JPH07170977A - マルトース・トレハロース変換酵素とその製造方法並びに用途 - Google Patents

マルトース・トレハロース変換酵素とその製造方法並びに用途

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Abstract

(57)【要約】 【目的】 マルトースをトレハロースに変換するマルト
ース・トレハロース変換酵素と該酵素を利用したトレハ
ロースの新規製造方法とその用途を提供する。 【構成】 本発明は、マルトースをトレハロースに変換
し、トレハロースをマルトースに変換するマルトース・
トレハロース変換酵素とその製造方法、それを産生する
微生物、並びに、このマルトース・トレハロース変換酵
素を用いてマルトースから製造されるトレハロース及び
これを含む糖質、更には、これら糖質を含有せしめた組
成物を主な構成とする。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、マルトース・トレハロ
ース変換酵素とその製造方法並びに用途に関し、更に詳
細には、マルトースをトレハロースに変換し、トレハロ
ースをマルトースに変換する新規マルトース・トレハロ
ース変換酵素とその製造方法、それを産生する微生物、
並びに、このマルトース・トレハロース変換酵素を用い
て製造されるトレハロース、又はこれを含む糖質、更に
は、これら糖質を含有せしめた組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】グルコースを構成糖とする非還元性糖質
として、古くからトレハロース（α，α−トレハロー
ス）が知られており、その存在は、『アドバンシズ・イ
ン・カーボハイドレイト・ケミストリー（Ａｄｖａｎｃ
ｅｓ ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ）』、第１８巻、第２０１乃至２２５頁（１９６
３年）アカデミック・プレス社（米国）及び『アプライ
ド・アンド・エンビロメンタル・マイクロバイオロジー
（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａ
ｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）』、第５６巻、第３２
１３乃至３２１５頁（１９９０年）などにも記載されて
いるように、少量ながら、微生物、きのこ、昆虫など広
範囲に及んでいる。トレハロースは、非還元性糖質ゆえ
にアミノ酸や蛋白質等のアミノ基を有する物質とアミノ
カルボニル反応を起こさず、アミノ酸含有物質を損なわ
ないことから、褐変、劣化を懸念することなく利用、加
工できることが期待され、その工業的製造方法の確立が
望まれている。
【０００３】トレハロースの製造方法としては、例え
ば、特開昭５０−１５４４８５公報で報告されている微
生物を用いる方法や、特開昭５８−２１６６９５公報で
提案されているマルトース・ホスホリラーゼとトレハロ
ース・ホスホリラーゼとの組合わせでマルトースを変換
する方法などが知られている。しかしながら、微生物を
用いる方法は、菌体を出発原料とし、これに含まれるト
レハロースの含量が、通常、固形物当たり１５ｗ／ｗ％
（以下、本明細書では、特にことわらない限り、ｗ／ｗ
％を％と略称する。）未満と低く、その上、これを抽出
・精製する工程が煩雑で、工業的製造方法としては不適
である。また、マルトース・ホスホリラーゼ及びトレハ
ロース・ホスホリラーゼなどホスホリラーゼを用いる方
法は、いずれもグルコースリン酸を経由しており、その
基質濃度を高めることが困難であり、また、反応系が平
衡反応で目的物の生成率が低く、更には、反応系を安定
に維持して反応をスムーズに進行させることが困難であ
って、未だ、工業的製造方法として実現するに至ってい
ない。
【０００４】一方、澱粉を原料として製造される澱粉部
分分解物、例えば、澱粉液化物、各種デキストリン、各
種マルトオリゴ糖などは、通常、その分子の末端に還元
基を有し、固形物当たりの還元力の大きさをデキストロ
ース・エクイバレント（Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ｅｑｕｉｖ
ａｌｅｎｔ，ＤＥ）として表している。この値の大きい
ものは、一般的に、分子が小さく低粘度で、甘味が強い
ものの、反応性が強く、アミノ酸や蛋白質などのアミノ
基を持つ物質とアミノカルボニル反応を起こし易く、褐
変し、悪臭を発生して、品質を劣化し易い性質のあるこ
とが知られている。このような還元性澱粉部分分解物の
種々の特性は、ＤＥの大小に依存しており、澱粉部分分
解物とＤＥとの関係は極めて重要である。従来、当業界
では、この関係を断ち切ることは不可能とさえ信じられ
てきた。
【０００５】これに関係して、『月刊フードケミカ
ル』、８月号、第６７乃至７２頁（１９９２年）、「澱
粉利用開発の現状と課題」の「オリゴ糖」の項におい
て、「トレハロースについては著しく広い応用範囲が考
えられるが、本糖の澱粉糖質からの直接糖転移、加水分
解反応を用いた酵素的生産は、現在のところ学術的には
不可能であるといわれている。」と記載されているよう
に、澱粉を原料とし、酵素反応によってトレハロースを
製造することは、従来、学術的にも不可能であると考え
られてきた。
【０００６】しかしながら、本発明者等は、当業界のこ
の常識を覆し、特願平４−３６２１３１号明細書及び特
願平５−１５６３３８号明細書で開示したように、澱粉
を原料として製造されるグルコース重合度が３以上の還
元性澱粉部分分解物に、その末端にトレハロース構造を
有するグルコース重合度が３以上の非還元性糖質を生成
する非還元性糖質生成酵素を作用させて該非還元性糖質
を生成せしめ、次いで、これにグルコアミラーゼ、又は
トレハロース遊離酵素を作用させることにより、還元性
澱粉部分分解物からトレハロースを酵素的に生産するこ
とに成功している。しかしながら、この非還元性糖質生
成酵素を用いるトレハロース製造方法では、グルコース
重合度が３以上の比較的高分子の澱粉糖質を原料とする
ものであり、その粘度も比較的高く、酵素の種類も２種
以上を必要とし、得られる反応物の糖組成も比較的複雑
でトレハロース製造におけるコスト高が懸念される。そ
こで、澱粉から工業的に製造され、安定供給されている
グルコース重合度２の澱粉部分分解物、マルトースをト
レハロースに変換するトレハロースの新規製造方法の確
立が望まれる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、澱粉から工
業的に製造され、安定供給されているマルトースをトレ
ハロースに変換するマルトース・トレハロース変換酵素
と該酵素を利用したトレハロース、又は、これを含む糖
質の新規製造方法並びにその用途を提供することであ
る。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記課題
を解決するためにマルトースからトレハロースを生成す
る全く新しい変換酵素を求めて、その酵素を産生する微
生物を広く検索した。その結果、岡山県岡山市の土壌か
ら分離したピメロバクター（Ｐｉｍｅｌｏｂａｃｔｅ
ｒ）属に属する新規な微生物Ｒ４８、兵庫県西宮市の土
壌から分離したシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ）属に属する新規な微生物Ｈ２６２、並びに公知の
サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属に属する微生物がマルト
ースをトレハロースに変換する新規マルトース・トレハ
ロース変換酵素を産生することを見いだし、本酵素をマ
ルトース含有溶液に作用させ得られるトレハロース及び
これを含む糖質の製造方法を確立し、併せて、これら糖
質を含有せしめた飲食物、化粧品、医薬品などの組成物
を確立して本発明を完成した。
【０００９】以下、本発明のピメロバクター属に属する
微生物Ｒ４８、並びにシュードモナス属に属する微生物
Ｈ２６２の同定試験結果を示す。なお、同定試験は、
『微生物の分類と同定』（長谷川武治編、学会出版セン
ター、１９８５年）に準拠して行った。
【００１０】
【ピメロバクター・スピーシーズ Ｒ４８の同定試験結
果】
【Ａ 細胞形態】
（１）肉汁寒天培養、２７℃ ：通常、０．５乃至０．
９×１．５乃至４．０μｍの桿菌。単独、希にＶ型の対
をなし、連鎖した細胞も観察される。運動性なし。無胞
子。非抗酸性。グラム陽性。 （２）酵母エキス・麦芽エキス寒天培養、２７℃：培養
１日の細胞の大きさは、０．６乃至１．０×１．３乃至
４．２μｍ、培養３日で０．６乃至１．０×１．０乃至
２．５μｍとなり、球菌に近い細胞もみられ、多形性が
認められる。また、単独、希にＶ型の対をなし、連鎖し
た細胞も観察される。
【００１１】
【Ｂ 培養的性質】
（１）肉汁寒天平板培養、２７℃ 形状 ：円形 大きさは２４時間で
０．５ｍｍ。３日で１．５乃至２ｍｍ。 周縁 ：波状 隆起 ：半レンズ状 光沢 ：なし 表面 ：しわ状 色調 ：不透明、クリーム色。 （２）酵母エキス・麦芽エキス寒天平板培養、２７℃ 形状 ：円形 大きさは３日で約１乃
至１．５ｍｍ。 周縁 ：波状 隆起 ：半レンズ状 光沢 ：なし 表面 ：粗面 色調 ：不透明、クリーム色。 （３）肉汁寒天斜面培養、２７℃ 生育度 ：良好 形状 ：糸状 （４）肉汁ゼラチン穿刺培養、２７℃：液化
【００１２】
【Ｃ 生理学的性質】
（１）硝酸塩の還元性 ：陽性 （２）脱窒反応 ：陰性 （３）メチルレッド試験 ：陰性 （４）ＶＰ試験 ：陰性 （５）インドールの生成 ：陰性 （６）硫化水素の生成 ：陽性 （７）澱粉の加水分解 ：陰性 （８）クエン酸の利用 ：陽性 （９）無機窒素源の利用 ：アンモニウム塩及び硝
酸塩ともに利用できる。 （１０）色素の生成 ：陰性 （１１）ウレアーゼ ：陰性 （１２）オキシダーゼ ：陰性 （１３）カタラーゼ ：陰性 （１４）生育の範囲 ：ｐＨ５乃至９、温度１
５乃至４０℃。 （１５）酸素に対する態度 ：好気性 （１６）炭素源の利用と酸生成の有無 利用性 酸生成能 Ｄ−グルコース 利用する 陰性 Ｄ−ガラクトース 利用しない 陰性 Ｄ−マンノース 利用する 陰性 Ｄ−フラクトース 利用する 陰性 Ｌ−アラビノース 利用する 陰性 Ｄ−キシロース 利用する 陰性 Ｌ−ラムノース 利用する 陰性 マルトース 利用する 陰性 スクロース 利用する 陰性 ラクトース 利用しない 陰性 トレハロース 利用する 陰性 ラフィノース 利用する 陰性 マンニトール 利用しない 陰性 デキストリン 利用する 陰性 ズルチトール 利用しない 陰性 （１７）アミノ酸の脱炭酸試験：Ｌ−リジン、Ｌ−アル
ギニン、オルニチン、いずれに対しても陰性。 （１８）アミノ酸の利用 ：Ｌ−グルタミン酸ナト
リウム、Ｌ−アスパラギン酸ナトリウムいずれも利用す
る。 （１９）ＤＮａｓｅ ：陰性 （２０）３−ケトラクトースの生成：陰性 （２１）ＤＮＡのＧ−Ｃ含量 ：７２％ （２２）細胞壁の主要ジアミノ酸：ＬＬ−ジアミノピメ
リン酸
【００１３】以上の菌学的性質に基づいて、『バージー
ズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオ
ロジー（Ｂｅｒｇｅｙ´ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙ
ｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）』、第
２巻（１９８６年）、及び、『ジャーナル・オブ・ジェ
ネラル・アプライド・マイクロバイオロジー（Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）』、第２９巻、第５９乃至７１
頁、（１９８３年）を参考にして、公知菌との異同を検
討した。その結果、本菌は、ピメロバクター属に属する
菌株で、新規マルトース・トレハロース変換酵素を産生
する新規微生物であることが判明した。
【００１４】これらの結果から、本発明者等は、本微生
物をピメロバクター・スピーシーズ（Ｐｉｍｅｌｏｂａ
ｃｔｅｒ ｓｐ．）Ｒ４８と命名し、平成５年６月３日
付けで、茨城県つくば市東１丁目１番３号にある通商産
業省工業技術院生命工学工業技術研究所、特許微生物寄
託センターに寄託し、受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−４３
１５として受託された。
【００１５】
【シュードモナス・プチダ Ｈ２６２の同定試験結果】
【Ａ 細胞形態】
（１）肉汁寒天培養、２７℃ ：通常 ０．５〜０．７
×１．０〜２．０μｍの桿菌で胞子は形成しない。極鞭
毛による運動性あり。グラム陰性。非抗酸性。 （２）酵母エキス・麦芽エキス寒天培養、２７℃：培養
１日の細胞の大きさは、０．６〜０．８×２．０〜４．
０μｍ。
【００１６】
【Ｂ 培養的性質】
（１）肉汁寒天平板培養、２７℃ 形状 ：円形 大きさは２４時間で１
〜２ｍｍ。３日で３．５〜４ｍｍ。 周縁 ：全縁 隆起 ：半レンズ状 光沢 ：湿光 表面 ：平滑 色調 ：不透明、白〜うすい黄色。 （２）酵母エキス・麦芽エキス寒天平板培養、２７℃ 形状 ：円形 大きさは３日で約４〜
５ｍｍ。 周縁 ：全縁 隆起 ：半レンズ状 光沢 ：湿光 表面 ：平滑 色調 ：不透明、白〜クリーム色。 （３）肉汁寒天斜面培養、２７℃ 生育度 ：良好 形状 ：糸状。隆起は薄く、表面は平
滑で湿光、不透明でやや黄味がかったクリーム色。 （４）肉汁ゼラチン穿刺培養、２７℃：液化しない
【００１７】
【Ｃ 生理学的性質】
（１）硝酸塩の還元性 ：陽性（コハク酸培地） （２）脱窒反応 ：陰性 （３）メチルレッド試験 ：陰性 （４）ＶＰ試験 ：陰性 （５）インドールの生成 ：陰性 （６）硫化水素の生成 ：陰性 （７）澱粉の加水分解 ：陰性 （８）ポリ−β−ヒドロキシブチレートの蓄積：陰性 （９）プロカテク酸の分解 ：オルト型 （１０）クエン酸の利用 ：陽性 （１１）無機窒素源の利用 ：アンモニウム塩及び
硝酸塩ともに利用できる。 （１２）色素の生成 ：うすい黄色の色素生
成。 （１３）蛍光性色素の生成 ：陽性 （１４）ウレアーゼ ：陽性 （１５）オキシダーゼ ：陽性 （１６）カタラーゼ ：陽性 （１７）生育の範囲 ：ｐＨ５乃至９、温度
１０乃至３７℃。 （１８）酸素に対する態度 ：好気性 （１９）炭素源の利用と酸生成の有無 利用性 酸生成能 Ｄ−グルコース 利用する 陰性 Ｄ−ガラクトース 利用しない 陰性 Ｄ−マンノース 利用する 陽性 Ｄ−フラクトース 利用する 陽性 Ｌ−アラビノース 利用する 陽性 Ｄ−キシロース 利用する 陽性 Ｌ−ラムノース 利用しない 陰性 マルトース 利用しない 陰性 スクロース 利用しない 陰性 ラクトース 利用しない 陰性 トレハロース 利用しない 陰性 ラフィノース 利用しない 陰性 マンニトール 利用しない 陰性 ソルビトール 利用しない 陰性 ズルチトール 利用しない 陰性 グリセロール 利用する 陽性 （２０）アミノ酸の脱炭酸試験 ：Ｌ−リジン、Ｌ−オ
ルニチンに対して陰性。Ｌ−アルギニンに対して陽性。 （２１）アミノ酸の利用 ：Ｌ−グルタミン酸ナ
トリウム、Ｌ−アスパラギン酸ナトリウム、Ｌ−アルギ
ニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−バリン、Ｄ−アラニンいず
れも利用する。Ｌ−トリプトファンを利用しない。 （２２）ＤＮａｓｅ ：陰性（２３）３−ケ
トラクトースの生成：陰性 （２４）ＤＮＡのＧ−Ｃ含量 ：６３％
【００１８】以上の菌学的性質に基づいて、『バージー
ズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオ
ロジー（Ｂｅｒｇｅｙ´ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙ
ｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）』、第
１巻（１９８４年）を参考にして、公知菌との異同を検
討した。その結果、本菌は、シュードモナス・プチダに
属する菌株であることが判明した。
【００１９】これらの結果から本発明者らは、本微生物
をシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｐｕｔｉｄａ）Ｈ２６２と命名し、平成６年２月２３日
付けで、茨城県つくば市東１丁目１番３号にある通商産
業省工業技術院生命工学工業技術研究所、特許微生物寄
託センターに寄託し、受託番号、ＦＥＲＭ ＢＰ−４５
７９として受託された。
【００２０】本発明では、上記菌株のみならず、ピメロ
パクター属及びシュードモナス属に属し、マルトース・
トレハロース変換酵素産生能を有する他の菌株やこれら
の変異株なども適宜使用することができる。
【００２１】また、本発明に用いられる微生物として
は、前記の新規微生物だけでなく、公知のサーマス（Ｔ
ｈｅｒｍｕｓ）属に属する微生物、例えば、サーマス・
アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕ
ｓ）ＡＴＣＣ２５１０４、サーマス・アクアティカス
ＡＴＣＣ２７６３４、サーマス・アクアティカス ＡＴ
ＣＣ３３９２３、サーマス・フィリホルミス（Ｔｈｅｒ
ｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＴＣＣ４３２８０、
サーマス・ルーバー（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ）Ａ
ＴＣＣ３５９４８、サーマス・スピーシーズ（Ｔｈｅｒ
ｍｕｓ ｓｐ．）ＡＴＣＣ４３８１４、及びサーマス・
スピーシーズ ＡＴＣＣ４３８１５なども有利に利用で
きる。
【００２２】本発明の微生物の培養に用いる培地は、微
生物が生育でき、本発明の酵素を産生するものであれば
よく、合成培地及び天然培地のいずれでもよい。炭素源
としては、微生物が資化できる物であればよく、例え
ば、グルコース、フラクトース、糖蜜、トレハロース、
ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトー
ル、澱粉部分分解物などの糖質、また、クエン酸、コハ
ク酸などの有機酸又はそれらの塩なども使用することが
できる。培地におけるこれらの炭素源の濃度は炭素源の
種類により適宜選択される。例えば、培養液のグルコー
スの濃度は、４０ｗ／ｖ％以下が望ましく、微生物の生
育及び増殖からは１０ｗ／ｖ％以下が好ましい。窒素源
としては、例えば、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機
窒素化合物及び、例えば、尿素、コーン・スティープ・
リカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキスな
どの有機窒素含有物が用いられる。また、無機成分とし
ては、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウ
ム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、
鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩などが適宜用い
られる。
【００２３】培養は、微生物が生育し、本発明の酵素を
産生する温度が適しており、通常、温度約４乃至８０
℃、好ましくは約２０乃至７５℃、ｐＨ約５乃至９、好
ましくはｐＨ約６乃至８．５から選ばれる条件で、好気
的に行われる。培養時間は微生物が増殖し得る時間であ
ればよく、好ましくは約１０乃至１００時間である。ま
た、培養液の溶存酸素濃度には特に制限はないが、通常
は、約０．５乃至２０ｐｐｍが好ましい。そのために、
通気量を調節したり、攪拌したり、酸素を使用したり、
また、培養槽内の圧力を高めるなどの手段が採用され
る。また、培養方式は、回分培養又は連続培養のいずれ
でもよい。
【００２４】このようにして、微生物を培養した後、得
られる培養物から本発明の酵素を回収する。本酵素活性
は、培養物の菌体外培養液及び菌体のいずれにも認めら
れ、菌体外培養液及び菌体を粗酵素として回収すればよ
く、また、培養物全体を粗酵素として用いることもでき
る。菌体外培養液と菌体との分離には通常の固液分離手
段が採用される。例えば、培養物そのものをそのまま遠
心分離する手段、培養物に濾過助剤を加えたり、あるい
は、プレコートすることにより濾過分離する手段、平
膜、中空糸膜などを用いる膜濾過分離する手段などを適
用し得る。菌体外培養液をそのまま粗酵素液として用い
ることができるが、好ましくは通常の手段で濃縮する。
例えば、硫安塩析法、アセトン及びアルコール沈殿法、
平膜、中空糸膜などを用いる膜濃縮法などが採用され
る。
【００２５】菌体内酵素は、通常の手段を用いて菌体か
ら抽出し、粗酵素液として用いることができる。例え
ば、超音波による破砕法、ガラスビーズ及びアルミナに
よる機械的破砕法、フレンチプレスによる破砕法などで
菌体から酵素を抽出し、遠心分離又は膜濾過などで清澄
な粗酵素液を得ることができる。
【００２６】更に、菌体外培養液及びその濃縮物又は菌
体抽出液は、通常の手段で固定化することもできる。例
えば、イオン交換体への結合法、樹脂及び膜などとの共
有結合・吸着法、高分子物質を用いた包括法などが採用
される。また、培養物から分離した菌体をそのまま粗酵
素として用いることができるが、固定化菌体として用い
てもよい。一例として、これをアルギン酸ナトリウムと
混合して、塩化カルシウム溶液中に滴下して粒状にゲル
化させる。この粒状化菌体をさらにポリエチレンイミ
ン、グルタルアルデヒドで処理した固定化酵素として用
いてもよい。
【００２７】粗酵素はそのまま用いてもよいが、通常の
手段によって精製することもできる。一例として、菌体
破砕抽出液を硫安塩析して濃縮した粗酵素標品を透析
後、ＤＥＡＥ−トヨパール樹脂を用いた陰イオン交換カ
ラムクロマトグラフィー、続いて、ブチルトヨパール樹
脂を用いた疎水カラムクロマトグラフィー、モノＱ Ｈ
Ｒ５／５樹脂を用いた陰イオン交換カラムクロマトグラ
フィー、トヨパールＨＷ−５５樹脂を用いたゲル濾過カ
ラムクロマトグラフィーなどを組合わせて電気泳動的に
単一な酵素を得ることができる。
【００２８】このようにして得られるマルトース・トレ
ハロース変換酵素は、下記の理化学的性質を有する。 （１） 作用 マルトースをトレハロースに変換し、トレハロースをマ
ルトースに変換する。 （２） 分子量 ＳＤＳ−ゲル電気泳動法で、約５７，０００乃至１２
０，０００ダルトン。 （３） 等電点 アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ約３．８乃
至５．１。 （４） 活性阻害 １ｍＭＣｕ++、Ｈｇ++又は５０ｍＭトリス塩酸緩衝液で
阻害を受ける。 （５） 起源 微生物により産生された酵素である。
【００２９】由来微生物の違いによる具体例を示せば次
の通りである。
【ピメロバクター・スピーシーズ Ｒ４８由来のマルト
ース・トレハロース変換酵素】 （１） 作用 マルトースをトレハロースに変換し、トレハロースをマ
ルトースに変換する。１モルのマルトース又はトレハロ
ースからそれぞれ約１モルのトレハロース又はマルトー
スを生成する。 （２） 分子量 ＳＤＳ−ゲル電気泳動法で、約５７，０００乃至６７，
０００ダルトン。 （３） 等電点 アンフォライン含有電気泳動法で、ｐＩ約４．１乃至
５．１。 （４） 活性阻害 １ｍＭＣｕ++、Ｈｇ++又は５０ｍＭトリス塩酸緩衝液で
阻害を受ける。 （５） 至適温度 ｐＨ７．０、６０分間反応で、２０℃付近。 （６） 至適ｐＨ ２５℃、６０分間反応で、約７．０乃至８．０。 （７） 温度安定性 ＰＨ７．０、６０分間保持で、３０℃付近まで安定。 （８） ｐＨ安定性 ２０℃、６０分間保持で、約６．０乃至９．０。
【００３０】
【シュードモナス・プチダ Ｈ２６２由来のマルトース
・トレハロース変換酵素】 （１） 作用 マルトースをトレハロースに変換し、トレハロースをマ
ルトースに変換する。１モルのマルトース又はトレハロ
ースからそれぞれ約１モルのトレハロース又はマルトー
スを生成する。 （２） 分子量 ＳＤＳ−ゲル電気泳動法で、約１１０，０００乃至１２
０，０００ダルトン。 （３） 等電点 アンフォライン含有電気泳動法で、ｐＩ約４．１乃至
５．１。 （４） 活性阻害 １ｍＭＣｕ++、Ｈｇ++又は５０ｍＭトリス塩酸緩衝液で
阻害を受ける。 （５） 至適温度 ｐＨ７．０、６０分間反応で、３７℃付近。 （６） 至適ｐＨ ３５℃、６０分間反応で、約７．３乃至８．３。 （７） 温度安定性 ｐＨ７．０、６０分間保持で、４０℃付近まで安定。 （８） ｐＨ安定性 ３５℃、６０分間保持で、約６．０乃至９．５。
【００３１】
【サーマス・アクアティカス ＡＴＣＣ３３９２３由来
のマルトース・トレハロース変換酵素】 （１） 作用 マルトースをトレハロースに変換し、トレハロースをマ
ルトースに変換する。１モルのマルトース又はトレハロ
ースからそれぞれ約１モルのトレハロース又はマルトー
スを生成する。 （２） 分子量 ＳＤＳ−ゲル電気泳動法で、約１００，０００乃至１１
０，０００ダルトン。 （３） 等電点 アンフォライン含有電気泳動法で、ｐＩ約３．８乃至
４．８。 （４） 活性阻害 １ｍＭＣｕ++、Ｈｇ++又は５０ｍＭトリス塩酸緩衝液で
阻害を受ける。 （５） 至適温度 ｐＨ７．０、６０分間反応で、６５℃付近。 （６） 至適ｐＨ ６０℃、６０分間反応で、約６．０乃至６．７。 （７） 温度安定性 ｐＨ７．０、６０分間保持で、８０℃付近まで安定。 （８） ｐＨ安定性 ６０℃、６０分間保持で、約５．５乃至９．５。
【００３２】本発明のマルトース・トレハロース変換酵
素の活性は次のようにして測定する。基質としてマルト
ース２０ｗ／ｖ％（１０ｍＭリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．
０）１ｍｌに酵素液１ｍｌを加え、反応温度を２５℃、
３５℃あるいは６０℃とし、６０分間反応させた後、１
００℃で１０分間加熱して反応を停止させる。この反応
液を正確に５０ｍＭリン酸塩緩衝液ｐＨ７．５で１１倍
に希釈し、その希釈液０．４ｍｌにトレハラーゼ含有溶
液（１単位／ｍｌ）を０．１ｍｌ添加したものを４５
℃、１２０分間インキュベートした後、この反応液中の
グルコース量をグルコースオキシダーゼ法で定量する。
対照として、予め１００℃で１０分間加熱することによ
り失活させた酵素液及びトレハラーゼを用いて同様に測
定する。上記の測定方法を用いて、増加するグルコース
量からマルトース・トレハロース変換酵素により生成す
るトレハロース量を求め、その活性１単位は、１分間に
１μｍｏｌｅのトレハロースを生成する酵素量と定義す
る。
【００３３】なお、反応温度は、マルトース・トレハロ
ース変換酵素が、ピメロバクター属に属する微生物由来
の場合に２５℃とし、シュードモナス属に属する微生物
由来の場合に３５℃とし、サーマス属に属する微生物由
来の場合に６０℃とした。
【００３４】本発明のマルトース・トレハロース変換酵
素は、マルトースをトレハロースに変換し、トレハロー
スをマルトースに変換できるので、基質は目的に適うも
のを選べばよい。トレハロースを製造しようとする目的
のためには、マルトースを基質にすればよい。
【００３５】マルトースとしては、本発明のマルトース
・トレハロース変換酵素が作用してトレハロースを生成
するものであればよく、一般的には、できるだけ高純度
の、望ましくは純度７０％以上のマルトース高含有物が
用いられる。市販のマルトースを用いることも、また、
常法に従って、澱粉を糖化して調製したマルトースを用
いることも有利に実施できる。
【００３６】マルトースを澱粉から調製する方法として
は、例えば、特公昭５６−１１４３７号公報、特公昭５
６−１７０７８号公報などに開示されている糊化又は液
化澱粉にβ−アミラーゼを作用させ、生成するマルトー
スを高分子デキストリンから分離し、マルトース高含有
物を採取する方法、又は、例えば、特公昭４７−１３０
８９号公報、特公昭５４−３９３８号公報に開示されて
いる糊化、又は液化澱粉にβ−アミラーゼとともにイソ
アミラーゼ、プルラナーゼなどの澱粉枝切酵素を作用さ
せてマルトース高含有物を採取する方法などがある。
【００３７】更に、これら方法で得られるマルトース高
含有物に含まれるマルトトリオースなどの夾雑糖類に、
例えば、特公昭５６−２８１５３号公報、特公昭５７−
３３５６号公報、特公昭５６−２８１５４号公報などに
開示されている酵素を作用させてマルトース含量を高め
るか、更には、例えば、特開昭５８−２３７９９号公報
などに開示されている塩型強酸性カチオン交換樹脂を用
いるカラムクロマトグラフィーにより、夾雑糖類を除去
するなどの方法によりマルトース含量を更に高めること
も好都合である。
【００３８】本発明の基質濃度は特に限定されない。例
えば、基質溶液としてマルトースを０．１％で用いた場
合でも、５０％で用いた場合でも、本酵素の反応は進行
し、トレハロースを生成する。また、基質溶液中に完全
に溶けきれない基質を含有する高濃度溶液であってもよ
い。反応温度は酵素が失活しない温度、すなわち８０℃
付近までで行えばよいが、好ましくは約０乃至７０℃の
範囲を用いる。反応ｐＨは、通常、約５．５乃至９．０
の範囲に調整すればよいが、好ましくはｐＨ約６．０乃
至８．５の範囲に調整する。反応時間は、酵素反応の進
行具合により適宜選択すればよく、通常、基質固形物グ
ラム当たり約０．１乃至１００単位の酵素使用量で０．
１乃至１００時間程度である。
【００３９】このようにして得られる反応液は、基質マ
ルトースからのトレハロースへの変換率が高く、最大で
約７０乃至８５％にも達することが判明した。
【００４０】反応液は、常法により、瀘過、遠心分離な
どして不溶物を除去した後、活性炭で脱色、Ｈ型、ＯＨ
型イオン交換樹脂で脱塩し、濃縮し、シラップ状製品と
することも、乾燥して粉末状製品にすることも、更には
結晶製品にすることも随意である。
【００４１】必要ならば、更に、高度な精製をすること
も随意である。例えば、イオン交換カラムクロマトグラ
フィーによる分画、活性炭カラムクロマトグラフィーに
よる分画、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる
分画、アルカリ処理による還元性糖質の分解除去などの
方法で精製することにより、高純度のトレハロース製品
を得ることも容易である。また、カラムクロマトグラフ
ィーなどにより分離し得られるマルトースを、再び、本
発明のマルトース・トレハロース変換酵素の基質に用い
てトレハロースへの変換反応を行うことも有利に実施で
きる。
【００４２】このようにして得られた本発明のトレハロ
ース含有糖質を、必要により、グルコアミラーゼ、α−
グルコシダーゼなどで加水分解したり、澱粉部分分解物
などを加え、シクロマルトデキストリン・グルカノトラ
ンスフェラーゼやグルコシルトランスフェラーゼなどで
糖転移したりして、甘味性、還元力、粘性などを調整す
ることも、また、アルカリ処理して還元性糖質を分解除
去したり、酵母により還元性糖質を発酵除去すること、
更には、水素添加して還元性糖質を糖アルコールにして
還元力を消滅せしめることなどの更なる加工処理を施す
ことも随意である。これを、前述の精製方法、例えば、
イオン交換カラムクロマトグラフィーなどにより、グル
コースを除去し、トレハロース高含有画分を採取し、こ
れを精製、濃縮して、シラップ状製品を得ることも、更
に濃縮して過飽和にし、晶出させてトレハロース含水結
晶又は無水結晶トレハロースを得ることも有利に実施で
きる。
【００４３】イオン交換カラムクロマトグラフィーとし
ては、特開昭５８−２３７９９号公報、特開昭５８−７
２５９８号公報などに開示されている塩型強酸性カチオ
ン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより、
夾雑糖類を除去してトレハロース高含有画分を採取する
方法が有利に実施できる。この際、固定床方式、移動床
方式、擬似移動床方式のいずれの方式を採用することも
随意である。
【００４４】トレハロース含水結晶を製造するには、例
えば、純度６０％以上、濃度６５乃至９０％のトレハロ
ース含有液を助晶機にとり、必要に応じて、約０．１乃
至２０％の種晶共存下で、温度９５℃以下、望ましく
は、１０乃至９０℃の範囲で、攪拌しつつ徐冷し、トレ
ハロース含水結晶を含有するマスキットを製造する。ま
た、減圧濃縮しながら晶析させる連続晶析法を採用する
ことも有利に実施できる。マスキットからトレハロース
含水結晶又はこれを含有する含蜜結晶を製造する方法
は、例えば、分蜜方法、ブロック粉砕方法、流動造粒方
法、噴霧乾燥方法など公知の方法を採用すればよい。
【００４５】分蜜方法の場合には、通常、マスキットを
バスケット型遠心分離機にかけ、トレハロース含水結晶
と蜜（母液）とを分離し、必要により、該結晶に少量の
冷水をスプレーして洗浄することも容易な方法であり、
より高純度のトレハロース含水結晶を製造するのに好適
である。
【００４６】噴霧乾燥方法の場合には、通常、濃度約６
０乃至８５％、晶出率２０乃至６０％程度のマスキット
を高圧ポンプでノズルから噴霧し、結晶粉末が溶解しな
い温度、例えば、約６０乃至１００℃の熱風で乾燥し、
次いで３０乃至６０℃程度の温風で約１乃至２０時間熟
成すれば非吸湿性又は難吸湿性の含蜜結晶が容易に製造
できる。
【００４７】また、ブロック粉砕方法の場合には、通
常、水分約１０乃至２５％、晶出率１０乃至６０％程度
のマスキットを数時間乃至３日間程度静置して全体をブ
ロック状に晶出固化させ、これを粉砕又は切削などの方
法によって粉末化し乾燥すれば、非吸湿性又は難吸湿性
の含蜜結晶が容易に製造できる。
【００４８】また、無水結晶トレハロースを製造するに
は、トレハロース含水結晶を乾燥して変換生成させるこ
ともできるが、一般的には、水分１０％未満の高濃度ト
レハロース高含有溶液を助晶機にとり、種晶共存下で５
０乃至１６０℃、望ましくは８０乃至１４０℃の範囲で
攪拌しつつ無水結晶トレハロースを含有するマスキット
を製造し、これを比較的高温乾燥条件下で、例えば、ブ
ロック粉砕方法、流動造粒方法、噴霧乾燥方法、押し出
し造粒方法などの方法で晶出、粉末化して製造される。
【００４９】このようにして製造される本発明のトレハ
ロースは、還元力がなく、安定であり、他の素材、特に
アミノ酸、オリゴペプチド、蛋白質などのアミノ酸又は
アミノ基を含有する物質と混合、加工しても、褐変する
ことも、異臭を発生することも、混合した他の素材を損
なうことも少ない。また、それ自身が良質で上品な甘味
を有している。更に、トレハロースは、体内のトレハラ
ーゼにより容易にグルコースに分解されることから、経
口摂取した場合、容易に消化吸収され、カロリー源とし
て利用される。また、虫歯誘発菌などによって、醗酵さ
れにくく、虫歯を起こしにくい甘味料としても利用でき
る。
【００５０】また、安定な甘味料であることより、結晶
製品の場合には、プルラン、ヒドロキシエチルスター
チ、ポリビニルピロリドンなどの結合剤と併用して錠剤
の糖衣剤として利用することも有利に実施できる。ま
た、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘
性、他糖の晶出防止性、難醗酵性、澱粉の老化防止性な
どの性質も具備している。
【００５１】従って、本発明のトレハロース及びこれを
含む糖質は、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定
剤、賦形剤などとして飲食物、嗜好物、飼料、化粧品、
医薬品などの各種組成物に有利に利用できる。
【００５２】本発明のトレハロース及びこれを含む糖質
は、そのまま甘味付けのための調味料として使用するこ
とができる。必要ならば、例えば、粉飴、ブドウ糖、マ
ルトース、蔗糖、異性化糖、蜂蜜、メイプルシュガー、
ソルビトール、マルチトール、ラクチトール、ジヒドロ
カルコン、ステビオシド、α−グリコシルステビオシ
ド、レバウディオシド、グリチルリチン、Ｌ−アスパル
チル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル、サッカリ
ン、グリシン、アラニンなどのような他の甘味料の１種
又は２種以上の適量と混合して使用してもよく、また必
要ならば、デキストリン、澱粉、乳糖などのような増量
剤と混合して使用することもできる。
【００５３】また、本発明のトレハロース及びこれを含
む糖質の粉末乃至結晶状製品は、そのままで、又は必要
に応じて、増量剤、賦形剤、結合剤などと混合して、顆
粒、球状、短棒状、板状、立方体、錠剤など各種形状に
成型して使用することも随意である。
【００５４】また、本発明のトレハロース及びこれを含
む糖質の甘味は、酸味、塩から味、渋味、旨味、苦味な
どの他の呈味を有する各種物質とよく調和し、耐酸性、
耐熱性も大きいので、一般の飲食物の甘味付け、呈味改
良に、また品質改良などに有利に利用できる。
【００５５】例えば、醤油、粉末醤油、味噌、粉末味
噌、もろみ、ひしお、ふりかけ、マヨネーズ、ドレッシ
ング、食酢、三杯酢、粉末すし酢、中華の素、天つゆ、
麺つゆ、ソース、ケチャップ、たくあん漬の素、白菜漬
の素、焼肉のタレ、カレールウ、シチューの素、スープ
の素、ダシの素、複合調味料、みりん、新みりん、テー
ブルシュガー、コーヒーシュガーなど各種調味料として
有利に使用できる。
【００５６】また、例えば、せんべい、あられ、おこ
し、餅類、まんじゅう、ういろう、あん類、羊羮、水羊
羮、錦玉、ゼリー、カステラ、飴玉などの各種和菓子、
パン、ビスケット、クラッカー、クッキー、パイ、プリ
ン、バタークリーム、カスタードクリーム、シュークリ
ーム、ワッフル、スポンジケーキ、ドーナツ、チョコレ
ート、チューインガム、キャラメル、キャンデーなどの
洋菓子、アイスクリーム、シャーベットなどの氷菓、果
実のシロップ漬、氷蜜などのシロップ類、フラワーペー
スト、ピーナッツペースト、フルーツペースト、スプレ
ッドなどのペースト類、ジャム、マーマレード、シロッ
プ漬、糖果などの果実、野菜の加工食品類、福神漬、べ
ったら漬、千枚漬、らっきょう漬などの漬物類、ハム、
ソーセージなどの畜肉製品類、魚肉ハム、魚肉ソーセー
ジ、かまぼこ、ちくわ、天ぷらなどの魚肉製品、ウニ、
イカの塩辛、酢こんぶ、さきするめ、ふぐみりん干しな
どの各種珍味類、のり、山菜、するめ、小魚、貝などで
製造されるつくだ煮類、煮豆、ポテトサラダ、こんぶ巻
などの惣菜食品、乳飲料、ヨーグルト、チーズなどの乳
製品、魚肉、畜肉、果実、野菜のビン詰、缶詰類、清
酒、合成酒、リキュール、洋酒などの酒類、紅茶、コー
ヒー、ココア、ジュース、炭酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌
飲料などの清涼飲料水、プリンミックス、ホットケーキ
ミックス、即席しるこ、即席スープなどの即席食品、更
には、離乳食、治療食、ドリンク剤などの各種飲食物へ
の甘味付けに呈味改良に、また、品質改良などに有利に
利用できる。
【００５７】また、家畜、家禽、その他蜜蜂、蚕、魚な
どの飼育動物のために飼料、餌料などの嗜好性を向上さ
せる目的で使用することもできる。その他、タバコ、練
歯磨、口紅、リップクリーム、内服液、錠剤、トロー
チ、肝油ドロップ、口中清涼剤、口中香剤、うがい剤な
ど各種固形物、ペースト状、液状などで嗜好物、化粧
品、医薬品などの各種組成物への甘味剤として、又は呈
味改良剤、矯味剤として、更には、品質改良剤として有
利に利用できる。
【００５８】品質改良剤、安定剤としては、有効成分、
活性などを失い易い各種生理活性物質又はこれを含む健
康食品、医薬品などに有利に適応できる。例えば、イン
ターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフ
ェロン−γ、ツモア・ネクロシス・ファクター−α、ツ
モア・ネクロシス・ファクター−β、マクロファージ遊
走阻止因子、コロニー刺激因子、トランスファーファク
ター、インターロイキン２などのリンホカイン含有液、
インシュリン、成長ホルモン、プロラクチン、エリトロ
ポエチン、卵細胞刺激ホルモン、胎盤ホルモンなどのホ
ルモン含有液、ＢＣＧワクチン、日本脳炎ワクチン、は
しかワクチン、ポリオ生ワクチン、痘苗、破傷風トキソ
イド、ハブ抗毒素、ヒト免疫グロブリンなどの生物製剤
含有液、ペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェ
ニコール、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、硫
酸カナマイシンなどの抗生物質含有液、チアミン、リボ
フラビン、Ｌ−アスコルビン酸、肝油、カロチノイド、
エルゴステロール、トコフェロールなどのビタミン含有
液、リパーゼ、エラスターゼ、ウロキナーゼ、プロテア
ーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラーゼ、グルカナー
ゼ、ラクターゼなどの酵素含有液、薬用人参エキス、ス
ッポンエキス、クロレラエキス、アロエエキス、プロポ
リスエキスなどのエキス類、ウイルス、乳酸菌、酵母な
どの生菌、ロイヤルゼリーなどの各種生理活性物質も、
その有効成分、活性を失うことなく、安定で高品質の健
康食品や医薬品などを容易に製造できる。
【００５９】以上述べたような各種組成物にトレハロー
ス及びこれを含む糖質を含有せしめる方法は、その製品
が完成するまでの工程で含有せしめればよく、例えば、
混和、溶解、融解、浸漬、浸透、散布、塗布、被覆、噴
霧、注入、晶出、固化など公知の方法が適宜選ばれる。
その量は、通常、０．１％以上、望ましくは、１％以上
含有せしめるのが好適である。次に実験により本発明を
さらに具体的に説明する。
【００６０】
【実験１ 酵素の生産】グルコース２．０ｗ／ｖ％、ポ
リペプトン０．５ｗ／ｖ％、酵母エキス０．１ｗ／ｖ
％、リン酸二カリウム０．１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリ
ウム０．０６ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム・７水塩０．
０５ｗ／ｖ％、炭酸カルシウム０．５ｗ／ｖ％、及び水
からなる液体培地を、５００ｍｌ容三角フラスコに１０
０ｍｌずつ入れ、オートクレーブで１１５℃、３０分間
滅菌し、冷却して、ピメロバクター・スピーシーズ Ｒ
４８（ＦＥＲＭ ＢＰ−４３１５）を接種し、２７℃、
２００ｒｐｍで２４時間回転振盪培養したものを種培養
とした。
【００６１】容量３０ｌのファーメンターに種培養の場
合と同組成の培地を約２０ｌ入れて、加熱滅菌、冷却し
て温度２７℃とした後、種培養液１ｖ／ｖ％を接種し、
温度２７℃、ｐＨ６．０乃至８．０に保ちつつ、約４０
時間通気攪拌培養した。
【００６２】培養液のマルトース・トレハロース変換酵
素活性は、０．５５単位／ｍｌであった。培養液の一部
を採り、遠心分離して菌体と培養液上清とに分離し、更
に菌体を５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁
し、元の培養液と同じ液量とした後、菌体懸濁液と培養
液上清のマルトース・トレハロース変換酵素活性を測定
したところ、菌体懸濁液には、０．５単位／ｍｌの活性
が、培養液上清には、０．０５単位／ｍｌの活性が認め
られた。なお、本酵素の活性は、反応温度を２５℃にし
て測定した。
【００６３】
【実験２ 酵素の精製】実験１で得た培養液を遠心分離
して湿重量約０．５ｋｇの菌体を回収し、これを１０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。この菌体懸
濁液約５ｌをヴィブローゲン セルミル（エドモンドビ
ューラー社製）にかけ、菌体を破砕し、この破砕処理液
を遠心分離（１５，０００Ｇ、３０分間）することによ
り、約４．５ｌの上清を得た。その上清液に飽和度０．
３になるように硫安を加え溶解させ、４℃、４時間放置
した後、遠心分離することにより上清を回収した。
【００６４】更に、その液に飽和度０．８になるように
硫安を加え溶解させ、４℃、一夜放置した後、遠心分離
することにより硫安塩析物を回収した。
【００６５】得られた硫安塩析物を１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）に溶解させた後、同じ緩衝液に対して
２４時間透析し、遠心分離して不溶物を除いた。その透
析液（４００ｍｌ）を２回に分けて、ＤＥＡＥ−トヨパ
ールゲル（東ソー株式会社製）を用いたイオン交換カラ
ムクロマトグラフィー（ゲル量３００ｍｌ）を行った。
【００６６】本発明のマルトース・トレハロース変換酵
素はＤＥＡＥ−トヨパールゲルに吸着し、食塩を含む同
緩衝液でカラムから溶出した。溶出した酵素活性画分を
回収した後、１Ｍ硫安を含む同緩衝液に対して透析し、
その透析液を遠心分離して不溶物を除き、次に、ブチル
トヨパール ６５０ゲル（東ソー株式会社製）を用いた
疎水カラムクロマトグラフィー（ゲル量３００ｍｌ）を
行った。吸着したマルトース・トレハロース変換酵素を
硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントによりカラムよ
り溶出させ、酵素活性画分を回収した。
【００６７】続いて、モノＱ ＨＲ５／５ カラム（ス
ウエーデン国、ファルマシア・エルケイビー社製）を用
いたイオン交換クロマトグラフィー（ゲル量１０ｍｌ）
を行い、溶出した酵素活性画分を回収した。精製の各ス
テップにおける酵素活性量、比活性、収率を表１に示
す。
【００６８】
【表１】
【００６９】精製した酵素標品を７．５％濃度ポリアク
リルアミドを含むゲル電気泳動により酵素標品の純度を
検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高い標品で
あった。
【００７０】
【実験３ 酵素の性質】実験２の方法で得た精製マルト
ース・トレハロース変換酵素標品をＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度１０％）に供し、同
時に泳動した分子量マーカー（日本バイオ・ラッド ラ
ボラトリーズ株式会社製）と比較して本酵素の分子量を
測定したところ、分子量約５７，０００乃至６７，００
０ダルトンであった。
【００７１】精製マルトース・トレハロース変換酵素標
品を２％アンフォライン（スウェーデン国、ファルマシ
ア・エルケイビー社製）含有等電点ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンド及びゲルの
ｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点
はｐＩ約４．１乃至５．１であった。
【００７２】本酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活
性測定方法に準じて調べた。結果を図１（温度の影
響）、図２（ｐＨの影響）に示した。酵素の至適温度
は、ｐＨ７．０、６０分間反応で２０℃付近、至適ｐＨ
は、２５℃、６０分間反応で約７．０乃至８．０であっ
た。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（５０ｍＭリン酸
緩衝液、ｐＨ７．０）を各温度に６０分間保持し、水冷
した後、残存する酵素活性を測定することにより求め
た。また、ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨの５０ｍＭ緩
衝液中で２０℃、６０分間保持した後、ｐＨを７．０に
調整し、残存する酵素活性を測定することにより求め
た。それぞれの結果を図３（温度安定性）、図４（ｐＨ
安定性）に示した。本酵素の温度安定性は３０℃付近ま
でであり、ｐＨ安定性は約６．０乃至９．０であった。
なお、本酵素活性は、１ｍＭＣｕ++、Ｈｇ++又は５０ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液で阻害された。
【００７３】
【実験４ 各種糖質への作用】各種糖質を用いて、基質
になりうるかどうかの試験をした。グルコース、マルト
ース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルト
ペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオー
ス、可溶性澱粉、アミロース（平均重合度１８）、トレ
ハロース、ネオトレハロース、ゲンチオビオース、コー
ジビオース、イソマルトース、セロビオース、マルチト
ール、シュクロース、マルツロース、ツラノース、パラ
チノース、トレハルロース、あるいはラクトースの溶
液、更に、α−グルコース・１−リン酸と等量のグルコ
ース、又は、β−グルコース・１−リン酸と等量のグル
コースとを含む溶液を調製した。
【００７４】これらの溶液に、実験２の方法で得た精製
マルトース・トレハロース変換酵素を基質固形物グラム
当たりそれぞれ２単位ずつ加え、基質濃度を５ｗ／ｖ％
になるよう調整し、これを２０℃、ｐＨ７．０で２４時
間作用させた。酵素反応前後の反応液をキーゼルゲル６
０（メルク社製、アルミプレート、２０×２０ｃｍ）を
用いた薄層クロマトグラフィー（以下、ＴＬＣと略称す
る。）にかけ、それぞれの糖質に対する酵素作用の有無
を確認した。ＴＬＣは展開溶媒に１−ブタノール：ピリ
ジン：水＝６：４：１（容積比）を用い、室温で１回展
開した。発色は２０％硫酸−メタノール溶液を噴霧し、
１１０℃で１０分間加熱しておこなった。結果を表２に
示す。
【００７５】
【表２】
【００７６】表２の結果から明かなように、本発明の酵
素は、試験した多種の糖質のうち、マルトースとトレハ
ロースにのみ作用し、その他の糖質、とりわけ、α−グ
ルコース・１リン酸とグルコースとを含む系や、β−グ
ルコース・１−リン酸とグルコースとを含む系に作用し
ないことから、従来知られているマルトース・ホスホリ
ラーゼやトレハロース・ホスホリラーゼなどのホスホリ
ラーゼとは違い、新規な酵素であることが判明した。
【００７７】
【実験５ マルトース又はトレハロースからの生成物】
最終濃度５％のマルトース水溶液に実験２の方法で得た
精製マルトース・トレハロース変換酵素を基質固形物グ
ラム当たり２単位加え、２０℃、ｐＨ７．０で２４時間
作用させた。酵素反応液の糖組成は、ガスクロマトグラ
フィー（以下、ＧＬＣと略称する。）で分析した。酵素
反応液の一部を乾固し、ピリジンに溶解した後トリメチ
ルシリル化したものを分析試料とした。ガスクロマトグ
ラフ装置はＧＣ−１６Ａ（株式会社島津製作所製）、カ
ラムは２％シリコンＯＶ−１７／クロモゾルブＷ（ジー
・エル・サイエンス株式会社製）を充填したステンレス
カラム（３ｍｍφ×２ｍ）、キャリアーガスは窒素ガス
を流量４０ｍｌ／分で、カラムオーブン温度は１６０℃
から３２０℃まで７．５℃／分の昇温速度で分析した。
検出は水素炎イオン検出器を用いた。その結果を表３に
示す。
【００７８】
【表３】
【００７９】表３の結果から明かなように、反応生成物
Ｘが多量に生成し、その保持時間が市販トレハロースの
それと一致していることが判明した。反応生成物Ｘを同
定するために次の確認試験を行った。すなわち、前述の
マルトースを基質とした酵素反応液を糖濃度２％になる
よう２０ｍＭ酢酸緩衝液，ｐＨ４．５で希釈し、この
０．５ｍｌにグルコアミラーゼ（生化学工業株式会社
製）０．１単位を加え４０℃で２０時間反応させた。
【００８０】また、同様に酵素反応液を糖濃度２％にな
るよう２０ｍＭリン酸緩衝液，ｐＨ７．０で希釈し、こ
の０．５ｍｌにトレハラーゼ０．５単位を加え４０℃で
２０時間反応させた。マルトースを基質とした酵素反応
液、そのグルコアミラーゼ処理液及びトレハラーゼ処理
液をＧＬＣで分析、比較したところ、グルコアミラーゼ
処理によりマルトースは完全にグルコースに分解され、
反応生成物Ｘは分解されずに残存していた。
【００８１】一方、トレハラーゼ処理によりマルトース
は残存していたが、反応生成物Ｘは完全にグルコースに
分解された。グルコアミラーゼ及びトレハラーゼの反応
特性を考慮すると、本発明の新規酵素によって生成する
マルトースからのオリゴ糖はトレハロースであると判断
される。
【００８２】更に、トレハロースを基質として、マルト
ースの場合と同様の条件で精製酵素を作用させ、その反
応液も同様にＧＬＣ分析したところ、本発明の酵素によ
ってトレハロースからはマルトースが生成することが判
明した。以上のＧＬＣ分析結果をまとめて表４に示す。
【００８３】
【表４】
【００８４】表４の結果から明かなように、本発明の酵
素は、マルトースをトレハロースに変換し、トレハロー
スをマルトースに変換する。その平衡点は、トレハロー
ス側に片寄っており、マルトースからのトレハロースへ
の変換率が高く、約７０％以上になることが判明した。
【００８５】
【実験６ トレハロース生成に及ぼすマルトース濃度の
影響】マルトース濃度を２．５％、５％、１０％、２０
％あるいは４０％で、温度２０℃、ｐＨ７．０にて、実
験２の方法で得た精製マルトース・トレハロース変換酵
素をマルトースグラム当たり２単位加えて反応させ、経
時的に反応液を採取し、１００℃で１０分間加熱して酵
素を失活させた。
【００８６】この反応液の全糖量をアンスロン硫酸法
で、還元糖量をソモギー・ネルソン法でグルコース換算
で定量し、全糖量に対する還元糖量の割合を還元力とし
て算出した。
【００８７】また、この反応液を糖濃度約１％になるよ
う希釈し、少量限外濾過器モルカットＩＩ ＬＧＣ（日
本ミリポアリミテッド製）にて除蛋白を行い、高速液体
クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略称する。）に
て糖組成を分析した。ＨＰＬＣの装置はＣＣＰＤシステ
ム（東ソー株式会社製）、分析カラムはＹＭＣ−ｐａｃ
ｋ ＰＡ−０３（４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ、株式会社
ワイエムシィー製）、溶離液はアセトニトリル：水＝７
８：２２（容積比）を流速１．２ｍｌ／ｍｉｎで、検出
は示差屈折計で行った。それらの結果を表５に示す。
【００８８】
【表５】
【００８９】表５の結果から明かなように、基質のマル
トース濃度に関係なく、マルトースからのトレハロース
への変換反応はよく進行し、トレハロースへ約８０％変
換した。
【００９０】
【実験７ トレハロース生成に及ぼす温度の影響】マル
トース濃度２０％で、ｐＨ７．０にして、実験２の方法
で得た精製マルトース・トレハロース変換酵素をマルト
ースグラム当たり２単位加えて、温度５℃、１０℃、１
５℃、２０℃あるいは２５℃で反応させ、経時的に反応
液を採取し、１００℃で１０分間加熱して酵素を失活さ
せた。この酵素反応液を実験６と同様にして、ＨＰＬＣ
にて糖組成を分析した。各温度、各時間でのトレハロー
ス含量を表６に示す。
【００９１】
【表６】
【００９２】表６の結果から明かなように、反応温度が
高いほどトレハロース生成速度は高くなる傾向にあった
が、温度５℃でもマルトースからのトレハロースへの変
換反応はよく進行し、トレハロースへ約８２％変換し
た。
【００９３】
【実験８ マルトースからのトレハロースの調製】マル
トース（株式会社林原生物化学研究所製）１０重量部を
水４０重量部に溶解し、温度１５℃、ｐＨ７．０にて、
実験２の方法で得た精製マルトース・トレハロース変換
酵素をマルトースグラム当たり２単位加えて４８時間反
応させ、次いで１００℃で１０分間加熱して酵素を失活
させた。本溶液には、トレハロースを固形物当たり約７
４％含有していた。本溶液を活性炭で脱色し、イオン交
換樹脂（Ｈ型及びＯＨ型）にて脱塩して精製し、濃度約
７８％に濃縮して、トレハロース含水結晶を種晶として
固形物当たり０．１％添加し、室温に一夜放置したとこ
ろ、結晶が析出した。得られたマスキットを分蜜し、結
晶に少量の水をスプレーして結晶を洗浄し、純度９９．
８％の極めて高純度のトレハロース含水結晶約３．０重
量部を得た。
【００９４】
【実験９ 酵素の生産】グルコース２．０ｗ／ｖ％、硫
酸アンモニウム１．０ｗ／ｖ％、リン酸二カリウム０．
１ｗ／ｖ％、リン酸一ナトリウム０．０６ｗ／ｖ％、硫
酸マグネシウム０．０５ｗ／ｖ％、炭酸カルシウム０．
３ｗ／ｖ％、及び水からなる液体培地を、５００ｍｌ容
三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレーブで
１１５℃で、３０分間滅菌し、冷却して、シュードモナ
ス・プチダ Ｈ２６２（ＦＥＲＭＢＰ−４５７９）を接
種し、２７℃、２００ｒｐｍで２４時間回転振とう培養
したものを種培養とした。
【００９５】容量３０ｌのファーメンターに種培養の場
合と同組成の培地を約２０ｌ入れて、加熱滅菌、冷却し
て温度２７℃とした後、種培養液１ｖ／ｖ％を接種し、
温度２７℃、ｐＨ６．５乃至８．０に保ちつつ、約２０
時間通気攪拌培養した。
【００９６】培養液のマルトース・トレハロース変換酵
素活性は、０．１２単位／ｍｌであった。培養液の一部
を採り、遠心分離して菌体と培養液上清とに分離し、更
に菌体を５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁
し、元の培養液と同じ液量とした後、菌体懸濁液と培養
液上清のマルトース・トレハロース変換酵素活性を測定
したところ、菌体懸濁液には、０．１１単位／ｍｌの活
性が、培養液上清には、０．０１単位／ｍｌの活性が認
められた。なお、本酵素の活性は、反応温度を３５℃に
して測定した。
【００９７】
【実験１０ 酵素の精製】実験９で得た培養液を遠心分
離して湿重量約０．４５ｋｇの菌体を回収し、これを１
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。この菌
体懸濁液約２ｌを超高圧菌体破砕装置ミニラボ（大日本
製薬株式会社販売）で処理し、菌体を破砕し、この破砕
処理液を遠心分離（１５，０００Ｇ、３０分間）するこ
とにより、約１．７ｌの上清を得た。その上清液に飽和
度０．７になるように硫安を加え溶解させ、４℃、一夜
放置した後、遠心分離することにより硫安塩析物を回収
した。
【００９８】得られた硫安塩析物を１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）に溶解させた後、同じ緩衝液に対して
２４時間透析し、遠心分離して不溶物を除いた。その透
析液（４００ｍｌ）を２回に分けて、ＤＥＡＥ−トヨパ
ールゲル（東ソー株式会社製）を用いたイオン交換カラ
ムクロマトグラフィー（ゲル量３００ｍｌ）を行った。
【００９９】本発明のマルトース・トレハロース変換酵
素はＤＥＡＥ−トヨパールゲルに吸着し、食塩を含む同
緩衝液でカラムから溶出した。溶出した酵素活性画分を
回収した後、同緩衝液に対して透析し、再度、ＤＥＡＥ
−トヨパールイオン交換カラムクロマトグラフィー（ゲ
ル量８０ｍｌ）を行った。吸着したマルトース・トレハ
ロース変換酵素を食塩０．１Ｍから０．３Ｍのリニアグ
ラジエントによりカラムより溶出させ、酵素活性画分を
回収した。
【０１００】続いて、トヨパール ＨＷ−５５Ｓ（東ソ
ー株式会社製造）を用いたゲル濾過クロマトグラフィー
（ゲル量４００ｍｌ）を行い、溶出した酵素活性画分を
回収した。精製の各ステップにおける酵素活性量、比活
性、収率を表７に示す。
【０１０１】
【表７】
【０１０２】精製した酵素標品を７．５ｗ／ｖ％濃度ポ
リアクリルアミドを含むゲル電気泳動により酵素標品の
純度を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高い
標品であった。
【０１０３】
【実験１１ 酵素の性質】実験１０の方法で得た精製マ
ルトース・トレハロース変換酵素標品をＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度７．５ｗ／ｖ
％）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイ
オ・ラッド ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本
酵素の分子量を測定したところ、分子量約１１０，００
０乃至１２０，０００ダルトンであった。
【０１０４】精製マルトース・トレハロース変換酵素標
品を２ｗ／ｖ％アンフォライン（スウェーデン国、ファ
ルマシア・エルケイビー社製）含有等電点ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンド及び
ゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、
等電点はｐＩ約４．１乃至５．１であった。
【０１０５】本酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活
性測定方法に準じて調べた。結果を図５（温度の影
響）、図６（ｐＨの影響）に示した。酵素の至適温度
は、ｐＨ７．０、６０分間反応で３７℃付近、至適ｐＨ
は、３５℃、６０分間反応で約７．３乃至８．３であっ
た。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（５０ｍＭリン酸
緩衝液、ｐＨ７．０）を各温度に６０分間保持し、水冷
した後、残存する酵素活性を測定することにより求め
た。また、ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨの５０ｍＭ緩
衝液中で３５℃、６０分間保持した後、ｐＨを７．０に
調整し、残存する酵素活性を測定することにより求め
た。それぞれの結果を図７（温度安定性）、図８（ｐＨ
安定性）に示した。本酵素の温度安定性は４０℃付近ま
でであり、ｐＨ安定性は約６．０乃至９．５であった。
なお、本酵素活性は、１ｍＭＣｕ++、Ｈｇ++又は５０ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液で阻害された。
【０１０６】
【実験１２ 各種糖質への作用】反応温度を３５℃とし
た以外は、実験４の方法に準じて、実験１０で得たシュ
ードモナス・プチダ Ｈ２６２の精製酵素を各種糖質に
作用させて、基質になりうるかどうかの試験をした。そ
の結果、シュードモナス・プチダ Ｈ２６２の酵素は、
ピメロバクター・スピーシーズ Ｒ４８の酵素と同様、
マルトースとトレハロースにのみ作用しマルトースをト
レハロースに変換し、トレハロースをマルトースに変換
した。その平衡点は、トレハロース側に片寄っており、
マルトースからのトレハロースへの変換率が高く、約７
０％になることが判明した。
【０１０７】
【実験１３ トレハロース生成に及ぼすマルトース濃度
の影響】マルトース濃度を５％、１０％、２０％あるい
は３０％で、温度３５℃、ｐＨ７．０にて、実験１０の
方法で得た精製マルトース・トレハロース変換酵素をマ
ルトースグラム当たり２単位加えて反応させ、経時的に
反応液を採取し、１００℃で１０分間加熱して酵素を失
活させた。
【０１０８】この反応液を用いて、実験６と同様に還元
力及び糖組成を測定した。それらの結果を表８に示す。
【０１０９】
【表８】
【０１１０】表８の結果から明らかなように、基質のマ
ルトース濃度に関係なく、トレハロースを約７０％生成
した。
【０１１１】
【実験１４ マルトースからのトレハロースの調製】マ
ルトース（株式会社林原生物化学研究所販売）１０重量
部を水４０重量部に溶解し、温度３５℃、ｐＨ７．０に
して、本発明の精製マルトース・トレハロース変換酵素
をマルトースグラム当たり２単位加えて４８時間反応さ
せ、次いで１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させ
た。本溶液には、トレハロースを固形物当たり約６９％
含有していた。本溶液を活性炭で脱色し、イオン交換樹
脂（Ｈ型及びＯＨ型）にて脱塩して精製し、濃度約７８
％に濃縮して、トレハロース含水結晶を種晶として固形
物当たり０．１％添加し、室温に一夜放置したところ、
結晶が析出した。得られたマスキットを分蜜し、結晶に
少量の水をスプレーして結晶を洗浄し、純度９９．７％
の極めて高純度のトレハロース結晶約２．３重量部を得
た。
【０１１２】
【実験１５ 酵素の生産】ポリペプトン０．５ｗ／ｖ
％、酵母エキス０．１ｗ／ｖ％、硝酸ナトリウム０．０
７ｗ／ｖ％、リン酸二ナトリウム０．０１ｗ／ｖ％、硫
酸マグネシウム０．０２ｗ／ｖ％、塩化カルシウム０．
０１ｗ／ｖ％及び水からなる液体培地を、ｐＨ７．５に
調整した後、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌず
つ入れ、オートクレーブで１２０℃で、２０分間滅菌
し、冷却して、サーマス・アクアティカス ＡＴＣＣ３
３９２３を接種し、６０℃、２００ｒｐｍで２４時間回
転振とう培養したものを種培養とした。
【０１１３】容量３０ｌのファーメンター２基に種培養
の場合と同組成の培地をそれぞれ約２０ｌ入れて、加熱
滅菌、冷却して温度６０℃とした後、種培養液１ｖ／ｖ
％を接種し、温度６０℃、ｐＨ６．５乃至８．０に保ち
つつ、約２０時間通気攪拌培養した。
【０１１４】培養液のマルトース・トレハロース変換酵
素活性は０．３５単位／ｍｌであった。培養液の一部を
採り、遠心分離して菌体と培養上清液とに分離し、更に
菌体を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、
元の培養液と同じ液量とした後、菌体懸濁液と培養上清
液のマルトース・トレハロース変換酵素活性を測定した
ところ、菌体懸濁液には０．３３単位／ｍｌの酵素活性
が、また、培養液上清には０．０２単位／ｍｌの酵素活
性が認められた。なお、本酵素の活性は、反応温度を６
０℃にして測定した。
【０１１５】
【実験１６ 酵素の精製】実験１５で得られた培養液を
遠心分離して湿重量約０．２８ｋｇの菌体を回収し、こ
れを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。
この菌体懸濁液約１．９ｌを、超音波破砕機 モデルＵ
Ｓ３００（株式会社日本精機製作所製）で処理し、菌体
を破砕した。この破砕処理液を遠心分離（１５，０００
Ｇ、３０分間）することにより、約１．８ｌの上清を得
た。その上清に飽和度０．７になるように硫安を加え溶
解させ、４℃、一夜放置した後、遠心分離機にかけ、硫
安塩析物を回収した。
【０１１６】得られた硫安塩析物を１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）に溶解させた後、同じ緩衝液に対して
２４時間透析し、遠心分離して不溶物を除いた。その透
析液（１５６０ｍｌ）を、ＤＥＡＥ−トヨパール６５０
ゲル（東ソー株式会社製）を用いたイオン交換カラムク
ロマトグラフィー（ゲル量５３０ｍｌ）を３回に分けて
行った。
【０１１７】本発明のマルトース・トレハロース変換酵
素はＤＥＡＥ−トヨパールゲルに吸着し、食塩を含む同
緩衝液でカラムから溶出した。溶出した酵素活性画分を
回収した後、１Ｍ硫安を含む同緩衝液に対して透析し、
次に、ブチルトヨパール ６５０ゲル（東ソー株式会社
製）を用いた疎水カラムクロマトグラフィー（ゲル量３
８０ｍｌ）を行った。吸着したマルトース・トレハロー
ス変換酵素を硫安１Ｍから０Ｍのリニアグラジエントに
よりカラムより溶出させ、酵素活性画分を回収した。
【０１１８】次に、トヨパール ＨＷ−５５Ｓ（東ソー
株式会社製）を用いたゲル濾過クロマトグラフィー（ゲ
ル量３８０ｍｌ）を行い、溶出した酵素活性画分を回収
した。
【０１１９】続いて、モノＱ ＨＲ５／５ カラム（ス
ウェーデン国、ファルマシア・エルケイビー社製）を用
いたイオン交換クロマトグラフィー（ゲル量１．０ｍ
ｌ）を行い、食塩０．１Ｍから０．３５Ｍのリニアグラ
ジエントにより溶出した酵素活性画分を回収した。精製
の各ステップにおける酵素活性量、比活性、収率を表９
に示す。
【０１２０】
【表９】
【０１２１】精製した酵素標品を５ｗ／ｖ％濃度ポリア
クリルアミドを含むゲル電気泳動により酵素標品の純度
を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高い標品
であった。
【０１２２】
【実験１７ 酵素の性質】実験１６の方法で得た精製マ
ルトース・トレハロース変換酵素標品をＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法（ゲル濃度７．５ｗ／ｖ
％）に供し、同時に泳動した分子量マーカー（日本バイ
オ・ラッド ラボラトリーズ株式会社製）と比較して本
酵素の分子量を測定したところ、分子量約１００，００
０乃至１１０，０００ダルトンであった。
【０１２３】精製マルトース・トレハロース変換酵素標
品を２％ｗ／ｖアンフォライン（スウェーデン国、ファ
ルマシア・エルケイビー社製）含有等電点ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンド及び
ゲルのｐＨを測定して本酵素の等電点を求めたところ、
等電点はｐＩ約３．８乃至４．８であった。
【０１２４】本酵素活性に及ぼす温度、ｐＨの影響を活
性測定方法に準じて調べた。結果を図９（温度の影
響）、図１０（ｐＨの影響）に示した。酵素の至適温度
は、ｐＨ７．０、６０分間反応で６５℃付近、至適ｐＨ
は、６０℃、６０分間反応で６．０乃至６．７であっ
た。本酵素の温度安定性は、酵素溶液（５０ｍＭリン酸
緩衝液を含む、ｐＨ７．０）を各温度に６０分間保持
し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することによ
り求めた。また、ｐＨ安定性は、本酵素を各ｐＨの５０
ｍＭ緩衝液中で６０℃、６０分間保持した後、ｐＨを
７．０に調整し、残存する酵素活性を測定することによ
り求めた。それぞれの結果を図１１（温度安定性）、図
１２（ｐＨ安定性）に示した。本酵素の温度安定性は約
８０℃付近までであり、ｐＨ安定性は５．５乃至９．５
であった。なお、本酵素活性は、１ｍＭＣｕ++、Ｈｇ++
又は５０ｍＭトリス塩酸緩衝液で阻害された。
【０１２５】
【実験１８ 各種糖質への作用】反応温度を５０℃とし
た以外は、実験４の方法に準じて、実験１６で得たサー
マス アクアティカス ＡＴＣＣ３３９２３の精製酵素
を各種糖質に作用させて、基質になりうるかどうかの試
験をした。その結果、サーマス・アクアティカスＡＴＣ
Ｃ３３９２３の酵素はピメロバクター・スピーシーズ
Ｒ４８の酵素、あるいは、シュードモナス・プチダ Ｈ
２６２の酵素と同様、マルトースとトレハロースにのみ
作用しマルトースをトレハロースに変換し、トレハロー
スをマルトースに変換した。その平衡点は、トレハロー
ス側に片寄っており、マルトースからトレハロースへの
変換率が高く、７０％以上になることが判明した。
【０１２６】
【実験１９ トレハロース生成に及ぼすマルトース濃度
の影響】マルトース濃度を２．５％、５％、１０％、２
０％あるいは４０％で、温度６０℃、ｐＨ６．５にて、
実験１６の方法で得たサーマス・アクアティカス ＡＴ
ＣＣ３３９２３の精製マルトース・トレハロース変換酵
素をマルトースグラム当たり２．５単位加えて反応さ
せ、７２時間目に反応液を採取し、１００℃で３０分間
加熱して酵素を失活させた。この反応液を用いて、実験
６と同様に還元力及び糖組成を測定した。その結果を表
１０に示した。
【０１２７】
【表１０】
【０１２８】表１０の結果から明らかなように、基質の
マルトース濃度に関係なく、トレハロースを約７０％生
成した。
【０１２９】
【実験２０ トレハロース生成に及ぼす温度の影響】マ
ルトース濃度２０％で、ｐＨ６．５にして、実験１６の
方法で得たサーマス・アクアティカス ＡＴＣＣ３３９
２３の精製マルトース・トレハロース変換酵素をマルト
ースグラム当たり２．５単位加えて、温度４０℃、５０
℃、６０℃、あるいは７０℃で反応させ、経時的に反応
液を採取し、１００℃で３０分間加熱して酵素を失活さ
せた。この反応液を実験６と同様にして、ＨＰＬＣにて
糖組成を分析した。各温度、各時間でのトレハロース含
量を表１１に示す。
【０１３０】
【表１１】
【０１３１】表１１の結果から明らかなように、マルト
ースからのトレハロースへの変換率は反応温度が低いほ
ど高く、４０℃においてトレハロースへ約８０％変換し
た。
【０１３２】
【実験２１ 他の微生物からのマルトース
・トレハロース変換酵素の生産と 【実験２１ 他の微生物からのマルトース・トレハロー
ス変換酵素の生産とその性質】公知微生物のうち、本発
明のマルトース・トレハロース変換酵素産生能の確認さ
れた特定の微生物を、実験１５の場合に準じて三角フラ
スコにて４８時間培養した。培養液の酵素活性を調べた
後、実験１６の方法に準じて、培養液を破砕装置にか
け、その上清を透析して、部分精製酵素を得、実験１７
の方法に従って、その性質を調べた。結果を表１２に示
した。
【０１３３】
【表１２】
【０１３４】表１２に示すこれらサーマス属に属する公
知微生物由来の部分精製酵素を用いて、実験１８の方法
に従って、各種糖質への作用を調べたところ、サーマス
・アクアティカス ＡＴＣＣ３３９２３由来の酵素の場
合と同様に、マルトースとトレハロースにのみ作用し、
マルトースからトレハロースを生成することが判明し
た。
【０１３５】また、サーマス・ルーバー ＡＴＣＣ３５
９４８のマルトース・トレハロース変換酵素は、サーマ
ス・アクアティカス ＡＴＣＣ３３９２３の酵素に比
し、その至適温度、安定温度は低かったが、他のサーマ
ス属の酵素は、サーマス・アクアティカス ＡＴＣＣ３
３９２３の酵素とほぼ同じ性質を示し、耐熱性の高いこ
とが判明した。
【０１３６】
【実験２２ マルトース・トレハロース変換酵素の部分
アミノ酸配列】実験２の方法で得られたピメロバクター
・スピーシーズ Ｒ４８由来の精製酵素標品、実験１０
の方法で得られたシュードモナス・プチダ Ｈ２６２由
来の精製酵素標品及び実験１６の方法で得られたサーマ
ス・アクアティカス ＡＴＣＣ３３９２３由来の精製酵
素標品の一部を、それぞれ蒸留水に対して透析した後、
蛋白量として約８０μｇをＮ末端アミノ酸配列分析用の
試料とした。Ｎ末端アミノ酸配列は、プロテインシーケ
ンサーモデル４７３Ａ（アプライドバイオシステムズ社
製造、米国）を用いて分析した。それぞれ得られたＮ末
端配列を表１３に示す。
【０１３７】
【表１３】
【０１３８】表１３の結果から明かなように、ピメロバ
クター・スピーシーズ Ｒ４８由来の酵素と、シュード
モナス・プチダ Ｈ２６２由来の酵素及びサーマス・ア
クアティカス ＡＴＣＣ３３９２３由来の酵素とは、相
同性の極めて高い部分アミノ酸配列を有していることが
判明した。すなわち、ピメロバクター属微生物由来酵素
のＮ末端側から第１０番目のトリプトファンから第１６
番目のフェニルアラニンまでの部分アミノ酸配列とシュ
ードモナス属微生物由来酵素のＮ末端側から第３番目の
トリプトファンから第９番目のフェニルアラニンまでの
部分アミノ酸配列とは、相同性が高く、トリプトファン
−Ｘ1−アルギニン−Ｘ2−アラニン−Ｘ3−フェニルア
ラニン（但し、Ｘ1はフェニルアラニン又はプロリンを
意味し、Ｘ2はトレオニン又はプロリンを意味し、Ｘ3は
バリン又はアラニンを意味する。）で表すことができ
る。また、ピメロバクター属微生物由来酵素のＮ末端側
から１４番目のアラニンから１７番目のチロシンまでの
部分アミノ酸配列とサーマス属微生物由来酵素のＮ末端
側から９番目のアラニンから１２番目のチロシンまでの
部分アミノ酸配列とは、相同性が高く、アラニン−バリ
ン−Ｘ4−チロシン（但し、Ｘ4はフェニルアラニン又は
イソロイシンを意味する。）で表すことができる。
【０１３９】
【実験２３ 調製したトレハロースの理化学的性質】実
験８の方法で調製したトレハロースの高純度標品を用い
て理化学的性質を調べた。融点は９７．０℃、比旋光度
は［α］20 D＋１９９゜（ｃ＝５）、融解熱は５７．８
ＫＪ／ｍｏｌｅ、溶解度は２５℃の水に対し、無水物と
して７７．０ｇであった。これらの物性値は、同時に測
定した市販トレハロース含水結晶（和光純薬工業株式会
社製）の値とよく一致した。
【０１４０】
【実験２４ 生体内での利用試験】厚治等が、『臨床栄
養』、第４１巻、第２号、第２００乃至２０８頁（１９
７２年）で報告している方法に準じて、実験８において
調製した高純度トレハロース標品（純度９９．８％）３
０ｇを２０ｗ／ｖ％水溶液とし、これをボランティア３
名（健康な２６才、２７才、３０才の男性）にそれぞれ
経口投与し、経時的に採血して、血糖値及びインスリン
値を測定した。対照としては、グルコースを用いた。そ
の結果、トレハロースは、グルコースの場合と同様の挙
動を示し、血糖値、インスリン値ともに、投与後、約
０．５乃至１時間で最大値を示した。トレハロースは、
容易に消化吸収、代謝利用されて、エネルギー源になる
ことが判明した。従って、本発明の方法で得られるトレ
ハロース及びこれを含む糖質は、エネルギー補給用糖源
として好適である。
【０１４１】
【実験２５ 急性毒性試験】マウスを使用して、実験８
において調製した高純度トレハロース標品（純度９９．
８％）を経口投与して急性毒性試験を行った。その結
果、トレハロースは低毒性の物質で、投与可能な最大投
与量においても死亡例は認められなかった。従って、正
確な値とはいえないが、そのＬＤ50値は、５０ｇ／ｋｇ
以上であった。
【０１４２】以下、本発明のマルトース・トレハロース
変換酵素とそれを利用したトレハロースとこれを含む糖
質の製造方法を実施例Ａで、トレハロースとこれを含む
糖質を含有せしめた組成物を実施例Ｂで示す。
【０１４３】
【実施例Ａ−１】ピメロバクター・スピーシーズ Ｒ４
８（ＦＥＲＭ ＢＰ−４３１５）を、培地成分中のグル
コース濃度を４．０ｗ／ｖ％とした以外は実験１と同じ
培地組成で、実験１の方法に準じてファーメンターで約
６０時間、通気攪拌培養した。この培養液のマルトース
・トレハロース変換酵素の活性は、培養液ｍｌ当たり
０．７５単位であった。また、その一部を遠心分離によ
り、菌体と培養上清とに分離し、活性を測定したとこ
ろ、菌体にその約６５％が、培養上清に約３５％の活性
が検出された。この菌体を含む培養液約３５ｌを、超高
圧菌体破砕装置ミニラボ（大日本製薬株式会社製）で処
理し、菌体を破砕した。この菌体破砕懸濁液を遠心分離
機にかけ、その上清を回収し、更にその液をＵＦ膜濃縮
し、マルトース・トレハロース変換酵素をｍｌ当たり約
１５単位有する濃縮酵素液約１．２ｌを回収した。１０
％馬鈴薯澱粉乳（ｐＨ５．５）にα−アミラーゼ（ナガ
セ生化学工業株式会社製、商品名スピターゼＨＳ）を澱
粉グラム当たり２単位加えて攪拌下、加熱糊化・液化さ
せ、ただちにオートクレーブ（１２０℃）を２０分間行
った後、温度５０℃、ｐＨ５．０に調整した。これにβ
−アミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社製）を澱粉グ
ラム当たり２０単位及びイソアミラーゼ（株式会社林原
生物化学研究所製）を澱粉グラム当たり５００単位の割
合になるように加え、２４時間反応させ、マルトース含
量約９２％の糖液を得た。その反応液を１００℃で２０
分間加熱した後、温度１０℃、ｐＨ７．０に調整し、こ
れに前記方法で調製したマルトース・トレハロース変換
酵素を固形物グラム当たり１単位の割合になるよう加
え、９６時間反応させた。その反応液を９５℃で１０分
間保った後、冷却し、常法に従って活性炭で脱色・濾過
し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製
し、更に濃縮して濃度約７０％のシラップを固形物収率
約９５％で得た。本品は、固形物当たりトレハロースを
約６９％含有していて還元力がＤＥ１８．２と低く、温
和な甘味、適度の粘度、保湿性を有し、甘味料、呈味改
良剤、安定剤、賦形剤などとして各種飲食物、化粧品、
医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【０１４４】
【実施例Ａ−２】実施例Ａ−１の方法で得たマルトース
・トレハロース変換酵素反応停止液に、固形物当たり１
０単位のグルコアミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社
製、商品名グルコチーム）をｐＨ５．０、５０℃で２４
時間作用させ、次いで、加熱失活、脱色、脱塩精製して
得られる糖液を原糖液とし、トレハロースの含量を高め
るため、アルカリ金属型強酸性カチオン交換樹脂（ＸＴ
−１０１６、Ｎａ+型、架橋度４％、東京有機化学工業
株式会社製）を用いたイオン交換カラムクロマトグラフ
ィーを行った。樹脂を内径５．４ｃｍのジャケット付き
ステンレス製カラム４本に充填し、直列につなぎ、樹脂
層全長２０ｍとした。カラム内温度６０℃に維持しつ
つ、糖液を樹脂に対して、５ｖ／ｖ％加え、これに６０
℃の温水をＳＶ０．１５で流して分画し、グルコースを
除去し、トレハロース高含有画分を採取した。更に、精
製、濃縮し、真空乾燥し、粉砕して、トレハロース高含
有粉末を固形物当たり、約５５％の収率で得た。本品
は、トレハロースを約９７％含有しており、極めて低い
還元性、まろやかで上品な甘味を有し、甘味料、呈味改
良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして、各種飲
食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用でき
る。
【０１４５】
【実施例Ａ−３】実施例Ａ−２の方法で得たトレハロー
ス高含有画分を、常法に従って、活性炭で脱色し、イオ
ン交換樹脂により脱塩して精製した溶液を濃度約７０％
に濃縮した後、助晶機にとり、種晶としてトレハロース
含水結晶約２％を加えて徐冷し、晶出率約４５％のマス
キットを得た。本マスキットを乾燥塔上のノズルより１
５０ｋｇ／ｃｍ2の高圧にて噴霧した。これと同時に８
５℃の熱風を乾燥塔の上部より送風して底部に設けた移
送金網コンベア上に捕集し、コンベアの下より４５℃の
温風を送りつつ、金網コンベア上に捕集した結晶粉末を
乾燥塔外に徐々に移動させ取り出した。この取り出した
結晶粉末を、熟成塔に充填して温風を送りつつ１０時間
熟成させ、結晶化と乾燥を完了し、トレハロース含水結
晶粉末を原料のトレハロース高含有糖液に対して固形物
当たり約９０％の収率で得た。本品は、実質的に吸湿性
を示さず、取扱いが容易であり、甘味料、呈味改良剤、
安定剤などとして各種飲食物、化粧品、医薬品など各種
組成物に有利に利用できる。
【０１４６】
【実施例Ａ−４】実施例Ａ−２の方法で得たトレハロー
ス高含有画分を、実施例Ａ−３と同様に精製し、次い
で、蒸発釜にとり、減圧下で煮詰め、水分約３．０％の
シラップとした。次いで、助晶機に移し、これに種晶と
して無水結晶トレハロースをシラップ固形物当たり１％
加え、１２０℃で攪拌助晶し、次いで、アルミ製バット
に取り出し、１００℃で６時間晶出熟成させてブロック
を調製した。次いで、本ブロックを切削機にて粉砕し、
流動乾燥して、水分約０．３％の無水結晶トレハロース
粉末を、原料のトレハロース高含有糖液に対して、固形
物当たり約８５％の収率で得た。本品は、食品、化粧
品、医薬品、その原材料、又は加工中間物などの含水物
の脱水剤としてのみならず、上品な甘味を有する白色粉
末甘味料としても、各種飲食物、化粧品、医薬品など各
種組成物に有利に利用できる。
【０１４７】
【実施例Ａ−５】ピメロバクター・スピーシーズ Ｒ４
８（ＦＥＲＭ ＢＰ−４３１５）を実験１と同様の方法
で培養し、さらに遠心分離して得た湿菌体１００ｇ（約
８００単位）を１０ｍＭリン酸緩衝液に溶解した２．５
％アルギン酸ナトリウム（３００乃至４００ｃｐ、和光
純薬工業株式会社製）１００ｍｌに混練した。この菌体
を含むスラリーを、マグネティックスターラーで攪拌し
ている０．１ＭＣａＣｌ2溶液中に、水面より約２０ｃ
ｍの高さから連続的に滴下し、直径２ｍｍ前後の球状の
ゲル化物を形成させた。このゲル化物をＣａＣｌ2溶液
中に室温で約２時間保った後、ブッフナーロート上で濾
過して、アルギン酸固定化菌体を回収した。この固定化
菌体を直径３０ｍｍ、長さ２００ｍｍのジャケット付き
ガラスカラムに充填し、温度を２０℃に保温した。この
固定化菌体カラムにｐＨ６．８のマルトース４０％溶液
をＳＶ０．２にて下向流で通液し、トレハロース含量約
７０％の糖液を得た。本糖液を実施例Ａ−１の方法に準
じて、精製、濃縮して、濃度約７０％のシラップを固形
物収率約９５％で得た。本品は、低還元性、温和な甘
味、適度の保湿性を有し、実施例Ａ−１の場合と同様に
各種組成物に有利に利用できる。
【０１４８】
【実施例Ａ−６】３３％とうもろこし澱粉乳に最終濃度
０．１重量％となるように炭酸カルシウムを加えた後、
ｐＨ６．５に調整し、これにα−アミラーゼ（ノボ社
製、商品名ターマミール６０Ｌ）を澱粉グラム当たり
０．２重量％になるよう加え、９５℃で１５分間反応さ
せた。その反応液をオートクレーブ（１２０℃）を３０
分間行った後、５５℃に冷却し、これにイソアミラーゼ
（株式会社林原生物化学研究所製）を澱粉グラム当たり
５００単位及びβ−アミラーゼ（ナガセ生化学工業株式
会社製）を澱粉グラム当たり３０単位の割合になるよう
に加え、４８時間反応させマルトース含量約８４％の糖
液を得た。その反応液を、１００℃で１０分間加熱し、
次いで１５℃に冷却し、実施例Ａ−１の方法で調製した
マルトース・トレハロース変換酵素を固形物グラム当た
り１．５単位の割合になるよう加え、７２時間反応させ
た。その反応液を１００℃で１５分間加熱して酵素を失
活させた後、常法に従って活性炭で脱色・濾過し、Ｈ型
及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に
濃縮して濃度約７０％のシラップを固形物収率約９５％
で得た。本品は、固形物当たりトレハロースを約６４％
を含有しており、低還元性、温和な甘味、適度の粘度、
保湿性を有し、実施例Ａ−１の場合と同様に、各種組成
物に有利に利用できる。
【０１４９】
【実施例Ａ−７】実施例Ａ−５の方法で得たシラップを
濃度約８２％に濃縮して助晶機にとり、種晶約１％を混
合した後、バットにとり、２０℃で４日間静置して晶出
固化させ、次いで切削機にて粉砕し、乾燥して含蜜型ト
レハロース含水結晶粉末を固形物収率約９５％で得た。
本品は、実質的に吸湿性を示さず、取扱いが容易であ
り、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤などとし
て、実施例Ａ−１の場合と同様に、各種組成物に有利に
利用できる。
【０１５０】
【実施例Ａ−８】実施例Ａ−６の方法で得たシラップを
濃度約８０％に濃縮して助晶機にとり、種晶としてトレ
ハロース含水結晶粉末約１％を加え、攪拌しつつ徐冷、
晶出させた。次いで、バスケット型遠心分離機で分蜜
し、結晶を少量の水でスプレーし、洗浄して高純度のト
レハロース含水結晶を固形物収率約２０％で得た。本品
は、実験２３と同様の理化学的性質を示し、甘味料、呈
味改良剤、品質改良剤、安定剤などとして、各種飲食
物、化粧品、医薬品などの各種組成物に有利に利用でき
る。更には、工業試薬、化学原料などに利用することも
有利に実施できる。
【０１５１】
【実施例Ａ−９】シュードモナス・プチダ Ｈ２６２
（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５７９）を、実験９の方法に準じ
てファーメンターで約２０時間、通気攪拌培養した。こ
の培養液約１８ｌを遠心分離にかけ、湿重量約０．４ｋ
ｇの菌体を得た。これを４ｌの１０ｍＭリン酸緩衝液に
懸濁し、超音波破砕機モデルＵＳ３００（株式会社日本
精機製作所製）で処理し、菌体を破砕した。この菌体破
砕懸濁液を遠心分離機にかけ、その上清を回収し、更に
その液をＵＦ膜濃縮し、マルトース・トレハロース変換
酵素をｍｌ当たり３．８単位有する濃縮酵素液約４００
ｍｌを回収した。１０％馬鈴薯澱粉乳（ｐＨ５．５）に
α−アミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社製、商品名
スピターゼＨＳ）を澱粉グラム当たり２単位加えて攪拌
下、加熱糊化・液化させ、ただちにオートクレーブ（１
２０℃）を２０分間行った後、温度５０℃、ｐＨ５．５
に調整した。これにプルラナーゼ（株式会社林原生物化
学研究所製）を澱粉グラム当たり５００単位及びβ−ア
ミラーゼ（ナガセ生化学工業株式会社製）を澱粉グラム
当たり２０単位の割合になるように加え、２４時間反応
させ、マルトース含量約９２％の糖液を得た。その反応
液を１００℃で２０分間加熱した後、温度４０℃、ｐＨ
７．０に調整し、これに前記方法で調製したマルトース
・トレハロース変換酵素を固形物グラム当たり１．５単
位の割合になるよう加え、７２時間反応させた。その反
応液を９５℃で１０分間保った後、冷却し、常法に従っ
て活性炭で脱色・濾過し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹
脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度約７０％の
シラップを固形物収率約９７％で得た。本品は、固形物
当たりトレハロースを約６５％含有していて還元力がＤ
Ｅ１６．２と低く、温和な甘味、適度の粘度、保湿性を
有し、甘味料、呈味改良剤、安定剤、賦形剤などとして
各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利
用できる。
【０１５２】
【実施例Ａ−１０】実施例Ａ−９の方法で得たマルトー
ス・トレハロース変換酵素による反応終了液を９５℃で
１０分間保って酵素を失活させた後、ｐＨ５．０、５５
℃に調整して、グルコアミラーゼ（ナガセ生化学工業株
式会社製、商品名グルコチーム）を固形物グラム当たり
１０単位加えて２４時間反応させた。反応液を常法に従
って、加熱して酵素を失活させ、脱色、脱塩して精製
し、濃度５５％に濃縮して糖液を得た。本糖液を原糖液
とし、アルカリ土類金属型強酸性カチオン交換樹脂（ダ
ウエックス９９、Ｃａ++型、架橋度６％、ダウケミカル
社製）を用いて、実施例Ａ−２と同様にカラムクロマト
グラフィーにかけ、トレハロース高含有画分を採取し
た。更に、これを精製し、濃縮しながら連続晶析させ、
得られるマスキットをバスケット型遠心分離機で分蜜
し、結晶を少量の水でスプレーし洗浄して高純度のトレ
ハロース含水結晶を固形物収率約２５％で得た。本品
は、実験２３と同様の理化学的性質を示し、実施例Ａ−
８と同様に、各種飲食物、化粧品、医薬品などの各種組
成物、更には、工業試薬、化学原料などに有利に利用で
きる。
【０１５３】
【実施例Ａ−１１】シュードモナス・プチダ Ｈ２６２
（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５７９）を実験９と同様の方法で
培養し、さらに遠心分離して得た湿菌体１００ｇ（約４
００単位）を１０ｍＭリン酸緩衝液に溶解した２．５％
アルギン酸ナトリウム（３００〜４００ｃｐ、和光純薬
工業株式会社販売）１００ｍｌに混練した。この菌体を
含むスラリーを、マグネティックスターラーで攪拌して
いる０．１ＭＣａＣｌ2溶液中に、水面より約２０ｃｍ
の高さから連続的に滴下し、直径２ｍｍ前後の球状のゲ
ル化物を形成させた。このゲル化物をＣａＣｌ2溶液中
に室温で約２時間保った後、ブッフナーロート上で濾過
して、アルギン酸固定化菌体を回収した。この固定化菌
体を直径３０ｍｍ、長さ２００ｍｍのジャケット付きガ
ラスカラムに充填し、温度を３５℃に保温した。この固
定化菌体カラムにｐＨ６．８のマルトース４０％溶液を
ＳＶ０．１にて下向流で通液し、トレハロース含量６７
％の糖液を得た。本糖液を実施例Ａ−９の方法に準じ
て、精製、濃縮し、これを助晶し、噴霧乾燥して含蜜型
トレハロース含水結晶粉末を固形物収率約９０％で得
た。本品は、低還元性、温和な甘味、適度の保湿性を有
し、実施例Ａ−９の場合と同様に各種組成物に有利に利
用できる。
【０１５４】
【実施例Ａ−１２】サーマス・アクアティカス ＡＴＣ
Ｃ３３９２３を、実験１５の方法に準じてファーメンタ
ーで約２０時間、通気攪拌培養した。この培養液のマル
トース・トレハロース変換酵素の活性は、培養液ｍｌ当
たり０．３２単位であった。この培養液約１８ｌから回
収した湿重量０．１８ｋｇの菌体を１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）に懸濁した。この菌体懸濁液約１．５
ｌを、超音波破砕装置で処理し、菌体を破砕した。この
菌体破砕懸濁液を遠心分離機にかけ、その上清を回収
し、更にその液をＵＦ膜濃縮し、マルトース・トレハロ
ース変換酵素をｍｌ当たり約１０単位有する濃縮酵素液
約５００ｍｌを回収した。１５％とうもろこし澱粉乳
（ｐＨ５．５）にα−アミラーゼ（ナガセ生化学工業株
式会社製、商品名スピターゼＨＳ）を澱粉グラム当たり
２単位加えて攪拌下、加熱糊化・液化させ、ただちにオ
ートクレーブ（１２０℃）を２０分間行った後、温度５
５℃、ｐＨ５．０に調整した。これにイソアミラーゼ
（株式会社林原生物化学研究所製）を澱粉グラム当たり
３００単位及びβ−アミラーゼ（ナガセ生化学工業株式
会社製）を澱粉グラム当たり２０単位の割合になるよう
に加え、２４時間反応させ、マルトース含量約９２％の
糖液を得た。その反応液を１００℃で２０分間加熱した
後、温度５０℃、ｐＨ７．０に調整し、これに前記方法
で調製したマルトース・トレハロース変換酵素を固形物
グラム当たり１．５単位の割合になるよう加え、７２時
間反応させた。その反応液を９５℃で１０分間保った
後、冷却し、常法に従って活性炭で脱色・濾過し、Ｈ型
及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に
濃縮して濃度約７０％のシラップを固形物収率約９５％
で得た。本品は、固形物当たりトレハロースを約６４％
含有していて還元力がＤＥ１８．０と低く、温和な甘
味、適度の粘度、保湿性を有し、甘味料、呈味改良剤、
安定剤、賦形剤などとして各種飲食物、化粧品、医薬品
など各種組成物に有利に利用できる。
【０１５５】
【実施例Ａ−１３】実施例Ａ−１２の方法で得たシラッ
プを濃度約８０％に濃縮して助晶機にとり、実施例Ａ−
８と同様に晶出、分蜜して高純度のトレハロース含水結
晶を固形物収率約２０％で得た。本品は、実験２３と同
様の理化学的性質を示し、実施例Ａ−８と同様に、各種
飲食物、化粧品、医薬品などの各種組成物、更には、工
業試薬、工業原料、化学原料などに有利に利用できる。
【０１５６】
【実施例Ａ−１４】サーマス・アクアティカス ＡＴＣ
Ｃ３３９２３を実験１５と同様の方法で培養し、さらに
遠心分離して得た湿菌体５０ｇ（約１，５００単位）を
１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解した２．５
％アルギン酸ナトリウム（３００乃至４００ｃｐ，和光
純薬工業株式会社製）１００ｍｌに混練した。この菌体
を含むスラリーを、マグネティックスターラーで攪拌し
ている０．１ＭＣａＣｌ2溶液中に、水面より約２０ｃ
ｍの高さから連続的に滴下し、直径２ｍｍ前後の球状の
ゲル化物を形成させた。このゲル化物をＣａＣｌ2溶液
中に室温で約２時間保った後、ブッフナーロート上で濾
過して、アルギン酸固定化菌体を回収した。この固定化
菌体を直径３０ｍｍ、長さ２００ｍｍのジャケット付き
ガラスカラムに充填し、温度を６０℃に保温した。この
固定化菌体カラムにｐＨ６．５のマルトース４０％溶液
をＳＶ０．２にて下向流で通液し、トレハロース含量約
６６％の糖液を得た。本糖液を常法に従って、精製、濃
縮し、噴霧乾燥してトレハロース含有粉末を固形物収率
約９０％で得た。本品は、低還元性で、温和な甘味を有
し、実施例Ａ−１２の場合と同様に各種組成物に有利に
利用できる。
【０１５７】
【実施例Ｂ−１ 甘味料】実施例Ａ−８の方法で得たト
レハロース含水結晶粉末１重量部に、α−グリコシルス
テビオシド（東洋精糖株式会社製、商品名αＧスイー
ト）０．０１重量部及びＬ−アスパルチル−Ｌ−フェニ
ルアラニンメチルエステル（商品名アスパルテーム）
０．０１重量部を均一に混合し、顆粒成型機にかけて、
顆粒状甘味料を得た。本品は、甘味の質が優れ、蔗糖の
約２．５倍の甘味度を有し、甘味度当たりカロリーは、
蔗糖の約１／２．５に低下している。本甘味料は、それ
に配合した高甘味度甘味物の分解もなく、安定性に優れ
ており、低カロリー甘味料として、カロリー摂取を制限
している肥満者、糖尿病者などのための低カロリー飲食
物などに対する甘味付けに好適である。また、本甘味料
は、虫歯誘発菌による酸の生成が少なく、不溶性グルカ
ンの生成も少ないことより、虫歯を抑制する飲食物など
に対する甘味付けにも好適である。
【０１５８】
【実施例Ｂ−２ ハードキャンディー】濃度５５％蔗糖
溶液１００重量部に実施例Ａ−１の方法で得たトレハロ
ース含有シラップ３０重量部を加熱混合し、次いで減圧
下で水分２％未満になるまで加熱濃縮し、これにクエン
酸１重量部及び適量のレモン香料と着色料とを混和し、
常法に従って成型し、製品を得た。本品は、歯切れ、呈
味良好で、蔗糖の晶出も起こらない高品質のハードキャ
ンディーである。
【０１５９】
【実施例Ｂ−３ チューインガム】ガムベース３重量部
を柔らかくなる程度に加熱溶融し、これに結晶マルチト
ール粉末３重量部及び実施例Ａ−３の方法で得たトレハ
ロース含水結晶粉末４重量部とを加え、更に適量の香料
と着色料とを混合し、常法に従って、ロールにより練り
合わせ、成形、包装して製品を得た。本品は、テクスチ
ャー、風味とも良好なチューインガムである。また、本
品は、低う蝕性乃至難う蝕性チューインガムとして好適
である。
【０１６０】
【実施例Ｂ−４ 粉末ジュース】噴霧乾燥により製造し
たオレンジ果汁粉末３３重量部に対して、実施例Ａ−７
の方法で得た含蜜型トレハロース含水結晶粉末５０重量
部、蔗糖１０重量部、無水クエン酸０．６５重量部、リ
ンゴ酸０．１重量部、Ｌ−アスコルビン酸０．１重量
部、クエン酸ソーダ０．１重量部、プルラン０．５重量
部、粉末香料適量をよく混合攪拌し、粉砕し微粉末にし
てこれを流動層造粒機に仕込み、排風温度４０℃、風量
１５０ｍ3とし、これに、実施例Ａ−６の方法で得たト
レハロース含有シラップをバインダーとしてスプレー
し、３０分間造粒し、計量、包装して製品を得た。本品
は、果汁含有率約３０％の粉末ジュースで、異味、異臭
がなく、高品質を長期に保った。
【０１６１】
【実施例Ｂ−５ 乳酸菌飲料】脱脂粉乳１７５重量部、
実施例Ａ−９の方法で得たトレハロース含有シラップ１
３０重量部及び特開平４−２８１７９５号公報で開示さ
れているラクトスクロース高含有粉末５０重量部を水
１，１５０重量部に溶解し、６５℃で３０分間殺菌し、
４０℃に冷却後、これに、常法に従って、乳酸菌のスタ
ーターを３０重量部植菌し、３７℃で８時間培養して乳
酸菌飲料を得た。本品は、風味良好な乳酸菌飲料であ
る。また、本品は、オリゴ糖を含有し、乳酸菌を安定に
保持するだけでなく、ビフィズス菌増殖促進作用をも有
する。
【０１６２】
【実施例Ｂ−６ カスタードクリーム】コーンスターチ
１００重量部、実施例Ａ−６の方法で得たトレハロース
含有シラップ１００重量部、マルトース８０重量部、蔗
糖２０重量部及び食塩１重量部を充分に混合し、鶏卵２
８０重量部を加えて攪拌し、これに沸騰した牛乳１，０
００重量部を徐々に加え、更に、これを火にかけて攪拌
を続け、コーンスターチが完全に糊化して全体が半透明
になった時に火を止め、これを冷却して適量のバニラ香
料を加え、計量、充填、包装して製品を得た。本品は、
なめらかな光沢を有し、温和な甘味で美味である。
【０１６３】
【実施例Ｂ−７ ういろうの素】米粉９０重量部に、コ
ーンスターチ２０重量部、蔗糖４０重量部、実施例Ａ−
１１の方法で得た含蜜型トレハロース含水結晶粉末８０
重量部及びプルラン４重量部を均一に混合してういろう
の素を製造した。ういろうの素と適量の抹茶と水とを混
練し、これを容器に入れて６０分間蒸し上げて抹茶うい
ろうを製造した。本品は、照り、口当たりも良好で、風
味も良い。また、澱粉の老化も抑制され、日持ちも良
い。
【０１６４】
【実施例Ｂ−８ 粉末ペプチド】４０％食品用大豆ペプ
チド溶液（不二精油株式会社製造、商品名ハイニュート
Ｓ）１重量部に、実施例Ａ−１０の方法で得たトレハロ
ース含水結晶２重量部を混合し、プラスチック製バット
に入れ、５０℃で減圧乾燥し、粉砕して粉末ペプチドを
得た。本品は、風味良好で、プレミックス、冷菓などの
製菓用材料としてのみならず、経口流動食、経管流動食
などの離乳食、治療用栄養剤などとしても有利に利用で
きる。
【０１６５】
【実施例Ｂ−９ 粉末味噌】赤味噌１重量部に実施例Ａ
−４の方法で得た無水結晶トレハロース粉末３重量部を
混合し、多数の半球状凹部を設けた金属板に流し込み、
これを室温下で一夜静置して固化し、離型して１個当た
り約４ｇの固形味噌を得、これを粉砕機にかけて粉末味
噌を得た。本品は、即席ラーメン、即席吸物などの調味
料として有利に利用できる。また、固形味噌は、固形調
味料としてだけでなく味噌菓子などにも利用できる。
【０１６６】
【実施例Ｂ−１０ 粉末卵黄】生卵から調製した黄卵を
プレート式加熱殺菌機で６０乃至６４℃で殺菌し、得ら
れる液状卵黄１重量部に対して、実施例Ａ−４の方法で
得た無水結晶トレハロース粉末４重量部の割合で混合し
た後バットに移し、一夜放置して、トレハロース含水結
晶に変換させてブロックを調製した。本ブロックを切削
機にかけて粉末化し、粉末卵黄を得た。本品は、プレミ
ックス、冷菓、乳化剤などの製菓用材料としてのみなら
ず、経口流動食、経管流動食などの離乳食、治療用栄養
剤などとしても有利に利用できる。また、美肌剤、育毛
剤などとしても有利に利用できる。
【０１６７】
【実施例Ｂ−１１ あん】原料あずき１０重量部に、常
法に従って、水を加えて煮沸し、渋切り、あく抜きし
て、水溶性夾雑物を除去して、あずきつぶ生あん約２１
重量部を得た。この生あんに、蔗糖１４重量部、実施例
Ａ−１２の方法で得たトレハロース含有シラップ５重量
部及び水５重量部を加えて煮沸し、これに少量のサラダ
オイルを加えてつぶあんをこわさないように練り上げ、
製品のあんを約３５重量部得た。本品は、色焼けもな
く、舌ざわりもよく、風味良好で、あんパン、まんじゅ
う、だんご、もなか、氷菓などのあん材料として、好適
である。
【０１６８】
【実施例Ｂ−１２ パン】小麦粉１００重量部、イース
ト２重量部、砂糖５重量部、実施例Ａ−１４の方法で得
たトレハロース含有粉末１重量部及び無機フード０．１
重量部を、常法に従って、水でこね、中種を２６℃で２
時間発酵させ、その後３０分間熟成し、焼き上げた。本
品は、色相、すだちともに良好で適度な弾力、温和な甘
味を有する高品質のパンである。
【０１６９】
【実施例Ｂ−１３ ハム】豚もも肉１，０００重量部に
食塩１５重量部及び硝酸カリウム３重量部を均一にすり
込んで、冷室に１昼夜堆積する。これを、水５００重量
部、食塩１００重量部、硝酸カリウム３重量部、実施例
Ａ−３の方法で得たトレハロース含水結晶粉末４０重量
部及び香辛料適量からなる塩漬液に冷室で７日間漬込
み、次いで、常法に従い、冷水で洗浄し、ひもで巻き締
め、燻煙し、クッキングし、冷却、包装して製品を得
た。本品は、色合いもよく、風味良好な高品質のハムで
ある。
【０１７０】
【実施例Ｂ−１４ 加糖練乳】原乳１００重量部に実施
例Ａ−５の方法で得たトレハロース含有シラップ３重量
部及び蔗糖１重量部を溶解し、プレートヒーターで加熱
殺菌し、次いで濃度７０％に濃縮し、無菌状態で缶詰し
て製品を得た。本品は、温和な甘味で、風味もよく、乳
幼児食品、フルーツ、コーヒー、ココア、紅茶などの調
味用に有利に利用できる。
【０１７１】
【実施例Ｂ−１５ 化粧用クリーム】モノステアリン酸
ポリオキシエチレングリコール２重量部、自己乳化型モ
ノステアリン酸グリセリン５重量部、実施例Ａ−７の方
法で得た含蜜型トレハロース含水結晶粉末２重量部、α
−グリコシルルチン１重量部、流動パラフィン１重量
部、トリオクタン酸グリセリン１０重量部及び防腐剤の
適量を常法に従って加熱溶解し、これにＬ−乳酸２重量
部、１，３−ブチレングリコール５重量部及び精製水６
６重量部を加え、ホモゲナイザーにかけ乳化し、更に香
料の適量を加えて攪拌混合しクリームを製造した。本品
は、安定性に優れ、高品質の日焼け止め、美肌剤、色白
剤などとして有利に利用できる。
【０１７２】
【実施例Ｂ−１６ 粉末薬用人参エキス】薬用人参エキ
ス０．５重量部に実施例Ａ−４の方法で得た無水結晶ト
レハロース粉末１．５重量部を混捏した後、バットに移
し、２日間放置してトレハロース含水結晶に変換させブ
ロックを調製した。本ブロックを切削機にかけて粉末化
し、分級して粉末薬用人参エキスを得た。本品を適量の
ビタミンＢ１及びビタミンＢ２粉末とともに顆粒成型機
にかけ、ビタミン含有顆粒状薬用人参エキスとした。本
品は、疲労回復剤、強壮、強精剤などとして有利に利用
できる。また、育毛剤などとしても利用できる。
【０１７３】
【実施例Ｂ−１７ 固体製剤】天然型ヒトインターフェ
ロン−α標品（株式会社林原生物化学研究所製、コスモ
・バイオ株式会社販売）を、常法に従って、固定化抗ヒ
トインターフェロン−α抗体カラムにかけ、該標品に含
まれる天然型ヒトインターフェロン−αを吸着させ、安
定剤である牛血清アルブミンを素通りさせて除去し、次
いで、ｐＨを変化させて、天然型ヒトインターフェロン
−αを実施例Ａ−２の方法で得たトレハロース高含有粉
末を５％含有する生理食塩水を用いて溶出した。本液を
精密濾過し、約２０倍量の無水結晶マルトース粉末（株
式会社林原商事製、商品名ファイントース）に加えて脱
水、粉末化し、これを打錠機にて打錠し、１錠（約２０
０ｍｇ）当たり天然型ヒトインターフェロン−αを約１
５０単位含有する錠剤を得た。本品は、舌下錠などとし
て、一日当たり、大人１乃至１０錠程度が経口的に投与
され、ウイルス性疾患、アレルギー性疾患、リューマ
チ、糖尿病、悪性腫瘍などの治療に有利に利用できる。
とりわけ、近年、患者数の急増しているエイズ、肝炎な
どの治療剤として有利に利用できる。本品は、トレハロ
ースと共にマルトースが安定剤として作用し、室温で放
置してもその活性を長期間よく維持する。
【０１７４】
【実施例Ｂ−１８ 糖衣錠】重量１５０ｍｇの素錠を芯
剤とし、これに実施例Ａ−３の方法で得たトレハロース
含水結晶粉末４０重量部、プルラン（平均分子量２０
万）２重量部、水３０重量部、タルク２５重量部及び酸
化チタン３重量部からなる下掛け液を用いて錠剤重量が
約２３０ｍｇになるまで糖衣し、次いで、同じトレハロ
ース含水結晶粉末６５重量部、プルラン１重量部及び水
３４重量部からなる上掛け液を用いて、糖衣し、更に、
ロウ液で艶出しして光沢のある外観の優れた糖衣錠を得
た。本品は、耐衝撃性にも優れており、高品質を長期間
維持する。
【０１７５】
【実施例Ｂ−１９ 練歯磨】 配合 第２リン酸カルシウム ４５．０％ プルラン ２．９５％ ラウリル硫酸ナトリウム １．５％ グリセリン ２０．０％ ポリオキシエチレンソルビタンラウレート ０．５％ 防腐剤 ０．０５％ 実施例Ａ−１４の方法で得たトレハロース含有粉末 １２．０％ マルチトール ５．０％ 水 １３．０％ 上記の材料を常法に従って混合し、練歯磨を得た。本品
は、適度の甘味を有しており、特に子供用練歯磨として
好適である。
【０１７６】
【実施例Ｂ−２０ 流動食用固体製剤】実施例Ａ−８の
方法で製造したトレハロース含水結晶５００重量部、粉
末卵黄２７０重量部、脱脂粉乳２０９重量部、塩化ナト
リウム４．４重量部、塩化カリウム１．８重量部、硫酸
マグネシウム４重量部、チアミン０．０１重量部、アス
コルビン酸ナトリウム０．１重量部、ビタミンＥアセテ
ート０．６重量部及びニコチン酸アミド０．０４重量部
からなる配合物を調製し、この配合物２５グラムずつ防
湿性ラミネート小袋に充填し、ヒートシールして製品を
得た。本品は、１袋分を約１５０乃至３００ｍｌの水に
溶解して流動食とし、経口的、又は鼻腔、胃、腸などへ
経管的使用方法により利用され、生体へのエネルギー補
給用に有利に利用できる。
【０１７７】
【実施例Ｂ−２１ 輸液剤】実施例Ａ−１０の方法で製
造した高純度トレハロース含水結晶を水に濃度約１０ｗ
／ｖ％に溶解し、次いで、常法に従って、精密濾過して
パイロジェンフリーとし、プラスチック製ボトルに無菌
的に充填し施栓して製品を得た。本品は、経日変化もな
く安定な輸液剤で、静脈内、腹腔内などに投与するのに
好適である。本品は濃度１０ｗ／ｖ％で血液と等張で、
グルコースの場合の２倍濃度でエネルギー補給できる。
【０１７８】
【実施例Ｂ−２２ 輸液剤】実施例Ａ−１３の方法で製
造した高純度トレハロース含水結晶と下記の組成のアミ
ノ酸配合物とがそれぞれ５ｗ／ｖ％、３０ｗ／ｖ％にな
るように水に混合溶解し、次いで実施例１０と同様に精
製してパイロジェンフリーとし、更に、プラスチック製
バックに充填し施栓して製品を得た。 アミノ酸配合物の組成（ｍｇ／１００ｍｌ） Ｌ−イソロイシン １８０ Ｌ−ロイシン ４１０ Ｌ−リジン塩酸塩 ６２０ Ｌ−メチオニン ２４０ Ｌ−フェニルアラニン ２９０ Ｌ−スレオニン １８０ Ｌ−トリプトファン ６０ Ｌ−バリン ２００ Ｌ−アルギニン塩酸塩 ２７０ Ｌ−ヒスチジン塩酸塩 １３０ グリシン ３４０ 本品は、糖質とアミノ酸との複合輸液剤にもかかわら
ず、トレハロースが還元性を示さないため、経日変化も
なく安定な輸液剤で、静脈内、腹腔内などへ投与するの
に好適である。本品は、生体へのエネルギー補給のみな
らず、アミノ酸補給のためにも有利に利用できる。
【０１７９】
【実施例Ｂ−２３ 外傷治療用膏薬】実施例Ａ−２の方
法で製造したトレハロース高含有粉末２００重量部及び
マルトース３００重量部に、ヨウ素３重量部を溶解した
メタノール５０重量部を加え混合し、更に１０ｗ／ｖ％
プルラン水溶液２００重量部を加えて混合し、適度の延
び、付着性を示す外傷治療用膏薬を得た。本品は、ヨウ
素による殺菌作用のみならず、トレハロースによる細胞
へのエネルギー補給剤としても作用することから、治癒
期間が短縮され、創面もきれいに治る。
【０１８０】
【発明の効果】上記から明らかなように、本発明の新規
マルトース・トレハロース変換酵素は、マルトースから
トレハロースへ高変換率で転換する。この酵素反応で得
られるトレハロースとこれを含む糖質は、安定であり、
良質でさわやかな甘味を有しており、また、経口摂取に
より消化吸収され、カロリー源となる糖質である。これ
ら糖質は、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、
賦形剤などとして、飲食物、化粧品、医薬品、など各種
組成物に有利に利用できる。
【０１８１】従って、本発明の確立は、安価で無限の資
源である澱粉に由来するマルトースから、トレハロース
とこれを含む糖質を、工業的に大量かつ安価に供給でき
る全く新しい道を拓くことになり、それが与える影響の
大きさは、澱粉科学、酵素化学、生化学などの学問分野
は言うに及ばず、産業界、とりわけ、食品、化粧品、医
薬品分野は勿論のこと、農水畜産業、化学工業にも及
び、これら産業界に与える工業的意義は、計り知れない
ものがある。
【図面の簡単な説明】
【図１】ピメロバクター・スピーシーズ Ｒ４８のマル
トース・トレハロース変換酵素の酵素活性に及ぼす温度
の影響を示す図である。
【図２】ピメロバクター・スピーシーズ Ｒ４８のマル
トース・トレハロース変換酵素の酵素活性に及ぼすｐＨ
の影響を示す図である。
【図３】ピメロバクター・スピーシーズ Ｒ４８のマル
トース・トレハロース変換酵素の安定性に及ぼす温度の
影響を示す図である。
【図４】ピメロバクター・スピーシーズ Ｒ４８のマル
トース・トレハロース変換酵素の安定性に及ぼすｐＨの
影響を示す図である。
【図５】シュードモナス・プチダ Ｈ２６２のマルトー
ス・トレハロース変換酵素の酵素活性に及ぼす温度の影
響を示す図である。
【図６】シュードモナス・プチダ Ｈ２６２のマルトー
ス・トレハロース変換酵素の酵素活性に及ぼすｐＨの影
響を示す図である。
【図７】シュードモナス・プチダ Ｈ２６２のマルトー
ス・トレハロース変換酵素の安定性に及ぼす温度の影響
を示す図である。
【図８】シュードモナス・プチダ Ｈ２６２のマルトー
ス・トレハロース変換酵素の安定性に及ぼすｐＨの影響
を示す図である。
【図９】サーマス・アクアティカス ＡＴＣＣ３３９２
３のマルトース・トレハロース変換酵素の酵素活性に及
ぼす温度の影響を示す図である。
【図１０】サーマス・アクアティカス ＡＴＣＣ３３９
２３のマルトース・トレハロース変換酵素の酵素活性に
及ぼすｐＨの影響を示す図である。
【図１１】サーマス・アクアティカス ＡＴＣＣ３３９
２３のマルトース・トレハロース変換酵素の安定性に及
ぼす温度の影響を示す図である。
【図１２】サーマス・アクアティカス ＡＴＣＣ３３９
２３のマルトース・トレハロース変換酵素の安定性に及
ぼすｐＨの影響を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ２３Ｇ 3/00 １０５ １０６ 3/02 3/30 Ａ２３Ｌ 1/202 １１８ 1/31 Ａ 1/32 Ａ 2/39 Ａ６１Ｋ 7/16 7/42 9/06 9/08 Ｊ 9/20 9/36 31/70 Ｃ０７Ｈ 3/04 Ｃ１２Ｎ 1/20 Ａ 8828−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 19/14 Ｚ 7432−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:40） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:40）

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 マルトースをトレハロースに変換し、ト
    レハロースをマルトースに変換するマルトース・トレハ
    ロース変換酵素。
  2. 【請求項２】 マルトース・トレハロース変換酵素が微
    生物由来の酵素である請求項１記載のマルトース・トレ
    ハロース変換酵素。
  3. 【請求項３】 微生物がピメロバクター属、シュードモ
    ナス属及びサーマス属から選ばれる微生物である請求項
    ２記載のマルトース・トレハロース変換酵素。
  4. 【請求項４】 下記の理化学的性質を有するマルトース
    ・トレハロース変換酵素。 （１） 作用 マルトースをトレハロースに変換し、トレハロースをマ
    ルトースに変換する。 （２） 分子量 ＳＤＳ−ゲル電気泳動法で、約５７，０００乃至１２
    ０，０００ダルトン。 （３） 等電点 アンフォライン含有電気泳動法により、ｐＩ約３．８乃
    至５．１。 （４） 活性阻害 １ｍＭＣｕ++、Ｈｇ++又は５０ｍＭトリス塩酸緩衝液で
    阻害を受ける。 （５） 起源 微生物により産生される酵素である。
  5. 【請求項５】 マルトース・トレハロース変換酵素が、
    ピメロバクター属、シュードモナス属及びサーマス属か
    ら選ばれる微生物由来の酵素であって、ピメロバクター
    属の場合、 （１） 至適温度 ｐＨ７．０、６０分間反応で、２０℃付近 （２） 至適ｐＨ ２５℃、６０分間反応で、ｐＨ約７．０乃至８．０ （３） 温度安定性 ｐＨ７．０、６０分間保持で、３０℃付近まで安定 （４） ｐＨ安定性 ２０℃、６０分間保持で、ｐＨ約６．０乃至９．５ の性質を有し、シュードモナス属の場合、 （１） 至適温度 ｐＨ７．０、６０分間反応で、３７℃付近 （２） 至適ｐＨ ３５℃、６０分間反応で、ｐＨ約７．３乃至８．３ （３） 温度安定性 ｐＨ７．０、６０分間保持で、４０℃付近まで安定 （４） ｐＨ安定性 ３５℃、６０分間保持で、ｐＨ約６．０乃至９．５ の性質を有し、サーマス属の場合、 （１） 至適温度 ｐＨ７．０、６０分間反応で、６５℃付近 （２） 至適ｐＨ ６０℃、６０分間反応で、ｐＨ約６．０乃至６．７ （３） 温度安定性 ｐＨ７．０、６０分間保持で、８０℃付近まで安定 （４） ｐＨ安定性 ６０℃、６０分間保持で、ｐＨ約５．５乃至９．５ の性質を有する請求項４記載のマルトース・トレハロー
    ス変換酵素。
  6. 【請求項６】 マルトースをトレハロースに変換し、ト
    レハロースをマルトースに変換する作用を有し、部分ア
    ミノ酸配列として、 （１） トリプトファン−Ｘ1−アルギニン−Ｘ2−アラ
    ニン−Ｘ3−フェニルアラニン（但し、Ｘ1はフェニルア
    ラニン又はプロリンを意味し、Ｘ2はトレオニン又はプ
    ロリンを意味し、 Ｘ3はバリン又はアラニンを意味す
    る。） （２） アラニン−バリン−Ｘ4−チロシン（但し、Ｘ4
    はフェニルアラニン又はイソロイシンを意味する。） から選ばれる部分アミノ酸配列を有するマルトース・ト
    レハロース変換酵素。
  7. 【請求項７】 マルトース・トレハロース変換酵素産生
    能を有する微生物を栄養培地に培養し、培養物からマル
    トース・トレハロース変換酵素を採取することを特徴と
    するマルトース・トレハロース変換酵素の製造方法。
  8. 【請求項８】 微生物がピメロバクター・スピーシーズ
    （Ｐｉｍｅｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）Ｒ４８（通商産
    業省工業技術院生命工学工業技術研究所、受託番号 Ｆ
    ＥＲＭ ＢＰ−４３１５）、シュードモナス・プチダ
    （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）Ｈ２６２
    （通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所、受託
    番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−４５７９）及びサーマス・アク
    アティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）Ａ
    ＴＣＣ３３９２３から選ばれる微生物である請求項７記
    載のマルトース・トレハロース変換酵素の製造方法。
  9. 【請求項９】 ピメロバクター・スピーシーズ（Ｐｉｍ
    ｅｌｏｂａｃｔｅｒｓｐ．）Ｒ４８（通商産業省工業技
    術院生命工学工業技術研究所、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ
    −４３１５）又はシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄ
    ｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）Ｈ２６２（通商産業省工
    業技術院生命工学工業技術研究所、受託番号 ＦＥＲＭ
    ＢＰ−４５７９）からなるマルトース・トレハロース
    変換酵素産生能を有する微生物。
  10. 【請求項１０】 マルトース含有溶液にマルトース・ト
    レハロース変換酵素を作用させてマルトースからトレハ
    ロースを生成させることを特徴とするマルトースの還元
    力低減方法。
  11. 【請求項１１】 マルトース含有溶液にマルトース・ト
    レハロース変換酵素を作用させ、得られるトレハロー
    ス、又はこれを含む糖質。
  12. 【請求項１２】 マルトース含有溶液が、澱粉にβ−ア
    ミラーゼ又はβ−アミラーゼとともに澱粉枝切酵素を作
    用させて得られたものである請求項１１記載のトレハロ
    ース、又はこれを含む糖質。
  13. 【請求項１３】 トレハロースが、マルトース含有溶液
    にマルトース・トレハロース変換酵素を作用させるか、
    又はマルトース含有溶液にマルトース・トレハロース変
    換酵素を作用させた後にグルコアミラーゼを作用させて
    トレハロース含有溶液とし、これを塩型強酸性カチオン
    交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにかけ、得
    られる含量を向上させたトレハロースであることを特徴
    とする請求項１１又は１２記載のトレハロース。
  14. 【請求項１４】 トレハロースが、含水結晶又は無水結
    晶である請求項１１、１２又は１３記載のトレハロー
    ス。
  15. 【請求項１５】 マルトース含有溶液にマルトース・ト
    レハロース変換酵素を作用させて得られるトレハロー
    ス、又はこれを含む糖質を含有せしめた組成物。
  16. 【請求項１６】 組成物が、飲食物、化粧品又は医薬品
    である請求項１５記載の組成物。
  17. 【請求項１７】 組成物がエネルギー補給用組成物であ
    る請求項１５又は１６記載の組成物。
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