X，生成环状麦芽糖基麦芽糖，糖X被认为是来自麦芽四糖的环状麦芽糖基麦芽糖生成反应的中间体。由于麦芽糖基麦芽糖和麦芽六糖同时生成，所以推定本酶是以麦芽糖单位催化糖转移的酶，糖X也被推定为通过麦芽糖基转移的生成物。

<实验9-2：糖X的分离>

对被认为由麦芽四糖生成环状麦芽糖基麦芽糖的反应的反应中间体糖X进行分离。向终浓度1w/v％的2L麦芽四糖水溶液中加最终浓度为20mM醋酸缓冲液(pH6.0)和最终浓度1mM氯化钙后、按照每1克底物固形物加1单位的通过实验4方法得到的纯化环状麦芽糖基麦芽糖合成酶，在40℃、pH6.0下使酶作用4小时后，在100℃下保持10分钟，使反应停止。然后通过预试验确认糖质X没有被β-淀粉酶分解后，将上述得到的反应液调整到pH5.5，按照每1克底物固形物加5单位的β-淀粉酶(Sigma公司制)，在50℃下处理16小时，将反应液中残存的麦芽四糖分解为麦芽糖。将反应液在100℃下保持10分钟，使反应停止，将不溶物过滤除去后、用三菱化学制造的离子交换树脂Diaion WA30进行脱色、脱盐，再用三菱化学制阳离子交换树脂Diaion SK-1B和Organo公司制阴离子交换树脂IRA411S进行脱色、脱盐，精密过滤后，用蒸发器进行浓缩，作为分级原料。将该原料供给分级用HPLC柱YMC-Pack ODS-A R355-15S-1512A(株式会社ヮイ·ェム·シイ制)进行纯化，从来自上述麦芽四糖的反应物可得到纯度99.3％以上的糖X标准品，固形物收率约6.7％。

<实验9-3：糖X的结构解析>

<实验9-3-1：环状麦芽糖基麦芽糖的生成试验>

向通过实验9-2的方法得到的糖X精制标准品水溶液(最终浓度1w/v％)加最终浓度20mM醋酸缓冲液(pH6.0)和最终浓度1mM氯化钙后、按照每1克底物固形物加1单位的通过实验4方法得到的纯化环状麦芽糖基麦芽糖合成酶，在40℃、pH6.0下使酶作用24小时，在100℃下保持10分钟，使反应停止后，采用实验1所述的TLC法和HPLC法进行分析，对生成物进行研究，判明主要生成麦芽糖和环状麦芽糖基麦芽糖，确认糖X是环状麦芽糖基麦芽糖生成反应的中间体。

<实验9-3-2：质量分析>

对于采用实验9-2的方法得到的糖X精制标准品，用实验2-1所述方法进行了质量分析，显著检测到质量数1013的添加钠的分子离子，判明糖X的质量数为990，由该质量数可知糖X是由6分子D-葡萄糖构成的。

<实验9-3-3：用支链淀粉酶进行的分解试验>

使支链淀粉酶(株式会社林原生物化学研究所制造)作用于采用实验9-2的方法得到的糖X精制标准品的水溶液(最终浓度1w/v％)，进行分解试验。按照1克底物固形物加1单位支链淀粉酶，在40℃、pH6.0下使酶作用24小时，在100℃下保持10分钟停止反应后，通过实验1所述的TLC法和HPLC法进行分析，对生成物进行了研究，判明生成了麦芽糖和麦芽四糖。即，判明糖X具有麦芽糖分子和麦芽四糖分子通过α-1，6糖苷键结合的结构。

<实验9-3-4：甲基化分析>

用通过实验9-2的方法得到的糖X标准品，根据常规方法进行甲基化分析，用气相色谱法对甲基化物进行研究。结果归纳在表7中。

[表7]

分析甲基化物的种类	比率
分析甲基化物的种类	比率	2，3，4-三甲基化物	1.00
2，3，6-三甲基化物	4.04	2，3，4-三甲基化物	1.00
2，3，6-三甲基化物	4.04	2，3，4，6-四甲基化物	0.85

就像表7的结果所表明的那样，由于2，3，4-三甲基化物、2，3，6-三甲基化物和2，3，4，6-四甲基化物比率约1∶4∶1，所以判明构成糖X的6分子葡萄糖中，1分子是在1位和6位通过糖苷键结合的葡萄糖，4分子是在1位和4位通过糖苷键结合的葡萄糖，另外1分子是仅在1位通过糖苷键结合的葡萄糖。另外，由该结果判明麦芽糖和麦芽四糖经α-1，6结合得到糖X中的1，6糖苷键存在于非还原末端葡萄糖残基。

由以上结果判明通过本发明的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶由麦芽四糖生成的糖X是环状麦芽糖基麦芽糖生成反应的中间体，其结构是麦芽糖基与麦芽四糖的非还原末端葡萄糖残基的6位羟基进行了α结合的6糖，是结构式1表示的α-麦芽糖基麦芽四糖(6⁴-α-麦芽糖基麦芽四糖)。

结构式1：

α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→6)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp-(1→4)-D-Glcp

由以上事实可以认为利用本发明的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶的环状麦芽糖基麦芽糖生成的反应机制象以下那样。

1)本酶作用于作为底物的葡萄糖聚合度为3以上的α-1，4葡聚糖，催化该非还原性末端的麦芽糖基残基转移到另外的α-1，4葡聚糖分子的非还原性末端葡萄糖残基的6位羟基的分子间的6-α-麦芽糖基转移，生成在非还原末端具有6-α-麦芽糖基的葡萄糖聚合度增加2的6-α-麦芽糖基-α-1，4葡聚糖以及葡萄糖聚合度减少2的麦芽低聚糖。

2)本酶另外作用于6-α-麦芽糖基-α-1，4葡聚糖，催化环化反应，生成具有环{→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}结构的环状麦芽糖基麦芽糖以及根据6-α-麦芽糖基-α-1，4葡聚糖计算，葡萄糖聚合度减少4的麦芽低聚糖。

3)本酶也稍微催化分子间的4-α-麦芽糖基转移，由麦芽低聚糖可生成少量的葡萄糖聚合度增加2的麦芽低聚糖和葡萄糖聚合度减少2的麦芽低聚糖。

<实验10：由各种底物生成环状麦芽糖基麦芽糖>

使用各种糖通过本发明的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶的作用进行环状麦芽糖基麦芽糖生成的试验。制备麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、直链淀粉、可溶性淀粉、淀粉部分分解物(商品名：パインデックス#100、松谷化学工业株式会社制)、糖原(来自玉米、キュ一ピ一株式会社制)溶液。

向这些水溶液(最终浓度1.0w/v％)中加最终浓度20mM醋酸缓冲液(pH6.0)和最终浓度1mM氯化钙后，每1克固形物加1单位的通过实验4方法得到的纯化环状麦芽糖基麦芽糖合成酶标准品，使酶在40℃、pH6.0下作用48小时后，将该反应液在100℃下加热10分钟使反应停止。与实验1同样进行α-糖苷酶-葡萄糖淀粉酶处理后用HPLC法对环状麦芽糖基麦芽糖进行定量，求环状麦芽糖基麦芽糖的生成率。这些结果表示在表8中。

[表8]

底物	环状麦芽糖基麦芽糖生成率(％)
底物	环状麦芽糖基麦芽糖生成率(％)	麦芽三糖	0.6
麦芽四糖	27.3	麦芽三糖	0.6
麦芽四糖	27.3	麦芽五糖	24.4
麦芽六糖	41.6	麦芽五糖	24.4
麦芽六糖	41.6	麦芽七糖	36.6
直链淀粉	41.8	麦芽七糖	36.6
直链淀粉	41.8	可溶性淀粉	31.4
淀粉部分分解物	32.6	可溶性淀粉	31.4
淀粉部分分解物	32.6	糖原	29.5

就像表8的结果所表明的那样，从试验的任一个糖都可以通过环状麦芽糖基麦芽糖合成酶的作用生成环状麦芽糖基麦芽糖。其生成率当底物为麦芽三糖时低到约0.6％，与此相反当底物为直链淀粉时最高至约42％，然后依次为麦芽六糖、麦芽庚糖。由可溶性淀粉、淀粉部分分解物以及糖原都可以以30％程度的生成率生成环状麦芽糖基麦芽糖。

<实验11：环状麦芽糖基麦芽糖生成反应和反应产物的还原能力>

向可溶性淀粉的水溶液(最终浓度1.0w/v％)加最终浓度20mM醋酸缓冲液(pH6.0)和最终浓度1mM氯化钙后、每1克固形物加1单位的通过实验4方法得到的纯化环状麦芽糖基麦芽糖合成酶标准品，使它们在40℃、pH6.0下反应，酶刚添加后立刻取样，立即在约100℃下加热10分钟停止反应，进行水冷，得到反应0小时的反应液。然后在反应1、2、3、4小时各个时间点取样，立即在约100℃下加热10分钟停止反应，进行水冷，得到反应1小时、反应2小时、反应3小时、反应4小时各个时间的反应液。对得到的反应液的还原糖量用Somogyi糖定量法进行测定，总全糖量用蒽酮法进行测定，将还原糖量占总全糖量的比例用百分率(％)表示，作为还原能力。另外对反应液与实验1同样进行α-糖苷酶-葡萄糖淀粉酶处理后，用HPLC法对环状麦芽糖基麦芽糖进行定量，求环状麦芽糖基麦芽糖的生成率。这些结果归纳在表9中。

表9

反应时间(小时)	还原能力(％)	环状麦芽糖基麦芽糖生成率(％)
反应时间(小时)	还原能力(％)	环状麦芽糖基麦芽糖生成率(％)	0	0.3	0
1	0.3	4.7	0	0.3	0
1	0.3	4.7	2	0.4	8.4
3	0.5	11.2	2	0.4	8.4
3	0.5	11.2	4	0.5	13.7

就像表9结果所表明的那样，使本发明的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶作用于可溶性淀粉，使环状麦芽糖基麦芽糖生成时，环状麦芽糖基麦芽糖的生成率即使在10％以上时，判明还原能力的增加也仅仅为0.2％程度。该事实意味着本发明的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶本质上是催化转移-环化反应的酶，在这些反应时几乎不伴随着水解。使本酶作用于淀粉或其分解物等，使环状麦芽糖基麦芽糖生成时，将反应前的淀粉或其分解物的还原能力、即DE降低，由于增加的还原能力很少，可知得到了还原能力低的生成物。

<实验12：影响环状麦芽糖基麦芽糖生成的异淀粉酶的添加效果>

制备淀粉部分分解物(商品名：パインデックス#100、松谷化学工业株式会社制)水溶液(最终浓度1w/v％)，加最终浓度20mM醋酸缓冲液(pH6.0)和最终浓度1mM氯化钙后，1克固形物加1单位的通过实验4方法得到的纯化环状麦芽糖基麦芽糖合成酶标准品，对1克固形物加0、125、250、500、1250或2500单位的异淀粉酶(株式会社林原生物化学研究所制)，于40℃、pH6.0下使酶作用48小时后，在100℃热处理10分钟，使酶失活。然后与实验1同样用α-糖苷酶以及葡萄糖淀粉酶对反应液进行处理后，用HPLC法对环状麦芽糖基麦芽糖进行定量，求环状麦芽糖基麦芽糖生成率。这些结果如表10所示。

[表10]

异淀粉酶添加量(单位)	环状麦芽糖基麦芽糖生成率(％)
异淀粉酶添加量(单位)	环状麦芽糖基麦芽糖生成率(％)	0	32.2
125	40.1	0	32.2
125	40.1	250	40.1
500	40.9	250	40.1
500	40.9	1250	41.0
2500	41.7	1250	41.0

就像表10结果所表明的那样，判明通过添加异淀粉酶，环状麦芽糖基麦芽糖的生成率增加。

<实验12：液化淀粉DE对环状麦芽糖基麦芽糖生成的影响>

将玉米淀粉做成浓度2质量％淀粉乳，向该淀粉乳加0.1质量％碳酸钙，调整到pH6.0，每克淀粉加0.2、0.4、0.6、1.0、1.5或2.0质量％α-淀粉酶(商品名：タ一マミ一ル60L、ノボ社制造)，分别在95℃下使其反应10分钟，然后在120℃下进行高压灭菌，急冷至约40℃，得到DE3.1至20.4的表11表示的6种淀粉液化液。向这些淀粉液化液(最终浓度1质量％)按照1克固形物加1单位的通过实验4方法得到的纯化环状麦芽糖基麦芽糖合成酶标准品，在40℃、pH6.0下使酶作用48小时后，对该反应液煮沸10分钟，使反应停止。为了研究这些热失活的反应液中的环状麦芽糖基麦芽糖的生成量，与实验1同样添加α-糖苷酶和葡萄糖淀粉酶，使其反应后，用HPLC法对环状麦芽糖基麦芽糖进行定量，求环状麦芽糖基麦芽糖生成率。表11给出了这些结果。

[表11]

α-淀粉酶使用量(质量％/g-淀粉)	DE	环状麦芽糖基麦芽糖生成率(％)
α-淀粉酶使用量(质量％/g-淀粉)	DE	环状麦芽糖基麦芽糖生成率(％)	0.2	3.1	32.6
0.4	4.8	30.3	0.2	3.1	32.6
0.4	4.8	30.3	0.6	7.9	26.2
1.0	12.6	23.1	0.6	7.9	26.2
1.0	12.6	23.1	1.5	17.4	21.2
2.0	20.4	20.9	1.5	17.4	21.2

就像表11结果所表明的那样，判明利用本发明的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶的环状麦芽糖基麦芽糖的生成率受到液化淀粉的DE的影响，DE越是低值，环状麦芽糖基麦芽糖的生成率越高，相反，DE越是高值，环状麦芽糖基麦芽糖的生成率越低。具体来说，判明液化淀粉的DE在约20以下、优选DE约8以下、更优选DE约5以下合适。

<实验14：结晶环状麦芽糖基麦芽糖的制备>

向作为最终浓度分别含有1.25w/v％、20mM、1mM的直链淀粉(株式会社林原生物化学研究所制)、醋酸缓冲液(pH6.0)以及氯化钙的水溶液16L中按照1克固形物加1单位的通过实验4方法得到的纯化环状麦芽糖基麦芽糖合成酶标准品，使酶在40℃、pH6.0下作用90小时后，将反应液在约98℃下加热10分钟，使反应停止。用实验1所述的方法对得到的反应液进行葡萄糖淀粉酶处理，通过用氢氧化钠进行碱处理，对还原糖进行分解后，进行过滤脱色、脱盐、精密过滤、浓缩、真空干燥，得到固形物约80.5g的环状麦芽糖基麦芽糖粉末。用HPLC法进行分析，环状麦芽糖基麦芽糖的纯度为98.9％。

将得到的环状麦芽糖基麦芽糖粉末(固形物36g)加到144g的水中，加温到约90℃，使环状麦芽糖基麦芽糖完全溶解后，在约25℃下静置2天，生成结晶状物质。对得到的含有结晶状物质的液体进行过滤，将结晶状物质回收在滤纸上，然后用少量水洗净后，收集结晶状物质，于常温常压下风干，得到21.8g的结晶状粉末。用HPLC法进行分析，环状麦芽糖基麦芽糖的纯度在99.9％以上，为极高纯度。

对于得到的环状麦芽糖基麦芽糖的结晶状粉末使用X射线衍射装置RAD-IIX(株式会社リガク制)进行粉末X射线衍射测定，就像图10所示那样，得到了作为主要的衍射角(2θ)，特征为5.6°、9.3°、16.5°以及27.1°的粉末X射线衍射图。另外对该结晶状粉末的水分用Karl Fischer法进行了测定，可知水分为12.8质量％，判明是1分子环状麦芽糖基麦芽糖含有5分子水的含水结晶。

另外，对该环状麦芽糖基麦芽糖的结晶粉末进行了热重量测定，导电率图11所示的热重量曲线，由该重量变化与温度的关系可以看到在直至温度约100℃的上升中减少相当于5分子水的重量，另外还看到从温度约280℃附近开始认为环状麦芽糖基麦芽糖本身热分解的重量减少。从这些事实可判明本发明的环状麦芽糖基麦芽糖含水结晶在常压下，由于使温度上升至100℃，每一结晶分子脱去5分子的水，变成了无水物。

<实验15：环状麦芽糖基麦芽糖对水的饱和浓度>

为了研究在温度25℃下环状麦芽糖基麦芽糖对水的饱和浓度，将10ml水加到带密封栓的玻璃制容器中，向容器中加通过实验14的方法得到的环状麦芽糖基麦芽糖含水结晶粉末，加的量为完全溶解的量以上的量，将玻璃容器密封，在达到饱和之前，在温度25℃下边保温边搅拌2天。将该环状麦芽糖基麦芽糖饱和溶液进行精密过滤，除去不溶的环状麦芽糖基麦芽糖后，通过乾燥减量法研究该滤液的水分，求饱和浓度，判明在温度25℃下环状麦芽糖基麦芽糖对水的饱和浓度约8.0质量％。

<实验16：环状麦芽糖基麦芽糖的甜度>

将通过实验14的方法得到的环状麦芽糖基麦芽糖含水结晶粉末溶于去离子水中，作成固形物浓度5质量％的水溶液，将该水溶液作为甜度试验溶液。另外制备蔗糖(市售细粒糖)0.5至5质量％水溶液，作为对照。经5名专门人员进行官能试验，推定环状麦芽糖基麦芽糖的甜度约为蔗糖的20％，判明环状麦芽糖基麦芽糖是低甜味的糖。

<实验17：环状麦芽糖基麦芽糖的热稳定性>

将通过实验14方法得到的环状麦芽糖基麦芽糖含水结晶粉末溶解于水中，制备浓度7w/v％的环状麦芽糖基麦芽糖水溶液，将该溶液8ml加到玻璃制试管中，密封后在120℃下加热30至90分钟。放冷后进行这些溶液的着色度测定研究和采用HPLC法的环状麦芽糖基麦芽糖的纯度测定。480nm的1cm池中的吸光度作为着色度。结果如表12所示。

[表12]

加热时间(分钟)	着色度(A480nm)	纯度(％)
加热时间(分钟)	着色度(A480nm)	纯度(％)	0	0	100
30	0	100	0	0	100
30	0	100	60	0	100
90	0	100	60	0	100

就像表12的结果所表明的那样，环状麦芽糖基麦芽糖水溶液即使加热到120℃的高温也不着色，没有看到由于分解使得纯度降低，判明环状麦芽糖基麦芽糖是对热稳定的糖。

<实验18：环状麦芽糖基麦芽糖的pH稳定性>

将通过实验14方法得到的环状麦芽糖基麦芽糖含水结晶粉末溶解于各种缓冲液(20mM)中，制备将环状麦芽糖基麦芽糖调整到浓度4w/v％、pH调整到2至9的表13所述的8种环状麦芽糖基麦芽糖水溶液。取各个溶液8ml分别加到玻璃试管中，密封后在100℃下加热24小时。放冷后与实验17同样进行这些溶液着色度的测定和用HPLC法进行环状麦芽糖基麦芽糖的纯度测定。结果如表13所示。

[表13]

pH	缓冲液的种类	着色度(A480nm)	纯度(％)
pH	缓冲液的种类	着色度(A480nm)	纯度(％)	2.0	醋酸	0	93
3.0	醋酸	0	100	2.0	醋酸	0	93
3.0	醋酸	0	100	4.0	醋酸	0	100
5.0	醋酸	0	100	4.0	醋酸	0	100
5.0	醋酸	0	100	6.0	Tris-盐酸	0	100
7.0	Tris-盐酸	0	100	6.0	Tris-盐酸	0	100
7.0	Tris-盐酸	0	100	8.0	Tris-盐酸	0	100
9.0	氨	0	100	8.0	Tris-盐酸	0	100

就像表13的结果所表明的那样，环状麦芽糖基麦芽糖水溶液即使在100℃的高温下加热24小时，在pH2至9很宽的范围内也不着色，只是在pH2，环状麦芽糖基麦芽糖有少量被分解，虽然发现纯度降低，但在pH3至9的范围内没有完全分解，判明即使环状麦芽糖基麦芽糖在很宽的pH范围内煮沸，也是非常稳定的糖。

<实验19：氨基羰基反应>

将通过实验14方法得到的环状麦芽糖基麦芽糖含水结晶粉末溶解于水中，再加市售试剂特级的甘氨酸和磷酸缓冲液，制备用50mM磷酸缓冲液调整到pH8.0的含有0.5w/v％甘氨酸的2.5w/v％环状麦芽糖基麦芽糖水溶液。作为对照，除了取代环状麦芽糖基麦芽糖含水结晶粉末使用麦芽糖以外，与上述同样操作制备麦芽糖水溶液。将各个溶液4ml取到玻璃试管中，密封后在100℃下加热30至90分钟。于室内放冷后、测定它们的着色度，研究氨基羰基反应性。着色度为1cm池的480nm的吸光度。结果如表14所示。

[表14]

加热时间(分钟)	着色度(A480nm)
	着色度(A480nm)		环状麦芽糖基麦芽糖	麦芽糖(对照)
	0	0.00	环状麦芽糖基麦芽糖	麦芽糖(对照)	0.00
30	0	0.00	0.00	0.02	0.00
30	60	0.00	0.00	0.02	0.08
90	60	0.00	0.00	0.17	0.08

就像表14的结果所表明的那样，对照的麦芽糖如果在甘氨酸共存下加热，着色，引起褐变。而本发明的环状麦芽糖基麦芽糖即使在甘氨酸共存下加热，也不着色，不发生褐变，判明是难于引起氨基羰基反应(美拉德反应)的稳定的糖。

<实验20：氨基羰基反应>

将用实验14方法得到的环状麦芽糖基麦芽糖含水结晶粉末和市售聚胨(日本制药制)溶于去离子水中，制备含有5w/v％聚胨的5w/v％环状麦芽糖基麦芽糖溶液。作为对照，除了使用麦芽糖取代环状麦芽糖基麦芽糖含水结晶粉末以外，其它与上述同样操作制备麦芽糖水溶液。将各个溶液4ml加到玻璃试管中，密封后在120℃下加热30至90分钟。室内放冷后，测定它们的着色度，研究氨基羰基反应性。同时将只含有聚胨的溶液作为空白，同样进行加热。着色度为480nm的1cm池的吸光度，将空白吸光度作为减去的值。结果如表15所示。

[表15]

加热时间(分钟)	着色度(A480nm)
	着色度(A480nm)		环状麦芽糖基麦芽糖	麦芽糖(对照)
	0	0.00	环状麦芽糖基麦芽糖	麦芽糖(对照)	0.00
30	0	0.00	0.00	0.10	0.00
30	60	0.00	0.00	0.10	0.30
90	60	0.00	0.00	0.62	0.30

就像表15的结果所表明的那样，对照麦芽糖在聚胨共存下一旦加热，则着色、发生褐变。而环状麦芽糖基麦芽糖即使在聚胨共存下加热也不着色，也不发生褐变，判明是难于引起氨基羰基反应的稳定的糖。

<实验21：环状麦芽糖基麦芽糖的包合作用>

将通过实验14的方法得到的环状麦芽糖基麦芽糖含水结晶粉末溶于去离子水，制备8质量％水溶液。向每100g的该水溶液分别加作为香气成分的具体例子、甲醇1.2g、乙醇1.7g或醋酸2.2g后进行包合。然后分别进行过滤，将滤液冷冻干燥，除去未包合物。作为对照，使用已知具有包合能力的支化环糊精(商品名：Isoelite P、マルハ株式会社销售)进行同样操作。为了测定冷冻干燥粉末中的包合物量，将各个冷冻干燥粉末1g溶于5ml水中，然后加入5ml的二乙醚，进行提取，再度重复提取后、用气相色谱法对二乙醚中的提取物进行定量。结果如表16所示。

[表16]

包合物	包合量(mg/g-冷冻干燥粉末)
	包合量(mg/g-冷冻干燥粉末)		环状麦芽糖基麦芽糖	分支环糊精
	甲醇	4.30	环状麦芽糖基麦芽糖	分支环糊精	3.23
乙醇	甲醇	4.30	4.20	8.67	3.23
乙醇	醋酸	30.55	4.20	8.67	38.14

就像表16结果所表明的那样，判明环状麦芽糖基麦芽糖具有包合能力，其包合能力与分支环糊精相比，如果用甲醇，每单位重量约强1.3倍、如果用乙醇约强0.5倍、如果用醋酸约强0.8倍。

<实验22：环状麦芽糖基麦芽糖的消化性试验>

使用通过实验14方法得到的环状麦芽糖基麦芽糖含水结晶粉末，根据日本营养粮食学会志、第43卷、第23至29页(1990)所述冈田等人的方法，研究试管内的唾液淀粉酶、人工胃液、胰液淀粉酶、小肠粘膜酶对环状麦芽糖基麦芽糖的消化性。作为对照，使用已知的难消化糖麦芽糖醇。结果如表17所示。

[表17]

消化酶	分解率(％)
	分解率(％)		环状麦芽糖基麦芽糖	麦芽糖(对照)
	唾液淀粉酶	0	环状麦芽糖基麦芽糖	麦芽糖(对照)	0
人工胃液	唾液淀粉酶	0	0	0	0
人工胃液	胰液淀粉酶	0	0	0	0
小肠粘膜酶	胰液淀粉酶	0	0	4	0

就像表17结果所表明的那样，可知环状麦芽糖基麦芽糖完全不能被唾液淀粉酶、人工胃液、胰液淀粉酶以及小肠粘膜酶中任一个酶消化，判明是极难消化的糖。

<实验23：环状麦芽糖基麦芽糖的发酵性试验>

使用通过实验14方法得到的环状麦芽糖基麦芽糖含水结晶粉末，根据Journal of Nutritional Science and Vitaminology、第37卷、529至544页(1991年)所述的奥等人的方法，研究大鼠盲肠内容物引起的环状麦芽糖基麦芽糖的发酵性。盲肠内容物使用在乙醚麻醉下处死Wistar系雄大鼠，厌氧条件下采集，悬浮于4倍量的0.1M碳酸氢钠水溶液的悬浊液。每单位盲肠内容物重量添加约7质量％环状麦芽糖基麦芽糖，用气相色谱法对刚添加后和12小时后残存的环状麦芽糖基麦芽糖量进行定量。其结果表明，刚添加后的环状麦芽糖基麦芽糖浓度每1克盲肠内容物为68.5mg，12小时后的环状麦芽糖基麦芽糖浓度每1克盲肠内容物为63.0mg，可知约92％没有被发酵仍然残存着，判明环状麦芽糖基麦芽糖是极难被发酵的糖。

<实验24：急性毒性试验>

使用小鼠，将通过实验14方法得到的环状麦芽糖基麦芽糖经口给予，进行急性毒性试验。其结果表明环状麦芽糖基麦芽糖是低毒性物质，即使是在可给予的最大给予量也没有看到死亡例，其LD₅₀值在5g/kg-小鼠体重以上。

由以上的实验22至24的结果表明，环状麦芽糖基麦芽糖即使经口摄取，也难于被消化、吸收，作为无热量乃至低热量的可食原料，可以有利地用作饮食甜味料、高甜度甜味料的赋形剂、饮食饮食物的增粘剂、增量剂、赋形剂、以及食物纤维、脂肪替代食品材料等。

以下实施例1至6给出了本发明的环状麦芽糖基麦芽糖以及含有该糖的糖类的制造方法，实施例7至23给出了含有环状麦芽糖基麦芽糖以及含有该糖的糖类的组成物。

实施例1

将球形节杆菌M6(FERM BP-8448)按照实验3方法进行种子培养。然后向容量30L的发酵罐中加约20L的由淀粉部分分解物(商品名パインデックス#100、松谷化学工业株式会社制造)3.0w/v％、大豆肽(商品名ハイニュ一トSMS、不二制油株式会社制造)3.6w/v％、磷酸氢二钾0.1w/v％、磷酸二氢钠二水盐0.06w/v％、硫酸镁七水盐0.05w/v％、碳酸钙0.3w/v％以及水构成的液体培养基，加热灭菌，冷却，达到温度27℃后，接种种子培养液1v/v％，保持在温度27℃、pH5.5至8.0，进行96小时通气培养。培养后使用SF膜进行除菌过滤，回收约18L的培养滤液，再将该滤液用UF膜浓缩，回收得到含有3.8单位/ml的本发明的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶的浓缩酶液约1L。

实施例2

将马铃薯淀粉乳做成浓度约1质量％淀粉乳，然后按照终浓度为1mM那样加氯化钙，调整到pH6.0，在95℃加热约20分钟，进行糊化，然后冷却至约40℃，按照最后每1克淀粉固形物0.26ml(约1单位)的比例加入通过实施例1方法得到的含有环状麦芽糖基麦芽糖合成酶的浓缩酶液，于pH6.0、温度40℃下反应48小时。将该反应液加热到95℃，保持30分钟后冷却，将过滤后得到的滤液按照常规方法用活性碳脱色，通过H型以及OH型离子交换树脂进行脱盐、纯化和浓缩，以每单位固形物收率约90％得到浓度65质量％的含有环状麦芽糖基麦芽糖的糖浆。本品每单位固形物含有环状麦芽糖基麦芽糖31.4质量％、麦芽糖2.2质量％、麦芽三糖1.5质量％以及其它糖65.9质量％，低还原性，具有温和的甜味、适度的粘度、保湿性、包合性，作为甘味料、呈味改良剂、品质改良剂、沥水防止剂、稳定剂、变色防止剂、赋形剂、包合剂、粉末化基材等可在各种饮食物、化妆品、医药品等各种组成物中有效利用。

实施例3

将木薯淀粉做成浓度约1质量％淀粉乳，然后按照终浓度为0.1质量％加入碳酸钙，调整到pH6.0，然后按照每克淀粉固形物终浓度为0.2质量％加入α-淀粉酶(ノボ社制造、商品名『タ一マミ一ル60L，在95℃反应10分钟，然后在120℃下进行20分钟高压灭菌，再急冷至约40℃，得到DE约3的液化溶液，向该液化溶液按照1克淀粉固形物0.26ml(约1单位)加用实施例1方法得到的含有环状麦芽糖基麦芽糖合成酶的浓缩液和按照1克淀粉固形物1000单位的比例加异淀粉酶(株式会社林原生物化学研究所制造)，在pH6.0、温度40℃下反应48小时反应。将该反应液加热到95℃，并保持30分钟后进行冷却，将过滤得到的滤液按照常规方法用活性碳进行脱色，通过H型和OH型离子交换树脂进行脱盐后进行纯化，再进行浓缩，得到每单位固形物含有41.1％环状麦芽糖基麦芽糖的浓度60质量％的糖浆。将得到的糖浆作为糖液，使用强酸性阳离子交换树脂(アンバ一ライトCR-1310、Na型、Organo株式会社制造)进行柱层析分级。将树脂填充到内径5.4cm的4根带保温套的不锈钢柱，成串联排列，树脂层全长20m。柱内温度维持在60℃，按照对树脂的5v/v％加糖液，然后使60℃的温水通过SV0.13流过柱子进行分级，用HPLC法监测洗脱液的糖组成，收集含有环状麦芽糖基麦芽糖级分的低分子级分，进行纯化、浓缩、喷雾干燥，以每单位固形物收率约54％获得含有环状麦芽糖基麦芽糖的粉末。本品每单位固形物含有环状麦芽糖基麦芽糖63.2质量％、麦芽糖7.4质量％、麦芽三糖6.2质量％、以及其它糖23.2质量％，为低还原性，具有温和的甜味、适度的粘度、保湿性、包合性，作为甜味料、呈味改良剂、品质改良剂、沥水防止剂、稳定剂、变色防止剂、赋形剂、包合剂等可在各种饮食物、化妆品、医药品等各种组成物中有效利用。

实施例4

将玉米淀粉做成浓度约1质量％淀粉乳，然后按照终浓度0.1质量％加碳酸钙，调整到pH6.0，然后按照每克淀粉固形物终浓度0.2质量％加入α-淀粉酶(商品名：ネオスピタ一ゼ、ナガセ生化学工业株式会社制)，在85至90℃反应20分钟，然后在120℃下进行20分钟高压灭菌，再急冷至约40℃，得到DE约3的液化溶液，向该液化溶液按照1克淀粉固形物0.26ml(约1单位)加用实施例1方法得到的含有环状麦芽糖基麦芽糖合成酶的浓缩液和按照1克淀粉固形物1000单位的比例加异淀粉酶(株式会社林原生物化学研究所制造)，在pH6.0、温度40℃下反应48小时。将该反应液加热到95℃，保持30分钟后，调整到pH 5.0、温度50℃，然后向该反应液中按照最终1克淀粉100单位的比例加葡糖淀粉酶(商品名：グルコチ一ム、ナガセ生化学工业株式会社制)，于pH5.0、温度50℃下反应16小时。将该反应液加热到95℃，保持30分钟後，进行冷却，将过滤得到的滤液按照常规方法用活性碳进行脱色，通过H型和OH型离子交换树脂进行脱盐后进行纯化，再进行浓缩，以每单位固形物收率约95％得到60质量％的含有环状麦芽糖基麦芽糖的糖浆。本品每单位固形物含有环状麦芽糖基麦芽糖42.6质量％、葡萄糖53.0质量％以及其它糖4.4质量％，具有温和的甜味、适度的粘度、保湿性、包合性，作为甜味料、呈味改良剂、品质改良剂、沥水防止剂、稳定剂、变色防止剂、赋形剂、包合剂、粉末化基材等可在各种饮食物、化妆品、医药品等各种组成物中有效利用。

实施例5

将用实施例4方法得到的含有环状麦芽糖基麦芽糖的糖浆按照常规方法加氢，对还原性糖进行糖醇化、纯化、浓缩、真空干燥、粉碎，以每单位固形物收率约90％得到环含有状麦芽糖基麦芽糖的粉末。本品每单位固形物含有环状麦芽糖基麦芽糖42.6质量％、山梨糖醇53.2质量％、以及其它糖醇4.2质量％，实质上没有表现出还原能力，难于引起氨基羰基反应，为低还原性，具有温和的甜味、适度粘度、保湿性、包合性，可作为甘味料、呈味改良剂、品质改良剂、沥水防止剂、稳定剂、变色防止剂、赋形剂、包合剂等在各种饮食物、化妆品、医药品等各种组成物有效利用。

实施例6

将通过实施例4方法得到的含有环状麦芽糖基麦芽糖的糖浆作为原糖液，为了提高环状麦芽糖基麦芽糖的含量，按照实施例3的方法使用盐型强酸性阳离子交换树脂进行柱层析，对环状麦芽糖基麦芽糖高含有级分进行收集、纯化，以每单位固形物收率约40％得到每单位固形物约90质量％的含有环状麦芽糖基麦芽糖的环状麦芽糖基麦芽糖高含有液。将本溶液边浓缩、边使其连续析出结晶，将得到的结晶浆液用篮型离心分离机进行分蜜，将结晶用少量水进行喷雾、洗涤、温风干燥，以每单位固形物约25％的收率得到高纯度的环状麦芽糖基麦芽糖含水结晶。本品是纯度99％以上的纯度极高的环状麦芽糖基麦芽糖含水结晶，还原性极低，难引起氨基羰基反应，也不表现出吸湿性，处理容易，具有温和的低甜味、适度的粘度、保湿性、包合性、难消化性，可作为甘味料、低热量食品素材、呈味改良剂、风味改良剂、品质改良剂、沥水防止剂、稳定剂、变色防止剂、赋形剂、包合剂、粉末化基材等，可在各种饮食物、化妆品、医药品等各种组成物、以及工业试药、化学原料等中有效利用。

实施例7

<甜味料>

将通过实施例6方法得到的环状麦芽糖基麦芽糖含水结晶0.8质量份与海藻糖含水结晶(株式会社林原商事销售，注册商标：トレハ)0.2质量份、α-葡萄糖基蛇菊甙(东洋精糖株式会社销售，商品名：αG甜味剂)0.01质量份、以及L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲基酯(商品名：阿斯巴甜)0.01质量份均一混合，经颗粒成型机加工得到颗粒状甜味料。本品甜味的质量优越，甜度约为蔗糖的2倍。本品的热量由于环状麦芽糖基麦芽糖难消化性、难发酵性，所以实质上为低热量，甚至无热量。而且室温保存下、也不用担心变质劣化，很稳定。因此本品作为高品质的低热量、低蛀齿性甜味料很合适。

实施例8

<硬糖>

将浓度55％蔗糖溶液100质量份和通过实施例4方法得到的含有环状麦芽糖基麦芽糖的糖浆50质量份加热混合，在减压下加热浓缩至水分不足2％，然后与柠檬酸0.6质量份和适量的柠檬香料和着色料混和，按照常规方法进行成型，得到制品。本品口感、呈味、味道都很好，也不会引起蔗糖的析出结晶，吸湿性少，也不引起滴流，是稳定且高品质的硬糖。

实施例9

<口香糖>

将口香糖的橡胶基料3质量份加热溶融至变得柔软的程度，然后加无水麦芽糖醇2质量份、木糖醇2质量份、通过实施例6方法得到的环状麦芽糖基麦芽糖含水结晶2质量份、以及海藻糖含水结晶1质量份和适量的香料以及着色料，并进行混合，按照常规方法，通过轧辊进行搅和、成型、包装后得到制品。本品的质感、呈味、味道均良好，优选作为低蛀齿性、低热量的口香糖。

实施例10

<加糖炼乳>

在原乳100质量份中溶解通过实施例2方法得到的含有环状麦芽糖基麦芽糖的糖浆4质量份和蔗糖2重量，用板式加热器加热杀菌，然后浓缩至浓度70％，在无菌状态下进行罐装，得到制品。本品有温和的甜味，味道也好，可在水果、咖啡、可可、红茶等调味之中有效利用。

实施例11

<乳酸菌饮料>

将脱脂奶粉175质量份、通过实施例3方法得到的含有环状麦芽糖基麦芽糖的粉末100质量份以及乳糖高含有粉末(株式会社林原商事销售，注册商标：乳果オリゴ)溶解于水1500质量份，于65℃下进行30分钟杀菌，冷却至40℃后，按照常规方法，向其中接种乳酸菌的发酵剂30质量份，于37℃下培养8小时，得到乳酸菌饮料。本品风味良好，含有寡糖、环状麦芽糖基麦芽糖，作为使乳酸菌保持稳定，而且具有双尾菌增殖促进作用、整肠作用的乳酸菌饮料很合适。

实施例12

<粉末果汁>

将通过喷雾干燥制造的橙汁粉末33质量份和相对于橙汁粉末量的通过实施例6方法得到的环状麦芽糖基麦芽糖含水结晶粉末50质量份、无水结晶麦芽糖醇10质量份、无水柠檬酸0.65质量份、苹果酸0.1质量份、2-O-α-葡萄糖基-L-抗坏血酸0.2质量份、柠檬酸苏打0.1质量份、支链淀粉0.5质量份和粉末香料适量充分混合搅拌，粉碎，做成微粉末，然后加入到流动层造粒机中，将排风温度调到40℃，将其中通过实施例2方法得到的含有环状麦芽糖基麦芽糖的糖浆作为粘合剂，适量喷雾，进行30分钟造粒，计量、包装后得到制品。本品是果汁含有率约30％的粉末果汁。另外本品无异味、异臭，高品质，作为低热量的果汁商品价值高。

实施例13

<蛋奶羹>

将玉米淀粉100质量份、通过实施例2方法得到的含有环状麦芽糖基麦芽糖的糖浆100质量份、海藻糖含水结晶60质量份、蔗糖40质量份、以及食盐1质量份充分混合，加鸡蛋280质量份后进行搅拌，再慢慢加入沸腾的牛奶1000质量份，然后加火，继续搅拌，在玉米淀粉完全糊化后整体成半透明时停火，然后冷却，加适量的香草香料，计量、充填、包装后得到制品。本品具有光滑的光泽，风味良好，淀粉的老化也被抑制，是高品质的蛋奶羹。

实施例14

<米粉糕原料>

在米粉90质量份中均一混合玉米淀粉20质量份、无水结晶麦芽糖醇70质量份、用实施例5方法得到的含有环状麦芽糖基麦芽糖的粉末50质量份、以及支链淀粉4质量份，制造米粉糕原料。将米粉糕原料和适量的粉末绿茶与水混揉，然后放入容器中，蒸60分钟，制造粉末绿茶米粉糕。本品有光泽、口味也良好，风味也好。另外淀粉的老化都被抑制、保存时日也长、作为低热量的米粉糕也很合适。

实施例15

<豆馅>

根据常规方法，向原料小豆10质量份中加水，煮沸，除涩味、去辣味、除去水溶性夹杂物，得到豆沙馅约21质量份。向该原馅加蔗糖14质量份、通过实施例2方法得到的含有环状麦芽糖基麦芽糖的糖浆5质量份和水4质量份后煮沸，然后加少量色拉油，要不破坏粒馅那样混揉，得到制品豆馅约35质量份。本品色焦、也无沥水，稳定，味觉、风味良好，作为豆馅面包、豆包、丸子、日式豌豆泥、冰点心等做糕点材料最合适。

实施例16

<面包>

将小麦粉100质量份、酵母菌2质量份、蔗糖5质量份、用实施例3方法得到的含有环状麦芽糖基麦芽糖的粉末1质量份以及无机食物0.1质量份按照常规方法用水和面，使生面团在26℃下发酵2小时，然后30分钟熟成、烧烤制成。本品色相、形状都好，是具有适度弹力、温和甜味的高品质的面包。

实施例17

<火腿>

向猪大腿肉1000质量份均一抹上食盐15质量份和硝酸钾3质量份，在冷室中堆积1昼夜。然后在由水500质量份、食盐100质量份、硝酸钾3质量份、用实施例5方法得到的含有环状麦芽糖基麦芽糖粉末40质量份以及香辛料构成的盐渍液中于冷室中腌7天，然后按照常规方法用冷水清洗，用细绳卷起来捆紧、烟熏、烹调、冷却、包装后得到制品。本品是配色好、风味良好的高品质的火腿。

实施例18

<粉末肽>

在40％食品用大豆肽溶液(不二制油株式会社销售、商品名：ハイニュ一トS)1质量份中混合用实施例6方法得到的环状麦芽糖基麦芽糖含水结晶粉末2质量份，加入到塑料制桶中，于50℃下进行减压干燥，粉碎后得到粉末肽。本品风味良好，不仅作为预混物、冰点心等低热量的制点心材料有用，而且作为用于经口流动食、经管流动食的难消化性的食物纤维、整肠剂量也有用。

实施例19

<化妆用雪花膏>

将单硬脂酸聚氧乙烯二醇2质量份、自体乳化型单硬脂酸甘油酯5质量份、用实施例6方法得到的环状麦芽糖基麦芽糖含水结晶粉末2质量份、α-葡萄糖基芸香甙(株式会社林原销售、商品名αG芸香甙)1质量份、液体石蜡1质量份、三辛酸甘油酯10质量份以及防腐剂适量按照常规方法进行加热溶解，然后加入L-乳酸2质量份、1，3-丁醇5质量份以及纯化水66质量份，用匀浆器乳化，再加适量香料后进行搅拌混合，制造化妆用雪花膏。本品具有抗氧化性，稳定性高，作为高品质的防晒霜、美肤剂、美白剂等可有效利用。

实施例20

<牙膏>

将磷酸氢钾45质量份、十二烷基硫酸钠1.5质量份、甘油25质量份、聚环氧乙烷山梨糖醇酐月桂酸酯0.5质量份、用实施例5方法得到的含有环状麦芽糖基麦芽糖的粉末10质量份、糖精0.02质量份与水18质量份混合后得到牙膏。本品不使表面活性剂的清洗能力下降，改善令人讨厌的味道，使用后感觉也良好。

实施例21

<流动食用固体制剂>

制备由用实施例3方法得到的含有环状麦芽糖基麦芽糖的粉末100质量份、海藻糖含水结晶200质量份、麦芽四糖高含有粉末200质量份、蛋黄粉末270质量份、脱脂奶粉209质量份、氯化钠4.4质量份、氯化钾1.8质量份、硫酸镁4质量份、硫胺素0.01质量份、L-抗坏血酸钠0.1质量份、维生素E乙酸盐0.6质量份以及尼克酰胺0.04质量份构成的配合物，将每25克该配合物填充到防湿性层压塑料小袋中，进行热封，得到制品。本品由于环状麦芽糖基麦芽糖对难消化性的食物纤维进行了强化，作为在整肠作用优良的流食，可通过经口的、或经管向鼻腔、胃、肠等输送的使用方法利用，在向机体的能量补给用中可有效利用。

实施例22

<片剂>

将通过实施例6的方法得到的环状麦芽糖基麦芽糖含水结晶粉末14质量份、玉米淀粉4质量份与阿斯匹林50质量份充分混合后，按照常规方法用压片机压片，制造厚5.25mm、1片680mg的片剂。本品由于是利用了环状麦芽糖基麦芽糖的赋形性的产品，所以无吸湿性，物理强度也充分，而且在水中的崩解非常良好。

实施例23

<外伤治疗用膏药>

下通过实施例6的方法得到的环状麦芽糖基麦芽糖含水结晶粉末100质量份和麦芽糖300质量份加溶解了碘3质量份的甲醇50质量份，并混合，再加10w/v％的支链淀粉水溶液200质量份，进行混合，得到表现出适度延展、付着性的外伤治疗用膏药。本品是通过环状麦芽糖基麦芽糖防止碘、甲醇的挥散，随时间变化少的商品价值高的膏药。另外，本品不仅有通过碘的杀菌作用，而且也有通过麦芽糖向细胞提供能量的能量补给剂的作用，所以可缩短治愈疗程，伤口愈合的也很整齐。

产业上的可利用性

通过本发明可以提供使用环状麦芽糖基麦芽糖合成酶大量制造以往未知的具有环{→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}结构的新的环状糖，即环状麦芽糖基麦芽糖。由于本糖具有非还原性，与氨基化合物不发生氨基羰基反应(美拉德反应)和褐变，另外由于是环状糖，具有包合能力，可以抑制包合的化合物的挥发，使其稳定。可提供新的环状麦芽糖基麦芽糖的本发明应当说对饮食物、化妆品、医药品等各个应用领域有贡献，其产业上意义非常大。

序列表

<110>株式会社林原生物化学研究所

<120>环状麦芽糖基麦芽糖以及环状麦芽糖基麦芽糖合成酶和它们的制造方法及其用途

<130>10102802

<160>10

<210>1

<211>5

<212>PRT

<213>球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)

<400>1

Asp Pro Thr Thr Ser

1 5

<210>2

<211>583

<212>PRT

<213>球形节杆菌

<400>2

Asp Pro Thr Thr Ser Pro Gly Pro Leu Ala Glu Gly Asp Val Ile Tyr

1 5 10 15

Gln Val Leu Val Asp Arg Phe Glu Asp Gly Asp Pro Thr Asn Asn Asp

20 25 30

Gln Gly Asp Gly Glu Tyr Asp Pro Ser Asp Leu Gly Phe Tyr His Gly

35 40 45

Gly Asp Trp Ala Gly Leu Thr Asp Arg Leu Asp Tyr Ile Ala Asp Leu

50 55 60

Gly Val Thr Ala Ile Trp Leu Ser Pro Val Ser Glu Gln Gln Pro Leu

65 70 75 80

Ser Arg Asp Gly Leu Glu Ala Ser Tyr His Gly Tyr Phe Thr Arg Asp

85 90 95

Phe Ala Thr Pro Ash Glu His Phe Gly Asp Arg Ala Glu Leu Gln Glu

100 105 110

Leu Ile Asp Thr Ala His Asp Leu Gly Leu Lys Met Ile Leu Asp Val

115 120 125

Val Pro Asn His Thr Ala Asp Tyr Leu Ala Gly Thr Ser Thr Thr Tyr

130 135 140

Ser Pro Ser Thr Tyr Lys Pro Ala Ser Pro Leu Asp Asp Ala Ser Tyr

145 150 155 160

Phe His His Ala Gly Asp Cys Leu Phe Asn Gly Leu Glu Thr Gln Thr

165 170 175

Gln Ile Glu Asn Cys Asp Leu Gly Gly Leu Asp Asp Leu Asp Gln Ser

180 185 190

Asn Pro Val Val Ser Ser His Leu Met Ser Thr Tyr Lys Asp Trp Val

195 200 205

Asp Met Gly Phe Asp Gly Ile Arg Val Asp Ala Ala Arg Ser Val Pro

210 215 220

Lys Pro Trp Leu Ala Asp Phe Glu Ala Glu Met Gly Val Pro Thr Phe

225 230 235 240

Gly Glu Val Phe Val Gly Asp Val Asp Tyr Val Ser Glu Tyr Gln Asp

245 250 255

Tyr Glu Trp Gly Val Leu Asp Phe Pro Tyr Phe Phe Thr Val Arg Glu

260 265 270

Ala Phe Ser Ala Asp Thr Asp Met Asn Lys Leu Gly Asp Leu Phe Asp

275 280 285

Gln Asp Ser Lys Tyr Ala Asn Pro Asn Arg Leu Glu Thr Phe Leu Asp

290 295 300

Asn His Asp Arg Ala Arg Phe Leu Thr Trp Ala Asp Asp Asn Tyr Gln

305 310 315 320

Arg Leu Arg Ser Gly Leu Thr Phe Leu Leu Thr Ser Arg Gly Val Pro

325 330 335

Val Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Ala Asp Asp Gly Asn Gly Asn Pro

340 345 350

Tyr Glu Val Pro Ile Ala Asn Lys Asp Asn Arg Lys Asp Met Glu Ser

355 360 365

Phe Asp Gln Asn Ser Asn Leu Tyr Lys His Ile Gln Arg Leu Thr Ala

370 375 380

Ile Lys Ala Ala Tyr Pro Ala Leu Gln Val Gly Thr Gln Arg Glu Met

385 390 395 400

Trp Ser Asp Thr Ser Val Tyr Gly Phe Ser Arg Arg Val Asp Ser Thr

405 410 415

Gly Ala Glu Ala Met Thr Phe Ser Ser Asn Ser Trp Thr Thr Gln Thr

420 425 430

Arg Thr Val Pro Leu Arg Ala Glu Ser Ser Ile Thr Val Gly Thr Thr

435 440 445

Leu Thr Asn Leu Met Asn Thr Gly Asp Thr Val Thr Val Thr Ala Gly

450 455 460

Gly Val Thr Gly Lys Gln Ile Thr Val Ser Leu Gly Glu His Glu Ser

465 470 475 480

Lys Val Tyr Ala Pro Gly Thr Pro Val Ser Ala Tyr Ser Pro Glu Ala

485 490 495

Arg Asn Thr Thr Lys Ile Arg Val His Tyr Asn Val Gly Leu Gly His

500 505 510

Ser Ile Ala Ile Arg Gly Asp Glu Tyr Pro Phe Thr Trp Thr Ser Gly

515 520 525

Arg Gly Ala Arg Asn Val Ala Ser Asp Val Trp Glu Phe Glu Val Glu

530 535 540

Arg Ile Pro Asp Gly Glu Thr Phe Gln Phe Lys Pro Leu Ile Asp Asp

545 550 555 560

Val Thr Trp Ser Thr Gly Gly Asn Phe Thr Gly Thr Gly Gly Asp Val

565 570 575

Ile Asp Ile Tyr Pro Thr Phe

580 583

<210>3

<211>1749

<212>DNA

<213>球形节杆菌

<400>3

gaccccacca cgtcgcccgg cccgctggcc gagggcgacg tgatctacca ggtgctcgtc 60

gaccggttcg aagacggcga ccccaccaac aacgaccagg gcgacggaga gtacgatccg 120

tccgacctcg gtttctacca cggcggcgac tgggcgggcc tgacggaccg gctcgactac 180

atcgccgatc tgggtgtgac ggcgatctgg ctctcgcccg tctccgagca gcagccgctc 240

tcgcgcgacg ggctggaggc cagctaccac ggctacttca ctcgggactt cgcgacgccg 300

aacgagcatt tcggcgaccg agccgagctg caggagctga tcgacacggc gcacgatctc 360

ggactcaaga tgatcctcga cgtcgtgccg aaccacacgg ccgactacct cgcgggcaca 420

tcgacgacct attcgccgag cacctacaag ccggcgagtc cgctcgatga cgcgtcgtac 480

ttccatcacg ccggcgactg cctgttcaac gggctcgaga cgcagaccca gatcgagaac 540

tgcgacctcg gcgggctcga cgacctcgat cagtcgaacc cggtcgtctc gtcgcacctg 600

atgagcacgt acaaggactg ggtcgacatg ggcttcgacg gcatccgggt cgatgcggcg 660

cgctcggtgc cgaagccgtg gctcgccgac ttcgaagccg agatgggcgt gccgaccttc 720

ggcgaggtgt tcgtcggcga tgtcgactac gtctcggagt accaggacta cgagtggggc 780

gtgctcgact tcccctactt cttcacggtg cgcgaggcgt tctcggccga taccgacatg 840

aacaagctcg gcgacctctt cgaccaggac agcaagtacg cgaacccgaa ccggctggag 900

acgttcctcg acaaccacga tcgggcgcgg ttcctcacct gggccgatga caactatcag 960

cggctgcgct caggactgac gttcctccta acctcccggg gcgtgcccgt gatctactac 1020

ggcaccgagc aggccgacga cggcaacggc aacccctacg aggtaccgat cgcgaacaag 1080

gacaaccgca aggacatgga gagcttcgat cagaactcga acctctacaa gcacatccag 1140

cggttgaccg cgatcaaggc cgcttacccg gctctgcagg tcggcacaca gcgcgagatg 1200

tggtccgaca cctccgtcta cgggttctcg cgacgcgtcg acagcacggg tgccgaggcg 1260

atgaccttct cgtcgaactc gtggacgacg cagacgcgca cggtgccgct gcgcgccgag 1320

agctcgatca cggtcggtac gacgctgacg aacctcatga acacgggcga cacggtgacc 1380

gtgaccgccg gcggtgtcac ggggaagcag atcaccgtct ccctcggcga gcacgagagc 1440

aaggtctatg cgcccggcac cccggtatcg gcatacagcc ccgaagcgcg caacaccacg 1500

aagatccgcg tgcactacaa cgtgggcctc gggcacagca tcgcgatccg cggcgacgag 1560

tacccgttca cctggacctc cggccgaggc gcgcgcaacg tcgcgtccga cgtctgggag 1620

ttcgaggtcg agcgcatccc cgacggtgag accttccagt tcaagcctct gatcgacgac 1680

gtcacctggt cgaccggcgg caacttcacc gggacgggcg gcgacgtgat cgacatctac 1740

cccaccttc 1749

<210>4

<211>9

<212>PRT

<213>球形节杆菌

<400>4

His Ile Gln Arg Leu Thr Ala Ile Lys

1 5

<210>5

<211>13

<212>PRT

<213>球形节杆菌

<400>5

Asp Met Glu Ser Phe Asp Gln Asn Ser Asn Leu Tyr Lys

1 5 10

<210>6

<211>10

<212>PRT

<213>球形节杆菌

<400>6

Leu Gly Asp Leu Phe Asp Gln Asp Ser Lys

1 5 10

<210>7

<211>27

<212>PRT

<213>球形节杆菌

<400>7

Met Ile Leu Asp Val Val Pro Asn His Thr Ala Asp Tyr Leu Ala Gly

1 5 10 15

Thr Ser Thr Thr Tyr Ser Pro Ser Thr Tyr Lys

20 25

<210>8

<211>20

<212>PRT

<213>球形节杆菌

<400>8

Asp Trp Val Asp Met Gly Phe Asp Gly Ile Arg Val Asp Ala Ala Arg

1 5 10 15

Ser Val Pro Lys

20

<210>9

<211>30

<212>PRT

<213>球形节杆菌

<400>9

Tyr Ala Asn Pro Asn Arg Leu Glu Thr Phe Leu Asp Asn His Asp Arg

1 5 10 15

Ala Arg Phe Leu Thr Trp Ala Asp Asp Asn Tyr Gln Arg Leu

20 25 30

<210>10

<211>4467

<212>DNA

<213>球形节杆菌

<400>10

ggatccctga gctggatggg catggctcac gcgctcgatc tcgagggggc ggcgaaggag 60

ctggcgaccg cagccggcga ggcacctctc ctccgcccgg ccgacctcgt ctacctcggc 120

gtcgatctcg cgcagacgac ggagggagaa cggtcgcagc gggaggcgct cgggctcgct 180

gtcgtcgagc agaacgctct cgtcgccgat cctcggcgag ctgctcggac cgcacgagcc 240

cacctcgccc caggaccgtt catcgtgcac ctggacgtcg atgtgctgga cttcctcgac 300

gcaccccttg ccgagaacgt gaacggccga aacagcgggc cgaccgtcga gcagctgcgg 360

gtcgcactcg ccgagcttct gcagcatccg gactgctggg cgatgtccat cggccaggtg 420

gtccccgcgc acgcggcggc cgacccgacc tccatcccgc ggctcatcgg cgccctggcc 480

gtgagctcca cgtagccgga cgtcgctcct ggagcggagc cgctccggca ggaacggcgt 540

cgcaccccgt cgagcggggg cgtcgccctc ttcgacgggg tctgcggcgc ggctacccgc 600

gcggcagcgt gagccgccac cgaccagatc tcatgcattt ggacgaactt cgccgtccaa 660

ttctctccgc gcctcaagca ggtatacatc gctcgaacgc gtcttcactg gcctgacggt 720

ccgcgatcac gtcgtgcagt gaagcatcct gccgcgaagg gtcttgatgc gcatgcagta 780

cgggagtcga atcactttca cgggcacggc cggtgtcagt acttgacaaa acgcatttat 840

acatgttgca tcgatccagt aaaccgtgca gctcgcggac cgatgcgcat ccgacaacga 900

agtcaggaga gagtc atg aga acg aca gtt cgt acc gct cgc gtc tcc gcg 951

Met Arg Thr Thr Val Arg Thr Ala Arg Val Ser Ala

1 5 10

cgt acg ggc ctc gcg atg gga gca gcc gtc gcg ctg gcg gcc ggc gcg 999

Arg Thr Gly Leu Ala Met Gly Ala Ala Val Ala Leu Ala Ala Gly Ala

15 20 25

ctc acc tgg ggc acc ggc ccc gca ccc gcg agt gcc gac ccc acc acg 1047

Leu Thr Trp Gly Thr Gly Pro Ala Pro Ala Ser Ala Asp Pro Thr Thr

30 35 40

tcg ccc ggc ccg ctg gcc gag ggc gac gtg atc tac cag gtg ctc gtc 1095

Ser Pro Gly Pro Leu Ala Glu Gly Asp Val Ile Tyr Gln Val Leu Val

45 50 55 60

gac cgg ttc gaa gac ggc gac ccc acc aac aac gac cag ggc gac gga 1143

Asp Arg Phe Glu Asp Gly Asp Pro Thr Asn Asn Asp Gln Gly Asp Gly

65 70 75

gag tac gat ccg tcc gac ctc ggt ttc tac cac ggc ggc gac tgg gcg 1191

Glu Tyr Asp Pro Ser Asp Leu Gly Phe Tyr His Gly Gly Asp Trp Ala

80 85 90

ggc ctg acg gac cgg ctc gac tac atc gcc gat ctg ggt gtg acg gcg 1239

Gly Leu Thr Asp Arg Leu Asp Tyr Ile Ala Asp Leu Gly Val Thr Ala

95 100 105

atc tgg ctc tcg ccc gtc tcc gag cag cag ccg ctc tcg cgc gac ggg 1287

Ile Trp Leu Ser Pro Val Ser Glu Gln Gln Pro Leu Ser Arg Asp Gly

110 115 120

ctg gag gcc agc tac cac ggc tac ttc act cgg gac ttc gcg acg ccg 1335

Leu Glu Ala Ser Tyr His Gly Tyr Phe Thr Arg Asp Phe Ala Thr Pro

125 130 135 140

aac gag cat ttc ggc gac cga gcc gag ctg cag gag ctg atc gac acg 1383

Asn Glu His Phe Gly Asp Arg Ala Glu Leu Gln Glu Leu Ile Asp Thr

145 150 155

gcg cac gat ctc gga ctc aag atg atc ctc gac gtc gtg ccg aac cac 1431

Ala His Asp Leu Gly Leu Lys Met Ile Leu Asp Val Val Pro Asn His

160 165 170

acg gcc gac tac ctc gcg ggc aca tcg acg acc tat tcg ccg agc acc 1479

Thr Ala Asp Tyr Leu Ala Gly Thr Ser Thr Thr Tyr Ser Pro Ser Thr

175 180 185

tac aag ccg gcg agt ccg ctc gat gac gcg tcg tac ttc cat cac gcc 1527

Tyr Lys Pro Ala Ser Pro Leu Asp Asp Ala Ser Tyr Phe His His Ala

190 195 200

ggc gac tgc ctg ttc aac ggg ctc gag acg cag acc cag atc gag aac 1575

Gly Asp Cys Leu Phe Asn Gly Leu Glu Thr Gln Thr Gln Ile Glu Asn

205 210 215 220

tgc gac ctc ggc ggg ctc gac gac ctc gat cag tcg aac ccg gtc gtc 1623

Cys Asp Leu Gly Gly Leu Asp Asp Leu Asp Gln Ser Asn Pro Val Val

225 230 235

tcg tcg cac ctg atg agc acg tac aag gac tgg gtc gac atg ggc ttc 1671

Ser Ser His Leu Met Ser Thr Tyr Lys Asp Trp Val Asp Met Gly Phe

240 245 250

gac ggc atc cgg gtc gat gcg gcg cgc tcg gtg ccg aag ccg tgg ctc 1719

Asp Gly Ile Arg Val Asp Ala Ala Arg Ser Val Pro Lys Pro Trp Leu

255 260 265

gcc gac ttc gaa gcc gag atg ggc gtg ccg acc ttc ggc gag gtg ttc 1767

Ala Asp Phe Glu Ala Glu Met Gly Val Pro Thr Phe Gly Glu Val Phe

270 275 280

gtc ggc gat gtc gac tac gtc tcg gag tac cag gac tac gag tgg ggc 1815

Val Gly Asp Val Asp Tyr Val Ser Glu Tyr Gln Asp Tyr Glu Trp Gly

285 290 295 300

gtg ctc gac ttc ccc tac ttc ttc acg gtg cgc gag gcg ttc tcg gcc 1863

Val Leu Asp Phe Pro Tyr Phe Phe Thr Val Arg Glu Ala Phe Ser Ala

305 310 315

gat acc gac atg aac aag ctc ggc gac ctc ttc gac cag gac agc aag 1911

Asp Thr Asp Met Asn Lys Leu Gly Asp Leu Phe Asp Gln Asp Ser Lys

320 325 330

tac gcg aac ccg aac cgg ctg gag acg ttc ctc gac aac cac gat cgg 1959

Tyr Ala Asn Pro Asn Arg Leu Glu Thr Phe Leu Asp Asn Hi s Asp Arg

335 340 345

gcg cgg ttc ctc acc tgg gcc gat gac aac tat cag cgg ctg cgc tca 2007

Ala Arg Phe Leu Thr Trp Ala Asp Asp Asn Tyr Gln Arg Leu Arg Ser

350 355 360

gga ctg acg ttc ctc cta acc tcc cgg ggc gtg ccc gtg atc tac tac 2055

Gly Leu Thr Phe Leu Leu Thr Ser Arg Gly Val Pro Val Ile Tyr Tyr

365 370 375 380

ggc acc gag cag gcc gac gac ggc aac ggc aac ccc tac gag gta ccg 2103

Gly Thr Glu Gln Ala Asp Asp Gly Asn Gly Asn Pro Tyr Glu Val Pro

385 390 395

atc gcg aac aag gac aac cgc aag gac atg gag agc ttc gat cag aac 2151

Ile Ala Asn Lys Asp Asn Arg Lys Asp Met Glu Ser Phe Asp Gln Asn

400 405 410

tcg aac ctc tac aag cac atc cag cgg ttg acc gcg atc aag gcc gct 2199

Ser Asn Leu Tyr Lys His Ile Gln Arg Leu Thr Ala Ile Lys Ala Ala

415 420 425

tac ccg gct ctg cag gtc ggc aca cag cgc gag atg tgg tcc gac acc 2247

Tyr Pro Ala Leu Gln Val Gly Thr Gln Arg Glu Met Trp Ser Asp Thr

430 435 440

tcc gtc tac ggg ttc tcg cga cgc gtc gac agc acg ggt gcc gag gcg 2295

Ser Val Tyr Gly Phe Ser Arg Arg Val Asp Ser Thr Gly Ala Glu Ala

445 450 455 460

atg acc ttc tcg tcg aac tcg tgg acg acg cag acg cgc acg gtg ccg 2343

Met Thr Phe Ser Ser Asn Ser Trp Thr Thr Gln Thr Arg Thr Val Pro

465 470 475

ctg cgc gcc gag agc tcg atc acg gtc ggt acg acg ctg acg aac ctc 2391

Leu Arg Ala Glu Ser Ser Ile Thr Val Gly Thr Thr Leu Thr Asn Leu

480 485 490

atg aac acg ggc gac acg gtg acc gtg acc gcc ggc ggt gtc acg ggg 2439

Met Asn Thr Gly Asp Thr Val Thr Val Thr Ala Gly Gly Val Thr Gly

495 500 505

aag cag atc acc gtc tcc ctc ggc gag cac gag agc aag gtc tat gcg 2487

Lys Gln Ile Thr Val Ser Leu Gly Glu His Glu Ser Lys Val Tyr Ala

510 515 520

ccc ggc acc ccg gta tcg gca tac agc ccc gaa gcg cgc aac acc acg 2535

Pro Gly Thr Pro Val Ser Ala Tyr Ser Pro Glu Ala Arg Asn Thr Thr

525 530 535 540

aag atc cgc gtg cac tac aac gtg ggc ctc ggg cac agc atc gcg atc 2583

Lys Ile Arg Val His Tyr Asn Val Gly Leu Gly His Ser Ile Ala Ile

545 550 555

cgc ggc gac gag tac ccg ttc acc tgg acc tcc ggc cga ggc gcg cgc 2631

Arg Gly Asp Glu Tyr Pro Phe Thr Trp Thr Ser Gly Arg Gly Ala Arg

560 565 570

aac gtc gcg tcc gac gtc tgg gag ttc gag gtc gag cgc atc ccc gac 2679

Asn Val Ala Ser Asp Val Trp Glu Phe Glu Val Glu ArgIle Pro Asp

575 580 585

ggt gag acc ttc cag ttc aag cct ctg atc gac gac gtc acc tgg tcg 2727

Gly Glu Thr Phe Gln Phe Lys Pro Leu Ile Asp Asp Val Thr Trp Ser

590 595 600

acc ggc ggc aac ttc acc ggg acg ggc ggc gac gtg atc gac atc tac 2775

Thr Gly Gly Asn Phe Thr Gly Thr Gly Gly Asp Val Ile Asp Ile Tyr

605 610 615 620

ccc acc ttc tga acccatccct cccgggactc caccgaaagg atgcttgtga gccac 2832

Pro Thr Phe

accatcgaac ggccctctcg cctcgacacg gcaaggcgcg ccttctcctg gcgcgacgcg 2892

gtcgtctacc aggtctacct gcggtcgttc cgcgacgcga acggcgacgg catcggcgac 2952

ctcggcggcc tgagccaggg tctcgacgcg atcgccgcac tcggctgcga cgccatctgg 3012

ctgaacccct gctacgcctc gccccagcgc gaccacgggt acgacatcgc cgactacctg 3072

acgatcgatc cggcgtacgg caccctcgag gagttcgacg aggtggttcg ccgagcgcac 3132

gagctcgggc tgcgcgttct gatggacatg gtcgcgaacc actgctcgtc cgaccacgcc 3192

tggttccagg cggcgttggc cgccgagccc ggcagcgacg agcgggcgcg cttcatcttc 3252

cgcgacggcc tcggccccga tggcgaactg ccgccgaaca actgggacag cgtcttcgga 3312

gggctcgcct ggacccgcgt caccgagcgc gacggacgcc ccgggcagtg gtacctccac 3372

tcctttgata cgagccagcc cgacttcgat tggcggcacc ccgcggtggc cgagcacttc 3432

gagaacgtgc tgcggttctg gttcgagcgg ggagtcgacg gcttccgcat cgacgtcgcg 3492

cacggccact tcaaggacgc cgccctgccc gaccacccgg gtggccgggg gcctgacgcc 3552

ggccacaacc acggcatgtg ggaccagccc gaggtgcacg acctctatcg ctcgtggcga 3612

gcgctcggcg atgcctacga gcccgagaag tacttcgtgg gcgagatctg ggtcccctcc 3672

cccgaccggc tggccgacta cctgcgaccc gacgagctgc acaacgcctt ctcgttcgat 3732

ctgctcgtgc agccgtggaa cgccgaccgg ttccggaagg cgatcgagac cggactcgcc 3792

gtcggacgcg ggtggccggc ctggacactg gccaaccacg acgtgcatcg tgcggtcacc 3852

cgctacggcc aggagcagcc gttggatgaa gccctgccga ccgacatgat cgccgcggcg 3912

cgacgcaggg gcccggccga tctggatcgc ggtcttcgcc gtgcgcgcgc ggcagccgcc 3972

ctcgccctcg cgctcccggg gtcgatgtac ctctatcagg gcgaagaact cgggttgccc 4032

gaggttctgg atctcccgga tgctgcgcgc caagacccga tctggacccg ctcgaacggc 4092

accgagctcg gccgggacgg gtgccgcatc cccctcccct ggacgcgaga gggccgcacc 4152

ttcggattca gcgacgcggc cgccgccacg acctggctcc cgcagcccgc gtggttcggc 4212

gcgttcgccc gggcgacgca ggcggccgat cccgactcga tgctctcgct gcatcgcgat 4272

ctcctcgcca cgcgccgcac ccacctccgc ggaacggagc cgatcgtctg gctgtccccg 4332

gcaggtgccg aggtgctcgc cttccgacgc ggggacgtcg tggtcgtcac gaacttcggc 4392

tccgcaccct tcacgccgcc gtccgcctgg ggcgcgctct cgccgctcct ggcctcccag 4452

ccgctgacgg gatcc 4467

Claims

1.具有环{→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}结构的环状麦芽糖基麦芽糖。

2.环状麦芽糖基麦芽糖合成酶，是具有作用于葡萄糖聚合度在3以上的α-1，4葡聚糖，生成具有环{→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}结构的环状麦芽糖基麦芽糖作用的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶。

3.权利要求2所述的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶，该酶具有下述理化学性质：

(1)分子量

通过SDS-凝胶电泳法测得72000±20000道尔顿；

(2)等电点

通过含有两性电解质的等电点电泳法测得pI3.6±0.5；

(3)最适温度

在pH6.0、30分钟反应的条件下，最适温度范围在50℃至55℃；

(4)最适pH

在40℃、30分钟反应的条件下，最适pH范围在pH5.5至6.5；

(5)温度稳定性

在pH6.0、保持60分钟的条件下，至30℃稳定；

在1mM钙离子存在下，至50℃稳定。

(6)pH稳定性

在4℃、保持24小时的条件下，在pH5.0至9.0稳定。

4.权利要求2或3所述环的状麦芽糖基麦芽糖合成酶，其中，作为N末端氨基酸序列，具有序列表中序列编号1所示的氨基酸序列。

5.权利要求2至4中任一项所述的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶，其中，具有序列表中序列编号2所示的氨基酸序列，或具有在序列表中序列编号2所示的氨基酸序列中，在保持该酶活性的范围内缺失、置换或附加1个或2个以上的氨基酸的氨基酸序列。

6.权利要求2至5中任一项所述的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶，其中，葡萄糖聚合度大于等于3的α-1，4葡聚糖是从麦芽低聚糖、麦芽糖糊精、淀粉糊精、直链淀粉、支链淀粉、可溶性淀粉、液化淀粉、糊化淀粉以及糖原中选出的1种或2种以上的糖。

7.权利要求2至6中任一项所述的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶，其中，环状麦芽糖基麦芽糖合成酶是来自微生物的酶。

8.权利要求7所述的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶，其中，微生物是节杆菌属的微生物。

9.权利要求8所述的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶，其中，节杆菌属的微生物是球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)M6(独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，保藏编号FERMBP-8448)或其变异株。

10.具有生产环状麦芽糖基麦芽糖合成酶能力的微生物，该微生物为球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)M6(独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心、保藏编号FERM BP-8448)或其变异株。

11.编码权利要求2至9中任一项所述的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶的DNA。

12.权利要求11所述的DNA，该DNA具有序列表中序列编号3所示的碱基序列，或具有在序列表中序列编号3所示的碱基序列中，在保持编码的酶的活性的范围内缺失、置换或附加1个或2个以上碱基的碱基序列、或与上述序列互补的碱基序列。

13.权利要求11或12所述的DNA，其中，根据基因编码的简并性，不改变编码的氨基酸序列，序列表中序列编号3所示的碱基序列中的1个或2个以上碱基被其它碱基置换。

14.权利要求11至13中任一项所述的DNA，是来自于节杆菌属的微生物。

15.含有权利要求11至14中任一项所述的DNA和可自我复制载体的可复制的重组DNA。

16.权利要求15所述的重组DNA，其中，可自我复制的载体是质粒载体Bluescript IISK(+)。

17.将权利要求15或16所述的重组DNA导入适当宿主后构成的转化体。

18.权利要求17所述的转化体，其中，宿主是大肠杆菌。

19.环状麦芽糖基麦芽糖合成酶的制造方法，其特征是：将具有权利要求2至9中任一项所述的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶的产生能力的微生物在营养培养基中进行培养，从得到的培养物提取权利要求2至9中任一项所述的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶。

20权利要求19所述的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶的制造方法，其中，微生物是节杆菌属的微生物。

21.权利要求20所述环状麦芽糖基麦芽糖合成酶的制造方法，其中，节杆菌属的微生物是球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)M6(独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心、保藏编号FERM BP-8448)或其变异株。

22.重组型环状麦芽糖基麦芽糖合成酶的制造方法，其特征是对权利要求17或18所述的转化体进行培养，从培养物中获取重组型环状麦芽糖基麦芽糖合成酶。

23.具有环{→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}结构的环状麦芽糖基麦芽糖的生成方法，其特征是使权利要求2至9任一项中所述的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶作用于含有葡萄糖聚合度在3以上的α-1，4葡聚糖的溶液。

24.权利要求23所述的具有环{→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}结构的环状麦芽糖基麦芽糖的生成方法，其中，葡萄糖聚合度在3以上的α-1，4葡聚糖是从麦芽低聚糖、麦芽糖糊精、淀粉糊精、直链淀粉、支链淀粉、可溶性淀粉、液化淀粉、糊化淀粉以及糖原中选出的1种或2种以上的糖。

25.使权利要求2至9任一项中所述的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶作用于含有葡萄糖聚合度在3以上的α-1，4葡聚糖的溶液得到的具有环{→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}结构的环状麦芽糖基麦芽糖、或含有该糖的糖类。

26.权利要求25所述的具有环{→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}结构的环状麦芽糖基麦芽糖、或含有该糖的糖类，其中，葡萄糖聚合度在3以上的α-1，4葡聚糖是从麦芽低聚糖、麦芽糖糊精、淀粉糊精、直链淀粉、支链淀粉、可溶性淀粉、液化淀粉、糊化淀粉和糖原中选出的1种或2种以上的糖。

27.具有环{→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}结构的环状麦芽糖基麦芽糖、或含有该糖的糖类，是使权利要求2至9任一项中所述的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶作用于含有葡萄糖聚合度在3以上的α-1，4葡聚糖的溶液，制备成含有具有环{→6}-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→)结构的环状麦芽糖基麦芽糖和其它糖的溶液，将该溶液进行使用强酸性阳离子交换树脂的柱层析后得到的。

28.含有具有环{→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}结构的环状麦芽糖基麦芽糖的糖，其特征是每单位固形物含有1质量％以上具有环{→6}-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→)结构的环状麦芽糖基麦芽糖。

29.具有环{→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}结构的环状麦芽糖基麦芽糖，或含有该糖的糖类，其特征是：其形态是糖浆、结晶浆液、非晶质粉末、非晶质固形物、结晶或结晶固形物的任一种。

30.具有环{→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}结构的环状麦芽糖基麦芽糖，或含有该糖的糖类的制造方法，其特征是使权利要求2至9任一项中所述的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶作用于已经将淀粉糊化和/或液化的溶液。

31.权利要求30所述的具有环{→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}结构的环状麦芽糖基麦芽糖，或含有该糖的糖类的制造方法，其中，已经使淀粉糊化和/或液化的溶液是DE20以下的溶液。

32.权利要求30或31所述的具有环{→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}结构的环状麦芽糖基麦芽糖，或含有该糖的糖类的制造方法，其特征是使权利要求2至9任一项中所述的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶与异淀粉酶一起作用于已经将淀粉糊化和/或液化的溶液，根据需要，再使从α-淀粉酶、β-淀粉酶、环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶、葡萄糖淀粉酶、α-糖苷酶中选出的1种或2种以上的酶作用。

33.权利要求30至32中任一项所述的具有环{→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}结构的环状麦芽糖基麦芽糖，或含有该糖的糖的制造方法，其特征是使权利要求2至9任一项中所述的环状麦芽糖基麦芽糖合成酶与异淀粉酶一起作用于已经将淀粉糊化和/或液化的溶液，根据需要，再使从α-淀粉酶、β-淀粉酶、环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶、葡萄糖淀粉酶、α-糖苷酶中选出的1种或2种以上的酶作用后，使用从柱层析级分、膜分离、微生物发酵处理和碱处理进行分解除去中选出1种或2种以上的纯化方法。

34.权利要求30至33中任一项所述的具有环{→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}结构的环状麦芽糖基麦芽糖，或含有该糖的糖类的制造方法，其特征是每单位固形物含有1质量％以上的具有环{→6}-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→)结构的环状麦芽糖基麦芽糖。

35.权利要求30至34任一项中所述的具有环{→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}结构的环状麦芽糖基麦芽糖、或含有该糖的糖的制造方法，其中形态是糖浆、结晶浆液、非晶质粉末、非晶质固形物、结晶或结晶固形物。

36.组合物，该组合物含有具有环{→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}结构的环状麦芽糖基麦芽糖、或含有该糖的糖类的组成物。

37.权利要求36所述的组成物，其中，组成物是饮食物、化妆品或医药品。

38.权利要求36或37所述的组成物，其中，每单位固形物含有0.1质量％以上的具有环{→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→}结构的环状麦芽糖基麦芽糖。