CN1054855C - 未还原的低聚糖及其制备方法和用途 - Google Patents

未还原的低聚糖及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

具有由式α-D-低聚葡糖基α-D-低聚葡糖苷表示的结构的新的未还原低聚糖通过使含有海藻糖和α-葡糖基糖的水溶液或含有在其末端具有海藻糖结构的未还原糖的水溶液受糖转移酶作用得到。低聚糖具有降低的甜度、优良的稳定性、合适的粘度，对结晶几乎无敏感性或在结晶形式时有优良的溶解度。这些特性使该低聚糖广泛用于各种组合物，包括食品、饮料、化妆品、药品和成型体。

Description

未还原的低聚糖及其制备方法和用途
本发明是关于新的糖类及其制备方法和用途，特别是关于由通式α-D-低聚葡糖基α-D低聚葡糖苷表示的未还原的低聚葡糖及其制备方法和用途。
已知几种不同类型的未还原的低聚糖：已经发现的一种类型的低聚糖中，蔗糖、erlose、棉子糖、松三糖和蔗果三糖、葡萄糖和果糖由α-1和β-2键连接，换言之，低聚糖分子中有蔗糖结构；糖醇，例如麦芽糖醇、麦芽三糖醇和乳糖醇；和海藻糖，其中蔗糖由α-1和α-1键互相连接。但是，在分子中有蔗糖结构的低聚糖在酸性溶液中容易分解，因为蔗糖结构是不稳定的。这些的确限制了食品、饮料等的生产。通常由高压加氢制备的糖醇具有优良的稳定性，但是其在过量吸收时也具有可以引起腹泻的缺点，因为糖醇在人体内不易消化和同化。可是，海藻糖很稳定，本发明人发现其在人体中易于消化和同化成能量。还发现海藻糖分子量低、粘度低，因此，在以浓的水溶液使用时可结晶性太高，在贮存过程中析出结晶，这些限制了其在食品工业中的应用。因此，迫切需要开发高级未还原的低聚糖，其具有优良的稳定性、消化性和同化性，还具有合适的粘度，对结晶几乎无敏感性或在结晶形式时具有优良的溶解度。
本发明提供了其分子中具有海藻糖结构的新的未还原的低聚糖，其对结晶几乎无敏感性或在结晶形式时具有优良的溶解度，以及提供未还原的低聚糖的制备方法和用途。
为了形成这样的未还原的低聚糖和确定其制备方法，本发明者研究了可以将其他糖连接到海藻糖分子中的两个葡糖基上的各种方法。本项研究实际上导致发现本发明的目的可由下述方法达到：使含有海藻糖和α-葡糖基糖的水溶液或者含有在其未端具有海藻糖结构的未还原糖(在本发明中这类糖可优选α-D-低聚葡糖基α-D-低聚葡糖苷)的水溶液，如同本申请人在日本专利申请362,131/92号公开的那样，受糖转移酶作用，这样，完成了本发明。除了制备方法外，本发明特别提供了新的未还原低聚糖，其中一个或几个葡糖基与海藻糖中两个葡糖基连接。另外，本发明还提供未还原低聚糖的几个用途，其性能包括优良的稳定性，合适的粘度，几乎无结晶性或在结晶形式时优良的溶解度，用口吸入时无味或降低的甜度和同化成热。
图1说明温度对由根瘤菌属(Rhizobium)M-11种得到的未还原糖生成酶的活性的影响。
图2说明PH值对由根瘤菌属M-11种得到的未还原糖生成酶的活性的影响。
图3说明由根瘤菌属M-11种得到的未还原糖生成酶的热稳定性。
图4说明由根瘤菌层M-11种得到的未还原糖生成酶的PH值稳定性。
图5是结晶的α-D-麦芽三糖基α-D-麦芽三糖苷的红外吸收光谱。
图6是结晶的α-D-麦芽三糖基α-D-麦芽三糖苷粉沫X-射线衍射图。
虽然本发明的未还原的低聚糖可以用化学方法合成，但是从工业观点用生物化学反应来合成是最有利的，具体地说，其中使糖转移酶与含有海藻糖和α-葡糖基糖的水溶液或者含有在其未端具有海藻糖结构的未还原糖的水溶液作用。优选的海藻糖源是含有可能最高含量海藻糖的糖浆和粉末，通常含量5％(W/W)或更多，优选20％(W/W)或更多，更优选含有50％(W/W)或更多海藻糖的粉末(下文中使用的百分数除非另有说明指的是“W/W％”)。为了制备这类糖浆或粉末，其中部分还原的淀粉水解产物用酶催化转化的方法，特别是本申请人在日本专利申请362,131/92号，156,338/93号和199,971/93号中公开的那些方法，是适合使用的，因为这些方法促进了大规模生产。必要时市场上可买到的海藻糖可任意使用。
适用于本发明的α-葡糖基糖是具有α-葡糖苷键的那些糖，例如淀粉、胶凝淀粉、液化淀粉、加溶淀粉、直链淀粉、支链淀粉、部分还原的淀粉水解物、糖转移淀粉产物、环糊精、糊精、麦芽糖低聚糖和蔗糖。
适用于本发明的未还原糖是本申请人在日本专利申请362,131/92号中公开的那些糖，可以通过使部分过原的淀粉水解产物与具有由葡萄糖聚合度3或更高的部分还原的淀粉水解物生成在其未端具有海藻糖结构的未还原糖的酶的作用来制备(该酶在本发明中可称为未还原糖生成酶)。正如本发明人在日本专利申请349,216/93号中公开的那样，这类未还原糖生成酶可以是能够生成该酶的微生的培养物，所述微生物例如根瘤菌属(Rhizobium)M-11种和节杆菌属(Arthrobacter)Q36种，其保藏在      ThePatentMicroorganism Depository， National   InstituteofBioscience    and    Humantechnology，  Agency   ofIndustrialScience and Technology，1-3，Higashi.1  chomeTsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan，保藏号分别是FERM BP-4230和FERM BP-4316，和通用的微生物，包括Brevibacteriumhelovolum(ATCC 11822)、     水生黄杆菌(Flavobueteriumaquatile)(IFO3772)、藤黄微球菌(Microcoecus luteus)(IF03064)、玫瑰色微球菌(Microeccus rosens)(ATCC 186)、Curtobacteriumcitreum(IFO 15231)、耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)  (ATCC 19420)  和Terrabactertumeseens(IFO12960)，或者是通过用常用方法随意提纯该培养物可得到的酶制剂。上述培养物或酶制剂具有从葡萄糖聚合度3或更高的一种或多种部分还原的淀粉水解产物生成在其未端有海藻糖结构的未还原糖的性质。
在制备上述未还原糖中，合适的方法是使上述的未还原糖生成酶与部分未还原的淀粉水解产物作用，上述淀粉水解产物通常的制备方法为：使α-葡糖基糖，例如部分还原的淀粉水解产物，如淀粉、胶凝淀粉、液化淀粉、加溶淀粉、直链淀粉、支链淀粉和糊精，受到α-淀粉酶作用或者受到α-淀粉酶和淀粉脱支酶作用。
关于糖转移酶，环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶(EC 2.4.1.19)是最好的，但是在必要时可使用其他酶如α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)和α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.20)。    在使用环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶时，可任意选择由通用的芽孢杆菌属(Bacillus)或克雷白氏杆菌属(klebsiella)的微生物得到的那些酶。α-淀粉酶包括由芽孢杆菌属的微生物得到的那些酶，特别是糖化的α-淀粉酶。α-葡糖苷酶包括通用的微生物和酶，除了由植物如稻谷和小麦种子得到的酶外，例如青霉属和毛霉属。
任何糖转移反应都可用于本发明中，只要其能得到本发明的未还原的低聚糖，根据使用的酶任意选择。例如，  在使用环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶或α-淀粉酶时，可以选择反应，使一种酶与含有海藻糖和α葡糖基糖如液化淀粉和部分还原淀粉水解产物的水溶液作用，以便使一个或多个α-葡糖基由α-葡糖基糖中转移到海藻糖中的两个葡糖基上，得到本发明的未还原的低聚糖。在这种情况下，α-葡糖基糖与海藻糖的重量比通常是0.1至100倍，优选0.2至20倍。另一方面，α-D-低聚葡糖基α-D-低聚葡糖苷可通过使在其未端有海藻糖结构的未还原糖与环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶作用来制备。在使用α-葡糖苷酶时，例如可选择使酶与含有海藻糖和α-葡糖基糖如糊精、麦芽糖低聚糖和有较低分子量的蔗糖的水溶液作用，以便使α-葡糖基从α-葡糖基糖上转移到海藻糖中的两个葡糖基上。在这种情况下，α-葡糖基糖与海藻糖的重量比通常是0.1至100倍，优选0.2至20倍。
这些酶催化反应通常在温度20-80℃和PH 3-9条件下进行，当用常用方法如载体约束法、交联法和截留法停止时，酶和微生物本身在连续或间歇方法中可重复使用。在上述糖转移反应中，从工业观点用环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶一般是最合适的，因为其允许使用较便宜的α-葡糖基糖作为糖供体，并得到高收率的α-D-低聚葡糖基α-D-低聚葡糖苷。特别是使用从嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)得到的环麦芽糖糊精葡糖转移酶是特别合适的，因为其可在高温下使用，这样可抑制在反应混合物中淀粉物质的逆行作用和微生物污染，和加速了酶催化反应。在这种情况下，含有海藻糖和α-葡糖基糖，例如胶凝淀粉、液化淀粉、DE1-50的部分还原淀粉水解产物、淀粉糊精和环糊精的水溶液，或者含有在其末端有海藻糖结构的未还原糖的水溶液，与每构α-葡糖基糖0.1单位或更多，优选1-25单位这样一种环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶作用1-100小时，优选4-70小时，生成未还原的低聚糖(缩写为“Gm-T-Gn”，其中“G”和“T”分别表示葡糖残基和α，α-海藻糖，而“m”和“n”表示整数1-8)，例如，麦芽糖基麦芽糖苷、麦芽三糖基麦芽糖苷、麦芽三糖基麦芽三糖苷、麦芽五糖基麦芽四糖苷和麦芽五糖基麦芽五糖苷，其中一个或几个α-葡糖基转移到海藻糖中的两个葡糖基上。在必要时，这些糖可以进一步与一种或多种水解酶，特别是β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)或β-淀粉酶和淀粉脱支酶如支链淀粉酶和异淀粉酶作用，以聚集做为主要产物的麦芽糖基麦芽糖苷、麦芽三糖基麦芽糖苷和麦芽三糖基麦芽三糖苷，接着收集产物。
通常含有多达5-60％(以干固体为基础)用上述糖转移反应或与水解结合生成的四或更多的α-D-低聚葡糖基α-D-低聚葡糖苷的溶液，在过滤、提纯、浓缩和用喷雾干燥或冷冻干燥脱水后，可以液体、糖浆或固体形式使用。
一般，为了充分发挥低级α-D-低聚葡糖基α-D-低聚葡糖苷的特性，在糖转换反应和接着的水解反应完成后，得到的含有四糖、五糖和六糖的溶液直接使用，或在使用之前进一步分离和提纯，成为富集四糖、五糖和六糖的产物、为了达到上述分离和提纯，任意选择通用方法，例如酵母发酵法、膜过滤法、分级沉降法、碱处理和/或柱色谱法，以分离和除去衍生的糖。特别是用强酸性阳离子交换剂盐的柱色谱，正如在日本专利特许公开23，799/83号和148,794/84号中公开的那样，适合于除去衍生的糖，以便收集富集未还原的四糖和五糖的级分或富集未还原的四糖、五糖和六糖的级分。在上述色谱中，可任意使用固定床法、移动床法和模拟移动床法。在必要时可分别收集四糖、五糖和六糖。
本发明的α-D-低聚葡糖基α-D-低聚葡糖苷是未还原的低聚糖，其很稳定、无味或甜度低，有合适的粘度，对结晶几乎不敏感或在结晶形式时易溶解。另外，本发明的低聚糖作为热源是有效的，因为其对消化酶是敏感的和由口吸入时在体内是可同化的。本发明的低聚糖还用作糖增甜剂物质，其具有减少的增甜能力和生龋性，因为其几乎不可能用生龋微生物发酵。本发明的低聚糖可与容易引起与糖的褐化反应的氨基酸和低聚肽一起使用，因为其化学上是稳定的。本发明的低聚糖能稳定容易失去其活性的生物活性物质以及具有合适的粘度，减少的发酵性和控制渗透压的性质，产生形状和光滑表面，防止其他糖的结晶，防止淀粉物质的逆行作用。
α-D-低聚葡糖基α-D-低聚葡糖苷的这些性质适于生产食品，包括食物、饮料、饲料和宠物饲料，以及生产各种组合物，包括化妆品、药品和有形体。本发明的有比较低分子量的α-D-低葡糖基α-D低聚葡糖苷的增甜能力很低，但是可直接用于增甜调味料。上述低聚糖可与合适量的一种或多种其他增甜剂一起使用，这些增甜剂例如粉状淀粉糖浆、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、异构化糖、蜜、槭糖、山梨糖醇、二氢查耳酮、卡哈苡苷、α-葡糖基卡哈苡苷、甜叶葡苷、甘草甜、L-天冬酰胺基-L-苯基丙氨酸甲酯、糖精、对羟苯基甘氨酸和丙氨酸，以及在必要时使用填料，例如糊精、淀粉和乳糖。
粉状的α-D-低聚葡糖基α-D-低聚葡糖苷可直接用作填料、赋形剂或粘合剂，或必要时，在与其他填料、赋形剂和/或粘合剂混合后成型为颗粒、球、棒条、板、立方体或片状，因为该粉末基本上是不吸湿的，很耐热的和很稳定的。该粉末适合作为例如糖食和焙烤食品的原料，其中面粉、玉米粉和淀粉部分或全部被上述粉末所代替。
一般，本发明的α-D-低聚葡糖基α-D-低聚葡糖苷适用于增甜食品和饮料，以及改善其味道和质量，因为上述低聚葡糖苷与具有其他类型味道如酸，成，涩，美味和较好味的物质很好调合，以及其酸性高和耐热。本发明的低聚葡糖适用于各种调味料，例如酱油、酱油粉、miso、miso粉、“moromi”、“hishio”、“furikake”、蛋黄酱、佐料、醋、“sanbai-zu”、“funmatsu-sushi-su”、“Chuka-no-moto”、tentsuyu“(cenpura 汤)”、“mentsuyu(日式面条汤)”、调味汁、调味番茄酱、“Yakinikn-no-tare(烤肉汤)、咖喱奶油面粉糊、stewpremix、预混合汤料、“dashi-no-moto”、混合调味料、“mirin(浓加甜清酒)”、“shin-mirin(合成的mirin)，食糖和咖啡糖。另外，本发明的低聚糖适用于增甜，例如日式糖食，如“senbei(脆米饼)”、“arare(片状senbei)”、“okoshi(粟和米薄脆饼干)、米粉糕、“manju(豆-果子酱夹心的奶油小圆甜面包)”、“uiro(甜米果冻)”、“an(豆果酱)”、“yokan(甜豆果冻)”、“mizu-yokan(软赤豆果冻)”、“kingyoku”、果冻、castella和“amedama(日式咖啡)；西式糖食，如奶油小圆甜面包、饼干、薄脆饼干、曲奇饼、馅饼、布丁、加糖奶油酱、蛋奶羹、奶油泡夫、华夫饼干、松蛋糕、多福饼、巧克力、口香糖、焦糖和糖果；冷冻甜食，如冰淇淋和冰糕；糖浆，如蜜饯用的那些糖浆和“kaki-gori(刨冰)；酱和糊，如面粉糊、花生酱、果泥；加工的水果和蔬菜，如果酱、马茉兰、糖果脯和蜜饯水果；腌制产品，如“fukujin zuka(用酱油腌制蔬菜片)”“bettara-zuke”(新鲜萝卜泡菜)”、“senmai-zuke”和rakkyozuke(腌制亚实基隆葱)”；腌制产品的预混合物，如“takuan-zuke-no-moto”和 “hakusai-zuke-no-moto”；“su-konbu”、“sakisurume”和“fugu-no-mirinboshi”；fugu-no-mirinboshi”；“tsukudani(用酱油蒸煮的食品)”，如紫菜(干海草)、“sansai(肉类产品，如火腿和香肠；鱼肉产品，如鱼肉火腿、鱼肉香肠、“kamaboko(清煮鱼酱)”、“chikuwa  (literally bamboowheels)”和“tenpura(油炸食品)”；调味品如“unino-shiokara(成海胆内脏)”、“ika-no-shiokara(成乌贼内赃)”、“su-konbu”、“sakisurume”和“fugu-no-mirinboshi”；“tsukudani(用酱油蒸煮的食品)”，如紫菜(干海草)、“sansai(山茉)”、“surume(干乌贼)、小鱼和贝类、用酱油蒸煮的食品；”日盘装食品，如“nimame(熟豆)，马铃薯沙拉和“konbu-maki(海带卷)；”奶产品；罐装和瓶装产品，如肉、鱼肉、水果和蔬菜；酒精性饮料，如合成清酒、配制酒、葡萄酒和威士忌酒；饮料，如咖啡、可可、果汁、碳酸饮料、乳酸饮料和乳酸杆菌饮料；预混合和速熟食料，如布丁粉、热蛋糕粉、“sokuseki-shiruko(赤豆汤与米粉糕的预混合料)”和速溶汤粉；婴儿食品；疗效性食料；以及改善食品和饮料的味道和质量。
此外，本发明的低聚糖可用于家畜和家禽包括蜜蜂、家蚕和鱼的饲料和宠物饲料中，以改善其味道质量。除了因作味道质量改善剂，味道掩蔽剂和质量改善剂外，本发明的低聚糖还可适用作以固体、糊或液体形式的口用产品的增甜剂，口用产品包括化妆品和药品、如雪茄烟、香烟、牙膏、口红、唇膏、内用药、锭剂、鱼肝油滴剂、口服清凉剂、口香片和含漱剂。
本发明的低聚糖还可适用作化妆品生产中的稳定剂、渗透作用控制剂、赋形剂、控湿剂、粘度控制剂和质量改善剂，所说化妆品例如肥皂、护肤霜、洗澡液、护发霜、唇膏、皮肤改善剂和头发再生剂。
除了用作渗透作用控制剂、赋形剂、导管给饲和浆液制剂外，本发明的α-D-低聚葡糖基-α-D-低聚葡糖苷在药品生产中也可用作生物活性物质中活性或活性组分的稳定剂，所说的生物活性物质例如细胞分裂素包括α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素，肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β、巨噬细胞移动抑制因子、菌落刺激因子、转移因子和白细胞间素2；激   素，例如胰岛素、生长激素、促乳泌素、促红素、促卵胞成熟激素；疫苗，例如BCG疫苗、日本脑炎疫苗、麻疹疫苗、脊髓灰质炎疫苗、牛豆病毒疫苗、破伤风类毒素、饭匙清抗毒液素和人体免疫球蛋白；抗菌素，例如青霉素、红霉素、氯霉素、四环素、链霉素和卡那霉素硫酸盐；维生素，例如维生素B1、核黄素、L-抗坏血酸、鱼肝油、类胡萝卜素、麦角甾醇和生育酚；酶，例如脂酶、胰肽酶E、尿激酶、蛋白酶和葡聚糖酶；提取物，例如人参提取物、鳄龟提取物、小球藻提取物、蜂巢蜡胶提取物和蜂乳；活的微生物，如病毒、乳酸杆菌、双岐杆菌和酵母。为了将本发明的α-D-低聚葡糖基α-D-低聚葡糖苷加入到上述组合物包括食品、饮料、化妆品、药品和有形体中，任意使用通用方法，例如混合、捏和、溶解、熔化、吸入、渗透、散布、加入、涂覆、喷洒、注射和固化，然后完成它们的加工。加入的α-D低聚葡糖基α-D-低聚葡糖苷的量定到使其显示出其特性，一般在产物中有0.1％或更多，优选5％或更多。会发现这样得到的组合物有广泛的用途，例如在家庭，农业，林业，渔业和化学，工业产品中应用，以及在食品、饮料、化妆品和口服或肠胃外使用的药物中应用。
下列试验将详细说明本发明。具体地说，试验A首先说明由根瘤菌属(Rhizobium)M-11种来制备、提纯和表征未还原糖生成酶，然后说明由部分还原淀粉水解物用该酶来制备海藻糖和在其末端有海藻糖结构的未还原糖。而试验B将说明本发明的几种α-D-低聚葡糖基α-D-低聚葡糖苷的制备和物化性质。
试验A-1
用根病瘤属M-11种制备未还原糖生成酶
将由2.0％(W/V)麦芽糖，0.5％(W/V)胨，0.1％(W/V)酵母提取液，0.1％(W/V)磷酸二氢钠，0.1％(W/V)磷酸二氢钾和水组成的液体培养基的PH调至7.0。将该液体培养基分成100ml等分试样，然后，分别放入500ml烧瓶中，在120℃消毒20分钟，冷却，用根瘤菌属M-11种(FERM  BP-4130)接种，在27℃和130rpm下培养24小时，这样，得到接种培养液。
约20升含有与在接种培养液中使用的相同组合物的培养基放入30L发酵瓶中，消毒，冷却到30℃，用1％(V/V)接种培养液接种，并在30℃和PH6.0-8.0下在通气和搅拌条件下培养24小时。得到的培养液中的酶催化活性是约1.5单位/ml。一部分培养液经离心分离成细胞和上清液，然后，将细胞悬浮在50mM磷酸盐缓冲液(PH7.0)中，得到起始体积，接着分析得到的细胞悬浮液和上清液的酶催化活性。结果，发现在细胞悬浮液中酶催化活性约0.6单位/ml。而在上清液中酶催化活性约0.9单位/ml。
未还原糖生成酶分析如下：向4ml1.25％(W/V)麦芽五糖底物在50mM磷酸缓冲液(PH7.0)中的溶液中加入1ml酶溶液，混合物在40℃保温60分钟，在100℃加热10分钟使酶钝化，用去离子水准确稀释至10倍，用Somogyi-Nelson法测定还原能力。作为对照试验，将相同的酶溶液的新鲜制剂通过在100℃加热10分钟钝化，然后按照与上述相类似方法测试。1单位酶定义为在上述条件下1分钟内降低以麦芽五糖的量表示的1微摩尔还原能力的酶量。
试验A-2
酶的提纯
约18升试验A-1中得到的培养液用“MINI-LAB”，一种超高压细胞均化器(日本大阪Dainippon pharmacutical Co.，Ltd生产)处理，以破碎细胞。生成物在10,000rpm下离心30分钟，得到约16升上清液。将硫酸铵溶于该上清液中，得到的溶液饱和度0.2，使生成物在4℃放置1小时，然后在10,000rpm下离心30分钟，接着收集新生成的上清液。
将硫酸铵再溶于上清液中，得到溶液的饱和度0.6，使生成物在4℃放置24小时，然后在10,000rpm下离心30分钟，接着收集生成的沉淀物。将沉淀物溶于10mM磷酸盐缓冲液(PH7.0)中，对新鲜的磷酸缓冲液渗析24小时，并在10,000rpm下离心30分钟以除去不溶物质。将渗析的溶液(360ml)分成两份，然后分别加入用300ml“DEAE TOYO Pear”硅胶的离子交换柱色谱中(上述硅胶是日本东京Tosoh Corporation的产品)。
吸附在硅胶上的目的酶用还含有氯化钠的相同磷酸缓冲液从柱上洗脱。得到的活性酶级分对还含有2M硫酸铵的相同磷酸盐缓冲液渗析，在10,000rpm下离心30分钾以除去不溶物质，得到的上清液加入用300ml“Butyl Toyo Pearl 650”硅胶(日本东京(Tosoh Corporation的产品)的疏水柱色谱中。吸附在柱上的酶用从2M降低至oM的线性梯度溶液洗脱，接着收集活性酶级分。然后该级分再加入用300ml“Toyo Pearl HW-55”(日本东京TosohCorporation生产的树脂)硅胶过滤色谱中，收集活性酶级分。酶催化活性、比活性和具体提纯步骤中的收率如表1所示。
表1中的在硅胶过滤步骤中洗脱得到的提纯的酶制剂用7.5％(W/V)聚丙烯酰胺凝胶的电泳测定纯度，电泳得到单个的蛋白质谱带，证明该酶制剂是电泳均匀的和高纯的。
                         表1
                             酶活性       比活性           收率
提纯步骤
                             (单位)    (单位/mg蛋白质)    ％
培养液                       26,800                       100
细胞破碎后的上清液           20,300         0.10          76
盐析后的渗析溶液             16,100         0.32          60
从离子交换柱中出来的洗脱液   11,300         5.5           42
从疏水柱中出来的洗脱液       5,730          98            21
从硅胶过滤柱中出来的洗脱液   3,890          195           15
试验3
酶的表征
一部分试验A-2中得到的提纯的酶制剂在凝胶浓度10％(W/V)下做SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后通过与用相同的凝胶做电泳的标准分子标记物(日本东京Nippon Bio-Rad Laboratories kk生产的比较测定分子量，表明酶的分子量约77,000-87,000道尔顿。
另一部分提纯的酶制剂用2％(W/V)“Ampholine”(瑞典Upsala，pharmacia LKB的产品)的聚丙烯酰胺凝胶做等点电泳，然后通过测定电泳凝胶中的PH测定等电点，表明该酶的等电点约3.6-4.6。
温度和PH对酶催化活性的影响根据上述分析方法测定。结果分别如图1和2所示。当在PH7.0保温60分钟时发现最佳温度约40℃，而在40℃保温60分钟时最佳PH约7.0。酶的热稳定性通过在不同温度下在50mM磷酸盐缓冲液(PH7.0)中保温该酶60分钟进行测定，在水浴中冷却，并分析剩余的酶催化活性。而PH稳定性通过在不同的PH值和25℃下在50mM磷酸盐缓冲液中保温该酶16小时来测定，调节缓冲液至PH7.0，分析剩余活性。结果分别由图3和4所示。在温度高达40℃和PH约6-9时该酶是稳定的。
试验A-4
未还原糖的制备
将含有20％(W/V)葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖或麦芽七糖作底物的水溶液与在试验A-2中得到的2单位提纯的酶/g固体底物混合，并在40℃和PH7.0下反应48小时，生成物去离子化，并在用“Wako Beads WB-330”柱(日本大阪Waka pure Chemical Industries，Ltd.的产品)的高效液相色谱上分析反应产物。高效液相色谱在室温下进行操作，水作为洗脱液，以流速0.5ml/分加入柱中，同时用“RI-8012”差式折光计(日本东京Tosoh Corporation生产)监测洗脱液。结果如表2所示。
由表2中的结果明显看出，反应产物由剩余的底物和新生成的糖PI、PII、PIII、PIV和PV组成，并无其他糖。具有葡萄糖聚合度4或更高的PII、PIII、PIV和PV的收率比较高，即85％或更高，而具有葡萄糖聚合度3的PI的收率比较低。上述结果表明没有由葡萄糖和麦芽糖生成糖。
                        表2
底物    反应产物        HPLC中洗脱时间     组成
                            (分)           ％
葡萄糖       葡萄糖         33.4         100.0
麦芽糖       麦芽糖         28.5         100.0
麦芽三糖     PLi            23.3         35.0
             麦芽三糖       25.9         65.0
             PII+           21.6         85.6
麦芽四糖
             麦芽四糖       24.1         14.4
             PIII+          19.7         92.7
麦芽五糖
             麦芽糖         22.6         7.3
             PIV+           18.7         93.5
麦芽六糖
             麦芽六糖       21.4         6.5
             PV+            17.8         93.4
麦芽七糖
             麦芽五糖       21.0         6.6
注：表中PI、PII、PIII、PIV和PV表示由相应的底物即麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖和麦芽七糖生成的新产物。
为了提纯这些新生成的糖，反应产物进行脱色、去离子化、浓缩和用“XT-1016(Na+型)”，一种碱金属形式的强酸性阳离子交换剂(日本东京Tokyo Organic Chemical Industries，Led.生产)进行柱上分极。具体地说，将阳离子交换剂装入3个有夹套的和串连的不锈钢柱中，每个柱内径2.0cm，长1m，然后装入反应产物，其量是阳离子交换剂体积的5％(V/V)，以空速0.13加入55℃水进行分离，收集含有97％和更高新生成的糖的级分。得到的级分分别冻干成高纯度的糖制剂。对具体底物的收率，以干固体为基础，PI约9％，PII约65％，PIII约82％，PIV约P 80％，PV约77％。产品最终纯度，PI约97.5％，PII约98.6％，PIII约99.5％，PIV约98.4％，PV约98.4％。
然后，用Somogyi-Nelson法测定这些高纯度糖制剂的还原能力，它们的还原能力用DE表示。结果如表3所示。
由表3中的结果明显看出，所有制剂都显示出很弱的还原能力。认为还原能力是由于加入和存在于制剂中的微量还原麦芽糖低聚糖引起的，以及所有新生成的糖基本上没有还原能力。
              表3
糖制剂        纯度(％)       DE
PI              97.5        0.83
PII             98.6        0.35
PIII            99.5        0.10
PIV             98.4        0.27
PV              98.4        0.23
试验A-5
用葡萄糖淀粉酶的酶降解
将50mg试验A-4中制备的任何一种糖制剂PI、PII、PIII、PIV或PV溶于1ml50mM乙酸盐缓冲液(PH4.5)中，向生成物溶液中加入1单位葡萄糖淀粉酶(日本东京Seikagakn Corporation生产的)，并在40℃保温6小时以进行酶降解，用高效液相色谱分析降
解产物。结果，在所有降解产物中仅检测出葡萄糖和海藻糖。内容物和葡萄糖与海藻糖的摩尔比如表4所示。
                      表4
         葡萄糖    海藻糖       摩尔比
糖制剂
          (％)      (％)    (葡萄糖/海藻糖)
PI        36.2      63.8        1.07
PII       52.0      48.0        2.06
PIII      61.4      38.6        3.02
PIV       68.3      31.7        4.09
PV        72.9      27.1        5.11
显然，表4中的结果表明PI由葡萄糖淀粉酶降解为1个葡萄糖分子和1个海藻糖分子；PII降解为2个葡萄糖分子和1个海藻糖分子；PIII降解为3个葡萄糖分子和1个海藻糖分子；PIV降解为4个葡萄糖分子和1个海藻糖分子；PV降解为5个葡萄糖分子和1个海藻糖分子。
考虑到葡萄糖淀粉酶的反应特性，这些未还原糖会具有通过α-1，4或α-1，6键将葡萄糖分子连在海藻糖分子上的结构。特别是PI是葡萄糖聚合度3的未还原糖，其中1个葡萄糖分子连在1个海藻糖分子上；PII是葡萄糖聚合度4的未还原糖，其中2个葡萄糖分子连在一个海藻糖分子上；PIII是葡萄糖聚合度5的未还原糖，其中3个葡萄糖分子连在1个海藻糖分子上；PIV是葡萄糖聚合度6的未还原糖，其中4个葡萄糖分子连在1个海藻糖分子上；PV是葡萄糖聚合度7的未还原糖，其中5个葡萄糖分子连在1个海藻糖分子上。在使PI、PII、PIII、PIV和PV受β-淀粉酶作用后，PI和PII不降解，而PIII降解为1个麦芽糖分子和1个PI分子；PIV降解为1个麦芽糖分子和1个PII分子；PV降解为2个麦芽糖分子和1个PI分子。
上述结果表明由本发明的未还原糖生成酶引起的反应是分子同转化反应，其既不同时发生底物的降解也不同时发生底物的聚合，换句话说，不改变它们的葡萄糖聚合度。因此，由酶作用产生的PI、PII、PIII、PIV和PV分别是α-葡糖基海藻糖(由“Gn-T表示，其中“G”和“T”分别表示葡萄糖残基和α，α-海藻糖，而“n”是整数1或更大)，特别是α-葡糖基海藻糖(或α-麦芽糖基葡糖苷)、α-麦芽糖基海藻糖(或α-麦芽三糖基葡糖苷)、α-麦芽三糖基海藻糖(或α-麦芽四糖基葡糖苷)、α-麦芽四糖基海藻糖(或α-麦芽五糖基葡糖苷)、α-麦芽五糖基海藻糖(或α-麦芽六糖基葡糖苷)。
试验A-6
海藻糖和在末端有海藻糖
结构的未还原糖的制备
在加热时将50份(重量)“PINE-DEX #4”--部分还原的淀粉水解产物(日本京都Matsutani Chemical Ind.CO.，Ltd.生产的)溶于60份(重量)水中，生成的溶液调至45℃和PH6.5，每克部分还原的淀粉水解产物加入1单位未还原糖生成酶(用试验A-2中的方法制备的)，反庆96小时，生成在其未端有海藻糖结构的未还原糖，接着在100℃加热10分钟使酶纯化。反应混合物稀释至约20％，每克部分还原淀粉水解产物加入10单位“Glucozyme”，一种葡萄糖淀粉酶(日本京都Naguse Biochemicals Ltd.生产的)，反应40小时，加热使酶纯化。生成的溶液用活炭脱色，用离子交换剂脱离子，用普通的方法浓缩至约60％。得到的糖溶液含有29.5％海藻糖(以干固体为基础)。在60℃和空速0.4下将该浓缩液加入预先装有“CG6000(Na+型)”一种强酸性阳离子交换剂(日本东京JapanOrgano Co.，Ltd生产的)的不锈钢柱中，收集富海藻糖的级分。该级分含有约90％海藻糖(以干固体为基础)。然后，该级分浓缩至约75％，加入结晶器中，加入约2％结晶的海藻糖水合物作晶种，逐渐冷却，得到结晶度约45％的糖膏。该糖膏从干燥塔的上部通过加压至150kg/cm2的喷咀进行喷雾干燥。同时从干燥塔的上部向其下部送入85℃空气，聚积在安装在干燥塔底部的运输机的金属丝网上的结晶粉末逐渐运送到干燥塔外，同时通过金属丝网向干燥塔的上部送45℃空气。然后，把结晶粉末加入老化塔中，在热空气流中老化10小时以完成其结晶和脱水，这样，得到结晶的海澡糖水合物粉末。
试验B-1
制备-α-D-低聚葡糖基α-D-低聚葡糖苷
将50份(重量)的按试验A-6的方法制备的海藻糖和“PINE-DEX#1”，还原的淀粉水解产物(DE 8)(日本京都MatsutaniChemicalInd，Co.，Ltd.生产)溶于150份(重量)的水中，同时加热，调节该生成的溶液到60℃和PH6.0，加入由日本  岡山HayashibaraBiochemical Laboratories，Inc.  生产的从嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus Stearo thermophilus)得到的环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶，其量为10单位/g部分还原的淀粉水解产物，反应40小时，并在100℃加热30小时，以钝化该酶。然后，将该溶液调节到55℃和PH5.0，加入由日本京都Nagase Biochemcals Ltd.生产的“β-淀粉酶#1500”，其量为20单位/g部分还原的淀粉水解产物，反应16小时，并在100℃加热15分钟，以钝化该酶。以干固体为基准，该溶液含有作为α-D-低聚葡糖基α-D-低聚葡糖苷的“物质1”、“物质2”和“物质3”的含量分别约15％、约15％和约4％。该溶液然后用活性炭脱色，用离子交换剂(H±和OH-型)脱离子，浓缩到约45％，并加到柱色谱中，接着收集富物质1、2和3的级分。用于分离的该离子变换剂是“XT-1016(Na+型)”，盐形式的强酸性阳离子交换剂，(由日本东京Japan Organo，Co.，Ltd.生产的)，其以水悬浮液的形式装在四个管不尔锈钢柱子中，每个柱子内径5.4cm，长5m。在这种情况下，这四个柱子串联总长度约20m。在保持这些柱子的温度在55℃的情况下，将5(V/V)的有关的糖溶液加到这些柱子中，然后，以空速(SV)0.3加入55℃的水进行分离，接着收集富含物质1、2和3的级分。这些级分再加到装有十八烷基硅胶载体的“YMC-Pack P-355-15”制备液相色谱柱中(该制备液相色谱由日本京都YMC Co.，Ltd.生产)，用水作洗脱液，收集纯度97％或更高的级分，冷冻干燥并粉碎，得到粉状高纯度的物质1、2和3。
试验B-2
α-D-低聚葡糖基α-D-低聚葡糖苷的物化性质
用试验B-1中的方法制备的高纯度的物质1、2和3，测定如下的物化性质。
(1)元素分析
  物质1
  实验值：C＝44.2％，H＝6.2％
  计算法：C＝43.25％，H＝6.35％
         (对分子式：C24H42O21)
  物质2
  实验值：C＝43.7％，H＝6.0％
  计算值：C＝43.48％，H＝6.3％
         (对分子式：C30H52O26)
  物质3
  实验值：C＝43.8％，H＝6.1％
  计算值：C＝43.64％，H＝6.31％
        (对分子式：C36H62O31)
(2)分子量
  物质1 666.6
  物质2 828.7
  物质3  990.9
(3)紫外吸收光谱
  这三种物质即没有显示特征吸收。
(4)颜色反应
  这种物质在蒽酮-硫酸反应时，着色成绿色，但是对费林反应和碘反应是负的。
(5)结构
(a)当用1N硫酸水解时，这三种物质形成唯一的产物D-葡萄糖。
(b)当受葡糖淀粉酶作用时，物质1形成2摩尔葡萄糖和1摩尔海藻糖；物质2形成3摩尔葡萄糖和1摩尔海藻糖；物质3形成4摩尔葡萄糖和1摩尔海藻糖。
(c)碳核磁共振分析(13C-NMR)，对物质得到不同的12个13C信号。这表明物质1有24个碳原子，并存在12对2个等价碳原子。根据Klaus Bock等人在Advance in Carbohydrate ChemistryandBiochemistry，Vol.42，PP.192-225(1984)中介绍的化学位移，通过把这些碳原子归类于标准物质α-D-吡喃葡萄糖、α，α-海藻糖和麦芽糖，认为物质1具有由0-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡糖基α-D-麦芽糖苷所表示的结构。
而物质2得到不同的19个13C信号。其表明物质2具有30个碳原子，并存在7对2个等价碳原子和一组5个等价碳原子。类似于物质1，根据Klaus Bock某人介绍的化学位移，通过将这些碳原子归类，认为物质2具有由0-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-0-α-D吡喃葡糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡糖基-α-D-麦芽糖苷所代表的结构。
物质3给出不同的16个13C信号。其显示物质3有36个碳原子。并存在15对2个等价碳原子和一组6个等价碳原子。类似于物质1，根据Klaus Bock等人介绍的化学位移，通过将这些碳原子归类，认为物质3具有由0-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-0-α-D-吡喃葡糖基-(1→4)-α-D-吡喃葡糖基-α-D-麦芽三糖甘所代表的结构。
基于上述结果，物质1、2和3的结构可以分别用如下的化学式1、2和3表示。
化学式1：
Figure C9410953200291
化学式2：
Figure C9410953200292
化学式3：
Figure C9410953200301
因为这些结构，所以物质1、2和3分别命名为“α-D麦芽糖基-α-D-麦芽糖苷(或麦芽糖基麦芽糖苷)”、“α-D-麦芽三糖基α-D-麦芽糖苷(或麦芽三糖基麦芽糖苷)”和“α-D-麦芽三糖基α-D-麦芽三糖苷(或麦芽三糖基麦芽三糖苷)”。上述的结果说明，这些物质是迄今未知的，完全新的分子中具有海藻糖结构的未还原的低聚糖类。
试验B-3
急性毒性
用鼠口服给药，试验用试验B-1的方法制备的高纯度麦芽糖基麦芽糖苷、麦芽三糖基麦芽糖苷和麦芽三糖基麦芽三糖苷的急性毒性。结果，发现麦芽糖基麦芽糖苷、麦芽三糖基麦芽糖苷和麦芽三糖基麦芽三糖苷是低毒的，用它们的最大的给药剂量没有看到死亡。这些都说明它们的LD50简单地是50g/kg或更高。
试验B-4
结晶的α-D-麦芽三糖基α-D-麦芽三糖苷的制备及物化性质
把接试验B-1的方法制备的纯度97％或更纯的α-D-麦芽三糖基α-D-麦芽三糖苷(物质3)用通常的方法脱色、脱离子并浓缩到70％，将该浓缩物移到烧杯中，并在4℃冷却室中静置2个月，使结晶体析出。离心收集结晶体，用最小量的水洗涤，这样得到纯度99.0％的结晶体。
试验的该结晶体的物化性质如下：
(1)颜色
  无色，透明结晶体。
(2)溶解度
  比较高，在25℃100ml水中大约可溶解91g。
(3)熔点
  215℃
(4)红外吸收光谱
把1毫克粉状结晶体和20omg无水KBr混合，制成透明的片，然后分析其红外吸收光谱，结果如图5所示。
(5)粉末的X-射线衍射
按照F.H.Stodola芽人在Journal of thd AmericanChemicalSociety，Vol.78，PP 2,514-2,518(1956)中介绍的方法，用铜靶2-射线测定结晶的α-D-麦芽三糖基α-D-麦芽三糖苷的粉末X-射线衍射谱图。结果示于图6。由图6所示的粉末X-射线衍射分析的结果，明显的可以看出结晶的α-D-麦芽三糖基α-D-麦芽三糖苷有主要的衍射角(2θ)7.8°、10.0°、13.1°、17.5°、和18.2°。
上述的结果说明该结晶体是新的结晶的α-D-麦芽三糖基α-D-麦芽三糖苷。
任何的方法，只要它们能够从过饱和的溶液中析出并收集结晶的α-D-麦芽三糖基α-D-麦芽三糖苷的都可用于本发明，常规的方法，例如糖膏分离法、闭塞粉碎法、流化床造粒法和喷雾干燥法都可随意选择。该结晶的α-D-麦芽三糖基α-D-麦芽三糖苷显示出很弱的收湿性，该收湿性根据α-D-麦芽三糖基α-D-麦芽三糖苷的纯度而变化，但是适用于各种组合物，例如食品、饮料、分妆品、药物、成形体和化学品，因为它基本上是不收湿的、自由流动的、不粘结、不固化，并且很容易处理。结晶的α-D-麦芽三糖基α-D-麦芽三糖苷的熔点和旋光率随它的纯度而变化。特别是该熔点通常随着纯度的降低而降低并加宽。因此，结晶的α-D-麦芽三糖基α-D-麦芽三糖苷的纯度可以随意地选择，以满足它的最终用途的要求。
下面的实施例A和实施例B将分别说明α-D-低聚葡糖基α-D-低聚葡萄苷的制备方法和它们的几种用途。
实施例A-1
把1份(重量)按试验A-6的方法制备的海藻糖和2份(重量)的“PINE-DEX #4”，糊精产品(DE 18)(日本京都Matsutani ChemicalInd.，Co.，Ltd.生产)，溶于3.7份(重量)水中，同时加热把生成的溶液调节到60℃和PH5.6，加入每克糊精15单位日本岡山Hayashibara Biochemical Laboratories，Inc，产的由嗜热，脂肪芽孢杆菌(Bacillus Stearothermophilus)产生的环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶，反应24小时，并加热，以钝化该酶。然后将该溶液用活性碳脱色，用离子变换剂(H+-和OH--型)脱离子并提纯，用通常的方法浓缩，得到75％糖浆，收率约92％(以干固体为基础)。
含有约65％以干固体为基准，未还原的低聚糖类如麦芽糖基麦芽糖苷、麦芽三糖基麦芽糖苷、麦芽三糖基麦芽三糖苷、麦芽四糖基麦芽三糖苷和麦芽四糖基麦芽四糖苷的该产物具有降低的甜度、合适的粘度和保湿活性，这些性质使得该产物在包括食品、饮料、化妆品、药物和成形体的各种组合物中广泛应用。
实施例A-2
把1份(重量)由日本大阪Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生产的海藻糖和1.5(重量)的α-环糊精溶于4份(重量)水中，同时加热，将生成的溶液调节至65℃和PH15.6，加入每克α-环糊精10单位的如实施例A-1用的同样类型环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶，反应24小时并加热以钝化该酶。然后，将该溶液调节至55℃和PH5.6，加入每克固体20单位 日本京都Nagase Biochemicals Ltd生产的“β-淀粉酶#1500”，反应16小时并加热，以钝化该酶。用类似于实施例A-1中的方法提纯并浓缩该生成物，得到75％糖浆，收率约93％(以干的固体计)。
含有麦芽糖基麦芽糖苷、麦芽三糖基麦芽糖苷、麦芽三糖基麦芽三糖苷分别为约15％、约15％和4％(按干固体计)的该产物像实施例A-1的产物那样具有降低的甜度、合适的粘度和保温活性，其使得该产物在包括食品、饮料、化妆品、药物和成形体的各种组合物中广泛应用。
实施例A-3
向20％淀粉悬浮液中加入“Fermamy 60L”α-淀粉酶(丹麦哥本哈根Novo Nordish Lndustry生产)，其量为淀粉固体的0.015％，在95-100℃液化并加热以钝化该酶，这样，得到一种液化的有DE3的淀粉溶液。向该溶液中加入按试验A-6的方法制备的海藻糖，其量与淀粉物质的量相同(按干固体计)，调至55℃和PH5.3，加入每克淀粉50单位由日本岡山        Hayashibara    BiochemicalLaboratories，Inc.生产的异淀粉酶和10单位与实施例A-1中所用的相同类型的环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶，反应40小时，并加热以钝化该酶。然后，通过加入水稀释该溶液到约25％，调至55°和PH5.3，加入每克固体20单位β-淀粉酶，反应16小时，并加热以钝化该酶。然后，用类似于实施A-1的方法提纯并浓缩该溶液，并用通常方法喷雾干燥，得到水分含量小于约2％的75％糖浆，收率约90％，(按干固体计)。
含有麦芽糖基麦芽糖苷、麦芽三糖基麦芽糖苷和麦芽三糖基麦芽三糖苷其量分别为约20％、约20％和约6％(按干固体计)的该产物像实施例A-1的产物那样，有降低的甜度，合适的粘度和保湿活性，其使得该产物在包括食品、饮料、化妆品、药品和成形体的各种组合物中广泛应用。
实施例A-4
将按实施例A-2的方法制备的含有麦芽糖基麦芽糖苷、麦芽三糖基麦芽糖苷和麦芽三糖基麦芽三糖苷的糖溶液浓缩到约45％，为了提高麦芽糖基麦芽糖苷、麦芽三糖基麦芽糖苷和麦芽三糖基麦芽三糖苷的含量，用类似于试验B-1的方法，只是分离的离子交换剂用“Dowex 50WX4(Ca2+型)”盐形式的强酸性阳离子交换剂美国密兹它州DOW Chemical co.代替，来进行色谱分离该溶液，并且用类似于实施例A-1的方法收集、提纯和浓缩富含麦芽糖基麦芽糖苷、麦芽三糖基麦芽糖苷和麦芽三糖基麦芽三糖苷的级分，得到65％糖浆，收率约45％(以干固体计)。
按干固体计，含有麦芽糖基麦芽糖苷、麦芽三糖基麦芽糖苷和麦芽三糖基麦芽三糖苷分别为约35％、约35％和约10％的该糖浆像实施例A-1的产物那样有降低的甜度、合适的粘度和保湿活性，其使得该糖浆在包括食品、饮料、化妆品、药物和成形体的各种组合物中广泛应用。
实施例A-5
将按实施例A-3中的方法制备的含有麦芽糖基麦芽糖苷、麦芽三糖基麦芽糖苷和麦芽三糖基麦芽三糖苷的糖溶液浓缩到约50％。然后按照试验B-1中的色谱分离该浓缩物，按照类似于实施例A-1中的方法，收集、提纯、浓缩富含麦芽糖基麦芽糖苷或麦芽糖三基麦芽糖苷或麦芽三糖基麦芽三糖苷的级分，得到65％的糖浆，收率分别为约15％，约15％和约4％(以固体计)。
含有约97％(以干固体计)高纯度麦芽糖基麦芽糖苷、麦芽三糖基麦芽糖苷或麦芽三糖基麦芽三糖苷的这些糖浆像实施例A-1中的产物那样，有降低的甜度、合适的粘度和保湿活性，其使得这些浆液在包括食品、饮料、化妆品、药物和成形体的各种组合物中广泛应用。
实施例A-6
将按实施便A-5中的方法得到的高纯度麦芽三糖基麦芽三糖苷浓缩到约85％，加到结晶器中，加入2％结晶的麦芽三糖基麦芽三糖苷作晶种，逐渐搅拌以结晶，移到浴缸中，让其在室温下静置2天，以便完成结晶并老化，以批量的形式把该生成物加到粉碎机中，干燥并过筛，得到结晶的麦芽三糖基麦芽三糖苷粉末。
该产物基本上不收湿且容易处理。  此外，该产物适合用于包括食品、饮料、化妆品、药物和成形体的各种组合物中，因为其有优良的溶解度和稳定性、降低的甜度、合适的粘度和保湿活性。
实施例A-7
向含有按照试验A-6中的方法制备的在其末端有海藻糖结构的未还原的低聚糖的20％糖混合物溶液中加入每克固体10单位环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶，反应24小时，并加热以钝化该酶。然后调整该溶液到55℃和PH5.3，加入每克糊精20单位β-淀粉酶，反应16小时，并加热以钝化该酶。然后，按照类似于实施例A-1中的方法，提纯并浓缩该溶液，得到75％糖浆，收率约92％。(以干固体为基准)。
含有麦芽糖基麦芽糖苷、麦芽三糖基麦芽糖芏和麦芽三糖基麦芽三糖苷分别为约25％，约25％和约8％(按干固体计)的该糖浆像实施便A-1的产物那样，有降低的甜度、合适的粘度和保湿活性，其使得该糖浆在包括食品、饮料、化妆品、药物和成形体的各种组合物中广泛应用。
实施例A-8
将按实施例A-4中的方法制备的含有含量增加的麦芽糖基麦芽糖苷、麦芽三糖基麦芽糖苷和麦芽三糖基麦芽三糖苷的浆液用通常的方法喷雾干燥，得到湿含量约1％的粉末，收率约90％
像实施例A-1的产物那样，该粉末很适合用于包括食品、饮料、化妆品、药物和有形体的各种结合物。
实施例A-9
将按实施例A-5中的方法制备的高纯度麦芽糖基麦芽糖苷糖浆在60℃冷冻干燥24小时。得到的干产物加到粉碎设备中，得到湿含量约0.5％的粉剂，收率约93％。
像实施例A-1的产物那样，该粉末适合用于包括食品、饮料、化妆品、药品和成形体的各种组合物。
实施例B-1
增甜剂
将1份(重量)按实施例A-6中的方法得到的结晶的麦芽三糖基麦芽三糖苷粉末和0.05份(重量)“α-G Sweet”--一种由日本东京ToYo Sugar Refining Co.，Ltd.生产的α-葡糖基卡哈茨苷混合均匀，把该混合物加到造粒机中，得到粒状增甜剂。
该增甜剂有很好的味觉质量及与蔗糖比较有约2倍多的增甜能力，从增甜能力的观点看该增甜剂的热量是蔗糖的大约一半。
该增甜剂适合于增甜那些热量摄取受限制的那些肥胖或糖尿病人所用的那些低热的食物和饮料。另外，该增甜剂也适合于增甜使之抑制牙的龋齿的食物和饮料，因为它由生龋的微生物产生的酸和不溶的葡聚糖是很少的。
实施例B-2
硬糖果
把100份(重量)的55％蔗糖溶液和20份(重量)按实施例A-1中的方法得到的含有未还原的低聚糖如麦芽糖基麦芽糖苷、麦芽三糖基麦芽糖苷和麦芽三糖基麦芽三糖苷的糖浆混合，同时加热，用真空加热法浓缩该混合物到湿含量低于2％，加入1份(重量)柠檬酸和适量的柠檬食用香料和着色剂，并用常用的方法成形。
该产品是高质量的硬糖果，其是松脆、味觉质量优良的，并且没有蔗糖的结晶。
实施例B-3
草莓酱
把150份(重量)的新鲜草莓，60份(重量)的蔗糖，20份(重量)麦芽糖，40份(重量)的按实施例A-2的方法得到的含有麦芽糖基麦芽糖苷、麦芽三糖基麦芽糖苷和麦芽三糖基麦芽三糖苷的糖浆，5份(重量)的果胶和1份(重量)的柠檬酸放在一个锅里煮浓，并把生成物装瓶。
实施例B-4
乳酸饮料
将10份(重量)脱脂奶在80℃巴氏杀菌20分钟，冷却到40℃，加入0.3份(重量)发酵剂，在约30℃发酵10小时。均化该生成物，加入4份(重量)按实施例A-8中的方法得到的含有麦芽糖基麦芽糖苷、麦芽三糖基麦芽糖苷和麦芽三糖基麦芽三糖苷的粉未，将1份(重量)蔗糖和2份(重量)异构糖，并把该混合物保持在70℃巴氏杀菌。然后冷却该混合物，加入适量调味剂并装瓶。
该产品是一种高质量乳酸饮料，其味道和甜度与酸味很协调。
实施例B-5
增甜浓缩奶
在100份(重量)鲜奶中溶解3份(重量)按实施例A-1中的方法得到的含有未还原的低聚糖如麦芽糖基麦芽糖苷、麦芽三糖基麦芽糖苷和麦芽三糖基麦芽三糖苷的糖浆，和1份(重量)蔗糖，用板式加热器加热对该生成物溶液进行消毒，浓缩至70％并消毒装罐。
该产品可以很好地用于罐身食品及水果、咖啡、可可和茶的调味品，因为它有中等甜度和极好的味道。
实施例B-6
果汁粉
将22份(重量)的喷雾干燥的橙汁与50份(重量)的由实施例A-9中的方法得到的高纯度麦芽糖基麦芽糖粉，10份(重量)蔗糖，0.65份(重量)柠檬酸酐，0.1份(重量)马来酸，0.1份重量)L-抗环血酸，0.1份(重量)柠檬酸钠、0.5份(重量)茁芽霉多糖和适量粉状调味剂混合均匀，磨成细粉，加到流化床造粒器中并在40℃通风温度下造粒30分钟，同时喷一种按实施例A-4中的方法得到的高含麦芽糖基麦芽糖苷、麦芽三糖基麦芽糖苷和麦苷三糖基麦芽三糖苷的糖浆作为粘合剂到该粉上，然后分成规定的量并包装。
该产品是果汁粉，其天然果汁含量约30％。该产品没有不希望的味道和气味、吸湿和固化并且在延长的时间周期中很稳定。
实施例B-7
巧克力
把40份(重量)可可浆、10份(重量)可可脂、30份(重量)蔗糖和20份(重量)按实施便A-9的方法得到的高纯度麦芽糖基麦芽糖苷粉末混合，把生成的混合物加到精研机中以减小颗粒大小，加入到制巧克力表研炼机中并在50℃捏和2天。在捏和过程中，向该混合物中加入0.5份(重量)卵磷脂，并充分混合和分散。然后用热敏控制器调节该混合物到31℃，在该脂固化前立即倒在模子中，用振动器驱气，并在20分钟内通过10℃冷却孔道以完全固化。然后把模子中的物料取出并包装。
该产品有很好的颜色、光泽和组织，但没有吸水性，在嘴里很好的熔化，显示出轻度的甜度和淡的味道。
实施例B-8
口香糖
通过加热把3份(重量)的胶质基料软化，加入4份(重量)的蔗糖和3份(重量)按实施例A-8中的方法得到的含有麦芽糖基麦芽糖苷、麦芽三糖基麦芽糖苷和麦芽三糖基麦芽三糖苷的粉末，与适量的调味剂和着色剂混合，用辊子捏合，并用通常的方法成形的包装。
该产品是有很好的组织、香味和味道的口香糖。
实施例B-9
蛋奶羹
把100份(重量)玉米淀粉、100份(重量)的按实施例A-3的方法制得的含有麦芽糖基麦芽糖苷、麦芽三糖基麦芽糖和麦芽三糖基麦第三糖苷的粉末、80份(重量)的麦芽糖、20份(重量)蔗糖和1份(重量)的氯化钠混合均匀，向生成的混合物中加入280份(重量)的新鲜鸡蛋，搅拌混合，慢慢加入1000份(重量)沸的奶，放到火上同时搅拌，直至玉米淀粉凝胶并且该混合物都变为半透明，冷却，加入适量香子兰香料，分成规定的量并包装。
该产品有平滑的光泽、中等甜度和极好的味道。
实施例B-10
“uiro-no-moto(速溶的“uiro”)”
90份(重量)大米粉与20份重量玉米淀粉、120份(重量)按实施例A-9的方法制得的高纯度麦芽糖基麦芽糖苷粉和4份(重量)茁霉多糖混合均匀，得到“uiro-no-noto”。该“uiro-no-moto”与适量的“maccha(一种绿茶)”和水一起混和， 将生成物分装在器皿中并蒸汽处理60分钟，得到“maccha-uiro”。
该产品光泽极佳有刺激性。另外该产品有长的贮存期限，因为足以抑制淀粉的老化作用。
实施例B-11
乳剂
用通常的方法通过加热，把0.5份(重量)聚氧乙烯二十二烷基醚，1份(重量)聚氧乙烯山梨糖醇四油酸酯，1份(重量)的油溶的单硬脂酸甘油酯，0.5份(重量)二十二醇、1份(重量)鳄梨油、35份(重量)按实施例A-7中的方法制得的含有麦芽糖基麦芽糖苷、麦芽三糖基麦芽糖和麦芽三糖基麦芽三糖苷的糖浆、1份(重量)α-糖基芸香苷和适量的维生素E及杀菌剂溶解，向该混合物中加入5份(重量)1，3-丁二醇、0.1份(重量)羧基乙烯基聚合物和85.3份(重量)精制水，并用均化器乳化。
该产品是一种保湿乳剂，其适合用作防晒剂和皮肤增白剂。
实施例B-12
护肤膏
用通常的方法通过加热把2份聚(重量)聚氧乙烯甘醇单硬脂酸酯、5份(重量)半乳化的丙三醇单硬脂酸脂，2份(重量)α-葡糖基芸香苷，1份(重量)液体石蜡，10份(重量)甘油三辛酸酯、4份(重量)按实施便A-9中的方法制得的高纯度麦芽糖基麦芽糖粉末和适量防腐剂溶解，向生成的溶液中加入5份(重量)1，3-丁二醇和66份(重量)精制水，用均化器乳化，并通过搅拌与适量的调整味剂混合。
该产品是很好的涂敷膏，其很适于用作防晒膏、皮肤改善剂和皮肤增白剂。
实施例B-13
洁牙剂
将55份(重量)磷酸钙，1.5份(重量)月桂酸钠，25份(重量)丙三醇，0.5份(重量)聚氧乙烯脱水山梨糖醇月桂酸酯，15份(重量)按实施便A-4中的方法制得的高含量麦芽糖基麦芽糖苷、麦芽糖三基麦芽糖苷和麦芽三糖基麦芽三糖苷的糖浆、0.02份(重量)的糖精和0.05份重量防腐剂与13份重量水混合。
该产品有很好的光泽和去污力，宜作和洁牙剂。
实施例B-14
管摄食
把由20份(重量)按实施例A-8中的方法制得的含有麦芽糖基麦芽糖苷、麦芽三糖基麦芽糖苷和麦芽三糖基麦芽三糖苷的粉末，1.1份(重量)甘氨酸，1份(重量)谷氨酸钠、0.4份(重量)乳酸钙、0.1份(重量)碳酸镁、0.01份(重量)维生素B1和0.01份(重量)维生素B2组成的组合物分成24g的等分试样，装在小的层压铝包中，然后将其热密封。
将一包该产品溶于约33-500ml水中，然后不经肠给食到鼻腔、胃或肠中。
该产品适用作养驯动物3及人的通过不经肠途径的管饲法。
实施例B-15
管摄食
把由580份(重量)按实施例A-6中的方法制得的结晶的麦芽三糖基麦芽三糖苷粉末、190份(重量)干york、209份(重量)脱脂奶、4.4份(重量)氯化钠、1.85份(重量)氯化钾、4份(重量)硫酸镁、0.01份(重量)维生素B1、0.1份(重量)抗坏血酸钠、0.6份(重量)乙酸维生素E和0.04份(重量)烟酰胺组成的组合物分成25g的等分试样，装在小的层压的铝包中，然后将其热密封。
将1包该产品溶于约150-300ml水中，然后非肠道给食到鼻腔、胃和肠中。
实施例B-16
液体干扰素制剂
用通常的方法，把由日本岡山            HayashibaraBiochemicalLaboratories，Inc.制备的由日本东京Cosmo BioCo.，Ltd.     生产的天然人体干扰素-γ制剂用于一种的固定抗人体干扰素-γ抗体柱上，以便吸附在该制剂中的天然人体的干扰素-γ上，但是使小牛血清白蛋白作为稳定剂通过该柱子以便除去，通过把含按实施例A-5中的方法制得的高纯度麦芽糖基麦芽糖苷糖浆的生理盐水加到该柱子中，加入量7％(按干固体计)，在改变该盐水的PH的同时，洗脱该吸附的天然人体干扰素-γ。然后将该该洗脱液进行膜过滤并且在消毒情况下装入药水瓶中，得到一种液体制剂，其含105单位的天然人体γ-干扰素/ml。
该液体制剂适用于治疗病毒性疾病、变应性疾病、风湿病、糖尿病和恶性肿瘤，其中该液体制剂是口服或不经肠给药，剂量为1-20ml/天/成年人。即使当让该液体制剂在4℃或25℃静置20天，该液体制剂仍保留它的初始活性，因为其用麦芽糖基麦芽糖苷作为稳定剂。
实施例B-17
液体肿瘤坏死因子制剂
按通常的方法，把由日本岡山Hayashibara  BiochemicalLaboratories，Inc.制备的由日本东京Cosmo，Bio Co.，Ltd.工业生产的天然人体肿瘤坏死因子-α制剂用于固定的抗人体肿瘤坏死因子-α，但是要用小牛血清白蛋白作为稳定剂通过该柱子以便除去，使用一种含有按实施便A-5中的方法制得的高纯度麦芽三糖基麦芽糖苷糖浆的生理盐水洗脱该吸附的人肿瘤坏死因子-α，用量为10％[以干固体计]，同时改变盐水的PH。把得到的洗脱液进行膜过滤并在消毒情况下装入药水瓶中，得到一种液体制剂，共含有104单位天然人肿瘤坏死因子-α/ml。
该液体制剂可用于治疗病毒性疾病，变应性疾病、风湿病、糖尿病和恶性肿瘤，其中该液体制剂是口服或不经肠给药，剂量是1-20ml/天/成人。即使当让其在4℃或25℃静置20天时该制剂仍保持它的初始活性，因为麦芽三糖基麦芽糖苷作为稳定剂。
实施便B-18
干扰素片剂
按通常的方法，把由日本岡山Hayashibara BiochemicalLaboratories，Inc，制备的并由日本东京Cosmo Bio Co.，Ltd.工业生产的天然人体干扰素-α制剂用于固定的抗人体干扰素-α抗体柱上，以在其上吸附制剂中的天然人体干扰素-α，但是使小牛血清的蛋白作为稳定剂通过该柱子以便除去，通过使用一种含有按实施例B-1中的方法制得的高纯变麦芽三糖基麦芽糖苷粉末的生理盐水，用量为5％(以干固体计)，来洗脱该吸附的天然人体干扰素-α，同时改变盐水的PH。将得到的洗脱液进行膜过滤、脱水，并通过加入大约20倍量的结晶的无水麦芽糖粉末(该麦芽糖粉末是由日本岡山Hayashibara Dhoji Co.，Ltd.工业生产的，注册商标“Finetose T”，进行粉碎将生成物粉末加到压片机中得到片剂，每批约200g，其含约150单位天然人体干扰素-α/片。
该片剂适宜用作锭剂，治疗病毒性疾病、变应性疾病、风湿病、糖尿病和恶性肿瘤，其中该片剂是口眼给药，剂量约1-10片/天/成人。特别是该片剂适用作为近年来迅速增加的爱滋病(AIDS)人的治疗药剂。
甚至当让其在室温静放时该片剂在处长的时间周期内仍保持它的初始活性，因为作为稳定剂加入的麦芽三糖基麦芽糖苷和麦芽糖的功能很好。
实施例B-19
肥料棒
把一种把料组合物，N＝14％，P2O5＝8％，K2O＝12％，茁霉多糖、一种含有按实施例A-3中的方法制得的麦芽糖基麦芽糖苷、麦芽三糖基麦芽糖苷和麦芽三糖基麦芽三糖苷的粉末、硫酸钙和水混合均匀，各组分的重量比为70∶5∶5∶15∶5，把生成的混合物加到挤压机中，该机的L/D＝20，压缩比＝1.8，用于切割的内径30mm，在80℃加热的同时挤成短棒。
该产品有很好的操作性能，不需要包装。该产品是硬的，足以在全部的使用层中使用它，通过改变组成可以控制组分的渗出速度。在必要时，该产品可以与植物激素、农药、土壤调节剂混合。
由上所述，很明显地看出，本发明的α-D-低聚葡糖基2-D-低聚葡糖苷是一种未还原的低聚糖，其是很稳定的，很容易溶于水，并有极好的质量和降低的甜度。另外，本发明的α-D-低聚葡糖基α-D-低聚葡糖苷具有提高的化学稳定性和稳定氨基酸和很容易引起棕黄反应的低聚肽的性能，以及稳定其活性或活性组分很容易钝化的生物活生物质。本发明的α-D-低聚葡糖基α-D-低聚葡糖苷还有另外的性能，例如活化性能，适宜的粘度、降低的发酵性，以及具有控制渗透压、产生光泽、保湿、防止其他糖类结晶和防止淀粉物质的逆行作用的性能。这些性能都适合用于生产包括食品、饮料、化妆品、药品和成形体的各种组合物中。这些都会在本领域作出很大的贡献。
因此，本发明的包括α-D-低聚葡糖基α-D-低聚葡糖苷的未还原的低聚糖类的形成及其制备和应用在食品、饮料、化妆品和药物领域会有工业重要性。

Claims (15)

1.由通式“Gm-T-Gn”代表的α-D-低聚葡糖苷的未还原低聚糖，其中“G”和“T”分别为葡糖基和α，α-海藻糖基，葡糖基互相联接及通过α-1，4键或α-1，6键与海藻糖基相连，“m”和“n”分别为1-8的整数。
2.按照权利要求1的未还原的低聚糖，其是α-D-麦芽糖基α-D-麦芽糖苷、α-D-麦芽三糖基α-D-麦牙糖苷或α-D-麦芽三糖基α-D-麦芽三糖苷。
3.按照权利要求1的未还原的低聚糖，其是结晶的α-D-麦芽三糖基α-D-麦芽三糖苷。
4.按照权利要求3的未还原的低聚糖，其中所说的结晶的粉末X-射线衍射分析，得到的主要的衍射角(2θ)为7.8°、10.0°、13.1°、17.5°和18.2°。
5.权利要求1的未还原的低聚糖的制备方法，所说的方法包括：
使含有海藻糖和α-葡糖基糖的水溶液或者含有在其末端具有海藻糖结构的未还原的糖类的水溶液受到糖转移酶的作用，或者相继受到糖转移酶和水解酶的作用，以便形成所说的未还原的低聚糖，所述糖转移酶为环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶和/或α-淀粉酶或α-葡糖苷酶，所述水解酶为β-淀粉酶和/或淀粉脱支酶；和收集该未还原的低聚糖。
6.根据权利要求5的方法，其中所说的未还原的低聚糖是部分还原的淀粉水解产物受到产生未还原糖的酶的作用形成的。
7.根据权利要求6的方法，其中所述酶与具有葡萄糖聚合度为3或更大的部分还原的淀粉水解产物作用形成在它的末端具有海藻糖结构的未还原糖。
8.根据权利要求5的方法，其中所说的未还原的低聚糖是α-D-麦芽糖基α-D-麦芽糖苷、α-D-麦芽三糖基α-D-麦芽糖苷或α-D-麦芽三糖基α-D-麦芽三糖苷。
9.权利要求5的方法，其中收集步骤包括：
把含有所说的未还原低聚糖的糖混合物溶液与其他糖一道加到使用强酸性阳离子交换剂或十八烷基硅胶的色谱中；和
收集富含所说的未还原低聚糖的馏分：
10.根据权利要求9的方法，其中所说的未还原的低聚糖是α-D-麦芽糖基α-D-麦芽糖苷、α-D-麦芽三糖基α-D-麦芽糖苷或α-D-麦芽三糖基α-D-麦芽三糖苷。
11.含有权利要求1的未还原的低聚糖及食品，饮料或化妆品中使用的载体的组合物。
12.根据权利要求11的组合物，其中所说的未还原的低聚糖的含量至少0.1％(W/W)。
13.根据权利要求11的组合物，其中所说的未还原的低聚糖是α-D-麦芽糖基α-D-麦芽糖苷、α-D-麦芽三糖基α-D-麦芽糖苷或α-D-麦芽三糖基α-D-麦芽三糖苷。
14.权利要求11的组合物，其为食品、饮料或化妆品形式。
15.权利要求1的未还原糖在制备药物中的用途。
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