JPH07170977A - マルトース・トレハロース変換酵素とその製造方法並びに用途 - Google Patents

マルトース・トレハロース変換酵素とその製造方法並びに用途

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Abstract

(57)【要約】 【目的】 マルトースをトレハロースに変換するマルト
ース・トレハロース変換酵素と該酵素を利用したトレハ
ロースの新規製造方法とその用途を提供する。 【構成】 本発明は、マルトースをトレハロースに変換
し、トレハロースをマルトースに変換するマルトース・
トレハロース変換酵素とその製造方法、それを産生する
微生物、並びに、このマルトース・トレハロース変換酵
素を用いてマルトースから製造されるトレハロース及び
これを含む糖質、更には、これら糖質を含有せしめた組
成物を主な構成とする。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、マルトース・トレハロ
ース変換酵素とその製造方法並びに用途に関し、更に詳
細には、マルトースをトレハロースに変換し、トレハロ
ースをマルトースに変換する新規マルトース・トレハロ
ース変換酵素とその製造方法、それを産生する微生物、
並びに、このマルトース・トレハロース変換酵素を用い
て製造されるトレハロース、又はこれを含む糖質、更に
は、これら糖質を含有せしめた組成物に関する。
【0002】
【従来の技術】グルコースを構成糖とする非還元性糖質
として、古くからトレハロース(α,α−トレハロー
ス)が知られており、その存在は、『アドバンシズ・イ
ン・カーボハイドレイト・ケミストリー(Advanc
es in Carbohydrate Chemis
try)』、第18巻、第201乃至225頁(196
3年)アカデミック・プレス社(米国)及び『アプライ
ド・アンド・エンビロメンタル・マイクロバイオロジー
(Applied and Environmenta
l Microbiology)』、第56巻、第32
13乃至3215頁(1990年)などにも記載されて
いるように、少量ながら、微生物、きのこ、昆虫など広
範囲に及んでいる。トレハロースは、非還元性糖質ゆえ
にアミノ酸や蛋白質等のアミノ基を有する物質とアミノ
カルボニル反応を起こさず、アミノ酸含有物質を損なわ
ないことから、褐変、劣化を懸念することなく利用、加
工できることが期待され、その工業的製造方法の確立が
望まれている。
【0003】トレハロースの製造方法としては、例え
ば、特開昭50−154485公報で報告されている微
生物を用いる方法や、特開昭58−216695公報で
提案されているマルトース・ホスホリラーゼとトレハロ
ース・ホスホリラーゼとの組合わせでマルトースを変換
する方法などが知られている。しかしながら、微生物を
用いる方法は、菌体を出発原料とし、これに含まれるト
レハロースの含量が、通常、固形物当たり15w/w%
(以下、本明細書では、特にことわらない限り、w/w
%を%と略称する。)未満と低く、その上、これを抽出
・精製する工程が煩雑で、工業的製造方法としては不適
である。また、マルトース・ホスホリラーゼ及びトレハ
ロース・ホスホリラーゼなどホスホリラーゼを用いる方
法は、いずれもグルコースリン酸を経由しており、その
基質濃度を高めることが困難であり、また、反応系が平
衡反応で目的物の生成率が低く、更には、反応系を安定
に維持して反応をスムーズに進行させることが困難であ
って、未だ、工業的製造方法として実現するに至ってい
ない。
【0004】一方、澱粉を原料として製造される澱粉部
分分解物、例えば、澱粉液化物、各種デキストリン、各
種マルトオリゴ糖などは、通常、その分子の末端に還元
基を有し、固形物当たりの還元力の大きさをデキストロ
ース・エクイバレント(Dextrose Equiv
alent,DE)として表している。この値の大きい
ものは、一般的に、分子が小さく低粘度で、甘味が強い
ものの、反応性が強く、アミノ酸や蛋白質などのアミノ
基を持つ物質とアミノカルボニル反応を起こし易く、褐
変し、悪臭を発生して、品質を劣化し易い性質のあるこ
とが知られている。このような還元性澱粉部分分解物の
種々の特性は、DEの大小に依存しており、澱粉部分分
解物とDEとの関係は極めて重要である。従来、当業界
では、この関係を断ち切ることは不可能とさえ信じられ
てきた。
【0005】これに関係して、『月刊フードケミカ
ル』、8月号、第67乃至72頁(1992年)、「澱
粉利用開発の現状と課題」の「オリゴ糖」の項におい
て、「トレハロースについては著しく広い応用範囲が考
えられるが、本糖の澱粉糖質からの直接糖転移、加水分
解反応を用いた酵素的生産は、現在のところ学術的には
不可能であるといわれている。」と記載されているよう
に、澱粉を原料とし、酵素反応によってトレハロースを
製造することは、従来、学術的にも不可能であると考え
られてきた。
【0006】しかしながら、本発明者等は、当業界のこ
の常識を覆し、特願平4−362131号明細書及び特
願平5−156338号明細書で開示したように、澱粉
を原料として製造されるグルコース重合度が3以上の還
元性澱粉部分分解物に、その末端にトレハロース構造を
有するグルコース重合度が3以上の非還元性糖質を生成
する非還元性糖質生成酵素を作用させて該非還元性糖質
を生成せしめ、次いで、これにグルコアミラーゼ、又は
トレハロース遊離酵素を作用させることにより、還元性
澱粉部分分解物からトレハロースを酵素的に生産するこ
とに成功している。しかしながら、この非還元性糖質生
成酵素を用いるトレハロース製造方法では、グルコース
重合度が3以上の比較的高分子の澱粉糖質を原料とする
ものであり、その粘度も比較的高く、酵素の種類も2種
以上を必要とし、得られる反応物の糖組成も比較的複雑
でトレハロース製造におけるコスト高が懸念される。そ
こで、澱粉から工業的に製造され、安定供給されている
グルコース重合度2の澱粉部分分解物、マルトースをト
レハロースに変換するトレハロースの新規製造方法の確
立が望まれる。
【0007】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、澱粉から工
業的に製造され、安定供給されているマルトースをトレ
ハロースに変換するマルトース・トレハロース変換酵素
と該酵素を利用したトレハロース、又は、これを含む糖
質の新規製造方法並びにその用途を提供することであ
る。
【0008】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記課題
を解決するためにマルトースからトレハロースを生成す
る全く新しい変換酵素を求めて、その酵素を産生する微
生物を広く検索した。その結果、岡山県岡山市の土壌か
ら分離したピメロバクター(Pimelobacte
r)属に属する新規な微生物R48、兵庫県西宮市の土
壌から分離したシュードモナス属(Pseudomon
as)属に属する新規な微生物H262、並びに公知の
サーマス(Thermus)属に属する微生物がマルト
ースをトレハロースに変換する新規マルトース・トレハ
ロース変換酵素を産生することを見いだし、本酵素をマ
ルトース含有溶液に作用させ得られるトレハロース及び
これを含む糖質の製造方法を確立し、併せて、これら糖
質を含有せしめた飲食物、化粧品、医薬品などの組成物
を確立して本発明を完成した。
【0009】以下、本発明のピメロバクター属に属する
微生物R48、並びにシュードモナス属に属する微生物
H262の同定試験結果を示す。なお、同定試験は、
『微生物の分類と同定』(長谷川武治編、学会出版セン
ター、1985年)に準拠して行った。
【0010】
【ピメロバクター・スピーシーズ R48の同定試験結
果】
【A 細胞形態】
(1)肉汁寒天培養、27℃ :通常、0.5乃至0.
9×1.5乃至4.0μmの桿菌。単独、希にV型の対
をなし、連鎖した細胞も観察される。運動性なし。無胞
子。非抗酸性。グラム陽性。 (2)酵母エキス・麦芽エキス寒天培養、27℃:培養
1日の細胞の大きさは、0.6乃至1.0×1.3乃至
4.2μm、培養3日で0.6乃至1.0×1.0乃至
2.5μmとなり、球菌に近い細胞もみられ、多形性が
認められる。また、単独、希にV型の対をなし、連鎖し
た細胞も観察される。
【0011】
【B 培養的性質】
(1)肉汁寒天平板培養、27℃ 形状 :円形 大きさは24時間で
0.5mm。3日で1.5乃至2mm。 周縁 :波状 隆起 :半レンズ状 光沢 :なし 表面 :しわ状 色調 :不透明、クリーム色。 (2)酵母エキス・麦芽エキス寒天平板培養、27℃ 形状 :円形 大きさは3日で約1乃
至1.5mm。 周縁 :波状 隆起 :半レンズ状 光沢 :なし 表面 :粗面 色調 :不透明、クリーム色。 (3)肉汁寒天斜面培養、27℃ 生育度 :良好 形状 :糸状 (4)肉汁ゼラチン穿刺培養、27℃:液化
【0012】
【C 生理学的性質】
(1)硝酸塩の還元性 :陽性 (2)脱窒反応 :陰性 (3)メチルレッド試験 :陰性 (4)VP試験 :陰性 (5)インドールの生成 :陰性 (6)硫化水素の生成 :陽性 (7)澱粉の加水分解 :陰性 (8)クエン酸の利用 :陽性 (9)無機窒素源の利用 :アンモニウム塩及び硝
酸塩ともに利用できる。 (10)色素の生成 :陰性 (11)ウレアーゼ :陰性 (12)オキシダーゼ :陰性 (13)カタラーゼ :陰性 (14)生育の範囲 :pH5乃至9、温度1
5乃至40℃。 (15)酸素に対する態度 :好気性 (16)炭素源の利用と酸生成の有無 利用性 酸生成能 D−グルコース 利用する 陰性 D−ガラクトース 利用しない 陰性 D−マンノース 利用する 陰性 D−フラクトース 利用する 陰性 L−アラビノース 利用する 陰性 D−キシロース 利用する 陰性 L−ラムノース 利用する 陰性 マルトース 利用する 陰性 スクロース 利用する 陰性 ラクトース 利用しない 陰性 トレハロース 利用する 陰性 ラフィノース 利用する 陰性 マンニトール 利用しない 陰性 デキストリン 利用する 陰性 ズルチトール 利用しない 陰性 (17)アミノ酸の脱炭酸試験:L−リジン、L−アル
ギニン、オルニチン、いずれに対しても陰性。 (18)アミノ酸の利用 :L−グルタミン酸ナト
リウム、L−アスパラギン酸ナトリウムいずれも利用す
る。 (19)DNase :陰性 (20)3−ケトラクトースの生成:陰性 (21)DNAのG−C含量 :72% (22)細胞壁の主要ジアミノ酸:LL−ジアミノピメ
リン酸
【0013】以上の菌学的性質に基づいて、『バージー
ズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオ
ロジー(Bergey´s Manual of Sy
stematic Bacteriology)』、第
2巻(1986年)、及び、『ジャーナル・オブ・ジェ
ネラル・アプライド・マイクロバイオロジー(Jour
nal of General Applied Mi
crobiology)』、第29巻、第59乃至71
頁、(1983年)を参考にして、公知菌との異同を検
討した。その結果、本菌は、ピメロバクター属に属する
菌株で、新規マルトース・トレハロース変換酵素を産生
する新規微生物であることが判明した。
【0014】これらの結果から、本発明者等は、本微生
物をピメロバクター・スピーシーズ(Pimeloba
cter sp.)R48と命名し、平成5年6月3日
付けで、茨城県つくば市東1丁目1番3号にある通商産
業省工業技術院生命工学工業技術研究所、特許微生物寄
託センターに寄託し、受託番号 FERM BP−43
15として受託された。
【0015】
【シュードモナス・プチダ H262の同定試験結果】
【A 細胞形態】
(1)肉汁寒天培養、27℃ :通常 0.5〜0.7
×1.0〜2.0μmの桿菌で胞子は形成しない。極鞭
毛による運動性あり。グラム陰性。非抗酸性。 (2)酵母エキス・麦芽エキス寒天培養、27℃:培養
1日の細胞の大きさは、0.6〜0.8×2.0〜4.
0μm。
【0016】
【B 培養的性質】
(1)肉汁寒天平板培養、27℃ 形状 :円形 大きさは24時間で1
〜2mm。3日で3.5〜4mm。 周縁 :全縁 隆起 :半レンズ状 光沢 :湿光 表面 :平滑 色調 :不透明、白〜うすい黄色。 (2)酵母エキス・麦芽エキス寒天平板培養、27℃ 形状 :円形 大きさは3日で約4〜
5mm。 周縁 :全縁 隆起 :半レンズ状 光沢 :湿光 表面 :平滑 色調 :不透明、白〜クリーム色。 (3)肉汁寒天斜面培養、27℃ 生育度 :良好 形状 :糸状。隆起は薄く、表面は平
滑で湿光、不透明でやや黄味がかったクリーム色。 (4)肉汁ゼラチン穿刺培養、27℃:液化しない
【0017】
【C 生理学的性質】
(1)硝酸塩の還元性 :陽性(コハク酸培地) (2)脱窒反応 :陰性 (3)メチルレッド試験 :陰性 (4)VP試験 :陰性 (5)インドールの生成 :陰性 (6)硫化水素の生成 :陰性 (7)澱粉の加水分解 :陰性 (8)ポリ−β−ヒドロキシブチレートの蓄積:陰性 (9)プロカテク酸の分解 :オルト型 (10)クエン酸の利用 :陽性 (11)無機窒素源の利用 :アンモニウム塩及び
硝酸塩ともに利用できる。 (12)色素の生成 :うすい黄色の色素生
成。 (13)蛍光性色素の生成 :陽性 (14)ウレアーゼ :陽性 (15)オキシダーゼ :陽性 (16)カタラーゼ :陽性 (17)生育の範囲 :pH5乃至9、温度
10乃至37℃。 (18)酸素に対する態度 :好気性 (19)炭素源の利用と酸生成の有無 利用性 酸生成能 D−グルコース 利用する 陰性 D−ガラクトース 利用しない 陰性 D−マンノース 利用する 陽性 D−フラクトース 利用する 陽性 L−アラビノース 利用する 陽性 D−キシロース 利用する 陽性 L−ラムノース 利用しない 陰性 マルトース 利用しない 陰性 スクロース 利用しない 陰性 ラクトース 利用しない 陰性 トレハロース 利用しない 陰性 ラフィノース 利用しない 陰性 マンニトール 利用しない 陰性 ソルビトール 利用しない 陰性 ズルチトール 利用しない 陰性 グリセロール 利用する 陽性 (20)アミノ酸の脱炭酸試験 :L−リジン、L−オ
ルニチンに対して陰性。L−アルギニンに対して陽性。 (21)アミノ酸の利用 :L−グルタミン酸ナ
トリウム、L−アスパラギン酸ナトリウム、L−アルギ
ニン、L−ヒスチジン、L−バリン、D−アラニンいず
れも利用する。L−トリプトファンを利用しない。 (22)DNase :陰性(23)3−ケ
トラクトースの生成:陰性 (24)DNAのG−C含量 :63%
【0018】以上の菌学的性質に基づいて、『バージー
ズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオ
ロジー(Bergey´s Manual of Sy
stematic Bacteriology)』、第
1巻(1984年)を参考にして、公知菌との異同を検
討した。その結果、本菌は、シュードモナス・プチダに
属する菌株であることが判明した。
【0019】これらの結果から本発明者らは、本微生物
をシュードモナス・プチダ(Pseudomonas
putida)H262と命名し、平成6年2月23日
付けで、茨城県つくば市東1丁目1番3号にある通商産
業省工業技術院生命工学工業技術研究所、特許微生物寄
託センターに寄託し、受託番号、FERM BP−45
79として受託された。
【0020】本発明では、上記菌株のみならず、ピメロ
パクター属及びシュードモナス属に属し、マルトース・
トレハロース変換酵素産生能を有する他の菌株やこれら
の変異株なども適宜使用することができる。
【0021】また、本発明に用いられる微生物として
は、前記の新規微生物だけでなく、公知のサーマス(T
hermus)属に属する微生物、例えば、サーマス・
アクアティカス(Thermus aquaticu
s)ATCC25104、サーマス・アクアティカス
ATCC27634、サーマス・アクアティカス AT
CC33923、サーマス・フィリホルミス(Ther
mus filiformis)ATCC43280、
サーマス・ルーバー(Thermus ruber)A
TCC35948、サーマス・スピーシーズ(Ther
mus sp.)ATCC43814、及びサーマス・
スピーシーズ ATCC43815なども有利に利用で
きる。
【0022】本発明の微生物の培養に用いる培地は、微
生物が生育でき、本発明の酵素を産生するものであれば
よく、合成培地及び天然培地のいずれでもよい。炭素源
としては、微生物が資化できる物であればよく、例え
ば、グルコース、フラクトース、糖蜜、トレハロース、
ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトー
ル、澱粉部分分解物などの糖質、また、クエン酸、コハ
ク酸などの有機酸又はそれらの塩なども使用することが
できる。培地におけるこれらの炭素源の濃度は炭素源の
種類により適宜選択される。例えば、培養液のグルコー
スの濃度は、40w/v%以下が望ましく、微生物の生
育及び増殖からは10w/v%以下が好ましい。窒素源
としては、例えば、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機
窒素化合物及び、例えば、尿素、コーン・スティープ・
リカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキスな
どの有機窒素含有物が用いられる。また、無機成分とし
ては、例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウ
ム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、
鉄塩、銅塩、モリブデン塩、コバルト塩などが適宜用い
られる。
【0023】培養は、微生物が生育し、本発明の酵素を
産生する温度が適しており、通常、温度約4乃至80
℃、好ましくは約20乃至75℃、pH約5乃至9、好
ましくはpH約6乃至8.5から選ばれる条件で、好気
的に行われる。培養時間は微生物が増殖し得る時間であ
ればよく、好ましくは約10乃至100時間である。ま
た、培養液の溶存酸素濃度には特に制限はないが、通常
は、約0.5乃至20ppmが好ましい。そのために、
通気量を調節したり、攪拌したり、酸素を使用したり、
また、培養槽内の圧力を高めるなどの手段が採用され
る。また、培養方式は、回分培養又は連続培養のいずれ
でもよい。
【0024】このようにして、微生物を培養した後、得
られる培養物から本発明の酵素を回収する。本酵素活性
は、培養物の菌体外培養液及び菌体のいずれにも認めら
れ、菌体外培養液及び菌体を粗酵素として回収すればよ
く、また、培養物全体を粗酵素として用いることもでき
る。菌体外培養液と菌体との分離には通常の固液分離手
段が採用される。例えば、培養物そのものをそのまま遠
心分離する手段、培養物に濾過助剤を加えたり、あるい
は、プレコートすることにより濾過分離する手段、平
膜、中空糸膜などを用いる膜濾過分離する手段などを適
用し得る。菌体外培養液をそのまま粗酵素液として用い
ることができるが、好ましくは通常の手段で濃縮する。
例えば、硫安塩析法、アセトン及びアルコール沈殿法、
平膜、中空糸膜などを用いる膜濃縮法などが採用され
る。
【0025】菌体内酵素は、通常の手段を用いて菌体か
ら抽出し、粗酵素液として用いることができる。例え
ば、超音波による破砕法、ガラスビーズ及びアルミナに
よる機械的破砕法、フレンチプレスによる破砕法などで
菌体から酵素を抽出し、遠心分離又は膜濾過などで清澄
な粗酵素液を得ることができる。
【0026】更に、菌体外培養液及びその濃縮物又は菌
体抽出液は、通常の手段で固定化することもできる。例
えば、イオン交換体への結合法、樹脂及び膜などとの共
有結合・吸着法、高分子物質を用いた包括法などが採用
される。また、培養物から分離した菌体をそのまま粗酵
素として用いることができるが、固定化菌体として用い
てもよい。一例として、これをアルギン酸ナトリウムと
混合して、塩化カルシウム溶液中に滴下して粒状にゲル
化させる。この粒状化菌体をさらにポリエチレンイミ
ン、グルタルアルデヒドで処理した固定化酵素として用
いてもよい。
【0027】粗酵素はそのまま用いてもよいが、通常の
手段によって精製することもできる。一例として、菌体
破砕抽出液を硫安塩析して濃縮した粗酵素標品を透析
後、DEAE−トヨパール樹脂を用いた陰イオン交換カ
ラムクロマトグラフィー、続いて、ブチルトヨパール樹
脂を用いた疎水カラムクロマトグラフィー、モノQ H
R5/5樹脂を用いた陰イオン交換カラムクロマトグラ
フィー、トヨパールHW−55樹脂を用いたゲル濾過カ
ラムクロマトグラフィーなどを組合わせて電気泳動的に
単一な酵素を得ることができる。
【0028】このようにして得られるマルトース・トレ
ハロース変換酵素は、下記の理化学的性質を有する。 (1) 作用 マルトースをトレハロースに変換し、トレハロースをマ
ルトースに変換する。 (2) 分子量 SDS−ゲル電気泳動法で、約57,000乃至12
0,000ダルトン。 (3) 等電点 アンフォライン含有電気泳動法により、pI約3.8乃
至5.1。 (4) 活性阻害 1mMCu++、Hg++又は50mMトリス塩酸緩衝液で
阻害を受ける。 (5) 起源 微生物により産生された酵素である。
【0029】由来微生物の違いによる具体例を示せば次
の通りである。
【ピメロバクター・スピーシーズ R48由来のマルト
ース・トレハロース変換酵素】 (1) 作用 マルトースをトレハロースに変換し、トレハロースをマ
ルトースに変換する。1モルのマルトース又はトレハロ
ースからそれぞれ約1モルのトレハロース又はマルトー
スを生成する。 (2) 分子量 SDS−ゲル電気泳動法で、約57,000乃至67,
000ダルトン。 (3) 等電点 アンフォライン含有電気泳動法で、pI約4.1乃至
5.1。 (4) 活性阻害 1mMCu++、Hg++又は50mMトリス塩酸緩衝液で
阻害を受ける。 (5) 至適温度 pH7.0、60分間反応で、20℃付近。 (6) 至適pH 25℃、60分間反応で、約7.0乃至8.0。 (7) 温度安定性 PH7.0、60分間保持で、30℃付近まで安定。 (8) pH安定性 20℃、60分間保持で、約6.0乃至9.0。
【0030】
【シュードモナス・プチダ H262由来のマルトース
・トレハロース変換酵素】 (1) 作用 マルトースをトレハロースに変換し、トレハロースをマ
ルトースに変換する。1モルのマルトース又はトレハロ
ースからそれぞれ約1モルのトレハロース又はマルトー
スを生成する。 (2) 分子量 SDS−ゲル電気泳動法で、約110,000乃至12
0,000ダルトン。 (3) 等電点 アンフォライン含有電気泳動法で、pI約4.1乃至
5.1。 (4) 活性阻害 1mMCu++、Hg++又は50mMトリス塩酸緩衝液で
阻害を受ける。 (5) 至適温度 pH7.0、60分間反応で、37℃付近。 (6) 至適pH 35℃、60分間反応で、約7.3乃至8.3。 (7) 温度安定性 pH7.0、60分間保持で、40℃付近まで安定。 (8) pH安定性 35℃、60分間保持で、約6.0乃至9.5。
【0031】
【サーマス・アクアティカス ATCC33923由来
のマルトース・トレハロース変換酵素】 (1) 作用 マルトースをトレハロースに変換し、トレハロースをマ
ルトースに変換する。1モルのマルトース又はトレハロ
ースからそれぞれ約1モルのトレハロース又はマルトー
スを生成する。 (2) 分子量 SDS−ゲル電気泳動法で、約100,000乃至11
0,000ダルトン。 (3) 等電点 アンフォライン含有電気泳動法で、pI約3.8乃至
4.8。 (4) 活性阻害 1mMCu++、Hg++又は50mMトリス塩酸緩衝液で
阻害を受ける。 (5) 至適温度 pH7.0、60分間反応で、65℃付近。 (6) 至適pH 60℃、60分間反応で、約6.0乃至6.7。 (7) 温度安定性 pH7.0、60分間保持で、80℃付近まで安定。 (8) pH安定性 60℃、60分間保持で、約5.5乃至9.5。
【0032】本発明のマルトース・トレハロース変換酵
素の活性は次のようにして測定する。基質としてマルト
ース20w/v%(10mMリン酸塩緩衝液、pH7.
0)1mlに酵素液1mlを加え、反応温度を25℃、
35℃あるいは60℃とし、60分間反応させた後、1
00℃で10分間加熱して反応を停止させる。この反応
液を正確に50mMリン酸塩緩衝液pH7.5で11倍
に希釈し、その希釈液0.4mlにトレハラーゼ含有溶
液(1単位/ml)を0.1ml添加したものを45
℃、120分間インキュベートした後、この反応液中の
グルコース量をグルコースオキシダーゼ法で定量する。
対照として、予め100℃で10分間加熱することによ
り失活させた酵素液及びトレハラーゼを用いて同様に測
定する。上記の測定方法を用いて、増加するグルコース
量からマルトース・トレハロース変換酵素により生成す
るトレハロース量を求め、その活性1単位は、1分間に
1μmoleのトレハロースを生成する酵素量と定義す
る。
【0033】なお、反応温度は、マルトース・トレハロ
ース変換酵素が、ピメロバクター属に属する微生物由来
の場合に25℃とし、シュードモナス属に属する微生物
由来の場合に35℃とし、サーマス属に属する微生物由
来の場合に60℃とした。
【0034】本発明のマルトース・トレハロース変換酵
素は、マルトースをトレハロースに変換し、トレハロー
スをマルトースに変換できるので、基質は目的に適うも
のを選べばよい。トレハロースを製造しようとする目的
のためには、マルトースを基質にすればよい。
【0035】マルトースとしては、本発明のマルトース
・トレハロース変換酵素が作用してトレハロースを生成
するものであればよく、一般的には、できるだけ高純度
の、望ましくは純度70%以上のマルトース高含有物が
用いられる。市販のマルトースを用いることも、また、
常法に従って、澱粉を糖化して調製したマルトースを用
いることも有利に実施できる。
【0036】マルトースを澱粉から調製する方法として
は、例えば、特公昭56−11437号公報、特公昭5
6−17078号公報などに開示されている糊化又は液
化澱粉にβ−アミラーゼを作用させ、生成するマルトー
スを高分子デキストリンから分離し、マルトース高含有
物を採取する方法、又は、例えば、特公昭47−130
89号公報、特公昭54−3938号公報に開示されて
いる糊化、又は液化澱粉にβ−アミラーゼとともにイソ
アミラーゼ、プルラナーゼなどの澱粉枝切酵素を作用さ
せてマルトース高含有物を採取する方法などがある。
【0037】更に、これら方法で得られるマルトース高
含有物に含まれるマルトトリオースなどの夾雑糖類に、
例えば、特公昭56−28153号公報、特公昭57−
3356号公報、特公昭56−28154号公報などに
開示されている酵素を作用させてマルトース含量を高め
るか、更には、例えば、特開昭58−23799号公報
などに開示されている塩型強酸性カチオン交換樹脂を用
いるカラムクロマトグラフィーにより、夾雑糖類を除去
するなどの方法によりマルトース含量を更に高めること
も好都合である。
【0038】本発明の基質濃度は特に限定されない。例
えば、基質溶液としてマルトースを0.1%で用いた場
合でも、50%で用いた場合でも、本酵素の反応は進行
し、トレハロースを生成する。また、基質溶液中に完全
に溶けきれない基質を含有する高濃度溶液であってもよ
い。反応温度は酵素が失活しない温度、すなわち80℃
付近までで行えばよいが、好ましくは約0乃至70℃の
範囲を用いる。反応pHは、通常、約5.5乃至9.0
の範囲に調整すればよいが、好ましくはpH約6.0乃
至8.5の範囲に調整する。反応時間は、酵素反応の進
行具合により適宜選択すればよく、通常、基質固形物グ
ラム当たり約0.1乃至100単位の酵素使用量で0.
1乃至100時間程度である。
【0039】このようにして得られる反応液は、基質マ
ルトースからのトレハロースへの変換率が高く、最大で
約70乃至85%にも達することが判明した。
【0040】反応液は、常法により、瀘過、遠心分離な
どして不溶物を除去した後、活性炭で脱色、H型、OH
型イオン交換樹脂で脱塩し、濃縮し、シラップ状製品と
することも、乾燥して粉末状製品にすることも、更には
結晶製品にすることも随意である。
【0041】必要ならば、更に、高度な精製をすること
も随意である。例えば、イオン交換カラムクロマトグラ
フィーによる分画、活性炭カラムクロマトグラフィーに
よる分画、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる
分画、アルカリ処理による還元性糖質の分解除去などの
方法で精製することにより、高純度のトレハロース製品
を得ることも容易である。また、カラムクロマトグラフ
ィーなどにより分離し得られるマルトースを、再び、本
発明のマルトース・トレハロース変換酵素の基質に用い
てトレハロースへの変換反応を行うことも有利に実施で
きる。
【0042】このようにして得られた本発明のトレハロ
ース含有糖質を、必要により、グルコアミラーゼ、α−
グルコシダーゼなどで加水分解したり、澱粉部分分解物
などを加え、シクロマルトデキストリン・グルカノトラ
ンスフェラーゼやグルコシルトランスフェラーゼなどで
糖転移したりして、甘味性、還元力、粘性などを調整す
ることも、また、アルカリ処理して還元性糖質を分解除
去したり、酵母により還元性糖質を発酵除去すること、
更には、水素添加して還元性糖質を糖アルコールにして
還元力を消滅せしめることなどの更なる加工処理を施す
ことも随意である。これを、前述の精製方法、例えば、
イオン交換カラムクロマトグラフィーなどにより、グル
コースを除去し、トレハロース高含有画分を採取し、こ
れを精製、濃縮して、シラップ状製品を得ることも、更
に濃縮して過飽和にし、晶出させてトレハロース含水結
晶又は無水結晶トレハロースを得ることも有利に実施で
きる。
【0043】イオン交換カラムクロマトグラフィーとし
ては、特開昭58−23799号公報、特開昭58−7
2598号公報などに開示されている塩型強酸性カチオ
ン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより、
夾雑糖類を除去してトレハロース高含有画分を採取する
方法が有利に実施できる。この際、固定床方式、移動床
方式、擬似移動床方式のいずれの方式を採用することも
随意である。
【0044】トレハロース含水結晶を製造するには、例
えば、純度60%以上、濃度65乃至90%のトレハロ
ース含有液を助晶機にとり、必要に応じて、約0.1乃
至20%の種晶共存下で、温度95℃以下、望ましく
は、10乃至90℃の範囲で、攪拌しつつ徐冷し、トレ
ハロース含水結晶を含有するマスキットを製造する。ま
た、減圧濃縮しながら晶析させる連続晶析法を採用する
ことも有利に実施できる。マスキットからトレハロース
含水結晶又はこれを含有する含蜜結晶を製造する方法
は、例えば、分蜜方法、ブロック粉砕方法、流動造粒方
法、噴霧乾燥方法など公知の方法を採用すればよい。
【0045】分蜜方法の場合には、通常、マスキットを
バスケット型遠心分離機にかけ、トレハロース含水結晶
と蜜(母液)とを分離し、必要により、該結晶に少量の
冷水をスプレーして洗浄することも容易な方法であり、
より高純度のトレハロース含水結晶を製造するのに好適
である。
【0046】噴霧乾燥方法の場合には、通常、濃度約6
0乃至85%、晶出率20乃至60%程度のマスキット
を高圧ポンプでノズルから噴霧し、結晶粉末が溶解しな
い温度、例えば、約60乃至100℃の熱風で乾燥し、
次いで30乃至60℃程度の温風で約1乃至20時間熟
成すれば非吸湿性又は難吸湿性の含蜜結晶が容易に製造
できる。
【0047】また、ブロック粉砕方法の場合には、通
常、水分約10乃至25%、晶出率10乃至60%程度
のマスキットを数時間乃至3日間程度静置して全体をブ
ロック状に晶出固化させ、これを粉砕又は切削などの方
法によって粉末化し乾燥すれば、非吸湿性又は難吸湿性
の含蜜結晶が容易に製造できる。
【0048】また、無水結晶トレハロースを製造するに
は、トレハロース含水結晶を乾燥して変換生成させるこ
ともできるが、一般的には、水分10%未満の高濃度ト
レハロース高含有溶液を助晶機にとり、種晶共存下で5
0乃至160℃、望ましくは80乃至140℃の範囲で
攪拌しつつ無水結晶トレハロースを含有するマスキット
を製造し、これを比較的高温乾燥条件下で、例えば、ブ
ロック粉砕方法、流動造粒方法、噴霧乾燥方法、押し出
し造粒方法などの方法で晶出、粉末化して製造される。
【0049】このようにして製造される本発明のトレハ
ロースは、還元力がなく、安定であり、他の素材、特に
アミノ酸、オリゴペプチド、蛋白質などのアミノ酸又は
アミノ基を含有する物質と混合、加工しても、褐変する
ことも、異臭を発生することも、混合した他の素材を損
なうことも少ない。また、それ自身が良質で上品な甘味
を有している。更に、トレハロースは、体内のトレハラ
ーゼにより容易にグルコースに分解されることから、経
口摂取した場合、容易に消化吸収され、カロリー源とし
て利用される。また、虫歯誘発菌などによって、醗酵さ
れにくく、虫歯を起こしにくい甘味料としても利用でき
る。
【0050】また、安定な甘味料であることより、結晶
製品の場合には、プルラン、ヒドロキシエチルスター
チ、ポリビニルピロリドンなどの結合剤と併用して錠剤
の糖衣剤として利用することも有利に実施できる。ま
た、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘
性、他糖の晶出防止性、難醗酵性、澱粉の老化防止性な
どの性質も具備している。
【0051】従って、本発明のトレハロース及びこれを
含む糖質は、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定
剤、賦形剤などとして飲食物、嗜好物、飼料、化粧品、
医薬品などの各種組成物に有利に利用できる。
【0052】本発明のトレハロース及びこれを含む糖質
は、そのまま甘味付けのための調味料として使用するこ
とができる。必要ならば、例えば、粉飴、ブドウ糖、マ
ルトース、蔗糖、異性化糖、蜂蜜、メイプルシュガー、
ソルビトール、マルチトール、ラクチトール、ジヒドロ
カルコン、ステビオシド、α−グリコシルステビオシ
ド、レバウディオシド、グリチルリチン、L−アスパル
チル−L−フェニルアラニンメチルエステル、サッカリ
ン、グリシン、アラニンなどのような他の甘味料の1種
又は2種以上の適量と混合して使用してもよく、また必
要ならば、デキストリン、澱粉、乳糖などのような増量
剤と混合して使用することもできる。
【0053】また、本発明のトレハロース及びこれを含
む糖質の粉末乃至結晶状製品は、そのままで、又は必要
に応じて、増量剤、賦形剤、結合剤などと混合して、顆
粒、球状、短棒状、板状、立方体、錠剤など各種形状に
成型して使用することも随意である。
【0054】また、本発明のトレハロース及びこれを含
む糖質の甘味は、酸味、塩から味、渋味、旨味、苦味な
どの他の呈味を有する各種物質とよく調和し、耐酸性、
耐熱性も大きいので、一般の飲食物の甘味付け、呈味改
良に、また品質改良などに有利に利用できる。
【0055】例えば、醤油、粉末醤油、味噌、粉末味
噌、もろみ、ひしお、ふりかけ、マヨネーズ、ドレッシ
ング、食酢、三杯酢、粉末すし酢、中華の素、天つゆ、
麺つゆ、ソース、ケチャップ、たくあん漬の素、白菜漬
の素、焼肉のタレ、カレールウ、シチューの素、スープ
の素、ダシの素、複合調味料、みりん、新みりん、テー
ブルシュガー、コーヒーシュガーなど各種調味料として
有利に使用できる。
【0056】また、例えば、せんべい、あられ、おこ
し、餅類、まんじゅう、ういろう、あん類、羊羮、水羊
羮、錦玉、ゼリー、カステラ、飴玉などの各種和菓子、
パン、ビスケット、クラッカー、クッキー、パイ、プリ
ン、バタークリーム、カスタードクリーム、シュークリ
ーム、ワッフル、スポンジケーキ、ドーナツ、チョコレ
ート、チューインガム、キャラメル、キャンデーなどの
洋菓子、アイスクリーム、シャーベットなどの氷菓、果
実のシロップ漬、氷蜜などのシロップ類、フラワーペー
スト、ピーナッツペースト、フルーツペースト、スプレ
ッドなどのペースト類、ジャム、マーマレード、シロッ
プ漬、糖果などの果実、野菜の加工食品類、福神漬、べ
ったら漬、千枚漬、らっきょう漬などの漬物類、ハム、
ソーセージなどの畜肉製品類、魚肉ハム、魚肉ソーセー
ジ、かまぼこ、ちくわ、天ぷらなどの魚肉製品、ウニ、
イカの塩辛、酢こんぶ、さきするめ、ふぐみりん干しな
どの各種珍味類、のり、山菜、するめ、小魚、貝などで
製造されるつくだ煮類、煮豆、ポテトサラダ、こんぶ巻
などの惣菜食品、乳飲料、ヨーグルト、チーズなどの乳
製品、魚肉、畜肉、果実、野菜のビン詰、缶詰類、清
酒、合成酒、リキュール、洋酒などの酒類、紅茶、コー
ヒー、ココア、ジュース、炭酸飲料、乳酸飲料、乳酸菌
飲料などの清涼飲料水、プリンミックス、ホットケーキ
ミックス、即席しるこ、即席スープなどの即席食品、更
には、離乳食、治療食、ドリンク剤などの各種飲食物へ
の甘味付けに呈味改良に、また、品質改良などに有利に
利用できる。
【0057】また、家畜、家禽、その他蜜蜂、蚕、魚な
どの飼育動物のために飼料、餌料などの嗜好性を向上さ
せる目的で使用することもできる。その他、タバコ、練
歯磨、口紅、リップクリーム、内服液、錠剤、トロー
チ、肝油ドロップ、口中清涼剤、口中香剤、うがい剤な
ど各種固形物、ペースト状、液状などで嗜好物、化粧
品、医薬品などの各種組成物への甘味剤として、又は呈
味改良剤、矯味剤として、更には、品質改良剤として有
利に利用できる。
【0058】品質改良剤、安定剤としては、有効成分、
活性などを失い易い各種生理活性物質又はこれを含む健
康食品、医薬品などに有利に適応できる。例えば、イン
ターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフ
ェロン−γ、ツモア・ネクロシス・ファクター−α、ツ
モア・ネクロシス・ファクター−β、マクロファージ遊
走阻止因子、コロニー刺激因子、トランスファーファク
ター、インターロイキン2などのリンホカイン含有液、
インシュリン、成長ホルモン、プロラクチン、エリトロ
ポエチン、卵細胞刺激ホルモン、胎盤ホルモンなどのホ
ルモン含有液、BCGワクチン、日本脳炎ワクチン、は
しかワクチン、ポリオ生ワクチン、痘苗、破傷風トキソ
イド、ハブ抗毒素、ヒト免疫グロブリンなどの生物製剤
含有液、ペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェ
ニコール、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、硫
酸カナマイシンなどの抗生物質含有液、チアミン、リボ
フラビン、L−アスコルビン酸、肝油、カロチノイド、
エルゴステロール、トコフェロールなどのビタミン含有
液、リパーゼ、エラスターゼ、ウロキナーゼ、プロテア
ーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラーゼ、グルカナー
ゼ、ラクターゼなどの酵素含有液、薬用人参エキス、ス
ッポンエキス、クロレラエキス、アロエエキス、プロポ
リスエキスなどのエキス類、ウイルス、乳酸菌、酵母な
どの生菌、ロイヤルゼリーなどの各種生理活性物質も、
その有効成分、活性を失うことなく、安定で高品質の健
康食品や医薬品などを容易に製造できる。
【0059】以上述べたような各種組成物にトレハロー
ス及びこれを含む糖質を含有せしめる方法は、その製品
が完成するまでの工程で含有せしめればよく、例えば、
混和、溶解、融解、浸漬、浸透、散布、塗布、被覆、噴
霧、注入、晶出、固化など公知の方法が適宜選ばれる。
その量は、通常、0.1%以上、望ましくは、1%以上
含有せしめるのが好適である。次に実験により本発明を
さらに具体的に説明する。
【0060】
【実験1 酵素の生産】グルコース2.0w/v%、ポ
リペプトン0.5w/v%、酵母エキス0.1w/v
%、リン酸二カリウム0.1w/v%、リン酸一ナトリ
ウム0.06w/v%、硫酸マグネシウム・7水塩0.
05w/v%、炭酸カルシウム0.5w/v%、及び水
からなる液体培地を、500ml容三角フラスコに10
0mlずつ入れ、オートクレーブで115℃、30分間
滅菌し、冷却して、ピメロバクター・スピーシーズ R
48(FERM BP−4315)を接種し、27℃、
200rpmで24時間回転振盪培養したものを種培養
とした。
【0061】容量30lのファーメンターに種培養の場
合と同組成の培地を約20l入れて、加熱滅菌、冷却し
て温度27℃とした後、種培養液1v/v%を接種し、
温度27℃、pH6.0乃至8.0に保ちつつ、約40
時間通気攪拌培養した。
【0062】培養液のマルトース・トレハロース変換酵
素活性は、0.55単位/mlであった。培養液の一部
を採り、遠心分離して菌体と培養液上清とに分離し、更
に菌体を50mMリン酸塩緩衝液(pH7.0)に懸濁
し、元の培養液と同じ液量とした後、菌体懸濁液と培養
液上清のマルトース・トレハロース変換酵素活性を測定
したところ、菌体懸濁液には、0.5単位/mlの活性
が、培養液上清には、0.05単位/mlの活性が認め
られた。なお、本酵素の活性は、反応温度を25℃にし
て測定した。
【0063】
【実験2 酵素の精製】実験1で得た培養液を遠心分離
して湿重量約0.5kgの菌体を回収し、これを10m
Mリン酸緩衝液(pH7.0)に懸濁した。この菌体懸
濁液約5lをヴィブローゲン セルミル(エドモンドビ
ューラー社製)にかけ、菌体を破砕し、この破砕処理液
を遠心分離(15,000G、30分間)することによ
り、約4.5lの上清を得た。その上清液に飽和度0.
3になるように硫安を加え溶解させ、4℃、4時間放置
した後、遠心分離することにより上清を回収した。
【0064】更に、その液に飽和度0.8になるように
硫安を加え溶解させ、4℃、一夜放置した後、遠心分離
することにより硫安塩析物を回収した。
【0065】得られた硫安塩析物を10mMリン酸緩衝
液(pH7.0)に溶解させた後、同じ緩衝液に対して
24時間透析し、遠心分離して不溶物を除いた。その透
析液(400ml)を2回に分けて、DEAE−トヨパ
ールゲル(東ソー株式会社製)を用いたイオン交換カラ
ムクロマトグラフィー(ゲル量300ml)を行った。
【0066】本発明のマルトース・トレハロース変換酵
素はDEAE−トヨパールゲルに吸着し、食塩を含む同
緩衝液でカラムから溶出した。溶出した酵素活性画分を
回収した後、1M硫安を含む同緩衝液に対して透析し、
その透析液を遠心分離して不溶物を除き、次に、ブチル
トヨパール 650ゲル(東ソー株式会社製)を用いた
疎水カラムクロマトグラフィー(ゲル量300ml)を
行った。吸着したマルトース・トレハロース変換酵素を
硫安1Mから0Mのリニアグラジエントによりカラムよ
り溶出させ、酵素活性画分を回収した。
【0067】続いて、モノQ HR5/5 カラム(ス
ウエーデン国、ファルマシア・エルケイビー社製)を用
いたイオン交換クロマトグラフィー(ゲル量10ml)
を行い、溶出した酵素活性画分を回収した。精製の各ス
テップにおける酵素活性量、比活性、収率を表1に示
す。
【0068】
【表1】
【0069】精製した酵素標品を7.5%濃度ポリアク
リルアミドを含むゲル電気泳動により酵素標品の純度を
検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高い標品で
あった。
【0070】
【実験3 酵素の性質】実験2の方法で得た精製マルト
ース・トレハロース変換酵素標品をSDS−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法(ゲル濃度10%)に供し、同
時に泳動した分子量マーカー(日本バイオ・ラッド ラ
ボラトリーズ株式会社製)と比較して本酵素の分子量を
測定したところ、分子量約57,000乃至67,00
0ダルトンであった。
【0071】精製マルトース・トレハロース変換酵素標
品を2%アンフォライン(スウェーデン国、ファルマシ
ア・エルケイビー社製)含有等電点ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンド及びゲルの
pHを測定して本酵素の等電点を求めたところ、等電点
はpI約4.1乃至5.1であった。
【0072】本酵素活性に及ぼす温度、pHの影響を活
性測定方法に準じて調べた。結果を図1(温度の影
響)、図2(pHの影響)に示した。酵素の至適温度
は、pH7.0、60分間反応で20℃付近、至適pH
は、25℃、60分間反応で約7.0乃至8.0であっ
た。本酵素の温度安定性は、酵素溶液(50mMリン酸
緩衝液、pH7.0)を各温度に60分間保持し、水冷
した後、残存する酵素活性を測定することにより求め
た。また、pH安定性は、本酵素を各pHの50mM緩
衝液中で20℃、60分間保持した後、pHを7.0に
調整し、残存する酵素活性を測定することにより求め
た。それぞれの結果を図3(温度安定性)、図4(pH
安定性)に示した。本酵素の温度安定性は30℃付近ま
でであり、pH安定性は約6.0乃至9.0であった。
なお、本酵素活性は、1mMCu++、Hg++又は50m
Mトリス塩酸緩衝液で阻害された。
【0073】
【実験4 各種糖質への作用】各種糖質を用いて、基質
になりうるかどうかの試験をした。グルコース、マルト
ース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルト
ペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオー
ス、可溶性澱粉、アミロース(平均重合度18)、トレ
ハロース、ネオトレハロース、ゲンチオビオース、コー
ジビオース、イソマルトース、セロビオース、マルチト
ール、シュクロース、マルツロース、ツラノース、パラ
チノース、トレハルロース、あるいはラクトースの溶
液、更に、α−グルコース・1−リン酸と等量のグルコ
ース、又は、β−グルコース・1−リン酸と等量のグル
コースとを含む溶液を調製した。
【0074】これらの溶液に、実験2の方法で得た精製
マルトース・トレハロース変換酵素を基質固形物グラム
当たりそれぞれ2単位ずつ加え、基質濃度を5w/v%
になるよう調整し、これを20℃、pH7.0で24時
間作用させた。酵素反応前後の反応液をキーゼルゲル6
0(メルク社製、アルミプレート、20×20cm)を
用いた薄層クロマトグラフィー(以下、TLCと略称す
る。)にかけ、それぞれの糖質に対する酵素作用の有無
を確認した。TLCは展開溶媒に1−ブタノール:ピリ
ジン:水=6:4:1(容積比)を用い、室温で1回展
開した。発色は20%硫酸−メタノール溶液を噴霧し、
110℃で10分間加熱しておこなった。結果を表2に
示す。
【0075】
【表2】
【0076】表2の結果から明かなように、本発明の酵
素は、試験した多種の糖質のうち、マルトースとトレハ
ロースにのみ作用し、その他の糖質、とりわけ、α−グ
ルコース・1リン酸とグルコースとを含む系や、β−グ
ルコース・1−リン酸とグルコースとを含む系に作用し
ないことから、従来知られているマルトース・ホスホリ
ラーゼやトレハロース・ホスホリラーゼなどのホスホリ
ラーゼとは違い、新規な酵素であることが判明した。
【0077】
【実験5 マルトース又はトレハロースからの生成物】
最終濃度5%のマルトース水溶液に実験2の方法で得た
精製マルトース・トレハロース変換酵素を基質固形物グ
ラム当たり2単位加え、20℃、pH7.0で24時間
作用させた。酵素反応液の糖組成は、ガスクロマトグラ
フィー(以下、GLCと略称する。)で分析した。酵素
反応液の一部を乾固し、ピリジンに溶解した後トリメチ
ルシリル化したものを分析試料とした。ガスクロマトグ
ラフ装置はGC−16A(株式会社島津製作所製)、カ
ラムは2%シリコンOV−17/クロモゾルブW(ジー
・エル・サイエンス株式会社製)を充填したステンレス
カラム(3mmφ×2m)、キャリアーガスは窒素ガス
を流量40ml/分で、カラムオーブン温度は160℃
から320℃まで7.5℃/分の昇温速度で分析した。
検出は水素炎イオン検出器を用いた。その結果を表3に
示す。
【0078】
【表3】
【0079】表3の結果から明かなように、反応生成物
Xが多量に生成し、その保持時間が市販トレハロースの
それと一致していることが判明した。反応生成物Xを同
定するために次の確認試験を行った。すなわち、前述の
マルトースを基質とした酵素反応液を糖濃度2%になる
よう20mM酢酸緩衝液,pH4.5で希釈し、この
0.5mlにグルコアミラーゼ(生化学工業株式会社
製)0.1単位を加え40℃で20時間反応させた。
【0080】また、同様に酵素反応液を糖濃度2%にな
るよう20mMリン酸緩衝液,pH7.0で希釈し、こ
の0.5mlにトレハラーゼ0.5単位を加え40℃で
20時間反応させた。マルトースを基質とした酵素反応
液、そのグルコアミラーゼ処理液及びトレハラーゼ処理
液をGLCで分析、比較したところ、グルコアミラーゼ
処理によりマルトースは完全にグルコースに分解され、
反応生成物Xは分解されずに残存していた。
【0081】一方、トレハラーゼ処理によりマルトース
は残存していたが、反応生成物Xは完全にグルコースに
分解された。グルコアミラーゼ及びトレハラーゼの反応
特性を考慮すると、本発明の新規酵素によって生成する
マルトースからのオリゴ糖はトレハロースであると判断
される。
【0082】更に、トレハロースを基質として、マルト
ースの場合と同様の条件で精製酵素を作用させ、その反
応液も同様にGLC分析したところ、本発明の酵素によ
ってトレハロースからはマルトースが生成することが判
明した。以上のGLC分析結果をまとめて表4に示す。
【0083】
【表4】
【0084】表4の結果から明かなように、本発明の酵
素は、マルトースをトレハロースに変換し、トレハロー
スをマルトースに変換する。その平衡点は、トレハロー
ス側に片寄っており、マルトースからのトレハロースへ
の変換率が高く、約70%以上になることが判明した。
【0085】
【実験6 トレハロース生成に及ぼすマルトース濃度の
影響】マルトース濃度を2.5%、5%、10%、20
%あるいは40%で、温度20℃、pH7.0にて、実
験2の方法で得た精製マルトース・トレハロース変換酵
素をマルトースグラム当たり2単位加えて反応させ、経
時的に反応液を採取し、100℃で10分間加熱して酵
素を失活させた。
【0086】この反応液の全糖量をアンスロン硫酸法
で、還元糖量をソモギー・ネルソン法でグルコース換算
で定量し、全糖量に対する還元糖量の割合を還元力とし
て算出した。
【0087】また、この反応液を糖濃度約1%になるよ
う希釈し、少量限外濾過器モルカットII LGC(日
本ミリポアリミテッド製)にて除蛋白を行い、高速液体
クロマトグラフィー(以下、HPLCと略称する。)に
て糖組成を分析した。HPLCの装置はCCPDシステ
ム(東ソー株式会社製)、分析カラムはYMC−pac
k PA−03(4.6mmφ×250mm、株式会社
ワイエムシィー製)、溶離液はアセトニトリル:水=7
8:22(容積比)を流速1.2ml/minで、検出
は示差屈折計で行った。それらの結果を表5に示す。
【0088】
【表5】
【0089】表5の結果から明かなように、基質のマル
トース濃度に関係なく、マルトースからのトレハロース
への変換反応はよく進行し、トレハロースへ約80%変
換した。
【0090】
【実験7 トレハロース生成に及ぼす温度の影響】マル
トース濃度20%で、pH7.0にして、実験2の方法
で得た精製マルトース・トレハロース変換酵素をマルト
ースグラム当たり2単位加えて、温度5℃、10℃、1
5℃、20℃あるいは25℃で反応させ、経時的に反応
液を採取し、100℃で10分間加熱して酵素を失活さ
せた。この酵素反応液を実験6と同様にして、HPLC
にて糖組成を分析した。各温度、各時間でのトレハロー
ス含量を表6に示す。
【0091】
【表6】
【0092】表6の結果から明かなように、反応温度が
高いほどトレハロース生成速度は高くなる傾向にあった
が、温度5℃でもマルトースからのトレハロースへの変
換反応はよく進行し、トレハロースへ約82%変換し
た。
【0093】
【実験8 マルトースからのトレハロースの調製】マル
トース(株式会社林原生物化学研究所製)10重量部を
水40重量部に溶解し、温度15℃、pH7.0にて、
実験2の方法で得た精製マルトース・トレハロース変換
酵素をマルトースグラム当たり2単位加えて48時間反
応させ、次いで100℃で10分間加熱して酵素を失活
させた。本溶液には、トレハロースを固形物当たり約7
4%含有していた。本溶液を活性炭で脱色し、イオン交
換樹脂(H型及びOH型)にて脱塩して精製し、濃度約
78%に濃縮して、トレハロース含水結晶を種晶として
固形物当たり0.1%添加し、室温に一夜放置したとこ
ろ、結晶が析出した。得られたマスキットを分蜜し、結
晶に少量の水をスプレーして結晶を洗浄し、純度99.
8%の極めて高純度のトレハロース含水結晶約3.0重
量部を得た。
【0094】
【実験9 酵素の生産】グルコース2.0w/v%、硫
酸アンモニウム1.0w/v%、リン酸二カリウム0.
1w/v%、リン酸一ナトリウム0.06w/v%、硫
酸マグネシウム0.05w/v%、炭酸カルシウム0.
3w/v%、及び水からなる液体培地を、500ml容
三角フラスコに100mlずつ入れ、オートクレーブで
115℃で、30分間滅菌し、冷却して、シュードモナ
ス・プチダ H262(FERMBP−4579)を接
種し、27℃、200rpmで24時間回転振とう培養
したものを種培養とした。
【0095】容量30lのファーメンターに種培養の場
合と同組成の培地を約20l入れて、加熱滅菌、冷却し
て温度27℃とした後、種培養液1v/v%を接種し、
温度27℃、pH6.5乃至8.0に保ちつつ、約20
時間通気攪拌培養した。
【0096】培養液のマルトース・トレハロース変換酵
素活性は、0.12単位/mlであった。培養液の一部
を採り、遠心分離して菌体と培養液上清とに分離し、更
に菌体を50mMリン酸塩緩衝液(pH7.0)に懸濁
し、元の培養液と同じ液量とした後、菌体懸濁液と培養
液上清のマルトース・トレハロース変換酵素活性を測定
したところ、菌体懸濁液には、0.11単位/mlの活
性が、培養液上清には、0.01単位/mlの活性が認
められた。なお、本酵素の活性は、反応温度を35℃に
して測定した。
【0097】
【実験10 酵素の精製】実験9で得た培養液を遠心分
離して湿重量約0.45kgの菌体を回収し、これを1
0mMリン酸緩衝液(pH7.0)に懸濁した。この菌
体懸濁液約2lを超高圧菌体破砕装置ミニラボ(大日本
製薬株式会社販売)で処理し、菌体を破砕し、この破砕
処理液を遠心分離(15,000G、30分間)するこ
とにより、約1.7lの上清を得た。その上清液に飽和
度0.7になるように硫安を加え溶解させ、4℃、一夜
放置した後、遠心分離することにより硫安塩析物を回収
した。
【0098】得られた硫安塩析物を10mMリン酸緩衝
液(pH7.0)に溶解させた後、同じ緩衝液に対して
24時間透析し、遠心分離して不溶物を除いた。その透
析液(400ml)を2回に分けて、DEAE−トヨパ
ールゲル(東ソー株式会社製)を用いたイオン交換カラ
ムクロマトグラフィー(ゲル量300ml)を行った。
【0099】本発明のマルトース・トレハロース変換酵
素はDEAE−トヨパールゲルに吸着し、食塩を含む同
緩衝液でカラムから溶出した。溶出した酵素活性画分を
回収した後、同緩衝液に対して透析し、再度、DEAE
−トヨパールイオン交換カラムクロマトグラフィー(ゲ
ル量80ml)を行った。吸着したマルトース・トレハ
ロース変換酵素を食塩0.1Mから0.3Mのリニアグ
ラジエントによりカラムより溶出させ、酵素活性画分を
回収した。
【0100】続いて、トヨパール HW−55S(東ソ
ー株式会社製造)を用いたゲル濾過クロマトグラフィー
(ゲル量400ml)を行い、溶出した酵素活性画分を
回収した。精製の各ステップにおける酵素活性量、比活
性、収率を表7に示す。
【0101】
【表7】
【0102】精製した酵素標品を7.5w/v%濃度ポ
リアクリルアミドを含むゲル電気泳動により酵素標品の
純度を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高い
標品であった。
【0103】
【実験11 酵素の性質】実験10の方法で得た精製マ
ルトース・トレハロース変換酵素標品をSDS−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法(ゲル濃度7.5w/v
%)に供し、同時に泳動した分子量マーカー(日本バイ
オ・ラッド ラボラトリーズ株式会社製)と比較して本
酵素の分子量を測定したところ、分子量約110,00
0乃至120,000ダルトンであった。
【0104】精製マルトース・トレハロース変換酵素標
品を2w/v%アンフォライン(スウェーデン国、ファ
ルマシア・エルケイビー社製)含有等電点ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンド及び
ゲルのpHを測定して本酵素の等電点を求めたところ、
等電点はpI約4.1乃至5.1であった。
【0105】本酵素活性に及ぼす温度、pHの影響を活
性測定方法に準じて調べた。結果を図5(温度の影
響)、図6(pHの影響)に示した。酵素の至適温度
は、pH7.0、60分間反応で37℃付近、至適pH
は、35℃、60分間反応で約7.3乃至8.3であっ
た。本酵素の温度安定性は、酵素溶液(50mMリン酸
緩衝液、pH7.0)を各温度に60分間保持し、水冷
した後、残存する酵素活性を測定することにより求め
た。また、pH安定性は、本酵素を各pHの50mM緩
衝液中で35℃、60分間保持した後、pHを7.0に
調整し、残存する酵素活性を測定することにより求め
た。それぞれの結果を図7(温度安定性)、図8(pH
安定性)に示した。本酵素の温度安定性は40℃付近ま
でであり、pH安定性は約6.0乃至9.5であった。
なお、本酵素活性は、1mMCu++、Hg++又は50m
Mトリス塩酸緩衝液で阻害された。
【0106】
【実験12 各種糖質への作用】反応温度を35℃とし
た以外は、実験4の方法に準じて、実験10で得たシュ
ードモナス・プチダ H262の精製酵素を各種糖質に
作用させて、基質になりうるかどうかの試験をした。そ
の結果、シュードモナス・プチダ H262の酵素は、
ピメロバクター・スピーシーズ R48の酵素と同様、
マルトースとトレハロースにのみ作用しマルトースをト
レハロースに変換し、トレハロースをマルトースに変換
した。その平衡点は、トレハロース側に片寄っており、
マルトースからのトレハロースへの変換率が高く、約7
0%になることが判明した。
【0107】
【実験13 トレハロース生成に及ぼすマルトース濃度
の影響】マルトース濃度を5%、10%、20%あるい
は30%で、温度35℃、pH7.0にて、実験10の
方法で得た精製マルトース・トレハロース変換酵素をマ
ルトースグラム当たり2単位加えて反応させ、経時的に
反応液を採取し、100℃で10分間加熱して酵素を失
活させた。
【0108】この反応液を用いて、実験6と同様に還元
力及び糖組成を測定した。それらの結果を表8に示す。
【0109】
【表8】
【0110】表8の結果から明らかなように、基質のマ
ルトース濃度に関係なく、トレハロースを約70%生成
した。
【0111】
【実験14 マルトースからのトレハロースの調製】マ
ルトース(株式会社林原生物化学研究所販売)10重量
部を水40重量部に溶解し、温度35℃、pH7.0に
して、本発明の精製マルトース・トレハロース変換酵素
をマルトースグラム当たり2単位加えて48時間反応さ
せ、次いで100℃で10分間加熱して酵素を失活させ
た。本溶液には、トレハロースを固形物当たり約69%
含有していた。本溶液を活性炭で脱色し、イオン交換樹
脂(H型及びOH型)にて脱塩して精製し、濃度約78
%に濃縮して、トレハロース含水結晶を種晶として固形
物当たり0.1%添加し、室温に一夜放置したところ、
結晶が析出した。得られたマスキットを分蜜し、結晶に
少量の水をスプレーして結晶を洗浄し、純度99.7%
の極めて高純度のトレハロース結晶約2.3重量部を得
た。
【0112】
【実験15 酵素の生産】ポリペプトン0.5w/v
%、酵母エキス0.1w/v%、硝酸ナトリウム0.0
7w/v%、リン酸二ナトリウム0.01w/v%、硫
酸マグネシウム0.02w/v%、塩化カルシウム0.
01w/v%及び水からなる液体培地を、pH7.5に
調整した後、500ml容三角フラスコに100mlず
つ入れ、オートクレーブで120℃で、20分間滅菌
し、冷却して、サーマス・アクアティカス ATCC3
3923を接種し、60℃、200rpmで24時間回
転振とう培養したものを種培養とした。
【0113】容量30lのファーメンター2基に種培養
の場合と同組成の培地をそれぞれ約20l入れて、加熱
滅菌、冷却して温度60℃とした後、種培養液1v/v
%を接種し、温度60℃、pH6.5乃至8.0に保ち
つつ、約20時間通気攪拌培養した。
【0114】培養液のマルトース・トレハロース変換酵
素活性は0.35単位/mlであった。培養液の一部を
採り、遠心分離して菌体と培養上清液とに分離し、更に
菌体を50mMリン酸緩衝液(pH7.0)に懸濁し、
元の培養液と同じ液量とした後、菌体懸濁液と培養上清
液のマルトース・トレハロース変換酵素活性を測定した
ところ、菌体懸濁液には0.33単位/mlの酵素活性
が、また、培養液上清には0.02単位/mlの酵素活
性が認められた。なお、本酵素の活性は、反応温度を6
0℃にして測定した。
【0115】
【実験16 酵素の精製】実験15で得られた培養液を
遠心分離して湿重量約0.28kgの菌体を回収し、こ
れを10mMリン酸緩衝液(pH7.0)に懸濁した。
この菌体懸濁液約1.9lを、超音波破砕機 モデルU
S300(株式会社日本精機製作所製)で処理し、菌体
を破砕した。この破砕処理液を遠心分離(15,000
G、30分間)することにより、約1.8lの上清を得
た。その上清に飽和度0.7になるように硫安を加え溶
解させ、4℃、一夜放置した後、遠心分離機にかけ、硫
安塩析物を回収した。
【0116】得られた硫安塩析物を10mMリン酸緩衝
液(pH7.0)に溶解させた後、同じ緩衝液に対して
24時間透析し、遠心分離して不溶物を除いた。その透
析液(1560ml)を、DEAE−トヨパール650
ゲル(東ソー株式会社製)を用いたイオン交換カラムク
ロマトグラフィー(ゲル量530ml)を3回に分けて
行った。
【0117】本発明のマルトース・トレハロース変換酵
素はDEAE−トヨパールゲルに吸着し、食塩を含む同
緩衝液でカラムから溶出した。溶出した酵素活性画分を
回収した後、1M硫安を含む同緩衝液に対して透析し、
次に、ブチルトヨパール 650ゲル(東ソー株式会社
製)を用いた疎水カラムクロマトグラフィー(ゲル量3
80ml)を行った。吸着したマルトース・トレハロー
ス変換酵素を硫安1Mから0Mのリニアグラジエントに
よりカラムより溶出させ、酵素活性画分を回収した。
【0118】次に、トヨパール HW−55S(東ソー
株式会社製)を用いたゲル濾過クロマトグラフィー(ゲ
ル量380ml)を行い、溶出した酵素活性画分を回収
した。
【0119】続いて、モノQ HR5/5 カラム(ス
ウェーデン国、ファルマシア・エルケイビー社製)を用
いたイオン交換クロマトグラフィー(ゲル量1.0m
l)を行い、食塩0.1Mから0.35Mのリニアグラ
ジエントにより溶出した酵素活性画分を回収した。精製
の各ステップにおける酵素活性量、比活性、収率を表9
に示す。
【0120】
【表9】
【0121】精製した酵素標品を5w/v%濃度ポリア
クリルアミドを含むゲル電気泳動により酵素標品の純度
を検定したところ、蛋白バンドは単一で純度の高い標品
であった。
【0122】
【実験17 酵素の性質】実験16の方法で得た精製マ
ルトース・トレハロース変換酵素標品をSDS−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法(ゲル濃度7.5w/v
%)に供し、同時に泳動した分子量マーカー(日本バイ
オ・ラッド ラボラトリーズ株式会社製)と比較して本
酵素の分子量を測定したところ、分子量約100,00
0乃至110,000ダルトンであった。
【0123】精製マルトース・トレハロース変換酵素標
品を2%w/vアンフォライン(スウェーデン国、ファ
ルマシア・エルケイビー社製)含有等電点ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法に供し、泳動後、蛋白バンド及び
ゲルのpHを測定して本酵素の等電点を求めたところ、
等電点はpI約3.8乃至4.8であった。
【0124】本酵素活性に及ぼす温度、pHの影響を活
性測定方法に準じて調べた。結果を図9(温度の影
響)、図10(pHの影響)に示した。酵素の至適温度
は、pH7.0、60分間反応で65℃付近、至適pH
は、60℃、60分間反応で6.0乃至6.7であっ
た。本酵素の温度安定性は、酵素溶液(50mMリン酸
緩衝液を含む、pH7.0)を各温度に60分間保持
し、水冷した後、残存する酵素活性を測定することによ
り求めた。また、pH安定性は、本酵素を各pHの50
mM緩衝液中で60℃、60分間保持した後、pHを
7.0に調整し、残存する酵素活性を測定することによ
り求めた。それぞれの結果を図11(温度安定性)、図
12(pH安定性)に示した。本酵素の温度安定性は約
80℃付近までであり、pH安定性は5.5乃至9.5
であった。なお、本酵素活性は、1mMCu++、Hg++
又は50mMトリス塩酸緩衝液で阻害された。
【0125】
【実験18 各種糖質への作用】反応温度を50℃とし
た以外は、実験4の方法に準じて、実験16で得たサー
マス アクアティカス ATCC33923の精製酵素
を各種糖質に作用させて、基質になりうるかどうかの試
験をした。その結果、サーマス・アクアティカスATC
C33923の酵素はピメロバクター・スピーシーズ
R48の酵素、あるいは、シュードモナス・プチダ H
262の酵素と同様、マルトースとトレハロースにのみ
作用しマルトースをトレハロースに変換し、トレハロー
スをマルトースに変換した。その平衡点は、トレハロー
ス側に片寄っており、マルトースからトレハロースへの
変換率が高く、70%以上になることが判明した。
【0126】
【実験19 トレハロース生成に及ぼすマルトース濃度
の影響】マルトース濃度を2.5%、5%、10%、2
0%あるいは40%で、温度60℃、pH6.5にて、
実験16の方法で得たサーマス・アクアティカス AT
CC33923の精製マルトース・トレハロース変換酵
素をマルトースグラム当たり2.5単位加えて反応さ
せ、72時間目に反応液を採取し、100℃で30分間
加熱して酵素を失活させた。この反応液を用いて、実験
6と同様に還元力及び糖組成を測定した。その結果を表
10に示した。
【0127】
【表10】
【0128】表10の結果から明らかなように、基質の
マルトース濃度に関係なく、トレハロースを約70%生
成した。
【0129】
【実験20 トレハロース生成に及ぼす温度の影響】マ
ルトース濃度20%で、pH6.5にして、実験16の
方法で得たサーマス・アクアティカス ATCC339
23の精製マルトース・トレハロース変換酵素をマルト
ースグラム当たり2.5単位加えて、温度40℃、50
℃、60℃、あるいは70℃で反応させ、経時的に反応
液を採取し、100℃で30分間加熱して酵素を失活さ
せた。この反応液を実験6と同様にして、HPLCにて
糖組成を分析した。各温度、各時間でのトレハロース含
量を表11に示す。
【0130】
【表11】
【0131】表11の結果から明らかなように、マルト
ースからのトレハロースへの変換率は反応温度が低いほ
ど高く、40℃においてトレハロースへ約80%変換し
た。
【0132】
【実験21 他の微生物からのマルトース
・トレハロース変換酵素の生産と 【実験21 他の微生物からのマルトース・トレハロー
ス変換酵素の生産とその性質】公知微生物のうち、本発
明のマルトース・トレハロース変換酵素産生能の確認さ
れた特定の微生物を、実験15の場合に準じて三角フラ
スコにて48時間培養した。培養液の酵素活性を調べた
後、実験16の方法に準じて、培養液を破砕装置にか
け、その上清を透析して、部分精製酵素を得、実験17
の方法に従って、その性質を調べた。結果を表12に示
した。
【0133】
【表12】
【0134】表12に示すこれらサーマス属に属する公
知微生物由来の部分精製酵素を用いて、実験18の方法
に従って、各種糖質への作用を調べたところ、サーマス
・アクアティカス ATCC33923由来の酵素の場
合と同様に、マルトースとトレハロースにのみ作用し、
マルトースからトレハロースを生成することが判明し
た。
【0135】また、サーマス・ルーバー ATCC35
948のマルトース・トレハロース変換酵素は、サーマ
ス・アクアティカス ATCC33923の酵素に比
し、その至適温度、安定温度は低かったが、他のサーマ
ス属の酵素は、サーマス・アクアティカス ATCC3
3923の酵素とほぼ同じ性質を示し、耐熱性の高いこ
とが判明した。
【0136】
【実験22 マルトース・トレハロース変換酵素の部分
アミノ酸配列】実験2の方法で得られたピメロバクター
・スピーシーズ R48由来の精製酵素標品、実験10
の方法で得られたシュードモナス・プチダ H262由
来の精製酵素標品及び実験16の方法で得られたサーマ
ス・アクアティカス ATCC33923由来の精製酵
素標品の一部を、それぞれ蒸留水に対して透析した後、
蛋白量として約80μgをN末端アミノ酸配列分析用の
試料とした。N末端アミノ酸配列は、プロテインシーケ
ンサーモデル473A(アプライドバイオシステムズ社
製造、米国)を用いて分析した。それぞれ得られたN末
端配列を表13に示す。
【0137】
【表13】
【0138】表13の結果から明かなように、ピメロバ
クター・スピーシーズ R48由来の酵素と、シュード
モナス・プチダ H262由来の酵素及びサーマス・ア
クアティカス ATCC33923由来の酵素とは、相
同性の極めて高い部分アミノ酸配列を有していることが
判明した。すなわち、ピメロバクター属微生物由来酵素
のN末端側から第10番目のトリプトファンから第16
番目のフェニルアラニンまでの部分アミノ酸配列とシュ
ードモナス属微生物由来酵素のN末端側から第3番目の
トリプトファンから第9番目のフェニルアラニンまでの
部分アミノ酸配列とは、相同性が高く、トリプトファン
−X1−アルギニン−X2−アラニン−X3−フェニルア
ラニン(但し、X1はフェニルアラニン又はプロリンを
意味し、X2はトレオニン又はプロリンを意味し、X3
バリン又はアラニンを意味する。)で表すことができ
る。また、ピメロバクター属微生物由来酵素のN末端側
から14番目のアラニンから17番目のチロシンまでの
部分アミノ酸配列とサーマス属微生物由来酵素のN末端
側から9番目のアラニンから12番目のチロシンまでの
部分アミノ酸配列とは、相同性が高く、アラニン−バリ
ン−X4−チロシン(但し、X4はフェニルアラニン又は
イソロイシンを意味する。)で表すことができる。
【0139】
【実験23 調製したトレハロースの理化学的性質】実
験8の方法で調製したトレハロースの高純度標品を用い
て理化学的性質を調べた。融点は97.0℃、比旋光度
は[α]20 D+199゜(c=5)、融解熱は57.8
KJ/mole、溶解度は25℃の水に対し、無水物と
して77.0gであった。これらの物性値は、同時に測
定した市販トレハロース含水結晶(和光純薬工業株式会
社製)の値とよく一致した。
【0140】
【実験24 生体内での利用試験】厚治等が、『臨床栄
養』、第41巻、第2号、第200乃至208頁(19
72年)で報告している方法に準じて、実験8において
調製した高純度トレハロース標品(純度99.8%)3
0gを20w/v%水溶液とし、これをボランティア3
名(健康な26才、27才、30才の男性)にそれぞれ
経口投与し、経時的に採血して、血糖値及びインスリン
値を測定した。対照としては、グルコースを用いた。そ
の結果、トレハロースは、グルコースの場合と同様の挙
動を示し、血糖値、インスリン値ともに、投与後、約
0.5乃至1時間で最大値を示した。トレハロースは、
容易に消化吸収、代謝利用されて、エネルギー源になる
ことが判明した。従って、本発明の方法で得られるトレ
ハロース及びこれを含む糖質は、エネルギー補給用糖源
として好適である。
【0141】
【実験25 急性毒性試験】マウスを使用して、実験8
において調製した高純度トレハロース標品(純度99.
8%)を経口投与して急性毒性試験を行った。その結
果、トレハロースは低毒性の物質で、投与可能な最大投
与量においても死亡例は認められなかった。従って、正
確な値とはいえないが、そのLD50値は、50g/kg
以上であった。
【0142】以下、本発明のマルトース・トレハロース
変換酵素とそれを利用したトレハロースとこれを含む糖
質の製造方法を実施例Aで、トレハロースとこれを含む
糖質を含有せしめた組成物を実施例Bで示す。
【0143】
【実施例A−1】ピメロバクター・スピーシーズ R4
8(FERM BP−4315)を、培地成分中のグル
コース濃度を4.0w/v%とした以外は実験1と同じ
培地組成で、実験1の方法に準じてファーメンターで約
60時間、通気攪拌培養した。この培養液のマルトース
・トレハロース変換酵素の活性は、培養液ml当たり
0.75単位であった。また、その一部を遠心分離によ
り、菌体と培養上清とに分離し、活性を測定したとこ
ろ、菌体にその約65%が、培養上清に約35%の活性
が検出された。この菌体を含む培養液約35lを、超高
圧菌体破砕装置ミニラボ(大日本製薬株式会社製)で処
理し、菌体を破砕した。この菌体破砕懸濁液を遠心分離
機にかけ、その上清を回収し、更にその液をUF膜濃縮
し、マルトース・トレハロース変換酵素をml当たり約
15単位有する濃縮酵素液約1.2lを回収した。10
%馬鈴薯澱粉乳(pH5.5)にα−アミラーゼ(ナガ
セ生化学工業株式会社製、商品名スピターゼHS)を澱
粉グラム当たり2単位加えて攪拌下、加熱糊化・液化さ
せ、ただちにオートクレーブ(120℃)を20分間行
った後、温度50℃、pH5.0に調整した。これにβ
−アミラーゼ(ナガセ生化学工業株式会社製)を澱粉グ
ラム当たり20単位及びイソアミラーゼ(株式会社林原
生物化学研究所製)を澱粉グラム当たり500単位の割
合になるように加え、24時間反応させ、マルトース含
量約92%の糖液を得た。その反応液を100℃で20
分間加熱した後、温度10℃、pH7.0に調整し、こ
れに前記方法で調製したマルトース・トレハロース変換
酵素を固形物グラム当たり1単位の割合になるよう加
え、96時間反応させた。その反応液を95℃で10分
間保った後、冷却し、常法に従って活性炭で脱色・濾過
し、H型及びOH型イオン交換樹脂により脱塩して精製
し、更に濃縮して濃度約70%のシラップを固形物収率
約95%で得た。本品は、固形物当たりトレハロースを
約69%含有していて還元力がDE18.2と低く、温
和な甘味、適度の粘度、保湿性を有し、甘味料、呈味改
良剤、安定剤、賦形剤などとして各種飲食物、化粧品、
医薬品など各種組成物に有利に利用できる。
【0144】
【実施例A−2】実施例A−1の方法で得たマルトース
・トレハロース変換酵素反応停止液に、固形物当たり1
0単位のグルコアミラーゼ(ナガセ生化学工業株式会社
製、商品名グルコチーム)をpH5.0、50℃で24
時間作用させ、次いで、加熱失活、脱色、脱塩精製して
得られる糖液を原糖液とし、トレハロースの含量を高め
るため、アルカリ金属型強酸性カチオン交換樹脂(XT
−1016、Na+型、架橋度4%、東京有機化学工業
株式会社製)を用いたイオン交換カラムクロマトグラフ
ィーを行った。樹脂を内径5.4cmのジャケット付き
ステンレス製カラム4本に充填し、直列につなぎ、樹脂
層全長20mとした。カラム内温度60℃に維持しつ
つ、糖液を樹脂に対して、5v/v%加え、これに60
℃の温水をSV0.15で流して分画し、グルコースを
除去し、トレハロース高含有画分を採取した。更に、精
製、濃縮し、真空乾燥し、粉砕して、トレハロース高含
有粉末を固形物当たり、約55%の収率で得た。本品
は、トレハロースを約97%含有しており、極めて低い
還元性、まろやかで上品な甘味を有し、甘味料、呈味改
良剤、品質改良剤、安定剤、賦形剤などとして、各種飲
食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利用でき
る。
【0145】
【実施例A−3】実施例A−2の方法で得たトレハロー
ス高含有画分を、常法に従って、活性炭で脱色し、イオ
ン交換樹脂により脱塩して精製した溶液を濃度約70%
に濃縮した後、助晶機にとり、種晶としてトレハロース
含水結晶約2%を加えて徐冷し、晶出率約45%のマス
キットを得た。本マスキットを乾燥塔上のノズルより1
50kg/cm2の高圧にて噴霧した。これと同時に8
5℃の熱風を乾燥塔の上部より送風して底部に設けた移
送金網コンベア上に捕集し、コンベアの下より45℃の
温風を送りつつ、金網コンベア上に捕集した結晶粉末を
乾燥塔外に徐々に移動させ取り出した。この取り出した
結晶粉末を、熟成塔に充填して温風を送りつつ10時間
熟成させ、結晶化と乾燥を完了し、トレハロース含水結
晶粉末を原料のトレハロース高含有糖液に対して固形物
当たり約90%の収率で得た。本品は、実質的に吸湿性
を示さず、取扱いが容易であり、甘味料、呈味改良剤、
安定剤などとして各種飲食物、化粧品、医薬品など各種
組成物に有利に利用できる。
【0146】
【実施例A−4】実施例A−2の方法で得たトレハロー
ス高含有画分を、実施例A−3と同様に精製し、次い
で、蒸発釜にとり、減圧下で煮詰め、水分約3.0%の
シラップとした。次いで、助晶機に移し、これに種晶と
して無水結晶トレハロースをシラップ固形物当たり1%
加え、120℃で攪拌助晶し、次いで、アルミ製バット
に取り出し、100℃で6時間晶出熟成させてブロック
を調製した。次いで、本ブロックを切削機にて粉砕し、
流動乾燥して、水分約0.3%の無水結晶トレハロース
粉末を、原料のトレハロース高含有糖液に対して、固形
物当たり約85%の収率で得た。本品は、食品、化粧
品、医薬品、その原材料、又は加工中間物などの含水物
の脱水剤としてのみならず、上品な甘味を有する白色粉
末甘味料としても、各種飲食物、化粧品、医薬品など各
種組成物に有利に利用できる。
【0147】
【実施例A−5】ピメロバクター・スピーシーズ R4
8(FERM BP−4315)を実験1と同様の方法
で培養し、さらに遠心分離して得た湿菌体100g(約
800単位)を10mMリン酸緩衝液に溶解した2.5
%アルギン酸ナトリウム(300乃至400cp、和光
純薬工業株式会社製)100mlに混練した。この菌体
を含むスラリーを、マグネティックスターラーで攪拌し
ている0.1MCaCl2溶液中に、水面より約20c
mの高さから連続的に滴下し、直径2mm前後の球状の
ゲル化物を形成させた。このゲル化物をCaCl2溶液
中に室温で約2時間保った後、ブッフナーロート上で濾
過して、アルギン酸固定化菌体を回収した。この固定化
菌体を直径30mm、長さ200mmのジャケット付き
ガラスカラムに充填し、温度を20℃に保温した。この
固定化菌体カラムにpH6.8のマルトース40%溶液
をSV0.2にて下向流で通液し、トレハロース含量約
70%の糖液を得た。本糖液を実施例A−1の方法に準
じて、精製、濃縮して、濃度約70%のシラップを固形
物収率約95%で得た。本品は、低還元性、温和な甘
味、適度の保湿性を有し、実施例A−1の場合と同様に
各種組成物に有利に利用できる。
【0148】
【実施例A−6】33%とうもろこし澱粉乳に最終濃度
0.1重量%となるように炭酸カルシウムを加えた後、
pH6.5に調整し、これにα−アミラーゼ(ノボ社
製、商品名ターマミール60L)を澱粉グラム当たり
0.2重量%になるよう加え、95℃で15分間反応さ
せた。その反応液をオートクレーブ(120℃)を30
分間行った後、55℃に冷却し、これにイソアミラーゼ
(株式会社林原生物化学研究所製)を澱粉グラム当たり
500単位及びβ−アミラーゼ(ナガセ生化学工業株式
会社製)を澱粉グラム当たり30単位の割合になるよう
に加え、48時間反応させマルトース含量約84%の糖
液を得た。その反応液を、100℃で10分間加熱し、
次いで15℃に冷却し、実施例A−1の方法で調製した
マルトース・トレハロース変換酵素を固形物グラム当た
り1.5単位の割合になるよう加え、72時間反応させ
た。その反応液を100℃で15分間加熱して酵素を失
活させた後、常法に従って活性炭で脱色・濾過し、H型
及びOH型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に
濃縮して濃度約70%のシラップを固形物収率約95%
で得た。本品は、固形物当たりトレハロースを約64%
を含有しており、低還元性、温和な甘味、適度の粘度、
保湿性を有し、実施例A−1の場合と同様に、各種組成
物に有利に利用できる。
【0149】
【実施例A−7】実施例A−5の方法で得たシラップを
濃度約82%に濃縮して助晶機にとり、種晶約1%を混
合した後、バットにとり、20℃で4日間静置して晶出
固化させ、次いで切削機にて粉砕し、乾燥して含蜜型ト
レハロース含水結晶粉末を固形物収率約95%で得た。
本品は、実質的に吸湿性を示さず、取扱いが容易であ
り、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤などとし
て、実施例A−1の場合と同様に、各種組成物に有利に
利用できる。
【0150】
【実施例A−8】実施例A−6の方法で得たシラップを
濃度約80%に濃縮して助晶機にとり、種晶としてトレ
ハロース含水結晶粉末約1%を加え、攪拌しつつ徐冷、
晶出させた。次いで、バスケット型遠心分離機で分蜜
し、結晶を少量の水でスプレーし、洗浄して高純度のト
レハロース含水結晶を固形物収率約20%で得た。本品
は、実験23と同様の理化学的性質を示し、甘味料、呈
味改良剤、品質改良剤、安定剤などとして、各種飲食
物、化粧品、医薬品などの各種組成物に有利に利用でき
る。更には、工業試薬、化学原料などに利用することも
有利に実施できる。
【0151】
【実施例A−9】シュードモナス・プチダ H262
(FERM BP−4579)を、実験9の方法に準じ
てファーメンターで約20時間、通気攪拌培養した。こ
の培養液約18lを遠心分離にかけ、湿重量約0.4k
gの菌体を得た。これを4lの10mMリン酸緩衝液に
懸濁し、超音波破砕機モデルUS300(株式会社日本
精機製作所製)で処理し、菌体を破砕した。この菌体破
砕懸濁液を遠心分離機にかけ、その上清を回収し、更に
その液をUF膜濃縮し、マルトース・トレハロース変換
酵素をml当たり3.8単位有する濃縮酵素液約400
mlを回収した。10%馬鈴薯澱粉乳(pH5.5)に
α−アミラーゼ(ナガセ生化学工業株式会社製、商品名
スピターゼHS)を澱粉グラム当たり2単位加えて攪拌
下、加熱糊化・液化させ、ただちにオートクレーブ(1
20℃)を20分間行った後、温度50℃、pH5.5
に調整した。これにプルラナーゼ(株式会社林原生物化
学研究所製)を澱粉グラム当たり500単位及びβ−ア
ミラーゼ(ナガセ生化学工業株式会社製)を澱粉グラム
当たり20単位の割合になるように加え、24時間反応
させ、マルトース含量約92%の糖液を得た。その反応
液を100℃で20分間加熱した後、温度40℃、pH
7.0に調整し、これに前記方法で調製したマルトース
・トレハロース変換酵素を固形物グラム当たり1.5単
位の割合になるよう加え、72時間反応させた。その反
応液を95℃で10分間保った後、冷却し、常法に従っ
て活性炭で脱色・濾過し、H型及びOH型イオン交換樹
脂により脱塩して精製し、更に濃縮して濃度約70%の
シラップを固形物収率約97%で得た。本品は、固形物
当たりトレハロースを約65%含有していて還元力がD
E16.2と低く、温和な甘味、適度の粘度、保湿性を
有し、甘味料、呈味改良剤、安定剤、賦形剤などとして
各種飲食物、化粧品、医薬品など各種組成物に有利に利
用できる。
【0152】
【実施例A−10】実施例A−9の方法で得たマルトー
ス・トレハロース変換酵素による反応終了液を95℃で
10分間保って酵素を失活させた後、pH5.0、55
℃に調整して、グルコアミラーゼ(ナガセ生化学工業株
式会社製、商品名グルコチーム)を固形物グラム当たり
10単位加えて24時間反応させた。反応液を常法に従
って、加熱して酵素を失活させ、脱色、脱塩して精製
し、濃度55%に濃縮して糖液を得た。本糖液を原糖液
とし、アルカリ土類金属型強酸性カチオン交換樹脂(ダ
ウエックス99、Ca++型、架橋度6%、ダウケミカル
社製)を用いて、実施例A−2と同様にカラムクロマト
グラフィーにかけ、トレハロース高含有画分を採取し
た。更に、これを精製し、濃縮しながら連続晶析させ、
得られるマスキットをバスケット型遠心分離機で分蜜
し、結晶を少量の水でスプレーし洗浄して高純度のトレ
ハロース含水結晶を固形物収率約25%で得た。本品
は、実験23と同様の理化学的性質を示し、実施例A−
8と同様に、各種飲食物、化粧品、医薬品などの各種組
成物、更には、工業試薬、化学原料などに有利に利用で
きる。
【0153】
【実施例A−11】シュードモナス・プチダ H262
(FERM BP−4579)を実験9と同様の方法で
培養し、さらに遠心分離して得た湿菌体100g(約4
00単位)を10mMリン酸緩衝液に溶解した2.5%
アルギン酸ナトリウム(300〜400cp、和光純薬
工業株式会社販売)100mlに混練した。この菌体を
含むスラリーを、マグネティックスターラーで攪拌して
いる0.1MCaCl2溶液中に、水面より約20cm
の高さから連続的に滴下し、直径2mm前後の球状のゲ
ル化物を形成させた。このゲル化物をCaCl2溶液中
に室温で約2時間保った後、ブッフナーロート上で濾過
して、アルギン酸固定化菌体を回収した。この固定化菌
体を直径30mm、長さ200mmのジャケット付きガ
ラスカラムに充填し、温度を35℃に保温した。この固
定化菌体カラムにpH6.8のマルトース40%溶液を
SV0.1にて下向流で通液し、トレハロース含量67
%の糖液を得た。本糖液を実施例A−9の方法に準じ
て、精製、濃縮し、これを助晶し、噴霧乾燥して含蜜型
トレハロース含水結晶粉末を固形物収率約90%で得
た。本品は、低還元性、温和な甘味、適度の保湿性を有
し、実施例A−9の場合と同様に各種組成物に有利に利
用できる。
【0154】
【実施例A−12】サーマス・アクアティカス ATC
C33923を、実験15の方法に準じてファーメンタ
ーで約20時間、通気攪拌培養した。この培養液のマル
トース・トレハロース変換酵素の活性は、培養液ml当
たり0.32単位であった。この培養液約18lから回
収した湿重量0.18kgの菌体を10mMリン酸緩衝
液(pH7.0)に懸濁した。この菌体懸濁液約1.5
lを、超音波破砕装置で処理し、菌体を破砕した。この
菌体破砕懸濁液を遠心分離機にかけ、その上清を回収
し、更にその液をUF膜濃縮し、マルトース・トレハロ
ース変換酵素をml当たり約10単位有する濃縮酵素液
約500mlを回収した。15%とうもろこし澱粉乳
(pH5.5)にα−アミラーゼ(ナガセ生化学工業株
式会社製、商品名スピターゼHS)を澱粉グラム当たり
2単位加えて攪拌下、加熱糊化・液化させ、ただちにオ
ートクレーブ(120℃)を20分間行った後、温度5
5℃、pH5.0に調整した。これにイソアミラーゼ
(株式会社林原生物化学研究所製)を澱粉グラム当たり
300単位及びβ−アミラーゼ(ナガセ生化学工業株式
会社製)を澱粉グラム当たり20単位の割合になるよう
に加え、24時間反応させ、マルトース含量約92%の
糖液を得た。その反応液を100℃で20分間加熱した
後、温度50℃、pH7.0に調整し、これに前記方法
で調製したマルトース・トレハロース変換酵素を固形物
グラム当たり1.5単位の割合になるよう加え、72時
間反応させた。その反応液を95℃で10分間保った
後、冷却し、常法に従って活性炭で脱色・濾過し、H型
及びOH型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に
濃縮して濃度約70%のシラップを固形物収率約95%
で得た。本品は、固形物当たりトレハロースを約64%
含有していて還元力がDE18.0と低く、温和な甘
味、適度の粘度、保湿性を有し、甘味料、呈味改良剤、
安定剤、賦形剤などとして各種飲食物、化粧品、医薬品
など各種組成物に有利に利用できる。
【0155】
【実施例A−13】実施例A−12の方法で得たシラッ
プを濃度約80%に濃縮して助晶機にとり、実施例A−
8と同様に晶出、分蜜して高純度のトレハロース含水結
晶を固形物収率約20%で得た。本品は、実験23と同
様の理化学的性質を示し、実施例A−8と同様に、各種
飲食物、化粧品、医薬品などの各種組成物、更には、工
業試薬、工業原料、化学原料などに有利に利用できる。
【0156】
【実施例A−14】サーマス・アクアティカス ATC
C33923を実験15と同様の方法で培養し、さらに
遠心分離して得た湿菌体50g(約1,500単位)を
10mMリン酸緩衝液(pH7.0)に溶解した2.5
%アルギン酸ナトリウム(300乃至400cp,和光
純薬工業株式会社製)100mlに混練した。この菌体
を含むスラリーを、マグネティックスターラーで攪拌し
ている0.1MCaCl2溶液中に、水面より約20c
mの高さから連続的に滴下し、直径2mm前後の球状の
ゲル化物を形成させた。このゲル化物をCaCl2溶液
中に室温で約2時間保った後、ブッフナーロート上で濾
過して、アルギン酸固定化菌体を回収した。この固定化
菌体を直径30mm、長さ200mmのジャケット付き
ガラスカラムに充填し、温度を60℃に保温した。この
固定化菌体カラムにpH6.5のマルトース40%溶液
をSV0.2にて下向流で通液し、トレハロース含量約
66%の糖液を得た。本糖液を常法に従って、精製、濃
縮し、噴霧乾燥してトレハロース含有粉末を固形物収率
約90%で得た。本品は、低還元性で、温和な甘味を有
し、実施例A−12の場合と同様に各種組成物に有利に
利用できる。
【0157】
【実施例B−1 甘味料】実施例A−8の方法で得たト
レハロース含水結晶粉末1重量部に、α−グリコシルス
テビオシド(東洋精糖株式会社製、商品名αGスイー
ト)0.01重量部及びL−アスパルチル−L−フェニ
ルアラニンメチルエステル(商品名アスパルテーム)
0.01重量部を均一に混合し、顆粒成型機にかけて、
顆粒状甘味料を得た。本品は、甘味の質が優れ、蔗糖の
約2.5倍の甘味度を有し、甘味度当たりカロリーは、
蔗糖の約1/2.5に低下している。本甘味料は、それ
に配合した高甘味度甘味物の分解もなく、安定性に優れ
ており、低カロリー甘味料として、カロリー摂取を制限
している肥満者、糖尿病者などのための低カロリー飲食
物などに対する甘味付けに好適である。また、本甘味料
は、虫歯誘発菌による酸の生成が少なく、不溶性グルカ
ンの生成も少ないことより、虫歯を抑制する飲食物など
に対する甘味付けにも好適である。
【0158】
【実施例B−2 ハードキャンディー】濃度55%蔗糖
溶液100重量部に実施例A−1の方法で得たトレハロ
ース含有シラップ30重量部を加熱混合し、次いで減圧
下で水分2%未満になるまで加熱濃縮し、これにクエン
酸1重量部及び適量のレモン香料と着色料とを混和し、
常法に従って成型し、製品を得た。本品は、歯切れ、呈
味良好で、蔗糖の晶出も起こらない高品質のハードキャ
ンディーである。
【0159】
【実施例B−3 チューインガム】ガムベース3重量部
を柔らかくなる程度に加熱溶融し、これに結晶マルチト
ール粉末3重量部及び実施例A−3の方法で得たトレハ
ロース含水結晶粉末4重量部とを加え、更に適量の香料
と着色料とを混合し、常法に従って、ロールにより練り
合わせ、成形、包装して製品を得た。本品は、テクスチ
ャー、風味とも良好なチューインガムである。また、本
品は、低う蝕性乃至難う蝕性チューインガムとして好適
である。
【0160】
【実施例B−4 粉末ジュース】噴霧乾燥により製造し
たオレンジ果汁粉末33重量部に対して、実施例A−7
の方法で得た含蜜型トレハロース含水結晶粉末50重量
部、蔗糖10重量部、無水クエン酸0.65重量部、リ
ンゴ酸0.1重量部、L−アスコルビン酸0.1重量
部、クエン酸ソーダ0.1重量部、プルラン0.5重量
部、粉末香料適量をよく混合攪拌し、粉砕し微粉末にし
てこれを流動層造粒機に仕込み、排風温度40℃、風量
150m3とし、これに、実施例A−6の方法で得たト
レハロース含有シラップをバインダーとしてスプレー
し、30分間造粒し、計量、包装して製品を得た。本品
は、果汁含有率約30%の粉末ジュースで、異味、異臭
がなく、高品質を長期に保った。
【0161】
【実施例B−5 乳酸菌飲料】脱脂粉乳175重量部、
実施例A−9の方法で得たトレハロース含有シラップ1
30重量部及び特開平4−281795号公報で開示さ
れているラクトスクロース高含有粉末50重量部を水
1,150重量部に溶解し、65℃で30分間殺菌し、
40℃に冷却後、これに、常法に従って、乳酸菌のスタ
ーターを30重量部植菌し、37℃で8時間培養して乳
酸菌飲料を得た。本品は、風味良好な乳酸菌飲料であ
る。また、本品は、オリゴ糖を含有し、乳酸菌を安定に
保持するだけでなく、ビフィズス菌増殖促進作用をも有
する。
【0162】
【実施例B−6 カスタードクリーム】コーンスターチ
100重量部、実施例A−6の方法で得たトレハロース
含有シラップ100重量部、マルトース80重量部、蔗
糖20重量部及び食塩1重量部を充分に混合し、鶏卵2
80重量部を加えて攪拌し、これに沸騰した牛乳1,0
00重量部を徐々に加え、更に、これを火にかけて攪拌
を続け、コーンスターチが完全に糊化して全体が半透明
になった時に火を止め、これを冷却して適量のバニラ香
料を加え、計量、充填、包装して製品を得た。本品は、
なめらかな光沢を有し、温和な甘味で美味である。
【0163】
【実施例B−7 ういろうの素】米粉90重量部に、コ
ーンスターチ20重量部、蔗糖40重量部、実施例A−
11の方法で得た含蜜型トレハロース含水結晶粉末80
重量部及びプルラン4重量部を均一に混合してういろう
の素を製造した。ういろうの素と適量の抹茶と水とを混
練し、これを容器に入れて60分間蒸し上げて抹茶うい
ろうを製造した。本品は、照り、口当たりも良好で、風
味も良い。また、澱粉の老化も抑制され、日持ちも良
い。
【0164】
【実施例B−8 粉末ペプチド】40%食品用大豆ペプ
チド溶液(不二精油株式会社製造、商品名ハイニュート
S)1重量部に、実施例A−10の方法で得たトレハロ
ース含水結晶2重量部を混合し、プラスチック製バット
に入れ、50℃で減圧乾燥し、粉砕して粉末ペプチドを
得た。本品は、風味良好で、プレミックス、冷菓などの
製菓用材料としてのみならず、経口流動食、経管流動食
などの離乳食、治療用栄養剤などとしても有利に利用で
きる。
【0165】
【実施例B−9 粉末味噌】赤味噌1重量部に実施例A
−4の方法で得た無水結晶トレハロース粉末3重量部を
混合し、多数の半球状凹部を設けた金属板に流し込み、
これを室温下で一夜静置して固化し、離型して1個当た
り約4gの固形味噌を得、これを粉砕機にかけて粉末味
噌を得た。本品は、即席ラーメン、即席吸物などの調味
料として有利に利用できる。また、固形味噌は、固形調
味料としてだけでなく味噌菓子などにも利用できる。
【0166】
【実施例B−10 粉末卵黄】生卵から調製した黄卵を
プレート式加熱殺菌機で60乃至64℃で殺菌し、得ら
れる液状卵黄1重量部に対して、実施例A−4の方法で
得た無水結晶トレハロース粉末4重量部の割合で混合し
た後バットに移し、一夜放置して、トレハロース含水結
晶に変換させてブロックを調製した。本ブロックを切削
機にかけて粉末化し、粉末卵黄を得た。本品は、プレミ
ックス、冷菓、乳化剤などの製菓用材料としてのみなら
ず、経口流動食、経管流動食などの離乳食、治療用栄養
剤などとしても有利に利用できる。また、美肌剤、育毛
剤などとしても有利に利用できる。
【0167】
【実施例B−11 あん】原料あずき10重量部に、常
法に従って、水を加えて煮沸し、渋切り、あく抜きし
て、水溶性夾雑物を除去して、あずきつぶ生あん約21
重量部を得た。この生あんに、蔗糖14重量部、実施例
A−12の方法で得たトレハロース含有シラップ5重量
部及び水5重量部を加えて煮沸し、これに少量のサラダ
オイルを加えてつぶあんをこわさないように練り上げ、
製品のあんを約35重量部得た。本品は、色焼けもな
く、舌ざわりもよく、風味良好で、あんパン、まんじゅ
う、だんご、もなか、氷菓などのあん材料として、好適
である。
【0168】
【実施例B−12 パン】小麦粉100重量部、イース
ト2重量部、砂糖5重量部、実施例A−14の方法で得
たトレハロース含有粉末1重量部及び無機フード0.1
重量部を、常法に従って、水でこね、中種を26℃で2
時間発酵させ、その後30分間熟成し、焼き上げた。本
品は、色相、すだちともに良好で適度な弾力、温和な甘
味を有する高品質のパンである。
【0169】
【実施例B−13 ハム】豚もも肉1,000重量部に
食塩15重量部及び硝酸カリウム3重量部を均一にすり
込んで、冷室に1昼夜堆積する。これを、水500重量
部、食塩100重量部、硝酸カリウム3重量部、実施例
A−3の方法で得たトレハロース含水結晶粉末40重量
部及び香辛料適量からなる塩漬液に冷室で7日間漬込
み、次いで、常法に従い、冷水で洗浄し、ひもで巻き締
め、燻煙し、クッキングし、冷却、包装して製品を得
た。本品は、色合いもよく、風味良好な高品質のハムで
ある。
【0170】
【実施例B−14 加糖練乳】原乳100重量部に実施
例A−5の方法で得たトレハロース含有シラップ3重量
部及び蔗糖1重量部を溶解し、プレートヒーターで加熱
殺菌し、次いで濃度70%に濃縮し、無菌状態で缶詰し
て製品を得た。本品は、温和な甘味で、風味もよく、乳
幼児食品、フルーツ、コーヒー、ココア、紅茶などの調
味用に有利に利用できる。
【0171】
【実施例B−15 化粧用クリーム】モノステアリン酸
ポリオキシエチレングリコール2重量部、自己乳化型モ
ノステアリン酸グリセリン5重量部、実施例A−7の方
法で得た含蜜型トレハロース含水結晶粉末2重量部、α
−グリコシルルチン1重量部、流動パラフィン1重量
部、トリオクタン酸グリセリン10重量部及び防腐剤の
適量を常法に従って加熱溶解し、これにL−乳酸2重量
部、1,3−ブチレングリコール5重量部及び精製水6
6重量部を加え、ホモゲナイザーにかけ乳化し、更に香
料の適量を加えて攪拌混合しクリームを製造した。本品
は、安定性に優れ、高品質の日焼け止め、美肌剤、色白
剤などとして有利に利用できる。
【0172】
【実施例B−16 粉末薬用人参エキス】薬用人参エキ
ス0.5重量部に実施例A−4の方法で得た無水結晶ト
レハロース粉末1.5重量部を混捏した後、バットに移
し、2日間放置してトレハロース含水結晶に変換させブ
ロックを調製した。本ブロックを切削機にかけて粉末化
し、分級して粉末薬用人参エキスを得た。本品を適量の
ビタミンB1及びビタミンB2粉末とともに顆粒成型機
にかけ、ビタミン含有顆粒状薬用人参エキスとした。本
品は、疲労回復剤、強壮、強精剤などとして有利に利用
できる。また、育毛剤などとしても利用できる。
【0173】
【実施例B−17 固体製剤】天然型ヒトインターフェ
ロン−α標品(株式会社林原生物化学研究所製、コスモ
・バイオ株式会社販売)を、常法に従って、固定化抗ヒ
トインターフェロン−α抗体カラムにかけ、該標品に含
まれる天然型ヒトインターフェロン−αを吸着させ、安
定剤である牛血清アルブミンを素通りさせて除去し、次
いで、pHを変化させて、天然型ヒトインターフェロン
−αを実施例A−2の方法で得たトレハロース高含有粉
末を5%含有する生理食塩水を用いて溶出した。本液を
精密濾過し、約20倍量の無水結晶マルトース粉末(株
式会社林原商事製、商品名ファイントース)に加えて脱
水、粉末化し、これを打錠機にて打錠し、1錠(約20
0mg)当たり天然型ヒトインターフェロン−αを約1
50単位含有する錠剤を得た。本品は、舌下錠などとし
て、一日当たり、大人1乃至10錠程度が経口的に投与
され、ウイルス性疾患、アレルギー性疾患、リューマ
チ、糖尿病、悪性腫瘍などの治療に有利に利用できる。
とりわけ、近年、患者数の急増しているエイズ、肝炎な
どの治療剤として有利に利用できる。本品は、トレハロ
ースと共にマルトースが安定剤として作用し、室温で放
置してもその活性を長期間よく維持する。
【0174】
【実施例B−18 糖衣錠】重量150mgの素錠を芯
剤とし、これに実施例A−3の方法で得たトレハロース
含水結晶粉末40重量部、プルラン(平均分子量20
万)2重量部、水30重量部、タルク25重量部及び酸
化チタン3重量部からなる下掛け液を用いて錠剤重量が
約230mgになるまで糖衣し、次いで、同じトレハロ
ース含水結晶粉末65重量部、プルラン1重量部及び水
34重量部からなる上掛け液を用いて、糖衣し、更に、
ロウ液で艶出しして光沢のある外観の優れた糖衣錠を得
た。本品は、耐衝撃性にも優れており、高品質を長期間
維持する。
【0175】
【実施例B−19 練歯磨】 配合 第2リン酸カルシウム 45.0% プルラン 2.95% ラウリル硫酸ナトリウム 1.5% グリセリン 20.0% ポリオキシエチレンソルビタンラウレート 0.5% 防腐剤 0.05% 実施例A−14の方法で得たトレハロース含有粉末 12.0% マルチトール 5.0% 水 13.0% 上記の材料を常法に従って混合し、練歯磨を得た。本品
は、適度の甘味を有しており、特に子供用練歯磨として
好適である。
【0176】
【実施例B−20 流動食用固体製剤】実施例A−8の
方法で製造したトレハロース含水結晶500重量部、粉
末卵黄270重量部、脱脂粉乳209重量部、塩化ナト
リウム4.4重量部、塩化カリウム1.8重量部、硫酸
マグネシウム4重量部、チアミン0.01重量部、アス
コルビン酸ナトリウム0.1重量部、ビタミンEアセテ
ート0.6重量部及びニコチン酸アミド0.04重量部
からなる配合物を調製し、この配合物25グラムずつ防
湿性ラミネート小袋に充填し、ヒートシールして製品を
得た。本品は、1袋分を約150乃至300mlの水に
溶解して流動食とし、経口的、又は鼻腔、胃、腸などへ
経管的使用方法により利用され、生体へのエネルギー補
給用に有利に利用できる。
【0177】
【実施例B−21 輸液剤】実施例A−10の方法で製
造した高純度トレハロース含水結晶を水に濃度約10w
/v%に溶解し、次いで、常法に従って、精密濾過して
パイロジェンフリーとし、プラスチック製ボトルに無菌
的に充填し施栓して製品を得た。本品は、経日変化もな
く安定な輸液剤で、静脈内、腹腔内などに投与するのに
好適である。本品は濃度10w/v%で血液と等張で、
グルコースの場合の2倍濃度でエネルギー補給できる。
【0178】
【実施例B−22 輸液剤】実施例A−13の方法で製
造した高純度トレハロース含水結晶と下記の組成のアミ
ノ酸配合物とがそれぞれ5w/v%、30w/v%にな
るように水に混合溶解し、次いで実施例10と同様に精
製してパイロジェンフリーとし、更に、プラスチック製
バックに充填し施栓して製品を得た。 アミノ酸配合物の組成(mg/100ml) L−イソロイシン 180 L−ロイシン 410 L−リジン塩酸塩 620 L−メチオニン 240 L−フェニルアラニン 290 L−スレオニン 180 L−トリプトファン 60 L−バリン 200 L−アルギニン塩酸塩 270 L−ヒスチジン塩酸塩 130 グリシン 340 本品は、糖質とアミノ酸との複合輸液剤にもかかわら
ず、トレハロースが還元性を示さないため、経日変化も
なく安定な輸液剤で、静脈内、腹腔内などへ投与するの
に好適である。本品は、生体へのエネルギー補給のみな
らず、アミノ酸補給のためにも有利に利用できる。
【0179】
【実施例B−23 外傷治療用膏薬】実施例A−2の方
法で製造したトレハロース高含有粉末200重量部及び
マルトース300重量部に、ヨウ素3重量部を溶解した
メタノール50重量部を加え混合し、更に10w/v%
プルラン水溶液200重量部を加えて混合し、適度の延
び、付着性を示す外傷治療用膏薬を得た。本品は、ヨウ
素による殺菌作用のみならず、トレハロースによる細胞
へのエネルギー補給剤としても作用することから、治癒
期間が短縮され、創面もきれいに治る。
【0180】
【発明の効果】上記から明らかなように、本発明の新規
マルトース・トレハロース変換酵素は、マルトースから
トレハロースへ高変換率で転換する。この酵素反応で得
られるトレハロースとこれを含む糖質は、安定であり、
良質でさわやかな甘味を有しており、また、経口摂取に
より消化吸収され、カロリー源となる糖質である。これ
ら糖質は、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、
賦形剤などとして、飲食物、化粧品、医薬品、など各種
組成物に有利に利用できる。
【0181】従って、本発明の確立は、安価で無限の資
源である澱粉に由来するマルトースから、トレハロース
とこれを含む糖質を、工業的に大量かつ安価に供給でき
る全く新しい道を拓くことになり、それが与える影響の
大きさは、澱粉科学、酵素化学、生化学などの学問分野
は言うに及ばず、産業界、とりわけ、食品、化粧品、医
薬品分野は勿論のこと、農水畜産業、化学工業にも及
び、これら産業界に与える工業的意義は、計り知れない
ものがある。
【図面の簡単な説明】
【図1】ピメロバクター・スピーシーズ R48のマル
トース・トレハロース変換酵素の酵素活性に及ぼす温度
の影響を示す図である。
【図2】ピメロバクター・スピーシーズ R48のマル
トース・トレハロース変換酵素の酵素活性に及ぼすpH
の影響を示す図である。
【図3】ピメロバクター・スピーシーズ R48のマル
トース・トレハロース変換酵素の安定性に及ぼす温度の
影響を示す図である。
【図4】ピメロバクター・スピーシーズ R48のマル
トース・トレハロース変換酵素の安定性に及ぼすpHの
影響を示す図である。
【図5】シュードモナス・プチダ H262のマルトー
ス・トレハロース変換酵素の酵素活性に及ぼす温度の影
響を示す図である。
【図6】シュードモナス・プチダ H262のマルトー
ス・トレハロース変換酵素の酵素活性に及ぼすpHの影
響を示す図である。
【図7】シュードモナス・プチダ H262のマルトー
ス・トレハロース変換酵素の安定性に及ぼす温度の影響
を示す図である。
【図8】シュードモナス・プチダ H262のマルトー
ス・トレハロース変換酵素の安定性に及ぼすpHの影響
を示す図である。
【図9】サーマス・アクアティカス ATCC3392
3のマルトース・トレハロース変換酵素の酵素活性に及
ぼす温度の影響を示す図である。
【図10】サーマス・アクアティカス ATCC339
23のマルトース・トレハロース変換酵素の酵素活性に
及ぼすpHの影響を示す図である。
【図11】サーマス・アクアティカス ATCC339
23のマルトース・トレハロース変換酵素の安定性に及
ぼす温度の影響を示す図である。
【図12】サーマス・アクアティカス ATCC339
23のマルトース・トレハロース変換酵素の安定性に及
ぼすpHの影響を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 A23G 3/00 105 106 3/02 3/30 A23L 1/202 118 1/31 A 1/32 A 2/39 A61K 7/16 7/42 9/06 9/08 J 9/20 9/36 31/70 C07H 3/04 C12N 1/20 A 8828−4B C12P 19/14 Z 7432−4B //(C12N 9/10 C12R 1:01) (C12N 9/10 C12R 1:40) (C12N 1/20 C12R 1:01) (C12N 1/20 C12R 1:40)

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 マルトースをトレハロースに変換し、ト
    レハロースをマルトースに変換するマルトース・トレハ
    ロース変換酵素。
  2. 【請求項2】 マルトース・トレハロース変換酵素が微
    生物由来の酵素である請求項1記載のマルトース・トレ
    ハロース変換酵素。
  3. 【請求項3】 微生物がピメロバクター属、シュードモ
    ナス属及びサーマス属から選ばれる微生物である請求項
    2記載のマルトース・トレハロース変換酵素。
  4. 【請求項4】 下記の理化学的性質を有するマルトース
    ・トレハロース変換酵素。 (1) 作用 マルトースをトレハロースに変換し、トレハロースをマ
    ルトースに変換する。 (2) 分子量 SDS−ゲル電気泳動法で、約57,000乃至12
    0,000ダルトン。 (3) 等電点 アンフォライン含有電気泳動法により、pI約3.8乃
    至5.1。 (4) 活性阻害 1mMCu++、Hg++又は50mMトリス塩酸緩衝液で
    阻害を受ける。 (5) 起源 微生物により産生される酵素である。
  5. 【請求項5】 マルトース・トレハロース変換酵素が、
    ピメロバクター属、シュードモナス属及びサーマス属か
    ら選ばれる微生物由来の酵素であって、ピメロバクター
    属の場合、 (1) 至適温度 pH7.0、60分間反応で、20℃付近 (2) 至適pH 25℃、60分間反応で、pH約7.0乃至8.0 (3) 温度安定性 pH7.0、60分間保持で、30℃付近まで安定 (4) pH安定性 20℃、60分間保持で、pH約6.0乃至9.5 の性質を有し、シュードモナス属の場合、 (1) 至適温度 pH7.0、60分間反応で、37℃付近 (2) 至適pH 35℃、60分間反応で、pH約7.3乃至8.3 (3) 温度安定性 pH7.0、60分間保持で、40℃付近まで安定 (4) pH安定性 35℃、60分間保持で、pH約6.0乃至9.5 の性質を有し、サーマス属の場合、 (1) 至適温度 pH7.0、60分間反応で、65℃付近 (2) 至適pH 60℃、60分間反応で、pH約6.0乃至6.7 (3) 温度安定性 pH7.0、60分間保持で、80℃付近まで安定 (4) pH安定性 60℃、60分間保持で、pH約5.5乃至9.5 の性質を有する請求項4記載のマルトース・トレハロー
    ス変換酵素。
  6. 【請求項6】 マルトースをトレハロースに変換し、ト
    レハロースをマルトースに変換する作用を有し、部分ア
    ミノ酸配列として、 (1) トリプトファン−X1−アルギニン−X2−アラ
    ニン−X3−フェニルアラニン(但し、X1はフェニルア
    ラニン又はプロリンを意味し、X2はトレオニン又はプ
    ロリンを意味し、 X3はバリン又はアラニンを意味す
    る。) (2) アラニン−バリン−X4−チロシン(但し、X4
    はフェニルアラニン又はイソロイシンを意味する。) から選ばれる部分アミノ酸配列を有するマルトース・ト
    レハロース変換酵素。
  7. 【請求項7】 マルトース・トレハロース変換酵素産生
    能を有する微生物を栄養培地に培養し、培養物からマル
    トース・トレハロース変換酵素を採取することを特徴と
    するマルトース・トレハロース変換酵素の製造方法。
  8. 【請求項8】 微生物がピメロバクター・スピーシーズ
    (Pimelobacter sp.)R48(通商産
    業省工業技術院生命工学工業技術研究所、受託番号 F
    ERM BP−4315)、シュードモナス・プチダ
    (Pseudomonas putida)H262
    (通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所、受託
    番号 FERM BP−4579)及びサーマス・アク
    アティカス(Thermus aquaticus)A
    TCC33923から選ばれる微生物である請求項7記
    載のマルトース・トレハロース変換酵素の製造方法。
  9. 【請求項9】 ピメロバクター・スピーシーズ(Pim
    elobactersp.)R48(通商産業省工業技
    術院生命工学工業技術研究所、受託番号FERM BP
    −4315)又はシュードモナス・プチダ(Pseud
    omonas putida)H262(通商産業省工
    業技術院生命工学工業技術研究所、受託番号 FERM
    BP−4579)からなるマルトース・トレハロース
    変換酵素産生能を有する微生物。
  10. 【請求項10】 マルトース含有溶液にマルトース・ト
    レハロース変換酵素を作用させてマルトースからトレハ
    ロースを生成させることを特徴とするマルトースの還元
    力低減方法。
  11. 【請求項11】 マルトース含有溶液にマルトース・ト
    レハロース変換酵素を作用させ、得られるトレハロー
    ス、又はこれを含む糖質。
  12. 【請求項12】 マルトース含有溶液が、澱粉にβ−ア
    ミラーゼ又はβ−アミラーゼとともに澱粉枝切酵素を作
    用させて得られたものである請求項11記載のトレハロ
    ース、又はこれを含む糖質。
  13. 【請求項13】 トレハロースが、マルトース含有溶液
    にマルトース・トレハロース変換酵素を作用させるか、
    又はマルトース含有溶液にマルトース・トレハロース変
    換酵素を作用させた後にグルコアミラーゼを作用させて
    トレハロース含有溶液とし、これを塩型強酸性カチオン
    交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにかけ、得
    られる含量を向上させたトレハロースであることを特徴
    とする請求項11又は12記載のトレハロース。
  14. 【請求項14】 トレハロースが、含水結晶又は無水結
    晶である請求項11、12又は13記載のトレハロー
    ス。
  15. 【請求項15】 マルトース含有溶液にマルトース・ト
    レハロース変換酵素を作用させて得られるトレハロー
    ス、又はこれを含む糖質を含有せしめた組成物。
  16. 【請求項16】 組成物が、飲食物、化粧品又は医薬品
    である請求項15記載の組成物。
  17. 【請求項17】 組成物がエネルギー補給用組成物であ
    る請求項15又は16記載の組成物。
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