DE69434532T2 - Verfahren zur Herstellung eines Produktes mit hohem Trehalosegehalt - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Produktes mit hohem Trehalosegehalt. Gemäß einem Aspekt betrifft die Erfindung ein Enzym, das Maltose in Trehalose oder Trehalose in Maltose umwandelt (und das im folgenden als "Maltose-Trehalose-umwandelndes Enzym" bezeichnet wird), sowie dessen Herstellung. Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen zur Herstellung des Enzyms fähigen Mikroorganismus, mit dem Enzym hergestellte Trehalose, Saccharidzusammensetzungen, die die Trehalose enthalten, und Zusammensetzungen, die die Trehalose oder die Saccharidzusammensetzung enthalten.
  • Trehalose bzw. α,α-Trehalose ist als nichtreduzierendes Saccharid bekannt, das aus Glucosen besteht. Wie in Advances in Carbohydrate Chemistry, Band 18, S. 201–225 (1963), veröffentlicht von Academic Press, USA, und Applied und Environmental Microbiology, Band 56, S. 3213–3215 (1990) beschrieben, ist Trehalose in Mikroorganismen, Pilzen, Insekten, usw. weit verbreitet, obwohl der Gehalt relativ gering ist. Bei Trehalose handelt es sich um ein nichtreduzierendes Saccharid, so daß es weder mit aminogruppenhaltigen Substanzen wie Aminosäuren und Proteinen reagiert, noch die Amino-Carbonyl-Reaktion induziert, noch aminosäurehaltige Substanzen beeinträchtigt. Trehalose kann somit verwendet werden, ohne daß man befürchten muß, eine unannehmbare Bräunung und Beeinträchtigung herbeizuführen. Aus diesen Gründen besteht ein großer Bedarf für ein großtechnisches Verfahren für die Herstellung von Trehalose.
  • Herkömmliche Verfahren zur Herstellung von Trehalose sind beispielsweise die in dem offengelegten japanischen Patent Nr. 154,485/75, in dem Mikroorganismen verwendet werden, und in dem offengelegten japanischen Patent Nr. 216,695/83, in dem Maltose durch die kombinierte Anwendung von Maltose- und Trehalosephosphorylasen in Trehalose umgewandelt wird, offenbarten Verfahren. Das erstgenannte Verfahren eignet sich jedoch nicht für die großtechnische Herstellung, da der in den als Ausgangsmaterialien verwendeten Mikroorganismen vorhandene Gehalt an Trehalose gewöhnlich unter 15 Gew.-% liegt (der Ausdruck "Gew.-%" wird in der Beschreibung, wenn nicht anders angegeben, als "%" abgekürzt), auf Basis des Trockengewichts (TG), und die Extraktions- und Aufreinigungsschritte sind kompliziert. Das letztgenannte Verfahren hat die folgenden Nachteile: (i) da Trehalose über Glucose-1-phosphat gebildet wird, kann die Konzentration von Maltose als ein Substrat nicht auf ein ausreichend hohes Maß eingestellt werden; (ii) bei den enzymatischen Reaktionssystemen der Phosphorylasen handelt es sich um reversible Umsetzungen, und ihre Ausbeuten an der gewünschten Trehalose sind relativ gering; und (iii) es ist im wesentlichen schwierig, ihre Reaktionssysteme stabil zu halten und ihre enzymatischen Umsetzungen glatt ablaufen zu lassen. Die oben erwähnten herkömmlichen Herstellungsverfahren lassen sich deshalb nicht für ein großtechnisches Verfahren einsetzen.
  • Es ist bekannt, daß aus einem Stärkematerial wie verflüssigter Stärke, Dextrinen und Maltooligosacchariden hergestellte partielle Stärkehydrolysate gewöhnlich aufgrund ihrer reduzierenden Endgruppen ein Reduktionsvermögen aufweisen. Das Reduktionsvermögen wird im allgemeinen als "Dextrose-Äquivalent- (DÄ-) Wert" auf Basis des Trockengewichts ausgedrückt. Unter den reduzierenden partiellen Stärkehydrolysaten haben die mit einem relativ hohen DÄ-Wert bekannterweise im allgemeinen ein wesentlich niedrigeres Molekulargewicht und eine wesentlich geringere Viskosität sowie ein relativ hohes Maß an Süße und Reaktivität und reagieren leicht mit aminogruppenhaltigen Substanzen wie Aminosäuren und Proteinen, was eine Bräunung, einen Geruch und eine Qualitätsverschlechterung zur Folge hat, die unannehmbar sind. Da sich die Eigenschaften von reduzierenden partiellen Stärkehydrolysaten in Abhängigkeit von ihren DÄ-Werten unterscheiden, ist die Beziehung zwischen den reduzierenden partiellen Stärkehydrolysaten und ihren DÄ-Werten signifikant. Man hat sogar angenommen, daß es unmöglich wäre, die Beziehung in dieser Hinsicht aufzuheben.
  • Was die Herstellung von Trehalose betrifft, so wird in der Spalte mit dem Titel "Oligosaccharides" im Kapitel "Current Status of Starch Application Development und Related Problems" in "Food Chemicals", Nr. 88, S. 67–72 (August, 1992) berichtet, daß "In spite of a wide applicability of trehalose, the enzymatic preparation via a direct saccharide-transfer reaction oder a hydrolytic reaction has been reported to be scientifically almost impossible in this field." ["trotz einer breiten Anwendbarkeit von Trehalose, die enzymatische Herstellung mittels einer direkten Saccharid-Transfer-Reaktion oder einer hydrolytischen Reaktion auf diesem Gebiet als wissenschafftlich fast unmöglich erachtet wird."] Die Herstellung von Trehalose durch eine enzymatische Umsetzung mit Stärke als Material wurde somit wissenschaftlich als sehr schwierig angesehen.
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben jedoch diese allgemeine Auffassung geändert und es ist ihnen gelungen, Trehalose wie in der japanischen Patentanmeldung Nr. 362,131/92 beschrieben herzustellen, wobei Trehalose direkt aus nichtreduzierenden partiellen Stärkehydrolysaten hergestellt wird, indem man Glucoamylase zusammen mit einem Enzym, das nichtreduzierende Saccharide bildet, und dazu in der Lage ist, nichtreduzierende Saccharide mit einer Trehalosestruktur als Endeinheit und mit einem Glucosepolymerisationsgrad von 3 oder mehr zu bilden, auf aus einem Stärkematerial hergestellte reduzierende partielle Stärkehydrolysate mit einem Glucosepolymerisationsgrad von 3 oder mehr einwirken läßt. Für das Verfahren benötigt man jedoch 2 oder mehr Arten von Enzymen und als Material ein relativ hochmolekulares stärkeartiges Saccharid mit einem Glucosepolymerisationsgrad von 3 oder mehr sowie einer relativ hohen Viskosität. Darüber hinaus ist die Saccharidzusammensetzung des so erhaltenen Produkts reichlich kompliziert, was höhere Produktionskosten zur Folge haben kann. Deshalb die Bereitstellung eines neuen Verfahrens zur Herstellung von Trehalose, bei dem Trehalose aus Maltose und partiellen Stärkehydrolysaten mit einem Glucosepolymerisationsgrad von 2 gebildet wird, die beide im technischen Maßstab hergestellt und stabil zur Verfügung gestellt werden und im Handel erhältlich sind.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines Produktes mit hohem Trehalosegehalt bereit, bei dem man:
    • (a) eine maltose- und trehalosehaltige Lösung bereitstellt,
    • (b) zur Hydrolyse der Maltose zu Glucose das Einwirken von Glucoamylase und/oder α-Glucosidase auf die Lösung ermöglicht,
    • (c) die Glucose aus der resultierenden Mischung durch Ionenaustausch-Säulenchromatographie entfernt und
    • (d) das resultierende Produkt mit hohem Trehalosegehalt zurückgewinnt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Maltose-Trehalose-umwandelndes Enzym bereit, das eine großtechnisch herstellbare und stabil lieferbare Maltose in Trehalose umwandelt, und eine neue Zubereitung und Verwendungen von Trehalose und eine die mit dem Enzym hergestellte Trehalose enthaltende Saccharidzusammensetzung.
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben Mikroorganismen, die dazu in der Lage sind, ein neues saccharidumwandelndes Enzym zu produzieren, das Trehalose aus Maltose bildet, intensiv untersucht. Im Ergebnis wurde gefunden, daß ein Mikroorganismus der Gattung Pimelobacter, d.h. Pimelobacter sp. R48, isoliert aus einem Boden in Okayama-City, Okayama, Japan; ein Mikroorganismus der Gattung Pseudomonas, i.e. Pseudomonas putida H262, isoliert aus einem Boden in Nishinomiya-City, Hyogo, Japan; und ein Mikroorganismus der Gattung Thermus ein neues Maltose-Trehaloseumwandelndes Enzym bilden, das Maltose in Trehalose umwandelt, und es wurde eine Trehalosezubereitung und eine die Trehalose enthaltende Saccharidzusammensetzung sowie Zusammensetzungen wie Nahrungsmittelprodukte, Kosmetika und Pharmazeutika, die die Trehalose bzw. die Saccharidzusammensetzung enthalten, bereitgestellt.
  • Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der beigefügten Zeichnungen beispielhaft ausführlicher beschrieben, wobei:
  • 1 den Einfluß der Temperatur auf die Enzymaktivität des vorliegenden, aus Pimelobacter sp. R48 gewonnenen Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms zeigt.
  • 2 den Einfluß des pH-Werts auf die Enzymaktivität des vorliegenden, aus Pimelobacter sp. R48 gewonnenen Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms zeigt.
  • 3 den Einfluß der Temperatur auf die Stabilität des vorliegenden, aus Pimelobacter sp. R48 gewonnenen Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms zeigt.
  • 4 den Einfluß des pH-Werts auf die Stabilität des vorliegenden, aus Pimelobacter sp. R48 gewonnenen Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms zeigt.
  • 5 den Einfluß der Temperatur auf die Enzymaktivität des vorliegenden, aus Pseudomonas putida H262 gewonnenen Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms zeigt.
  • 6 den Einfluß des pH-Werts auf die Enzymaktivität des vorliegenden, aus Pseudomonas putida H262 gewonnenen Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms zeigt.
  • 7 den Einfluß der Temperatur auf die Stabilität des vorliegenden, aus Pseudomonas putida H262 gewonnenen Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms zeigt.
  • 8 den Einfluß des pH-Wertes auf die Stabilität des vorliegenden, aus Pseudomonas putida H262 gewonnenen Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms zeigt.
  • 9 den Einfluß der Temperatur auf die Enzymaktivität des vorliegenden, aus Thermus aquaticus (ATCC 33923) gewonnenen Maltose-Trehaloseumwandelnden Enzyms zeigt.
  • 10 den Einfluß des pH-Werts auf die Enzymaktivität des vorliegenden, aus Thermus aquaticus (ATCC 33923) gewonnenen Maltose-Trehaloseumwandelnden Enzyms zeigt.
  • 11 den Einfluß der Temperatur auf die Stabilität des vorliegenden, aus Thermus aquaticus (ATCC 33923) gewonnenen Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms zeigt.
  • 12. den Einfluß des pH-Werts auf die Stabilität des vorliegenden, aus Thermus aquaticus (ATCC 33923) gewonnenen Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms zeigt.
  • Gemäß einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Maltose-Trehalose-umwandelndes Enzym und dessen Herstellung und Verwendungen. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein neues Maltose-Trehaloseumwandelndes Enzym, das Maltose in Trehalose und/oder Trehalose in Maltose umwandelt, sowie dessen Herstellung. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen Mikroorganismus, der dazu in der Lage ist, das Enzym herzustellen, eine mit dem Enzym hergestellt Trehalose, eine die Trehalose enthaltende Saccharidzusammensetzung, und eine Zusammensetzung, die die Trehalose oder die Saccharidzusammensetzung enthält.
  • Der Identifikationstest eines Mikroorganismus der Gattung Pimelobacter, d.h. "Pimelobacter sp. R48", und eines Mikroorganismus der Gattung Pseudomonas, d.h. Pseudomonas putida H262, gemäß der folgenden Erfindung lieferte die unten angeführten Ergebnisse. Der Test wurde gemäß des in "Biseibutsu-no-Bunrui-to-Dotei" (Klassifizierung und Identifizierung von Mikroorganismen), herausgegeben von Takeji Hasegawa, veröffentlicht von Japan Scientific Societies Press, Tokio, Japan (1985) beschriebenen Verfahrens durchgeführt.
  • Die Ergebnisse für Pimelobacter sp. R48 waren wie folgt:
  • A. Morphologie
    • (1) Eigenschaften von Zellen nach Inkubation bei 27°C in Nähragar liegen gewöhnlich in Stäbchenform von 0,5–0,9 × 1,5–4,0 μm vor; liegen einzeln aber in seltenen Fällen auch als V-förmiges Paar oder in verbundener Form vor; verfügen nicht über Motilität und sind asporogen; nicht säurebeständig; und Gram-Anfärbung: positiv.
    • (2) Eigenschaften von Zellen nach Inkubation bei 27°C in mit Hefe- und Malzextrakten ergänztem Agarmedium mit einer Größe von 0,6–1,0 × 1,3–4,2 μm nach eintägiger Kultivierung, liegen nach 3tägiger Kultivierung nahezu in Kokkenform mit einer Größe von 0,6–1,0 × 1,0–2,5 μm vor; zeigen Polymorphismus; und liegen einzeln aber in seltenen Fällen auch als V-förmiges Paar oder in verbundener Form vor.
  • B. Eigenschaften von Kulturen
    • (1) Eigenschaften einer nach Inkubation bei 27°C in einer Nähragarplatte gebildeten Kultur Form: kreisförmige Kolonie mit einem Durchmesser von 0,5 mm nach 24stündiger Inkubation und 1,5–2 mm nach 3tägiger Inkubation; Rand: ohrähnlich; Überstand: halbkugelförmig; Glanz: keiner; Oberfläche: schrumpelig; Farbe: cremefarbene, undurchsichtige Kolonie;
    • (2) Eigenschaften einer nach Inkubation bei 27°C in einer mit Hefe- und Malzextrakten angereicherten Nähragarplatte gebildeten Kultur Form: kreisförmige Kolonie mit einem Durchmesser von etwa 1–1,5 mm nach 3tägiger Inkubation; Rand: ohrähnlich; Überstand: halbkugelförmig; Glanz: keiner; Oberfläche: schrumpelig; Farbe: cremefarbene, undurchsichtige Kolonie;
    • (3) Eigenschaften einer nach Inkubation bei 27°C in Schrägnähragar gebildeten Kultur Wachstum: zufriedenstellend; Form: fadenähnlich; und
    • (4) als Stichkultur bei 27°C in Nährgelatine die Gelatine nicht verflüssigend.
  • C. Physiologische Eigenschaften
    • (1) Reduktion von Nitrat: positiv;
    • (2) Denitrifikationsreaktion: negativ;
    • (3) Methylrot-Test: negativ;
    • (4) VP-Test: negativ;
    • (5) Bildung von Indol: negativ;
    • (6) Bildung von Wasserstoffsulfid: positiv;
    • (7) Hydrolyse von Stärke: negativ;
    • (8) Verwendung von Citronensäure: positiv;
    • (9) Verwendung von anorganischen Stickstoffquellen: Verwendung von Ammoniumsalzen und Nitraten;
    • (10) Bildung von Pigment: negativ;
    • (11) Urease: negativ;
    • (12) Oxidase: negativ;
    • (13) Katalase: negativ;
    • (14) Wachstumsbedingungen: Wachstum bei einem pH-Wert im Bereich von 5–9 und einer Temperatur im Bereich von 15–40°C;
    • (15) Sauerstoffbedarf: aerob;
    • (16) Verwendung von Kohlenstoffquelle und Säurebildung
      Figure 00100001
    • (17) Decarboxylase-Test auf Aminosäure: negativ auf L-Lysin, L-Arginin und L-Ornithin;
    • (18) Verwendung von Aminosäure, Verwendung von Natrium-L-glutamat und Natrium-L-asparat;
    • (19) DNase: negativ;
    • (20) Bildung von 3-Ketolactose: negativ;
    • (21) Mol% Guanin (G) plus Cytosin (C) der DNA: 72%; und
    • (22) Haupt-Diaminosäure der Zellwand LL-Diaminopimelinsäure.
  • Am 3. Juni 1993 wurde am National Institute of Bioscience und Human-Technology Agency of Industrial Science und Technology, Ibaraki, Japan, eine Probe von Pimelobacter sp R48 hinterlegt. Die Probe wurde an diesem Tag angenommen und wird an dem Institut unter der Zugangsnummer FERM BP-4315 aufbewahrt.
  • Die Ergebnisse für Pseudomonas putida H262 waren wie folgt:
  • A. Morphologie
    • (1) Eigenschaften von Zellen nach Inkubation bei 27°C in Nähragar liegen gewöhnlich in Stäbchenform von 0,5–0,7 × 1,0–2,0 μm vor und sind asporogen; Motilität durch Flagellum; nicht säurebeständig; und Gram-Anfärbung: negativ.
    • (2) Eigenschaften von Zellen nach Inkubation bei 27°C in mit Hefe- und Malzextrakten ergänztem Agarmedium mit einer Größe von 0,6–0,8 × 2,0–4,0 μm nach eintägiger Kultivierung.
  • B. Eigenschaften von Kulturen
    • (1) Eigenschaften einer nach Inkubation bei 27°C in einer Nähragarplatte gebildeten Kultur Form: kreisförmige Kolonie mit einem Durchmesser von 1–2 mm nach 24stündiger Inkubation und 3,5–4 mm nach 3tägiger Inkubation; Rand: vollständig; Überstand: halbkugelförmig; Glanz: feuchter Glanz; Oberfläche: glatt; Farbe: cremefarbene oder weiße undurchsichtige Kolonie;
    • (2) Eigenschaften einer nach Inkubation bei 27°C in einer mit Hefe- und Malzextrakten angereicherten Nähragarplatte gebildeten Kultur Form: kreisförmige Kolonie mit einem Durchmesser von etwa 4–5 mm nach 3tägiger Inkubation; Rand: vollständig; Überstand: halbkugelförmig; Glanz: feuchter Glanz; Oberfläche: glatt; Farbe: cremefarbene oder weiße undurchsichtige Kolonie;
    • (3) Eigenschaften einer nach Inkubation bei 27°C in Schrägnähragar gebildeten Kultur Wachstum: zufriedenstellend; Form: fadenähnlich. Bildet eine relativ dünne Projektion mit glatter Oberfläche, feuchtem Glanz, undurchsichtiger und gelblich beige; und
    • (4) als Stichkultur bei 27°C in Nährgelatine die Gelatine nicht verflüssigend.
  • C. Physiologische Eigenschaften
    • (1) Reduktion von Nitrat in einem Bernsteinsäuremedium: positiv;
    • (2) Denitrifikationsreaktion: negativ;
    • (3) Methylrot-Test: negativ;
    • (4) VP-Test: negativ;
    • (5) Bildung von Indol: negativ;
    • (6) Bildung von Wasserstoffsulfid: negativ;
    • (7) Hydrolyse von Stärke: negativ;
    • (8) Akkumulation von Poly-β-hydroxybutylat: negativ
    • (9) Zersetzung von Procatechuat: Orth-Typ
    • (10) Verwendung von Citronensäure: positiv;
    • (11) Verwendung von anorganischen Stickstoffquellen: Verwendung von Ammoniumsalzen und Nitraten;
    • (12) Bildung von Pigment: hellgelbes Pigment
    • (13) Bildung von fluoreszierendem Pigment: positiv;
    • (14) Urease: positiv;
    • (15) Oxidase: positiv;
    • (16) Katalase: positiv;
    • (17) Wachstumsbedingungen: Wachstum bei einem pH-Wert im Bereich von 5–9 und einer Temperatur im Bereich von 10–37°C;
    • (18) Sauerstoffbedarf: aerob;
    • (19) Verwendung von Kohlenstoffquelle und Säurebildung
      Figure 00130001
    • (20) Decarboxylase-Test auf Aminosäure: negativ auf L-Lysin und L-Ornithin, positiv auf L-Arginin;
    • (21) Verwendung von Aminosäure, Verwendung von Natrium-L-glutamat, Natrium-L-asparat, Natrium- L-arginin, L-Histidin, L-Valin und D-Alanin, jedoch nicht L-Tryptophan;
    • (22) DNase: negativ;
    • (23) Bildung von 3-Ketolactose: negativ; und
    • (24) Mol% Guanin (G) plus Cytosin (C) der DNA: 63%.
  • Ausgehend von den Ergebnissen wurden die bakteriologischen Eigenschaften mit denen bekannter Mikroorganismen verglichen, wobei auf Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 1. Auflage (1984) Bezug genommen wurde. Der Mikroorganismus wurde auf diese Weise als ein Mikroorganismus der Spezies Pseudomonas putida identifiziert.
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung bezeichneten diesen Mikooorganismus als "Pseudomonas putida H262", und hinterlegten ihn am 23. Februar 1994 im National Institute of Bioscience und Human-Technology Agency of Industrial Science und Technology, Ibaraki, Japan. Die Probe wurde an diesem Tag vom Institut angenommen und wird an dem Institut unter der Zugangsnummer FERM BP-4579 aufbewahrt.
  • Zusätzlich zu dem oben identifizierten Mikroorganismus können auch andere Stämme der Gattung Pseudomonas und deren Mutanten mit Erfolg für die Erfindung eingesetzt werden, vorausgesetzt, sie produzieren das erfindungsgemäße Maltose-Trehalose-umwandelnde Enzym.
  • Weiterhin eignen sich für die Erfindung auch Mikroorganismen der Gattung Thermus, beispielsweise die der Spezies Thermus aquaticus (ATCC 25104), Thermus aquaticus (ATCC 33923), Thermus filiformis (ATCC 43280), Thermus ruber (ATCC 35948), Thermus sp. (ATCC 43814), und Thermus sp. (ATCC 43815).
  • Erfindungsgemäß lassen sich alle Nährmedien verwenden, solange die Mikroorganismen darin wachsen können und das erfindungsgemäße Enzym produzieren: beispielsweise kann man je nach Gutdünken synthetische und natürliche Nährkulturmedien einsetzen. Als Kohlenstoffquelle kann für die Erfindung eine beliebige kohlenstoffhaltige Substanz verwendet werden, solange sie von den Mikororganismen verwendet wird: Beispiele für eine solche Kohlenstoffquelle sind Saccharide wie z.B. Glucose, Fructose, Molassen, Trehalose, Lactose, Saccharose, Mannit, Sorbit, partielle Stärkehydrolysate; und organische Säuren wie z.B. Citronensäure und Bernsteinsäure sowie deren Salze. Die Konzentrationen dieser Kohlenstoffquellen in Nährkulturmedien werden entsprechend gewählt. So beträgt beispielsweise, wenn man Glucose verwendet, eine bevorzugte Konzentration gewöhnlich 40% w/v oder weniger, vorzugsweise 10% w/v oder weniger, TG, hinsichtlich des Wachstums und der Proliferation der Mikroorganismen. Bei den erfindungsgemäß verwendbaren Stickstoffquellen handelt es sich beispielsweise um anorganische Stickstoffverbindungen wie Ammoniumsalze und Nitrate; und organische stickstoffhaltige Verbindungen wie Harnstoff, Maisquellwasser, Casein, Pepton, Hefeextrakt und Fleischextrakt. Die für die Erfindung verwendbaren anorganischen Bestandteile sind beispielsweise Calciumsalze, Magnesiumsalze, Kaliumsalze, Natriumsalze, Phosphate und andere Salze von Mangan, Zink, Eisen, Kupfer, Molybdän und Cobalt.
  • Die erfindungsgemäß angewandten Kulturbedingungen sind die, bei denen die Mikroorganismen wachsen können und das erfindungsgemäße Enzym produzieren, beispielsweise aerobe Bedingungen bei einer Temperatur im Bereich von etwa 4–80°C, vorzugsweise einer Temperatur im Bereich von etwa 20–75°C; und einem pH-Wert im Bereich von etwa 5–9, vorzugsweise einem pH-Wert im Bereich von 6–8,5. Die geeigneterweise bei der Erfindung zur Anwendung gelangende Kultivierungszeit wird auf eine Zeit eingestellt, die länger ist als die für das Einleiten des Wachstums der Mikroorganismen erforderliche Zeit, vorzugsweise 10–100 Stunden. Die Konzentration an gelöstem Sauerstoff (GS) in den Nährkulturmedien unterliegt keinen speziellen Beschränkungen, und gewöhnlich reicht ein GS im Bereich von etwa 0,5–20 ppm aus. Die GS-Konzentration läßt sich innerhalb dieses Bereichs halten, indem man die Belüftungsrate steuert, das Nährkulturmedium rührt, zur Belüftung zusätzlichen Sauerstoff zusetzt und den Innendruck der Fermenter erhöht. Die Kultivierung kann chargenweise oder kontinuierlich erfolgen.
  • Nach dem Ende der Kultivierung wird das Enzym aus der Kultur zurückgewonnen. Wenn sich sowohl in den Zellen als auch in den zellfreien Überständen die Aktivität des erfindungsgemäßen Enzyms findet, so kann man diese gewinnen und als Rohenzym verwenden. Die erhaltene Kultur kann, so wie sie ist, als Rohenzym verwendet werden. Es lassen sich bei der Erfindung zum Abtrennen von Zellen aus der Kultur herkömmliche flüssig-fest-Trennverfahren anwenden. So können geeigneterweise beispielsweise Verfahren zum direkten Zentrifugieren der so erhaltenen Kultur und Verfahren zum Filtrieren von Zellen mit vorbeschichteten Filtern oder zum Filtrieren von Zellen unter Zugabe von Filtrierhilfsmitteln sowie zum Trennen von Zellen durch Membranfiltration mit Plattenflitern oder Hohlfasern angewendet werden. Auf diese Weise erhaltene zellfreie Filtrate können so, wie sie sind, als Enzymlösung verwendet werden, oder vor ihrer Verwendung auf gewöhnliche Weise eingeengt werden. Bei den bei der Erfindung anwendbaren Konzentrationsverfahren handelt es sich beispielsweise um Aussalzen mit Ammoniumsulfat, Sedimentation mit Aceton und Alkohol und Membranfiltration mit Plattenfiltern, Hohlfasern usw.
  • Handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Enzym um ein intrazelluläres Enzym, so läßt sich dieses durch herkömmliche Verfahren aus Zellen extrahieren, und der so erhaltene Extrakt kann als Rohenzym verwendet werden. Um einen solchen Extrakt zu erhalten, werden die Zellen durch Zertrümmerung mit Ultraschall, mechanisches Aufbrechen mit Glasperlen oder Aluminiumoxid, Aufbrechen mit einer French-Presse etc. aufgebrochen, und die so erhaltene Zellzubereitung wird dann einer Zentrifugation oder Membranfiltration unterzogen, wodurch man eine klare Rohenzymlösung erhält.
  • Zellfreie Filtrate und deren Konzentrate sowie Zellextrakte lassen sich durch herkömmliche Verfahren immobilisieren. Beispiele für solche Immobilisierungsverfahren sind Konjugationsverfahren unter Verwendung von Ionenaustauschern, kovalente Bindungen und Absorptionen mit Harzen und Membranen, und Einschlußverfahren mit hochmolekularen Substanzen. Aus der erhaltenen Kultur abgetrennte intakte Zellen können als Rohenzym verwendet oder vor ihrer Verwendung immobilisiert werden. So lassen sich die Zellen beispielsweise immobilisieren, indem man sie mit Natriumalginat mischt und die Suspension in eine Calciumchloridlösung gibt und die Tropfen so zu einem Granulat gelatinisiert. Das so erhaltene Granulat kann dann vor der Verwendung mit Polyethylenimin oder Glutaraldehyd fixiert werden.
  • Die so erhaltenen Rohenzymlösungen können so, wie sie sind, verwendet werden, oder vor ihrer Verwendung durch herkömmliche Methoden auf gereinigt werden. So läßt sich beispielsweise eine aufgereinigte Enzymzubereitung, die bei der Elektrophorese ein einzelnes Band zeigt, herstellen, indem man eine durch Aussalzen eines Extraktes aus aufgebrochenen Zellen mit Ammoniumsulfat und Einengen erhaltene Rohenzymlösung dialysiert und die dialysierte Lösung nacheinander durch Anionenaustauscher-Säulenchromatographie mit "DEAE-TOYOPEARL®", einem Anionenaustauscher; hydrophobe Säulenchromatographie mit "BUTYL-TOYOPEARL®", einem hydrophoben Harz, alle jeweils Produkte der Tosoh Corporation, Tokio, Japan; Anionenaustauscher-Säulenchromatographie mit "MONO Q HR5/5", einem von Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Schweden, im Handel erhältlichen Anionenaustauscher; und Gelfiltrations-Säulenchromatographie mit "TOYOPEARL®HW-55", einem von der Tosoh Corporation, Tokio, Japan, im Handel erhältlichen Harz, aufreinigt. Diese Vorschriften liefern ein Enzym, das bei der Elektrophorese ein einzelnes Band zeigt.
  • Das so erhaltene Maltose-Trehalose-umwandelnde Enzym der vorliegenden Erfindung hat die folgenden physikochemischen Eigenschaften:
    • (1) Wirkung Umwandlung von Maltose in Trehalose und umgekehrt.
    • (2) Molekulargewicht etwa 57000–120000 Dalton bei der Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE);
    • (3) Isoelektrischer Punkt (pI) etwa 3,8–5,1 bei der Isoelektrophorese mit Ampholyt;
    • (4) Inhibierung der Wirkung wird durch 1 mM Cu++-, Hg++- und Tris-HCl-Puffer inhibiert; und
    • (5) Ursprung stammt aus Mikroorganismen.
  • Die physikochemischen Eigenschaften des erfindungsgemäßen Enzyms unterscheiden sich insbesondere in Abhängigkeit davon, woher es stammt, wie unten gezeigt.
  • Ein aus Pimelobacter sp. R48 gewonnenes Maltose-Trehalose-umwandelndes Enzym zeigt die folgenden physikochemischen Eigenschaften:
    • (1) Wirkung Umwandlung von Maltose in Trehalose und umgekehrt. Es wird etwa ein Mol Trehalose aus einem Mol Maltose oder etwa ein Mol Maltose aus einem Mol Trehalose gebildet
    • (2) Molekulargewicht etwa 57000–67000 Dalton bei der Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE);
    • (3) Isoelektrischer Punkt (pI) etwa 4,1–5,1 bei der Isoelektrophorese mit Ampholyt;
    • (4) Inhibierung der Wirkung wird durch 1 mM Cu++-, Hg++- und Tris-HC1-Puffer inhibiert; und
    • (5) Optimale Temperatur etwa 20°C bei 60minütiger Inkubation bei einem pH-Wert von 7,0;
    • (6) Optimaler pH-Wert etwa 7,0–8,0 bei 60minütiger Inkubation bei 25°C;
    • (7) Thermische Stabilität bei 60minütiger Inkubation bei einem pH-Wert von 7,0 stabil bis zu etwa 30°C; und
    • (8) pH-Wert-Stabilität bei 60minütiger Inkubation bei 20°C stabil bei einem pH-Wert von etwa 6,0–9,0.
  • Ein aus Pseudomonas putida H262 gewonnenes Maltose-Trehalose-umwandelndes Enzym zeigt die folgenden physikochemischen Eigenschaften:
    • (1) Wirkung Umwandlung von Maltose in Trehalose und umgekehrt. Es wird etwa ein Mol Trehalose aus einem Mol Maltose oder etwa ein Mol Maltose aus einem Mol Trehalose gebildet
    • (2) Molekulargewicht etwa 110000–120000 Dalton bei SDS-PAGE;
    • (3) Isoelektrischer Punkt (pI) etwa 4,1–5,1 bei der Isoelektrophorese mit Ampholyt;
    • (4) Inhibierung der Wirkung wird durch 1 mM Cu++-, Hg++- und 50 mM Tris-HCl-Puffer inhibiert;
    • (5) Optimale Temperatur etwa 37°C bei 60minütiger Inkubation bei einem pH-Wert von 7,0;
    • (6) Optimaler pH-Wert bei 60minütiger Inkubation bei einem pH-Wert von 7,0 stabil bei einem pH-Wert von 7,3–8,3;
    • (7) Thermische Stabilität bei 60minütiger Inkubation bei einem pH-Wert von 7,0 stabil bis zu etwa 40°C; und
    • (8) pH-Wert-Stabilität bei 60minütiger Inkubation bei 35°C stabil bei einem pH-Wert von etwa 6,0–9,5.
  • Das aus Thermus aquaticus (ATCC 33923) gewonnene Maltose-Trehalose-umwandelnde Enzym zeigt die folgenden physikochemischen Eigenschaften:
    • (1) Wirkung Umwandlung von Maltose in Trehalose und umgekehrt. Es wird etwa ein Mol Trehalose aus einem Mol Maltose oder etwa ein Mol Maltose aus einem Mol Trehalose gebildet
    • (2) Molekulargewicht etwa 100000–110000 Dalton bei SDS-PAGE;
    • (3) Isoelektrischer Punkt (pI) etwa 3,8–4,8 bei der Isoelektrophorese mit Ampholyt;
    • (4) Inhibierung der Wirkung wird durch 1 mM Cu++-, Hg++- und 50 mM Tris-HCl-Puffer inkibiert;
    • (5) Optimale Temperatur etwa 65°C bei 60minütiger Inkubation bei einem pH-Wert von 7,0;
    • (6) Optimaler pH-Wert bei 60minütiger Inkubation bei 60°C stabil bei einem pH-Wert von 6,0–6,7;
    • (7) Thermische Stabilität bei 60minütiger Inkubation bei einem pH-Wert von 7,0 stabil bis zu etwa 80°C; und
    • (8) pH-Wert-Stabilität bei 60minütiger Inkubation bei 60°C stabil bei einem pH-Wert von etwa 5,5–9,5.
  • Die Aktivität des erfindungsgemäßen Maltose-Trehaloseumwandelnden Enzyms wird wie folgt untersucht: ein ml einer Enzymlösung wird zu einem ml 20% w/v Maltose als Substrat in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) gegeben, und die Mischung wird 60 min bei 25°C, 35°C oder 60°C inkubiert, worauf die Lösung 10 min auf 100°C erhitzt wird, um den enzymatischen Ansatz zu suspendieren. Die so erhaltene Reaktionsmischung wird genau 11fach mit 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,5) verdünnt, und 0,4 ml der verdünnten Lösung werden mit 0,1 ml einer Trehalaselösung mit einer Trehalaseeinheit/ml vermischt. Die so erhaltene Lösung wird 120 min bei 45°C inkubiert, und anschließend bestimmt man die Menge an Glucose nach dem Glucose-Oxidase-Verfahren. Als Kontrolle wird die Aktivität der Enzymlösung in ähnlicher Weise wie oben bestimmt, wobei man Trehalase und eine Enzymlösung verwendet, die zum Desaktivieren des Enzyms 10 min auf 100°C erhitzt wurden. Durch den obigen Assay wird der Gehalt an durch das erfindungsgemäße Maltose-Trehalose- umwandelnde Enzym gebildeter Trehalose anhand der Menge an gebildeter Glucose bestimmt, und eine Einheitsaktivität des Enzyms ist definiert als die Menge an Enzym, die pro Minute ein μmol Trehalose bildet. Was die Reaktiontemperatur betrifft, so wird sie für das Enzym eines Mikroorganismus der Gattung Pimelobacter auf 25°C, für das der Gattung Pseudomonas auf 35°C und für das der Gattung Thermus auf 60°C eingestellt.
  • Da das erfindungegemäße Maltose-Trehalose-umwandelnde Enzym Maltose in Trehalose umwandelt und umgekehrt, kann man bei seiner letztendlichen Verwendung als Substrat Maltose oder Trehalose einsetzen. Zur Herstellung von Trehalose verwendet man als Substrat Maltose.
  • Bei der Erfindung kann man eine beliebige Maltose verwenden, solange sie in Trehalose umgewandelt wird, wenn sie der Einwirkung des erfindungsgemäßen Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms ausgesetzt wird, und allgemein eignen sich für eine Verwendung Produkte mit einem hohen Maltosegehalt mit der höchstmöglichen Reinheit, vorzugsweise die mit einer Reinheit von 70% TG oder mehr. Ebenfalls verwendet werden im Handel erhältliche Maltoseprodukte sowie die, die durch herkömmliche Stärkeverzuckerungsverfahren hergestellt werden.
  • Beispiele für die Herstellung von Maltose aus Stärke sind die in den japanischen Patentveröffentlichungen Nr. 11,437/81 und 17,078/81 offenbarten, bei denen man β-Amylase auf gelatinisierte und verflüssigte Stärke einwirken läßt, wobei Maltose gebildet wird, die dann von dem hochmolekularen Dextrin abgetrennt und als ein Produkt mit hohem Maltosegehalt gewonnen wird. Andere Beispiele sind die in den japanischen Patentveröffentlichungen Nr. 13,089/72 und 3,938/79 offenbarten, bei denen man β-Amylase zusammen mit einer Amylo-1,6-glucosidase wie Isoamylase und Pullulanase auf gelatinisierte und verflüssigte Stärke einwirken läßt, wobei Maltose gebildet wird, die dann als ein Produkt mit hohem Maltosegehalt gewonnen wird.
  • Die ebenfalls in den so erhaltenen, nach den oben erwähnten Herstellungsverfahren gewonnenen Produkten mit hohem Maltosegehalt vorhandenen Saccharide wie Maltotriose werden zum Erhöhen des Maltosegehalts mit den in den japanischen Patentveröffentlichungen Nr. 28,153/81, 3,356/82 und 28,154/81 offenbarten Enzymen versetzt. Der Maltosegehalt in den Produkten mit hohem Maltosegehalt läßt sich in zufriedenstellender Weise weiter erhöhen, indem man die ebenfalls vorhandenen Saccharide durch Säulenchromatographie mit einem stark sauren Kationenaustauscherharz entfernt, wie in dem offengelegten japanischen Patent Nr. 23,799/83 offenbart.
  • Die Konzentration der bei der Erfindung verwendeten Substrate unterliegt keinen speziellen Einschränkungen. Die enzymatische Umsetzung der erfindungsgemäßen Enzyme läuft selbst in einer 0,1%igen oder 50%igen Lösung des Materials Maltose ab, was zur Bildung von Trehalose führt. Für die Erfindung können auch Suspensionen, die unlösliche Substrate enthalten, verwendet werden. Die bei der erfindungsgemäßen enzymatischen Reaktion zur Anwendung gelangende Temperatur kann auf eine Temperatur eingestellt werden, bei der das Enzym nicht desaktiviert ist, d.h. auf eine Temperatur von bis zu etwa 80°C, vorzugsweise eine Temperatur im Bereich von etwa 0–70°C. Der bei der erfindungsgemäßen enzymatischen Umsetzung zur Anwendung gelangende Reaktions-pH-Wert wird auf einen pH-Wert im Bereich von etwa 5,5–9,0, vorzugsweise einen pH-Wert im Bereich von etwa 6,0–8,5, eingestellt. Die für die erfindungsgemäße enzymatische Umsetzung angewendete Reaktionszeit wird den Reaktionsbedingungen entsprechend gewählt und liegt gewöhnlich im Bereich von etwa 0,1–100 Stunden, wenn das Enzym in einer Menge von etwa 0,1–100 Einheiten/g Substrat TG eingesetzt wird.
  • Mit der erfindungsgemäßen enzymatischen Umsetzung ist es möglich, Trehalose aus einem Maltosematerial in einer relativ hohen Umwandlungsrate umzuwandeln, d.h. das Maximum beläuft sich auf etwa 70–85%.
  • Die so erhaltene Reaktionsmischung wird zum Entfernen unlöslicher Substanzen auf herkömmliche Weise einer Filtration und Zentrifugation unterzogen und mit Aktivkohle entfärbt, mit Ionenaustauschern in H- und OH-Form entsalzt und zu sirupartigen Produkten eingeengt. Falls erforderlich können die sirupartigen Produkte je nach Gutdünken zu pulverförmigen Produkten getrocknet oder in kristalline Produkte umgewandelt werden.
  • Weiterhin lassen sich die pulverförmigen Produkte leicht zu hochreinen Trehaloseprodukten verarbeiten, indem man sie nach einem oder mehreren Verfahren, beispielsweise Fraktionierung durch Ionenaustauschchromatographie und Säulenchromatographie unter Verwendung einer Aktivkohle oder eines Kieselgels, aufreinigt; und mit Alkali behandelt, um sie zu zersetzen, und die verbliebenen reduzierenden Saccharide entfernt. Für die Umwandlung von Maltose in Trehalose durch das erfindungsgemäße Maltose-Trehalose-umwandelnde Enzym läßt sich als Substrat geeigneterweise durch eine solche Säulenchromatographie abtrennbare Maltose verwenden.
  • Falls erforderlich kann man die vorliegende trehalosehaltige Saccharidzusammensetzung zum Einstellen ihrer Süße, Reduktionskraft und Viskosität mit Glucoamylase und α-Glucosidase hydrolysieren oder einer Saccharidtransferreaktion mit Cyclomaltodextrin-Glucanotransferase und/oder -Glucosyltransferase unterziehen. Weiterhin kann man je nach Gutdünken reduzierende Saccharide in den so erhaltenen Trehaloseprodukten entfernen, indem man sie durch Behandeln mit Alkali zersetzt und sie mit Hefen fermentiert oder zu Zuckeralkoholen hydriert. Ihre Reduktionskraft wird auf diese Weise beseitigt. Aus den so erhaltenen Produkten läßt sich Glucose durch die obigen Aufreinigungsverfahren wie Ionenaustauscherchromatographie abtrennen, was Fraktionen mit hohem Trehalosegehalt liefert. Die auf diese Weise gewonnenen Fraktionen können leicht aufgereinigt und zu sirupartigen Produkten eingeengt werden, und die sirupartigen Produkte können, falls erforderlich, weiter zu übersättigten Lösungen eingeengt und zu wasserhaltiger oder wasserfreier kristalliner Trehalose konzentriert werden.
  • Zu den erfindungsgemäß anwendbaren Ionenaustausch-Säulenchromatographieverfahren zählen beispielsweise die, bei denen man ein stark saures Kationenaustauscherharz einsetzt, wie in den offengelegten japanischen Patenten Nr. 23,799/83 und 72,598/83 offenbart. Durch die Anwendung der Säulenchromatographie lassen sich die ebenfalls in dem rohen Trehaloseprodukt enthaltenen Saccharide leicht entfernen, was Fraktionen mit einem hohen Trehalosegehalt liefert. In diesem Fall kann man je nach Gutdünken eines der Festbett-, Bewegtbett- und Halbbewegtverfahren anwenden.
  • Zur Herstellung von wasserhaltiger kristalliner Trehalose gibt man eine 65–90%ige Trehaloselösung mit einer Reinheit von 60% oder mehr in ein Kristallisationsgerät und kühlt schrittweise ab, wobei in Gegenwart oder Abwesenheit von etwa 0,1–20% Impfkristallen bei einer Temperatur von 95°C oder weniger, vorzugsweise bei einer Temperatur im Bereich von 10–90°C, gerührt wird, wodurch man eine Füllmasse erhält, die wasserhaltige kristalline Trehalose enthält. Je nach Gutdünken kann man kontinuierliche Kristallisationsverfahren anwenden, bei denen man die Kristallisierung der gewünschten Saccharide erreicht, indem man sie im Vakuum einengt. Bei der Erfindung kann man sich herkömmlicher Verfahren wie Abtrennung, Blockpulverisierung, Wirbelschichtgranulation und Sprühtrocknen bedienen, um aus der Füllmasse wasserhaltige kristalline Trehalose oder diese enthaltende kristalline Saccharide herzustellen.
  • Bei der Abtrennung unterzieht man die Füllmassen gewöhnlich einer Zentrifugation in einer Zentrifuge vom Trommeltyp, um die wasserhaltige kristalline Trehalose von der Mutterlauge abzutrennen, und wäscht die so erhaltene wasserhaltige kristalline Trehalose, falls erforderlich, indem man sie mit einer geringen Menge kaltem Wasser besprüht, was die Herstellung von wasserhaltiger kristalliner Trehalose mit einer erhöhten Reinheit erleichtert.
  • Durch Sprühtrocknen lassen sich kristalline Saccharide leicht ohne bzw. im wesentlichen frei von Hygroskopizität herstellen, indem man Füllmassen mit einer Konzentration von etwa 60–85% TG und einer Kristallinität von etwa 20–60% TG mittels einer Hochdruckpumpe aus einer Düse versprüht; das so erhaltene Material mit etwa 60–100°C heißer Luft trocknet, wobei die so erhaltenen kristallinen Pulver nicht schmelzen; und die so erhaltenen Pulver etwa 1–20 Stunden lang altern läßt, wobei mit etwa 30–60°C heißer Luft geblasen wird.
  • Durch die Blockpulverisierung lassen sich kristalline Saccharide leicht ohne bzw. im wesentlichen frei von Hygroskopizität herstellen, indem man Füllmassen mit einem Feuchtigkeitsgehalt von etwa 10–25% und einer Kristallinität von etwa 10–60% TG mehrere Stunden lang bis 3 Tage lang oder so stehenläßt, um den gesamten Inhalt zu Blöcken zu kristallisieren und zu verfestigen, die so erhaltenen Blöcke zu pulverisieren bzw. zu zerschneiden und das so erhaltenen Material zu trocknen.
  • Wenngleich sich wasserfreie kristalline Trehalose herstellen läßt, indem man wasserhaltige kristalline Trehalose zum Umwandeln in ihre wasserfreie Form trocknet, so wird sie im allgemeinen hergestellt, indem mam eine Lösung mit hohem Trehalosegehalt mit einem Feuchtigkeitsgehalt von weniger als 10% bereitstellt, die Lösung in ein Kristallisationsgerät gibt, die Lösung in Gegenwart eines Impfkristalls unter Rühren bei einer Temperatur im Bereich von 50–160°C hält, vorzugsweise bei einer Temperatur im Bereich von 80–140°C, wodurch man eine wasserfreie kristalline Trehalose enthaltende Füllmasse enthält, und die wasserfreie kristalline Trehalose durch herkömmliche Verfahren wie Blockpulverisierung, Wirbelschichtgranulation und Sprühtrocknen unter trockenen Bedingungen bei einer relativ hohen Temperatur kristallisisert und pulverisiert.
  • Die auf diese Weise erhaltene erfindungsgemäße Trehalose ist stabil und hat im wesentlichen kein Reduktionsvermögen, und kann mit anderen Materialien, speziell Aminosäuren und aminosäurehaltigen Substanzen wie Oligopeptiden und Proteinen gemischt und verarbeitet werden, ohne daß man befürchten muß, eine unannehmbare Bräunung und einen unannehmbaren Geruch sowie eine Beeinträchtigung der Materialien herbeizuführen. Trehalose an sich ist von ausreichend hoher Qualität und Süße. Da Trehalose leicht von Trehalase zu Glucosen hydrolysiert wird, wird sie von lebenden Organismen bei oraler Verabreichung leicht als Energiequelle assimiliert, absorbiert und verwendet. Weiterhin wird Trehalose nicht wesentlich durch Zahnkaries verursachende Mikroorganismen fermentiert, und hierdurch ist es als im wesentlichen nicht zahnkariesinduzierender Süßstoff von Nutzen.
  • Bei der erfindungsgemäßen Trehalose handelt es sich um einen stabilen Süßstoff, und kristalline Trehalose wird insbesondere je nach Gutdünken als Zuckerüberzugsmittel für Tabletten verwendet, wobei man sie in Kombination mit einem Bindemittel wie Pullulan, Hydroxyethylstärke oder Polyvinylpyrrolidon einsetzt. Darüber hinaus hat die Trehalose Eigenschaften wie z.B. die Fähigkeit zur Steuerung des osmotischen Drucks, die Fähigkeit, Füllstoffeigenschaften auszuüben, die Fähigkeit, Glanz zu verleihen, die Fähigkeit, Feuchtigkeit zurückzuhalten, die Fähigkeit, Viskosität zu verleihen, im wesentlichen keine Fermentierbarkeit, die Fähigkeit, die Rückumwandlung gelatinisierter Stärke zu verhindern, und die Fähigkeit, die Kristallisation anderer Saccharide zu verhindern.
  • Die erfindungsgemäße Trehalose und die diese enthaltende Saccharidzusammensetzung können somit je nach Gutdünken als Süßstoff, geschmacksverbesserndes Mittel, qualitätsverbesserndes Mittel, Stabilisierungsmittel und Füllstoff in verschiedenen Zusammensetzungen wie Lebensmittelprodukten, Zigaretten, Tabaken, Futtermitteln, Kosmetika und Pharmazeutika eingesetzt werden.
  • Die erfindungsgemäße Trehalose und die Saccharidzusammensetzung können unverändert als Gewürzmittel zum Süßen verwendet werden. Falls erforderlich kann man sie in Kombination mit angemessenen Mengen eines oder mehrerer anderer Süßstoffe, beispielsweise gepulvertem Sirup, Glucose, Maltose, Saccharose, isomerisiertem Zucker, Honig, Ahornsirup, Sorbit, Maltit, Lactit, Dihydrochalcon, Steviosid, α-Glycosylsteviosid, Rebaudiosid, Glycyrrhizin, L-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester, Saccharin, Glycin und Alanin; und/oder einem Füllstoff wie Dextrin, Stärke und Lactose verwenden.
  • Die die erfindungsgemäße Trehalose oder die Saccharidzusammensetzung enthaltende pulverige oder kristalline Produkte können so, wie sie sind, verwendet werden und, falls erforderlich, mit einem Hilfsstoff, Füllstoff, Verdünnungsmittel und Bindemittel gemischt und vor ihrer Verwendung zu Granulat, Kügelchen, Shot-Stäbchen, Platten, Würfeln und Tabletten geformt werden.
  • Die Trehalose mit einer niedrigeren Reduzierkraft enthaltende erfindungsgemäße Saccharidzusammensetzung und davon abgetrennte Trehalose harmonisieren gut mit anderen Materialien mit säuerlichen, sauren, salzigen, bitteren, astringenten und köstlichen Geschmacken, und haben eine relativ hohe Säuretoleranz und Hitzebeständigkeit. Sie können somit vorteilhaft in Nahrungsmittelprodukten eingesetzt werden, im allgemeinen als Süßstoffe, geschmacksverbessernde Mittel und qualitätsverbessernde Mittel.
  • Die erfindungsgemäße Trehalose und die diese enthaltende Saccharidzusammensetzung können in Gewürzmitteln wie Sojasauce, gepulverter Sojasauce, "miso", "funmatsu-miso" (einem gepulverten Miso), "moromi" (einem raffinierten Sake), "hishio" (einer raffinierten Sojasauce), "furikake" (einem gewürzten Fischmehl), Mayonnaise, Salatsauce, Essig, "sanbai-zu" (einer Sauce mit Zucker, Sojasauce und Essig), "funmatsu-sushi-su" (gepulverter Essig für Sushi), "chuka-no-moto" (eine Instantmischung für ein chinesisches Gericht), "tentsuyu" (eine Sauce für frittiertes japanisches Essen), "mentsuyu" (eine Sauce für japanische Vermicelli), Sauce, Ketchup, "takuan-zuke-no-moto" (einer Vormischung für eingelegte Radieschen), "hakusai-zuke-no-moto" (einer Vormischung für frischen eingelegten weißen Raps), "yakiniku-no-tare" (einer Sauce für japanisches gegrilltes Fleisch), Curry Roux, Instant-Eintopfmischung, Instant-Suppenmischung, "dashi-no-moto" (einer Instant-Brühmischung), Gewürz mischungen, "mirin" (einem süßen Sake), "shin-mirin" (einem synthetischen Mirin), Tafelzucker und Zucker für Kaffee.
  • Die erfindungsgemäße Trehalose und die diese enthaltende Saccharidzusammensetzung können auch nach Belieben zum Süßen von "wagashi" (japanischen Keksen) wie "senbei" (einem Reiskeks), "arare-mochi" (einem Reiskekswürfel), "okoshi" (einem Keks aus Hirse und Reis), "mochi" (einer Reispaste), "manju" (einem süßen Gebäck mit Bohnenkonfitüre), "uiro" (einem süßen Reisgelee), "an" (einer Bohnenkonfitüre), "yokan" (einem süßen Bohnengelee), "mizu-yokan" (einem weichen Gelee aus Adzuki-Bohnen), "kingyoku" (einer Art Yokan), Gelee, Pao de Castella und "amedama" (einem japanischen Toffee); Süßspeisen wie süßem Gebäck; Biskuit, Keksen, Plätzchen, Kuchen, Pudding, Buttercreme, Eierkrem, Windbeutel, Waffeln, Biskuitkuchen, Berlinern, Schokolade, Kaugummi, Caramel und Konfekt; gefrorene Nachspeisen wie Eiscreme und Sorbet; Sirupe wie "kajitsu-no-sirup-zuke" (einer eingelegten Frucht) und "korimitsu" (einem Zuckersirup für sehr fein zerkleinertes Eis ("shaved ice")); Pasten wie Mehlpaste, Erdnußpaste, Fruchtpaste und Aufstrich; verarbeiteten Früchten und Gemüse wie Konfitüre, Marmelade, "sirup-zuke" (eingelegte Früchte) und "toka" (Eingemachtes); Beizen zum EInlegen und eingelegte Produkte wie "fukujin-zuke" (eingelegte rotgefärbte Radieschen), "bettara-zuke" (eine Art eingelegte ganze frische Radieschen), "senmai-zuke" (eine Art eingelegte, in Scheiben geschnittene frische Radieschen) und "rakkyo-zuke" (eingelegte Schalotten); Fleischprodukte wie Schinken und Wurst; Fischfleischprodukte wie Fischschinken, Fischwurst, "kamaboko" (eine gedämpfte Fischpaste), "chikuwa" (eine Art Fischpaste) und "tenpura" (eine japanische frittierte Fischpaste); "chinmi" (Relish) wie "uni-no-shiokara" (gesalzene Seegurkeneingeweide), "ika-no-shiokara" (gesalzene Tin tenfischeingeweide), "su-konbu" (verarbeiteter Seetang), "saki-surume" (getrocknete Tintenfischstreifen) und "fugu-no-mirin-boshi" (ein getrockneter, mit Mirin gewürzter Pufferfisch); "tsukudani" (in Sojasauce eingeengte Nahrungsmittel) wie Seealgen, eßbare wilde Pflanzen, getrockneter Tintenfisch, Fisch und Schalentiere; Tagesgerichte wie "nimame" (gekochte Bohnen), Kartoffelsalat und "konbu-maki" (ein Seetangbrötchen); Milchprodukte wie Milchgetränke, Joghurt und Käse; in Dosen und Flaschen abgefüllte Produkte wie Fleischprodukte, Fischfleischprodukte, Früchteprodukte und Gemüseprodukte; alkoholische Getränke wie synthetischer Sake, Wein und hochprozentige Alkoholika; alkoholfreie Getränke wie Kaffee, Tee, Kakao, Saft, kohlensäurehaltige Getränke, Sauermilchgetränke und Getränke, die ein Milchsäurebakterium enthalten; Instant-Nahrungsmittelprodukte wie Instant-Puddingmischung, Instant-Kuchenmischung und "sokuseki-shiruco" (eine Instantmischung aus Adzuki-Bohnensuppe mit Reiskeks) und Instant-Suppenmischung; und Getränke wie Babynahrung, therapeutische Nahrung und mit Nährstoffen angereicherte Getränke; sowie zur Verbesserung des Geschmacks und der Qualität der oben erwähnten Lebensmittel.
  • Die erfindungsgemäße Trehalose und die diese enthaltende Saccharidzusammensetzung können auch in Futter und Tierfutter für Tiere wie Haustiere, Geflügel, Honigbienen, Seidenraupen und Fischen zur Verbesserung der Geschmacksvorlieben davon zur Anwendung gelangen. Die erfindungsgemäße Trehalose und Saccharidzusammensetzung kann je nach Gutdünken als Süßstoff, als Mittel zur Geschmacksverbesserung, als Mittel zur Verbesserung der Qualität und als Stabilisator in anderen Produkten in pastöser und flüssiger Form wie Tabak, Zigarette, Zahnputzmittel, Lippenstift, Rouge, Lippenbalsam, Medizin zur Einnahme, Tablette, Troche, Lebertran in Form eines Tropfens, Cachou, oraler Kühltrank, Gurgellösung, Kosmetikum und Pharmazeutikum verwendet werden.
  • Die erfindungsgemäße Trehalose und die diese enthaltende Saccharidzusammensetzung können als qualitätsverbesserndes Mittel und Stabilisator für gegenüber einem Verlust ihrer Wirkstoffe und Wirksamkeit empfindliche biologisch wirksame Substanzen, sowie in Gesundheitsnahrungsmitteln und pharmazeutischen Zusammensetzungen, die biologisch wirksame Substanzen enthalten, eingesetzt werden. Beispiele für solche biologisch wirksamen Substanzen sind Lymphokine wie α-, β- und γ-Interferone, Tumornekrosefaktor-α (TNF-α), Tumornekrosefaktor-β (TNF-β), Macrophage Migration Inhibitory Factor, der koloniestimulierende Faktor, der Transferfaktor und Interleukin 2 (IL-2); Hormone wie Insulin, Wachstumshormon, Prolactin, Erythropoietin, follikelstimulierendes Hormon und Plazentahormon; biologische Zubereitungen wie BCG-Impfstoff, Impfstoff gegen japanische Enzephalitis, Masern-Impfstoff, Polio-Lebendimpfstoff, Pocken-Impfstoff, Tetanustoxoid, Trimeresurus-Antitoxin und humanes Immunoglobulin; Antibiotika wie Penicillin, Erythromycin, Chloramphenicol, Tetracyclin, Streptomycin und Kanamycinsulfat; Vitamine wie Thiamin, Riboflavin, L-Ascorbinsäure, Lebertran, Carotenoid, Ergosterol und Tocopherol; Enzyme wie Lipase, Elastase, Urokinase, Protease, β-Amylase, Isoamylase, Glucanase und Lactase; Extrakte wie Ginseng-Extrakt, Schnappschildkröten-Extrakt, Chlorella-Extrakt, Aloe-Extrakt und Propolis-Extrakt; lebensfähige Mikroorganismen wie Viren, Milchsäurebakterien und Hefen; und andere biologisch wirksame Substanzen wie Gelee Royal. Mit der erfindungsgemäßen Trehalose und der diese enthaltenden Saccharidzusammensetzung lassen sich die oben erwähnten biologisch wirksamen Substanzen leicht zu Gesundheitsnahrungsmitteln und pharmazeutischen Zusammensetzungen mit einer zufriedenstellend hohen Stabilität und Qualität verarbeiten, ohne daß man einen Verlust bzw. eine Desaktivierung ihrer Wirkungen und Wirkstoffe befürchten muß.
  • Wie oben beschrieben zählen zu den zum Einarbeiten der erfindungsgemäßen Trehalose und der diese enthaltenden Saccharidzusammensetzung in die oben erwähnten Substanzen und Zusammensetzungen angewandten Verfahren herkömmliche Verfahren, beispielsweise Mischen, Kneten, Lösen, Schmelzen, Einweichen, Durchdringen, Besprenkeln, Aufbringen, Beschichten, Besprühen, Injizieren, Kristallisieren und Verfestigen. Die Trehalose und die Saccharidzusammensetzung werden in die oben erwähnten Substanzen und Zusammensetzungen gewöhnlich in einer Menge von 0,1% oder mehr, vorzugsweise 1% oder mehr, TG, eingearbeitet.
  • Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Experimente ausführlicher erläutert:
  • Experiment 1
  • Enzymherstellung
  • 100-ml-Aliquots eines flüssigen Nährkulturmediums bestehend aus 2,0% (w/v) Glucose, 0,5% (w/v) Polypepton, 0,1% (w/v) Hefeextrakt, 0,06% (w/v) Dinatriumhydrogenphosphat, 0,1% (w/v) Kaliumhydrogenphosphat, 0,05% (w/v) Magnesiumsulfat-heptahydrat, 0,5% (w/v) Calciumcarbonat und Wasser, wurden in 500-ml-Erlenmeyerkolben gegeben, zum Sterilisieren 30 min bei 115°C autoklaviert, abgekühlt und mit einer Impfkultur von Pimelobacter sp. R48 (FERM BP-4315) inokuliert, worauf unter Rühren bei 200 U/min 24 Stunden lang bei 27°C kultiviert wurde. Die so erhaltenen Kulturen wurden gepoolt und als Impfkultur verwendet.
  • Ein etwa 20-l-Aliquot einer frischen Zubereitung des gleichen flüssigen Nährkulturmediums, das in der obigen Kultur verwendet worden war, wurde in einen 30-l-Fermenter gegeben, sterilisiert, auf 27°C abgekühlt und mit 1 Volumen-% der Impfkultur inokuliert, worauf unter Rühren und aeroben Bedingungen etwa 40 Stunden lang bei 27°C und einem pH-Wert von 6,0–8,0 inkubiert wurde.
  • Die Aktivität des in der so erhaltenen Kultur angereicherten Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms betrug 0,55 Einheiten/ml. Ein Teil der Kultur wurde durch Zentrifugation in Zellen und einen Überstand getrennt, und die Zellen wurden in 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert, so daß man das gleiche Volumen wie bei der Portion erhielt, worauf die Enzymaktivität in der Zellsuspension und dem Überstand als 0,5 Einheiten/ml bzw. 0,05 Einheiten/ml bestimmt wurde. Bei der Enzymaktivität handelte es sich um den bei 25°C bestimmten Wert.
  • Experiment 2
  • Enzymaufreinigung
  • Die in Experiment 1 erhaltene Kultur wurde zentrifugiert, wodurch man etwa 0,5 kg nasse Zellen erhielt, die dann in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert wurden. Die Zellsuspension wurde einer Behandlung in einer "VIBROGEN-ZELLMÜHLE", einem im Handel von Edmund Bühler, Tübingen, Deutschland, erhältlichen Gerät zum Aufbrechen von Zellen, unterzogen, und die so erhaltene Mischung wurde 30 min bei 15000 × g zentrifugiert, wodurch man etwa 4,5 l Überstand erhielt. Ammoniumsulfat wurde zum Überstand gegeben und darin so gelöst, daß man einen Sättigungsgrad von 0,3 erhielt, und die Lösung wurde 4 Stunden lang bei 4°C stehengelassen und zentrifugiert, was einen Überstand lieferte.
  • Weiteres Ammoniumsulfat wurde zu dem so erhaltenen Überstand gegeben und darin so gelöst, daß man einen Sättigungsgrad von 0,8 erhielt, und die Lösung wurde über Nacht bei 4°C stehengelassen und zentrifugiert, was ein Sediment lieferte.
  • Das Sediment wurde in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) gelöst, 24 Stunden lang gegen eine frische Zubereitung des gleichen Puffers dialysiert und zum Entfernen unlöslicher Substanzen zentrifugiert. 400 ml der so erhaltenen dialysierten Lösung wurden in 2 Portionen geteilt, die dann getrennt einer Säulenchromatographie mit einer mit 300 ml "DEAE-TOYOPEARL®GEL", einem im Handel von Tosoh Corporation, Tokio, Japan, erhältlichen Ionenaustauscher, gepackten Säule unterzogen wurden.
  • Das auf dem Ionenaustauscher adsorbierte erfindungsgemäße Maltose-Trehalose-umwandelnde Enzym wurde mit einer frischen Zubereitung des gleichen Puffers, der Salz zugesetzt worden war, von der Säule eluiert. Die von der Säule eluierten Fraktionen mit Enzymaktivität wurden zurückgewonnen, gepoolt und gegen eine frische Zubereitung des gleichen Puffers, der 1 M Ammoniumsulfat zugesetzt worden war, dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde zum Entfernen unlöslicher Substanzen zentrifugiert und einer hydrophoben Säulenchromatographie mit einer mit 300 ml "BUTYL-TOYOPEARL®650 GEL", einem von Tosoh Corporation, Tokio, Japan, im Handel erhältlichen hydrophoben Gel, gepackten Säule unterzogen. Das an dem Gel adsorbierte Maltose-Trehalose-umwandelnde Enzym wurde mit einem linearen Puffergradienten von 1 M bis 0 M Ammoniumsulfat von der Säule eluiert, worauf die Fraktionen mit Enzymaktivität zurückgewonnen wurden.
  • Die Fraktionen wurden gepoolt und einer Ionenaustauscher-Säulenchromatographie mit einer mit 10 ml "MONO Q HR5/5", einem im Handel von Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Schweden, erhältlichen Gel, gepackten Säule unterzogen, worauf die Fraktionen mit Enzymaktivität zurückgewonnen wurden. Die Gesamtaktivität, spezifische Aktivität und Ausbeute in den einzelnen Aufreinigungsschritten sind in Tabelle 1 aufgelistet.
  • Figure 00360001
  • Anmerkung: Das Symbol "*" kennzeichnet das erfindungsgemäße Maltose-Trehalose-umwandelnde Enzym.
  • Die nach der obigen Aufreinigungsvorschrift erhaltene aufgereinigte Enzymzubereitung wurde einer Elektrophorese mit einem 7,5%igen Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel unterzogen, was eine einzelne Proteinbande lieferte; dies bedeutete, daß es sich um eine Zubereitung mit einer beträchtlich hohen Reinheit handelte.
  • Experiment 3
  • Enzymeigenschaften
  • Ein Teil der nach dem Verfahren in Experiment 2 erhaltenen, aufgereinigten Zubereitung des Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms wurde einer Elektrophorese mit einem 10%igen Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel unterzogen. Das Molekulargewicht wurde durch Vergleich mit im Handel von Japan Bio-Rad Laboratories, Tokio, Japan, erhältlichen Markerproteinen, die gleichzeitig einer Elektrophorese unterzogen wurden, als etwa 57000–67000 Daltons bestimmt.
  • Eine weitere Portion der aufgereinigten Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzymzubereitung wurde einer Isoelektrophorese mit einem Polyacrylamidgel mit 2 Vol.-% "AMPHOLINE", ein im Handel von Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Schweden erhältliches Ampholyt, unterzogen. Das so erhaltene Gel wurde in Stücke geschnitten, deren pH-Werte dann bestimmt wurden, wodurch festgestellt wurde, daß der pI des Enzyms etwa 4,1–5,1 betrug.
  • Die Auswirkungen von Temperatur und pH-Wert auf die Aktivität des erfindungsgemäßen Enzyms wurden nach dem für die Bestimmung der Enzymaktivität angewendeten Verfahren untersucht. Die jeweiligen Ergebnisse sind in in 1 (Auswirkung der Temperatur) und 2 (Auswirkung des pH-Wertes) gezeigt. Die für das Enzym optimale Temperatur betrug bei einer 60minütigen Inkubation bei einem pH-Wert von 7,0 etwa 20°C, und der optimale pH-Wert betrug bei einer 60minütigen Inkubation bei 25°C etwa 7,0–8,0. Die thermische Stabilität des Enzyms wurde bestimmt, indem man es bei verschiedenen Temperaturen 60 min in 50 mM Phosphatpuffern (pH 7,0) in Reagenzgläsern inkubierte, die Reagenzgläser mit kaltem Wasser abkühlte und die in dem jeweiligen Puffer verbliebene Enzymaktivität bestimmte. Die pH-Wert-Stabilität des Enzyms wurde bestimmt, indem man es bei 20°C 60 min in 50 mM Phosphatpuffern mit verschiedenen pH-Werten inkubierte, die Puffer auf einen pH-Wert von 7,0 einstellte und die in dem jeweiligen Puffer verbliebene Enzymaktivität bestimmte. Die Ergebnisse der termischen und pH-Wert-Stabilitäten des Enzyms sind in 3 beziehungsweise 4 gezeigt. Das Enzym war stabil bis zu einer Temperatur von etwa 30°C und stabil bei einem pH-Wert von etwa 6,0–9,0. 1 mM Cu++ oder Hg++ und 50 mM Tris-HCl-Puffer hemmten das Enzym.
  • Experiment 4
  • Wirkung auf Saccharide
  • Verschiedene Saccharide wurden getestet, um zu bestimmen, ob sie sich als Substrat für das erfindungsgemäße Enzym eignen. Glucose, Maltose, Maltotriose, Maltotetraose, Maltopentaose, Maltohexaose, Maltoheptaose, lösliche Stärke, Amylose mit einem durchschnittlichen Polymerisationsgrad von 18, Trehalose, Neotrehalose, Gentiobiose, Kojibiose, Isomaltose, Cellobiose, Maltit, Saccharode, Maltulose, Turanose, Paratinose, Trehalulose oder Lactose wurde als Lösung zubereitet. Eine Lösung mit Glucose und der gleichen Menge an α-Glucose-1-phosphat oder β-Glucose-1-phosphat wurde hergestellt.
  • Die Lösungen wurden jeweils mit 2 Einheiten/g Substrat, TG, des nach dem Verfahren in Experimnet 2 erhaltenen Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms gemischt, ihre Substratkonzentrationen wurden auf 5% (w/v) eingestellt und sie wurde einer 24stündigen enzymatischen Reaktion bei 20°C und einem pH-Wert von 7,0 unterzogen. Vor und nach ihren enzymatischen Reaktionen wurden die Lösungen einer Dünnschichtchromatographie (DC) mit "KIESELGEL 60 (20 × 20 cm)", einer im Handel von Merck & Co., Inc., Rahway, USA, erhältlichen Aluminiumplatte für die DC, unterzogen, um zu bestimmen, ob das erfindungsgemäße Enzym auf die Saccharide wirkt. Die so erhaltenen Produkte wurden einmal auf den Platten entwickelt, wobei für die Entwicklung ein Lösungsmittelsystem aus 1-Butanol, Pyridin und Wasser (= 6:4:1 (v/v/v)) verwendet wurde. Die Produkte auf dem Platten wurden angefärbt, indem man sie mit einer 20%igen (v/v) Schwefelsäure in Methanol besprühte und die Platten 10 min auf 110°C erhitzte. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
  • Tabelle 2
    Figure 00400001
  • Figure 00400002
  • Anmerkung: In der Tabelle bedeutet das Symbol "–", daß vor und nach der Enzymreaktion keine Änderung beobachtet wurde; das Symbol "+" bedeutet, daß die Größe das Substratflecks aufgrund der Bildung anderer Produkte leicht reduziert war; und das Symbol "++" bedeutet, daß die Größe das Substratflecks aufgrund der Bildung anderer Produkte beträchtlich reduziert war.
  • Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 2 ersichtlich ist, zeigte sich, daß das erfindungsgemäße Enzym unter anderen Sacchariden nur auf Maltose und Trehalose wirkt und insbesondere nicht auf die beiden Glucose und α-Glucose-1-phosphat oder β-Glucose-1-phosphat Systeme wirkt. Aus diesen Ergebnissen läßt sich schlußfolgern, daß es sich bei dem erfindungsgemäßen Enzym um ein neuartiges Enzym handelt, das sich von herkömmlichen Maltose- und Trehalosephosphorylasen unterscheidet.
  • Experiment 5
  • Produkte aus Maltose oder Trehalose
  • Eine wäßrige Maltoselösung wurde mit 2 Einheiten/g Maltose als Substrat, TG, des nach dem Verfahren in Experiment 2 erhaltenen Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms so versetzt, daß sich eine Endsubstratkonzentration von 5% (w/v) ergab, und die so erhaltene Lösung wurde einer 24stündigen enzymatischen Umsetzung bei 20°C und einem pH-Wert von 7,0 unterzogen. Die Saccharidzusammensetzung der so erhaltenen Reaktionsmischung wurde gaschromatographisch (im folgenden als "GLC" abgekürzt) untersucht. Ein Teil der Reaktionsmischung wurde getrocknet, in Pyridin gelöst und trimethylsilyliert, wodurch man ein Produkt, eine Probe für die Analyse, erhielt. Bei dem für die GLC-Analyse verwendeten Gerät und den Bedingungen handelte es sich um "CG-16A", einen von Shimadzu Corporation, Tokio, Japan, im Handel erhältlichen Gaschromatographen; eine Säule aus rostfreiem Stahl mit einem Durchmesser von 3 mm und einer Länge von 2 m, gepackt mit 2% "SILICONE OV-17/CHROMOSORB W", im Handel erhältlich von GL Sciences Inc., Tokio, Japan; einer Fließgeschwindigkeit von 40 ml/min Stickstoffgas als Trägergas; und einem Temperaturanstiegsverhältnis von 7,5°C/min im Bereich von 160°C bis 320°C, in einem Ofen. Die Saccharidzusammensetzung wurde mit einem Wasserstoffflammenionisationsdetektor analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
  • Tabelle 3
    Figure 00410001
  • Anmerkung: Der Wert des Symbols "*" stimmt mit dem von Trehalose überein.
  • Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 3 hervorgeht, zeigte sich, daß das Produkt "X" in Mengen gebildet wird und daß die Retentionszeit mit der von im Handel erhältlicher Trehalose übereinstimmte. Zur Identifizierung des Produkts "X" wurde der folgende Test zur Bestätigung durchgeführt. Eine frische Zubereitung der gleichen wäßrigen Maltoselösung wie der oben verwendeten wurde mit 20 mM Acetatpuffer (pH 4,5) auf eine Maltosekonzentration von 2% (w/v) verdünnt, und 0,5 ml davon wurden mit 0,1 Einheiten einer im Handel von Seikagaku-Kogyo Co., Ltd., Tokio, Japan, erhältlichen Glucoamylaseprobe versetzt, worauf die Mischung einer 20stün digen enzymatischen Umsetzung bei 40°C unterzogen wurde.
  • In ähnlicher Weise wurde einer frische Zubereitung der gleichen wäßrigen Maltoselösung wie der oben verwendeten mit 20 mM Acetatpuffer (pH 7,0) auf eine Maltosekonzentration von 2% (w/v) verdünnt, und 0,5 ml davon wurden mit 0,5 Einheiten Trehalase versetzt, worauf die Mischung einer 20stündigen enzymatischen Umsetzung bei 40°C unterzogen wurde. Die intakte wäßrige Maltoselösung und die mit Glucoamylase und Trehalase behandelten wäßrigen Maltoselösungen wurden durch GLC analysiert, worauf eine Untersuchung der Daten zeigte, daß die Maltose durch Glucoamylase vollständig zu Glucosen abgebaut worden war, das Produkt "X" jedoch unversehrt geblieben war.
  • Bei der Behandlung mit Trehalase verblieb Maltose unversehrt, das Produkt "X" wurde jedoch vollständig zu Glucosen abgebaut. Angesichts der Reaktionsmechanismen von Glucoamylase und Trehalase wurde schlußgefolgert, daß das erfindungsgemäße Enzym aus Maltose ein Oligosaccharid, d.h. Trehalose, bildet.
  • Das aufgereinigte Enzym gemäß der vorliegenden Erfindung wurde unter den gleichen Bedingungen wie im Fall von Maltose auf Trehalose als Substrat einwirken gelassen, und die so erhaltene Reaktionsmischung wurde durch GLC analysiert. Die Daten bestätigten, daß das erfindungsgemäße Enzym Maltose aus Trehalose bildet. Die Ergebnisse waren wie in Tabelle 4 gezeigt.
  • Tabelle 4
    Figure 00420001
  • Figure 00430001
  • Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 4 hervorgeht, wandelt das erfindungsgemäße Enzym Maltose in Trehalose um und umgekehrt. Es zeigte sich, daß die Lage des Gleichgewichts der Umwandlungsreaktion zur Bildung von Trehalose neigt, d.h. die Umwandlungsrate von Maltose in Trehalose betrug etwa 70% oder mehr, was über der von Trehalose in Maltose lag.
  • Experiment 6
  • Einfluß der Maltosekonzentration auf die Trehalosebildung
  • Eine Lösung, die 2, 5, 5, 10, 20 oder 40% (w/v) Maltose enthielt, wurde mit 2 Einheiten/g Maltose, TG, des nach dem Verfahren in Experiment 2 erhaltenen aufgereinigten Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms gemischt und enzymatisch bei 20°C und einem pH-Wert von 7,0 umgesetzt. Während der enzymatischen Umsetzung wurden Proben der Reaktionsmischung entnommen und zum Desaktivieren des Enzyms 10 min auf 100°C erhitzt.
  • Der Gesamtzuckergehalt der Reaktionsmischung wurde nach dem Anthron-Schwefelsäure-Verfahren bestimmt. Der Gehalt an reduzierenden Zuckern wurde nach Somogyi-Nelson-Verfahren als Glucose quantifiziert, und die Reduk tionskraft wurde als Verhältnis des Gehalts an reduzierenden Zuckern zum Gesamtzuckergehalt bestimmt.
  • Die Probe wurde auf eine Saccharidkonzentration von etwa 1% (w/v) verdünnt und dann zum Entfernen von Protein mit "MOL-CUT II LGC", Japan Millipore Ltd., Tokio, Japan, behandelt und durch Hochleistungsflüssigchromatographie (im folgenden als "HPLC" abgekürzt) auf seine Saccharidzusammensetzung analysiert. Bei dem für die Analyse verwendeten Gerät und den Bedingungen handelte es sich um das "CCPD SYSTEM", ein von Tosoh Corporation, Tokio, Japan, im Handel erhältliches HPLC-Gerät; "YMC-PACK PA-03", eine Säule mit einem Durchmesser von 4,6 mm und einer Länge von 250 mm, im Handel erhältlich von YMC Co., Ltd., Tokio, Japan; einem Laufmittelsystem aus Acetonitril und Wasser (= 78:22 (v/v)); einer Fließgeschwindigkeit von 1,2 ml/min; und einem Differentialrefraktometer als Detektor. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt.
  • Tabelle 5
    Figure 00440001
  • Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 5 hervorgeht, verlief die Umwandlung von Maltose in Trehalose unabhängig von der Maltosekonzentration glatt mit einer Umwandlungsrate von etwa 80%.
  • Experiment 7
  • Einfluß der Temperatur auf die Trehalosebildung
  • Eine 20%ige (w/v) Maltoselösung wurde mit 2 Einheiten/g Maltose, TG, an aufgereinigtem, durch das Verfahren von Experiment 2 erhaltenem Maltose-Trehalose-umwandelndem Enzym versetzt und bei 5, 10, 15, 20 oder 25°C einer enzymatischen Umwandlung unterzogen. Während der enzymatischen Reaktion wurden zu vorgegebenen Zeitpunkten Proben aus der Reaktionsmischung entnommen, und die Proben wurden zum Desaktivieren des Enzyms 10 min auf 100°C erhitzt. Ähnlich wie in Experiment 6 wurde die Saccharidzusammensetzung der Probe durch HPLC analysiert. Der Trehalosegehalt in den Proben, die bei verschiedenen Temperaturen und zu verschiedenen Reaktionszeiten entnommen worden waren, waren wie in Tabelle 6 gezeigt.
  • Tabelle 6
    Figure 00450001
  • Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 6 hervorgeht, neigt die Trehalosebildungsrate dazu, mit zunehmender Reaktionstemperatur zuzunehmen, und die Umwandlung von Maltose in Trehalose verläuft selbst bei 5°C glatt, mit einer Trehaloseumwandlungsrate von etwa 82%.
  • Experiment 8
  • Herstellung von Trehalose aus Maltose
  • 10 Gewichtsteile von im Handel von Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan, erhältlicher Maltose wurden in 40 Gewichtsteilen Wasser gelöst, und die Lösung wurde mit 2 Einheiten/g Maltose, TG, des nach dem Verfahren in Experiment 2 erhaltenen, aufgereinigten Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms gemischt und einer 48stündigen enzymatischen Umsetzung bei 15°C und einem pH-Wert von 7,0 unterzogen, worauf die so erhaltene Reaktionsmischung zum Desaktivieren des verbliebenen Enzyms 10 min auf 100°C erhitzt wurde. Die Reaktionsmischung, die etwa 74% Trehalose, TG, enthielt, wurde mit Aktivkohle entfärbt, mit Ionenaustauscher in H- und oH-Form entsalzt, zu einer etwa 78%igen (w/v) Lösung eingeengt, die dann mit 0,1% kristalliner Trehalose als Impfkristall, TG, gemischt wurde, worauf die Mischung zum Kristallisieren über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen wurde. Die so erhaltene Füllmasse wurde dann als Kristalle abgetrennt, die dann mit wenig Wasser besprüht und gewaschen wurden, worauf etwa 3,0 Gew.-Teile hochreiner kristalliner Trehalose mit einer Reinheit von etwa 99.8 TG zurückgewonnen wurden.
  • Experiment 9
  • Enzymherstellung
  • 100-ml-Aliquots eines flüssigen Nährkulturmediums bestehend aus 2,0% (w/v) Glucose, 1,0% (w/v) Ammoniumsulfat, 0,1% (w/v) Dikaliumhydrogenphosphat, 0,06% (w/v) Natriumdihydrogenphosphat, 0,05% (w/v) Magnesiumsulfat, 0,3% (w/v) Calciumcarbonat und Wasser, wurden in 500-ml-Erlenmeyerkolben gegeben, zum Sterilisieren 30 min bei 115°C autoklaviert, abgekühlt und mit einer Impfkultur von Pseudomonas putida (FERM BP-4579) inokuliert, worauf unter Rühren bei 200 U/min 24 Stunden lang bei 27°C kultiviert wurde. Die so erhaltenen Kulturen wurden gepoolt und als Impfkultur verwendet.
  • Ein etwa 20-l-Aliquot einer frischen Zubereitung des gleichen flüssigen Nährkulturmediums, das in der obigen Kultur verwendet worden war, wurde in einen 30-l-Fermenter gegeben, sterilisiert, auf 27°C abgekühlt und mit 1 Volumen-% der Impfkultur inokuliert, worauf unter Rühren und aeroben Bedingungen etwa 20 Stunden lang bei 27°C und einem pH-Wert von 6,5–8,0 inkubiert wurde.
  • Die Aktivität des in der so erhaltenen Kultur angereicherten Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms betrug 0,12 Einheiten/ml. Ein Teil der Kultur wurde durch Zentrifugation in Zellen und einen Überstand getrennt, und die Zellen wurden in 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert, so daß man das gleiche Volumen wie bei der Portion erhielt, worauf die Enzymaktivität in der Zellsuspension und dem Überstand als 0,11 Einheiten/ml bzw. 0,01 Einheiten/ml bestimmt wurde. Bei der Enzymaktivität handelte es sich um den bei 35°C bestimmten Wert.
  • Experiment 10
  • Enzymaufreinigung
  • Die in Experiment 9 erhaltene Kultur wurde zentrifugiert, wodurch man etwa 0,45 kg nasse Zellen erhielt, die dann in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert wurden. Etwa 2 l der so erhaltenen Zellsuspension wurden mit "MINI-RABO", einem im Handel von Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., Tokio, Japan, erhältlichen Apparat zum Aufbrechen von Zellen unter hohem Druck, behandelt, um die Zellen aufzubrechen, und die so erhaltene Mischung wurde 30 min bei 15000 × g zentrifugiert, was etwa 1,7 l Überstand lieferte. Ammoniumsulfat wurde zum Überstand gegeben und darin so gelöst, daß man einen Sättigungsgrad von 0,7 erhielt, und die Lösung wurde 4 Stunden lang bei 4°C stehengelassen und zentrifugiert, was ein Sediment lieferte.
  • Das Sediment wurde in 10 mM Phosphatbuffer (pH 7,0) gelöst, und die Lösung 24 wurde Stunden lang gegen eine frische Zubereitung des gleichen Puffers dialysiert und zum Entfernen unlöslicher Substanzen zentrifugiert. 400 ml der dialysierten Lösung wurden in 2 Portionen geteilt, die dann jeweils einer Ionenaustauschersäulenchromatographie mit einer mit 300 ml "DEAE-TOYOPEARL®GEL", einem im Handel von Tosoh Corporation, Tokio, Japan, erhältlichen Gel, gepackten Säule unterzogen wurden.
  • Das erfindungsgemäße Maltose-Trehalose-umwandelnde Enzym adsorbierte an dem Gel und wurde davon mit einer frischen Zubereitung des gleichen Puffers, der Salz zugesetzt worden war, eluiert. Die Fraktionen mit Enzymaktivität wurden zurückgewonnen und einer Ionenaustauschersäulenchchromatographie unter Verwendung einer mit 80 ml "DEAE-TOYOPEARL®GEL" gepackten Säule unterzogen. Das an dem Gel adsorbierte Maltose-Trehalose-umwandelnde Enzym wurde mit einem linearen Salzgradienten von 0,1 M bis 0,3 M davon eluiert, worauf die Fraktionen mit Enzymaktivität zurückgewonnen wurden.
  • Die Fraktionen wurden gepoolt und einer Gelfiltrationssäulenchromatographie mit einer mit 400 ml "TOYO-PEARL HW-55S", einem im Handel von Tosoh Corporation, Tokio, Japan, erhältlichen Gel, gepackten Säule unterzogen, worauf die eluierten Fraktionen mit Enzymaktivität zurückgewonnen wurden. Die Gesamtaktivität, spezifische Aktivität und Ausbeute in den einzelnen Aufreinigungsschritten sind in Tabelle 7 aufgelistet.
  • Figure 00490001
  • Anmerkung: Das Symbol "*" kennzeichnet das erfindungsgemäße Maltose-Trehalose-umwandelnde Enzym.
  • Die aufgereinigte Enzymzubereitung wurde einer Elektrophorese mit einem 7,5%igen (w/v) Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel unterzogen, was eine einzelne Proteinbande lieferte; dies bedeutete, daß es sich um eine Zubereitung mit einer relativ hohen Reinheit handelte.
  • Experiment 11
  • Enzymeigenschaften
  • Ein Teil der nach dem Verfahren in Experiment 10 erhaltenen, aufgereinigten Zubereitung des Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms wurde einer Elektrophorese mit einem 7,5%igen (w/v) Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel unterzogen, wobei das Molekulargewicht durch Vergleich mit im Handel von Japan Bio-Rad Laboratories, Tokio, Japan, erhältlichen Markerproteinen, die gleichzeitig einer Elektrophorese unterzogen wurden, als etwa 110000–120000 Daltons bestimmt wurde.
  • Eine weitere Portion der aufgereinigten Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzymzubereitung wurde einer Isoelektrophorese mit einem Polyacrylamidgel mit 2 Vol.-% "AMPHOLINE", ein im Handel von Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Schweden erhältliches Ampholyt, unterzogen. Das so erhaltene Gel wurde in Stücke geschnitten, deren pH-Werte dann bestimmt wurden, wodurch festgestellt wurde, daß der pI des Enzyms etwa 4,1–5,1 betrug.
  • Die Auswirkungen von Temperatur und pH-Wert auf die Aktivität des erfindungsgemäßen Enzyms wurden nach dem für die Bestimmung der Enzymaktivität angewendeten Verfahren untersucht. Die jeweiligen Ergebnisse sind in in 5 (Auswirkung der Temperatur) und 6 (Auswirkung des pH-Wertes) gezeigt. Die für das Enzym optimale Temperatur betrug bei einer 60minütigen Inkubation bei einem pH-Wert von 7,0 etwa 20°C, und der optimale pH-Wert betrug bei einer 60minütigen Inkubation bei 35°C etwa 7,3–8,3. Die thermische Stabilität des Enzyms wurde bestimmt, indem man es bei verschiedenen Temperaturen 60 min in 50 mM Phosphatpuffern (pH 7,0) in Behältern inkubierte, die so erhaltenen Puffer in den Behältern mit kaltem Wasser abkühlte und die in dem jeweiligen Puffer verbliebene Enzymaktivität bestimmte. Die pH-Wert-Stabilität des Enzyms wurde bestimmt, indem man es bei 35°C 60 min in 50 mM Phosphatpuffern mit verschiedenen pH-Werten inkubierte, die so erhaltenen Puffer auf einen pH-Wert von 7, 0 einstellte und die in dem jeweiligen Puffer verbliebene Enzymaktivität bestimmte. Die Ergebnisse der termischen und pH-Wert-Stabilitäten des Enzyms sind in 7 beziehungsweise 8 gezeigt. Das Enzym war stabil bis zu einer Temperatur von etwa 40°C und stabil bei einem pH-Wert von etwa 6,0–9,5. 1 mM Cu++ oder Hg++ und 50 mM Tris-HCl-Puffer hemmten das Enzym.
  • Experiment 12
  • Wirkung auf Saccharide
  • Verschiedene Saccharide wurden nach dem Verfahren von Experiment 4 getestet, um zu bestimmen, ob sie sich als Substrat für das erfindungsgemäße, in Experiment 10 aus Pseudomonas putida H262 erhaltene Enzym eignen; hierbei wurde die Reaktionstemperatur allerdings auf 35°C eingestellt. Ähnlich wie bei dem Enzym aus Pseudomonas putida H262 wirkte das Enzym aus Pimelobacter sp. R48 spezifisch auf Maltose und Trehalose, d.h. es wandelte Maltose in Trehalose um und umgekehrt. Es zeigte sich, daß die Lage des Gleichgewichts der Umwandlungsreaktion zur Bildung von Trehalose neigt, d.h. die Umwandlungsrate von Maltose in Trehalose betrug etwa 70%.
  • Experiment 13
  • Einfluß der Maltosekonzentration auf die Trehalosebildung
  • Eine Lösung, die 5, 10, 20 oder 30% Maltose enthielt, wurde mit 2 Einheiten/g Maltose, TG, des nach dem Verfahren in Experiment 10 erhaltenen aufgereinigten Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms versetzt und enzymatisch bei 35°C und einem pH-Wert von 7,0 umgesetzt. Während der enzymatischen Umsetzung wurden zu vorgegebenen Zeitpunkten Proben der Reaktionsmischung entnommen und zum Desaktivieren des Enzyms 10 min auf 100°C erhitzt.
  • Die Reduktionskraft und die Saccharidzusammensetzung der Proben wurden ähnlich wie in Experiment 6 bestimmt. Die Ergebnisse waren wie in Tabelle 8 gezeigt.
  • Tabelle 8
    Figure 00520001
  • Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 8 hervorgeht, bildet das erfindungsgemäße Enzym Trehalose aus Maltose in einer Ausbeute von etwa 70%, unabhängig von der Konzentration an Maltose als Substrat.
  • Experiment 14
  • Herstellung von Trehalose aus Maltose
  • 10 Gewichtsteile von im Handel von Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan, erhältlicher Maltose wurden in 40 Gewichtsteilen Wasser gelöst, und die Lösung wurde mit 2 Einheiten/g Maltose, TG, des erfindungsgemäßen, aufgereinigten Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms gemischt und einer 48stündigen enzymatischen Umsetzung bei 35°C und einem pH-Wert von 7,0 unterzogen, worauf die so erhaltene Reaktionsmischung zum Desaktivieren des verbliebenen Enzyms 10 min auf 100°C erhitzt wurde. Die Reaktionsmischung, die etwa 69% Trehalose, TG, enthielt, wurde mit Aktivkohle entfärbt, mit Ionenaustauschern in H- und OH-Form entsalzt, zu einer etwa 78%igen (w/v) Lösung eingeengt, die dann mit 0,1% kristalliner Trehalose als Impfkristall, TG, gemischt wurde, worauf die Mischung zum Kristallisieren über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen wurde. Die so erhaltene Füllmasse wurde dann als Kristalle abgetrennt, die dann mit wenig Wasser besprüht und gewaschen wurden, worauf etwa 2,3 Gew.-Teile hochreiner kristalliner Trehalose mit einer Reinheit von etwa 99,7% TG zurückgewonnen wurden.
  • Experiment 15
  • Enzymherstellung
  • 100-ml-Aliquots eines flüssigen Nährkulturmediums bestehend aus 0,5% (w/v) Polypepton, 0,1% (w/v) Hefeextrakt, 0,07% (w/v) Natriumnitrat, 0,01% (w/v) Dikaliumhydrogenphosphat, 0,02% (w/v) Magnesiumsulfat, 0,01% (w/v) Calciumchlorid und Wasser, wurden auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt, in 500-ml-Erlenmeyerkolben gegeben, zum Sterilisieren 20 min bei 120°C autoklaviert, abgekühlt und mit einer Impfkultur von Thermus aquaticus (ATCC 33923) inokuliert, worauf unter Rühren bei 200 U/min 24 Stunden lang bei 60°C kultiviert wurde. Die so erhaltenen Kulturen wurden gepoolt und als Impfkultur verwendet.
  • Ein etwa 20-l-Aliquot einer frischen Zubereitung des gleichen flüssigen Nährkulturmediums, das in der obigen Kultur verwendet worden war, wurde in einen 30-l-Fermenter gegeben, sterilisiert, auf C abgekühlt und mit 1 Volumen-% der Impfkultur inokuliert, worauf unter Rühren und aeroben Bedingungen etwa 20 Stunden lang bei 60°C und einem pH-Wert von 6,5–8,0 inkubiert wurde.
  • Die Aktivität des in der so erhaltenen Kultur angereicherten Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms betrug 0,35 Einheiten/ml. Ein Teil der Kultur wurde durch Zentrifugation in Zellen und einen Überstand getrennt, und die Zellen wurden in 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert, so daß man das gleiche Volumen wie bei der Portion erhielt, worauf die Enzymaktivität in der Zellsuspension und dem Überstand als 0,33 Einheiten/ml bzw. 0,02 Einheiten/ml bestimmt wurde. Bei der Enzymaktivität handelte es sich um den bei 60°C bestimmten Wert.
  • Experiment 16
  • Enzymaufreinigung
  • Die in Experiment 15 erhaltene Kultur wurde zentrifugiert, wodurch man etwa 0,28 kg nasse Zellen erhielt, die dann in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert wurden. Etwa 1,9 l der so erhaltenen Zellsuspension wurden mit " MODEL US300", einem im Handel von Nippon Seiki Co., Ltd., Niigata, Japan, erhältlichen Ultraschallzertrümmerer zum Aufbrechen von Zellen, behandelt. Die so erhaltene Mischung wurde 30 min bei 15000 × g zentrifugiert, was etwa 1,8 l Überstand lieferte. Ammoniumsulfat wurde zum Überstand gegeben und darin so gelöst, daß man einen Sättigungsgrad von 0,7 erhielt, und die Lösung wurde 4 Stunden lang bei 4°C stehengelassen und zentrifugiert, was ein Sediment lieferte.
  • Das Sediment wurde in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) gelöst, und die Lösung wurde 24 Stunden lang gegen eine frische Zubereitung des gleichen Puffers dialysiert und zum Entfernen unlöslicher Substanzen zentrifugiert. Die dialysierte Lösung, Volumen 1560 ml, wurde in 3 Portionen geteilt, die dann jeweils einer Ionenaustauschersäulenchromatographie mit einer mit 530 ml "DEAE-TOYOPEARL®650 GEL", einem im Handel von Tosoh Corporation, Tokio, Japan, erhältlichen Gel, gepackten Säule unterzogen wurden.
  • Das erfindungsgemäße Maltose-Trehalose-umwandelnde Enzym adsorbierte an dem Gel und wurde davon mit einer frischen Zubereitung des gleichen Puffers, der Salz zugesetzt worden war, eluiert. Die Fraktionen mit Enzymaktivität wurden zurückgewonnen, gegen eine frische Zubereitung des gleichen Puffers, der 1 M Ammoniumsulfat zugesetzt worden war, dialysiert und einer hydrophoben Säulenchromatographie unter Verwendung einer mit 380 ml "BUTYL-TOYOPEARL®650 GEL", einem im Handel von Tosoh Corporation, Tokio, Japan, erhältlichen hydrophoben Gel, gepackten Säule unterzogen. Das an dem Gel adsorbierte Maltose-Trehalose-umwandelnde Enzym wurde mit einem linearen Salzgradienten von 1 M bis 0 M davon eluiert, worauf die Fraktionen mit Enzymaktivität zurückgewonnen wurden.
  • Die Fraktionen wurden gepoolt und einer Gelfiltrationssäulenchromatographie mit einer mit 380 ml "TOYO-PEARL HW-55S", einem im Handel von Tosoh Corporation, Tokio, Japan, erhältlichen Gel, gepackten Säule unterzogen, worauf die Fraktionen mit Enzymaktivität zurückgewonnen wurden.
  • Die Fraktionen wurden gepoolt und einer Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung einer mit 1,0 ml "MONO Q HR5/5", im Handel erhältlich von Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Schweden, gepackten Säule unterzogen. Das Enzym wurde von der Säule mit einem linearen Salzgradienten von 0,1 M bis 0,35 M eluiert, worauf die Fraktionen mit Enzymaktivität zurückgewonnen wurden. Die Gesamtaktivität, spezifische Aktivität und Ausbeute in den einzelnen Aufreinigungsschritten sind in Tabelle 9 aufgelistet.
  • Figure 00550001
  • Figure 00560001
  • Anmerkung: Das Symbol "*" kennzeichnet das erfindungsgemäße Maltose-Trehalose-umwandelnde Enzym.
  • Die aufgereinigte Enzymzubereitung wurde einer Gelelektrophorese mit einem 5%igen (w/v) Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel unterzogen, was eine einzelne Proteinbande lieferte. Dies bedeutete, daß es sich um eine Zubereitung mit einer relativ hohen Reinheit handelte.
  • Experiment 17
  • Enzymeigenschaften
  • Ein Teil der nach dem Verfahren in Experiment 16 erhaltenen, aufgereinigten Zubereitung des Maltose-Trehalo se-umwandelnden Enzyms wurde einer Elektrophorese mit einem 7,5%igen (w/v) Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel unterzogen, wobei das Molekulargewicht durch Vergleich mit im Handel von Japan Bio-Rad Laboratories, Tokio, Japan, erhältlichen Markerproteinen, die gleichzeitig einer Elektrophorese unterzogen wurden, als etwa 100000–110000 Daltons bestimmt wurde.
  • Eine weitere Portion der aufgereinigten Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzymzubereitung wurde einer Isoelektrophorese mit einem Polyacrylamidgel mit 2 Vol.-% "AMPHOLINE", ein im Handel von Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Schweden erhältliches Ampholyt, unterzogen. Das so erhaltene Gel wurde in Stücke geschnitten, deren pH-Werte dann bestimmt wurden, wodurch festgestellt wurde, daß der pI des Enzyms etwa 3,8–4,8 betrug.
  • Die Auswirkungen von Temperatur und pH-Wert auf die Aktivität des erfindungsgemäßen Enzyms wurden nach dem für die Bestimmung der Enzymaktivität angewendeten Verfahren untersucht. Die jeweiligen Ergebnisse sind in in 9 (Auswirkung der Temperatur) und 10 (Auswirkung des pH-Wertes) gezeigt. Die für das Enzym optimale Temperatur betrug bei einer 60minütigen Inkubation bei einem pH-Wert von 7,0 etwa 65°C, und der optimale pH-Wert betrug bei einer 60minütigen Inkubation bei 60°C etwa 6,0–6,7. Die thermische Stabilität des Enzyms wurde bestimmt, indem man es bei verschiedenen Temperaturen 60 min in 50 mM Phosphatpuffern (pH 7,0) in Reagenzgläsern inkubierte, die Reagenzgläsern mit kaltem Wasser abkühlte und die in dem jeweiligen Puffer verbliebene Enzymaktivität bestimmte. Die pH-Wert-Stabilität des Enzyms wurde bestimmt, indem man es bei 60°C 60 min in 50 mM Phosphatpuffern mit verschiedenen pH-Werten inkubierte, die so erhaltenen Puffer auf einen pH-Wert von 7,0 einstellte und die in dem jeweiligen Puffer verbliebene Enzymaktivität bestimmte. Die Ergebnisse der thermischen und pH-Wert-Stabilitäten des Enzyms sind in 11 beziehungsweise 12 gezeigt. Das Enzym war stabil bis zu einer Temperatur von etwa 80°C und stabil bei einem pH-Wert von etwa 5,5–9,5. 1 mM Cu++ oder Hg++ und 50 mM Tris-HCl-Puffer hemmten das erfindungsgemäße Enzym.
  • Experiment 18
  • Wirkung auf Saccharide
  • Verschiedene Saccharide wurden getestet, um zu bestimmen, ob sie sich als Substrat für das erfindungsgemäße Enzym aus Thermus aquaticus (ATCC 33923) eignen; hierbei wurde nach dem Verfahren von Experiment 4 vorgegangen, allerdings wurde die Reaktionstemperatur auf 50°C eingestellt. Ähnlich wie bei den Enzymen aus Pimelobacter sp. R48 und Pseudomonas putida H262 wirkte das Enzym aus Thermus aquaticus (ATCC 33923) spezifisch auf Maltose und Trehalose, d.h. es wandelte Maltose in Trehalose um und umgekehrt. Es zeigte sich, daß die Lage des Gleichgewichts der Umwandlungsreaktion zur Bildung von Trehalose neigt, d.h. die Umwandlungsrate von Maltose in Trehalose betrug etwa 70% oder mehr.
  • Experiment 19
  • Einfluß der Maltosekonzentration auf die Trehalosebildung
  • Eine Lösung, die 2,5, 5, 10, 20 oder 40% Maltose enthielt, wurde mit 2 Einheiten/g Maltose, TG, des nach dem Verfahren in Experiment 16 erhaltenen aufgereinigten Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms aus Thermus aquaticus (ATCC 33923) versetzt, und die Lösung wurde enzymatisch bei 60°C und einem pH-Wert von 6,5 umgesetzt. 72 Stunden nach Beginn der enzymatischen Umsetzung wurde eine Probe der Reaktionsmischung entnommen und zum Desaktivieren des Enzyms 30 auf 100°C erhitzt. Die Reduktionskraft und die Saccharidzusammensetzung der Probe wurden ähnlich wie in Experiment 6 bestimmt. Die Ergebnisse waren wie in Tabelle 10 gezeigt.
  • Tabelle 10
    Figure 00590001
  • Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 10 hervorgeht, bildet das erfindungsgemäße Enzym Trehalose aus Maltose in einer Ausbeute von etwa 70%, unabhängig von der Konzentration an Maltose als Substrat.
  • Experiment 20
  • Einfluß der Temperatur auf die Trehalosebildung
  • Eine 20%ige Maltoselösung mit einem pH-Wert von 6,5 wurde mit 2,5 Einheiten/g Maltose, TG, an durch das Verfahren von Experiment 16 erhaltenem, aus Thermus aquaticus (ATCC 33923) gewonnenem Maltose-Trehalose-umwandelndem Enzym versetzt, und die Mischung wurde bei 40, 50 60 oder 70°C einer enzymatischen Umwandlung unterzogen, wobei zu vorgegebenen Zeitpunkten Proben entnommen wurden. Die Proben wurden zum Desaktivieren des verbleibenden Enzyms 30 min auf 100°C erhitzt. Ähnlich wie in Experiment 6 wurden die so erhaltenen Reaktionsmischungen durch HPLC auf ihre Saccharidzusammensetzung analysiert. Die Trehalosegehalte bei verschiedenen Temperaturen und zu verschiedenen Reaktionszeiten waren wie in Tabelle 11 gezeigt.
  • Tabelle 11
    Figure 00600001
  • Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 11 hervorgeht, gilt: je niedriger die enzymatische Umsetzungstemperatur, desto höher die Rate der Umwandlung von Maltose in Trehalose. Das Enzym wandelte Maltose mit einer Umwamdlungsrate von etwa 80% in Trehalose um.
  • Experiment 21
  • Gewinnung und Eigenschaften von Maltose-Trehalose-umwandelndem Enzym aus Mikroorganismen
  • Gemäß Experiment 15 wurde aus herkömmlichen Mikroorganismen ein Mikroorganismus, dessen Fähigkeit zur Herstellung des erfindungsgemäßen Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms bestätigt worden war, 48 Stunden lang in einem Erlenmeyerkolben inkubiert. Nach der Analyse der Enzymaktivität wurde die so erhaltene Kultur gemäß Experiment 16 einer Behandlung mit einem zellzertrümmernden Apparat unterzogen. Aus der so erhaltenen Mischung wurde ein Überstand hergestellt und dialysiert, wodurch man ein teilaufgereinigtes Enzym erhielt, worauf die Eigenschaften gemäß Experiment 17 analysiert wurden. Die Ergebnisse waren wie in Tabelle 12 gezeigt.
  • Tabelle 12
    Figure 00610001
  • Teilaufgereinigte, aus bekannten Mikroorganismen der Gattung Thermus gewonnene Enzyme wurden wie in Tabelle 12 gezeigt gemäß dem Verfahren in Experiment 18 auf ihre Wirkung auf verschiedene Saccharide untersucht. Im Ergebnis zeigte sich, daß die teilaufgereinigten Enzyme ähnlich wie das aus Thermus aquaticus (ATCC 33923) gewonnene Enzym spezifisch auf Maltose und Trehalose wirkten und Trehalose aus Maltose bildeten.
  • Es wurde gezeigt, daß das aus Thermus ruber (ATCC 35948) gewonnene Maltose-Trehalose-umwandelnde Enzym eine niedrigere optimale Temperatur und eine niedrigere stabile Temperatur hatte als das aus Thermus aquaticus (ATCC 33923), während die aus Mikroorganismen der Gattung Thermus gewonnenen Enzyme ungefähr die gleichen Eigenschaften wie die aus Thermus aquaticus (ATCC 33923) aufwiesen sowie über eine relativ hohe thermische Stabilität verfügten.
  • Experiment 22
  • Partielle Aminosäuresequenz des Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms
  • Ein Teil einer aufgereinigten, nach dem Verfahren von Experiment 2 erhaltenen, aus Pimelobacter sp. R48 gewonnenen Enzymzubereitung, einer nach dem Verfahren von Experiment 10 erhaltenen, aus Pseudomonas putida H262 gewonnenen Enzymzubereitung oder einer nach dem Verfahren von Experiment 16 erhaltenen, aus Thermus aquaticus (ATCC 33923) gewonnenen Enzymzubereitung wurde gegen destilliertes Wasser dialysiert, und etwa 80 μg Protein des so erhaltenen Materials wurden als Probe für die Analyse einer partiellen, den N-Terminus des Enzyms umfassenden Aminosäuresequenz verwendet. Der N-Terminus wurde auf einem "PROTEIN SEQUENCER MODEL 473A", einem im Handel von Applied Biosystems Inc., Foster City, USA, erhältlichen Proteinsequenziergerät, analysiert. Die den N-Terminus des jeweiligen Enzyms umfassende partielle Aminosäuresequenz war wie in Tabelle 13 gezeigt.
  • Tabelle 13
    Figure 00620001
  • Anmerkung: In der Tabelle stellen die Abbildungen jeweils die vom N-Terminus gezählte Anzahl an Aminosäuren der jeweiligen partiellen Aminosäuresequenz dar.
  • Wie aus den Ergebnissen in Tabelle 13 hervorgeht, zeigte sich, daß die aus Pimelobacter sp. R48, Pseudomonas putida H262 und Thermus aquaticus (ATCC 33923) gewonnenen Enzyme in hohem Maße homologe partielle Aminosäuresequenzen aufwiesen. Eine relativ hohe Homologie wurde zwischen einer aus einem Mikroorganismus der Gattung Pimelobacter gewonnenen partiellen Aminosäuresequenz, die sich von der 10. Aminosäure, dem "Trp", bis zur 16. Aminosäure, dem "Phe", erstreckte, und einer aus einem Mikroorganismus der Gattung Pseudomonas gewonnenen partiellen Aminosäuresequenz, die sich von der 3. Aminosäure, dem "Trp", bis zur 9. Aminosäure, dem "Phe", erstreckte, gefunden. Die partielle Aminosäuresequenz läßt sich als Trp-X1-Arg-X2-Ala-X3-Phe beschreiben (wobei das Symbol "X1" für "Phe" oder "Pro" steht; das Symbol "X2" für "Thr" oder "Pro" steht; und das Symbol "X3" für "Val" oder "Ala" steht). Eine relativ hohe Homologie wurde zwischen einer aus einem Mikroorganismus der Gattung Pimelobacter gewonnenen partiellen Aminosäuresequenz, die sich von der 14. Aminosäure, dem "Ala", bis zur 17. Aminosäure, dem "Tyr", erstreckte, und einer aus einem Mikroorganismus der Gattung Thermus gewonnenen partiellen Aminosäuresequenz, die sich von der 9. Aminosäure, dem "Ala", bis zur 12. Aminosäure, dem "Tyr", erstreckte, gefunden. Die partielle Aminosäuresequenz läßt sich als Ala-Val-X4-Tyr (wobei das Symbol "X4" für "Phe" oder "Ile" steht) beschreiben.
  • Experiment 23
  • Physikochemische Eigenschaften von Trehalose
  • Eine nach dem Verfahren in Experiment 8 hergestellte hochreine Trehaloseprobe wurde auf ihre physikochemischen Eigenschaften untersucht. Im Ergebnis wurde der Schmelzpunkt als 97,0°C bestimmt, die spezifische Rotation betrug [α]D 20 + 199°C (c = 5), die Schmelzwärme belief sich auf 57,8 kJ/mol und die Löslichkeit in Wasser bei 25°C betrug 77,0 für wasserfreie Trehalose. Diese Daten stimmten gut mit denen von im Handel erhältlicher, von Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Tokio, Japan, erworbener wasserhaltiger kristalliner Trehalose überein, die parallel zu den obigen Experimenten untersucht wurde.
  • Experiment 24
  • Verwendungstest in vivo
  • Gemäß dem von H. Atsuji et al. in Journal of Clinical Nutrition, Band 41, Nr. 2, S. 200–208 (1972), beschriebenen Verfahren wurden 30 g der hochreinen Trehaloseprobe mit einer Reinheit von 99,8%, TG, in Experiment 8 zu einer 20%igen (w/v) wäßrigen Lösung zubereitet, die dann 3 gesunden männlichen Probanden im Alter von 26, 27 bzw. 30 Jahren oral verabreicht wurde, wobei in vorgegebenen Zeitabständen Blutproben entnommen und anschließend die Blutzucker- und Insulinkonzentrationen gemessen wurden. Zur Kontrolle wurde Glucose verwendet. Im Ergebnis verhielt sich Trehalose ähnlich wie Glucose, und maximale Blutzucker- und Insulinkonzentrationen wurden etwa 0,5–1 Stunde nach der Verabreichung beobachtet. Dies zeigt, daß die erfindungsgemäße Trehalose von lebenden Organismen leicht verdaut, absorbiert und metabolisiert sowie als Energiequelle verwendet wird. Die erfindungsgemäße Trehalose und die diese enthaltende Saccharidzusammensetzung eignen sich somit als energieergänzendes Saccharid.
  • Experiment 25
  • Untersuchung der akuten Toxizität
  • Unter Verwendung von Mäusen wurde die in Experiment 8 hergestellte hochreine Trehaloseprobe mit einer Reinheit von 99,8, TG, für die Untersuchung ihrer akuten Toxizität den Mäusen oral verabreicht. Im Ergebnis ziegte sich, daß es sich bei der erfindungsgemäßen Trehalose um eine Substanz mit relativ geringer Toxizität handelt, und selbst bei Verabreichung der höchsten den Mäusen verabreichbaren Dosis starb keine der Mäuse. Wenngleich dieser Wert nicht besonders genau ist, wurde der LD50 als 50 g/kg oder höher bestimmt.
  • Die erfindungsgemäße Trehalose und die diese enthaltende Saccharidzusammensetzung, hergestellt mit dem erfindungsgemäßen Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzym, sowie ihre Zubereitungen, sind in Beispiel A erläutert. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, die entweder die Trehalose oder die diese enthaltende Saccharidzusammensetzung enthalten, sind in Beispiel B erläutert:
  • Beispiel A-1
  • Nach dem Verfahren in Experiment 1 wurde eine Impfkultur eines Mikroorganismus der Spezies Pimelobacter sp. R48 (FERM BP-4315) etwa 60 Stunden lang in einem Fermenter unter Belüften und Rühren in einer frischen Zubereitung des gleichen Nährkulturmediums wie dem in Experiment 1 verwendeten kultiviert, wobei allerdings die Glucosekonzentration auf 4,0% (w/v) eingestellt wurde. Die Aktivität des erfindungsgemäßen Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms in der so erhaltenen Kultur betrug 0,75 Einheiten/ml. Ein Teil der Kultur wurde durch Zentrifugieren in Zellen und einen Kulturüberstand getrennt, die dann auf ihre Enzymaktivität untersucht wurden. Im Ergebnis wurde etwa 65% der Enzymaktivität in den Zellen und etwa 35% der Enzymaktivität in dem Kulturüberstand gefunden. Eine Zellen enthaltende, etwa 35-l-Kultur wurde zum Aufbrechen der Zellen mit einem "MINI-RABO", einem im Handel von Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., Tokio, Japan, erhältlichen, unter superhohem Druck betriebenen Zellzertrümmerer behandelt. Die so erhaltene Zellsuspension wurde zentrifugiert, wodurch man einen Überstand erhielt, der dann einer Membranfiltration mit einer UF-Membran unterzogen wurde, worauf etwa 1,2 l Konzentrat mit etwa 15 Einheiten/ml des erfindungsgemäßen Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms zurückgewonnen wurden.
  • Eine 10%ige (w/v) Suspension (pH 5,5) von Kartoffelstärke wurde mit 2 Einheiten/g Stärke, TG, "SPITASE HS", einer im Handel von Nagase Biochemicals Ltd., Kyoto, Japan, erhältlichen α-Amylase versetzt, und die so erhaltene Mischung wurde unter Rühren und Erhitzen gelatinisiert und verflüssigt, worauf die Mischung unmittelbar im Anschluß 20 min auf 120°C gehalten und das so erhaltene Material auf 50°C und einen pH-Wert von 5,0 eingestellt wurde. Die so erhaltene Mischung wurde mit 20 Einheiten/g Stärke, TG, einer im Handel von Nagase Biochemicals Ltd., Kyoto, Japan, erhältlichen β-Amylase und 500 Einheiten/g Stärke, TG, einer im Handel von Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan, erhältlichen Isoamylase gemischt, und die so erhaltene Mischung wurde einer 24stündigen enzymatischen Umsetzung unterzogen, wodurch man eine Saccharidlösung erhielt, die etwa 92% (w/v) Maltose enthielt. Die Reaktionsmischung wurde 20 min auf 100°C erhitzt, auf 10°C erhitzt, auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt, mit 1 Einheit/g Trockenmasse des oben hergestellten Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms gemischt und einer 96stündigen enzymatischen Umsetzung unterzogen.
  • Die Reaktionsmischung wurde 10 min auf 95°C gehalten, abgekühlt und auf herkömmliche Weise mit Aktivkohle entfärbt und filtriert. Das Filtrat wurde aufgereinigt, indem man es mit Ionenaustauschern in H- und OH-Form entsalzte und einengte, worauf man einen Sirup mit einer Konzentration von etwa 70% (w/v) in einer Ausbeute von etwa 95%, TG, erhielt.
  • Das Produkt, das etwa 69% Trehalose, TG, enthielt und eine Reduktionskraft von lediglich DÄ 18,2 aufwies, hat eine milde Süße sowie eine angemessene Viskosität und Fähigkeit zum Zurückhalten von Feuchtigkeit und wird daher geeigneterweise als Süßstoff, geschmackverbesserndes Mittel, Stabilisator, Verdünnungsmittel, Hilfsstoff und Füllstoff in verschiedenen Zusammensetzungen wie Lebensmittelprodukten, Kosmetika und Pharmazeutika verwendet.
  • Beispiel A-2
  • Eine Reaktionsmischung, in der eine enzymatische Umsetzung einer Maltose-Trehalose-Umwandlung suspendiert worden war, wurde nach dem Verfahren von Beispiel A-1 zubereitet, mit 10 Einheiten/g "GLUCOZYME", einer im Handel von Nagase Biochemicals, Ltd., Kyoto, Japan, erhältlichen Glucoamylase gemischt und einer 24stündigen enzymatischen Umsetzung bei einem pH-Wert von 5,0 und C unterzogen. Die so erhaltene Reaktionsmischung wurde zum Desaktivieren des verbliebenen Enzyms erhitzt, entfärbt, entsalzt und aufgereinigt, wodurch man eine Saccharidlösung als Feedlösung erhielt. Die Saccharidlösung wurde einer Ionenaustauschersäulenchromatographie unter Verwendung von "XT-1016 (Na+-Form, Polymerisationsgrad 4%)", im Handel erhältlich von Tokio Organic Chemical Industries, Ltd., Tokio, Japan, unterzogen. Die Harze wurden in Säulen aus rostfreiem Stahl mit 4 Ummantelungen mit einem Innendurchmesser von 5,4 cm gepackt, die so in einer Kaskade angeordnet waren, daß sich eine Gesamtgelbettiefe von 20 m ergab.
  • Während die Säuleninnentemperatur auf 60°C gehalten wurde, wurde die Saccharidlösung den Säulen in einer Menge von 5 Vol.-% zugeführt und fraktioniert, indem man den Säulen zum Entfernen der Glucose 60°C heißes Wasser mit einer RG (Raumgeschwindigkeit) von 0,15 zuführte und anschließend die Fraktionen mit einem hohem Trehalosegehalt zurückgewann. Die Fraktionen wurden gepoolt, aufgereinigt, eingeengt, im Vakuum getrocknet und pulverisiert, wodurch man ein Pulver mit einem hohen Trehalosegehalt in einer Ausbeute von etwa 55%, TG, erhielt.
  • Das Produkt, das etwa 97% Trehalose, TG, enthält und eine zufriedenstellende Reduktionskraft sowie eine milde, qualitativ hochwertige Süße aufweist, kann je nach Gutdünken als Süßstoff, geschmacksverbesserndes Mittel, qualitätsverbesserndes Mittel, Stabilisator, Verdünnungsmittel, Hilfsstoff und Füllstoff in verschiedenen Zusammensetzungen wie Lebensmittelprodukten, Kosmetika und Pharmazeutika eingesetzt werden.
  • Beispiel A-3
  • Eine nach dem Verfahren in Beispiel A-2 erhaltene Fraktion mit hohem Trehalosegehalt wurde auf die herkömmliche Weise mit Aktivkohle entfärbt, entsalzt und mit einem Ionenaustauscher aufgereinigt. Das Filtrat wurde zu einer etwa 70%igen (w/v) Lösung eingeengt, die dann in ein Kristallisationsgerät gegeben, mit etwa 2% wasserhaltiger kristalliner Trehalose als Impfkristall versetzt und schrittweise abgekühlt wurde, worauf man eine Füllmasse mit einer Kristallinität von etwa 45% erhielt. Die Füllmasse wurde aus einer oben in einem Trockenturm angebrachten Düse mit einem hohen Druck von 150 kg/cm2 besprüht. Beim Besprühschritt wurde die Füllmasse gleichzeitig mit 85°C heißer Luft belüftet, die oben aus dem Trockenturm herabströmte, und das so erhaltene kristalline Pulver wurde auf einem unten im Trockenturm angebrachten, aus einem Metalldrahtnetz gefertigten Transportband gesammelt und schrittweise aus dem Trockenturm ausgetragen, wobei ein Strom von 45°C warmer Luft von unten durch das Metalldrahtnetz geführt wurde. Das so erhaltene kristalline Pulver wurde in einen Reifeturm eingebracht und zum Abschluß der Kristallisation und des Trocknens 10 Stunden lang reifen gelassen, worauf das so erhaltene wasserhaltige kristalline Trehalosepulver in einer Ausbeute von etwa 90%, bezogen auf die Materialfraktion mit hohem Trehalosegehalt, TG, zurückgewonnen wurde.
  • Das Produkt ist im wesentlichen nicht hygroskopisch und leicht zu handhaben, und hierdurch eignet es sich je nach Gutdünken als Süßstoff, geschmacksverbesserndes Mittel, qualitätsverbesserndes Mittel und Stabilisator für verschiedene Zusammensetzungen wie Lebensmittelprodukte, Kosmetika und Pharmazeutika.
  • Beispiel A-4
  • Eine nach dem Verfahren in Beispiel A-2 erhaltene Fraktion mit hohem Trehalosegehalt wurde ähnlich wie in Beispiel A-3 aufgereinigt, und das so erhaltene Material wurde in einen Verdampfer gegeben und im Vakuum aufgekocht, wodurch man einen Sirup mit einem Feuchtigkeitsgehalt von etwa 3,0% erhielt. Der so erhaltene Sirup wurde in ein Kristallisationsgerät gegeben, mit 1 wasserfreier kristalliner Trehalose, bezogen auf den Sirup, TG, gemischt und bei 120°C unter Rühren kristallisiert, und die so erhaltene Mischung wurde in einen einfachen Aluminumbehälter gegeben und 6 Stunden lang bei 100°C reifen gelassen, wodurch man einen Block erhielt.
  • Der auf diese Weise erhaltene Block wurde in einem Schneidegerät pulverisiert und in einer Wirbelschicht getrocknet, wodurch man ein wasserfreies kristallines Trehalosepulver mit einem Feuchtigkeitsgehalt von etwa 0,3% in einer Ausbeute von etwa 85%, bezogen auf die Materialfraktion mit hohem Trehalosegehalt, TG, erhielt.
  • Das Produkt kann je nach Gutdünken als Trockenmittel in Lebensmittelprodukten, Kosmetika, Pharmazeutika und deren Materialien und Zwischenprodukten verwendet werden, und auch als weißer, pulverförmiger Süßstoff in verschiedenen Zusammensetzungen wie Lebensmittelprodukten, Kosmetika und Pharmazeutika eingesetzt werden.
  • Beispiel A-5
  • Nach dem Verfahren von Experiment 1 wurde eine Impkultur von Pimelobacter sp. R48 (FERM BP-4315) in ein Nährkulturmedium inokuliert und darin kultiviert, und die so erhaltene Kultur wurde zentrifugiert, worauf man 100 g nasse Zellen erhielt, die eine Aktivität von etwa 800 Einheiten des erfindungsgemäßen Enzyms aufwiesen, und die dann mit 100 ml 10 mM Phosphatpuffer verknetet wurden, in dem zuvor 2,5% Natriumalginat mit einer Viskosität von 300–400 cp, im Handel erhältlich von Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Tokio, Japan, in 10 mM Phosphatpuffer gelöst worden war. Die auf diese Weise zubereitete, die Zellen enthaltende Aufschlämmung wurde anschließend aus einer Höhe von etwa 20 cm über der Oberfläche der Lösung in eine mit einem Magnetrührer gerührte 0,1 M Calciumchloridlösung gegossen, wodurch sich kugelförmige Gele mit einem Durchmesser von etwa 2 mm bildeten. Die Gele wurden bei Raumtemperatur etwa 2 Stunden lang in der Lösung stehengelassen und mit einem Büchnertrichter filtriert, worauf mit Alginat immobilisierte Zellen zurückgewonnen wurden. Die so erhaltenen immobilisierten Zellen wurden in eine ummantelte Glassäule mit einem Durchmesser von 30 mm und einer Länge von 200 mm gepackt, und die Säule wurde erwärmt und auf 20°C gehalten. Der Säule wurde von oben fließend eine 40%ige Maltoselösung (pH 6,8) mit einer RG von 0,2 zugeführt, wodurch man eine Saccharidlösung erhielt, die etwa 70% Trehalose, TG, enthielt. Die auf diese Weise erhaltene Saccharidlösung wurde aufgereinigt und eingeengt, was einen Sirup mit einer Konzentration von etwa 70% in einer Ausbeute von etwa 95%, TG, lieferte
  • Das Produkt hat eine relativ geringe Reduktionskraft und eine milde Süße sowie eine angemessene Fähigkeit zum Zurückhalten von Feuchtigkeit, und es kann deshalb je nach Gutdünken ähnlich dem Produkt in Beispiel A-1 in verschiedenen Zusammensetzungen zur Anwendung kommen.
  • Beispiel A-6
  • Eine 33%ige Maisstärkesuspension wurde mit Calciumcarbonat gemischt, so daß man auf eine Endkonzentration von 0,1% kam, und die Mischung wurde auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt und dann mit 0,2 Einheiten/g Stärke, TG, "TERMAMYL 60L", einer im Handel von Novo Industri A/S Kopenhagen, Dänemark, erhältlichen α-Amylase, gemischt und einer 15minütigen enzymatischen Umsetzung bei 95°C unterzogen. Die Reaktionsmischung wurde 30 min bei 120°C autoklaviert, auf C abgekühlt, mit 500 Einheiten/g Stärke, TG, einer im Handel von Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan, erhältlichen Isoamylase und 30 Einheiten/g Stärke, TG, einer im Handel von Nagase Biochemicals Ltd., Kyoto, Japan, erhältlichen β-Amylase gemischt und einer 48stündigen enzymatischen Umsetzung unterzogen, worauf eine Saccharidlösung mit einem Maltosegehalt von etwa 84%, TG, zurückgewonnen wurde. Die Saccharidlösung wurde 10 min bei 100°C gehalten, auf 15°C abgekühlt, mit 1,5 Einheiten/g Stärke, TG, des nach dem Verfahren von Beispiel A-1 erhaltenen erfindungsgemäßen Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms gemischt und einer 72stündigen enzymatischen Umsetzung unterzogen. Die so erhaltene Reaktionsmischung wurde zum Desaktivieren des verbliebenen Enzyms 15 min auf 100°C erhitzt und auf herkömmliche Weise mit Aktivkohle entfärbt, entsalzt und mit einem Ionenaustauscher aufgereinigt, worauf das so erhaltene Material zu einem Sirup mit einer Konzentration von etwa 70% in einer Ausbeute von etwa 95%, TG, eingeengt wurde.
  • Das Produkt enthält etwa 64% Trehalose, TG, und hat eine relativ geringe Reduktionskraft und eine milde Süße sowie eine angemessene Fähigkeit zum Zurückhalten von Feuchtigkeit, und es kann deshalb je nach Gutdünken ähnlich dem Produkt in Beispiel A-1 in verschiedenen Zusammensetzungen zur Anwendung kommen.
  • Beispiel A-7
  • Ein nach dem Verfahren in Beispiel A-5 erhaltener Sirup wurde zu einem etwa 82%igen Sirup eingeengt, der dann in ein Kristallisationsgerät gegeben, mit etwa 1 Impfkristall versetzt, in ein einfaches Gefäß gegeben und zum Kristallisieren 4 Tage lang bei 20°C stehengelassen wurde. Die so erhaltenen Kristalle wurden mit einem Scheidegerät pulverisiert und getrocknet, wodurch man ein füllmasseähnliches wasserhaltiges kristallines Trehalosepulver in einer Ausbeute von etwa 95%, TG, erhielt.
  • Das Produkt ist im wesentlichen nicht hygroskopisch und leicht zu handhaben, und hierdurch eignet es sich je nach Gutdünken für verschiedene Zusammensetzungen, ähnlich dem Produkt in Beispiel A-1.
  • Beispiel A-8
  • Ein nach dem Verfahren in Beispiel A-6 erhaltener Sirup wurde zu einem etwa 80%igen Sirup eingeengt, der dann in ein Kristallisationsgerät gegeben, mit einer etwa 1%igen wasserhaltigen kristallinen Trehalose als Impfkristall gemischt und zum Kristallisieren unter Rühren abgekühlt wurde. Das auf diese Weise erhaltene Material wurde mit einer Korbzentrifuge abgetrennt, wodurch man Kristalle erhielt, die dann mit einer geringen Menge an kaltem Wasser besprüht wurden, wodurch man hochreine wasserhaltige kristalline Trehalose in einer Ausbeute von etwa 20%, TG, erhielt.
  • Das Produkt, das die gleichen physikochemischen Eigenschaften wie in Experiment 23 gezeigt aufweist, kann je nach Gutdünken als Süßstoff, geschmacksverbesserndes Mittel, qualitätsverbesserndes Mittel, Stabilisator in verschiedenen Zusammensetzungen wie Lebensmittelprodukten, Kosmetika und Pharmazeutika sowie industriellen Reagentien und chemischen Materialien verwendet werden.
  • Beispiel A-9
  • Eine Impfkultur von Pseudomonas putida H262 (FERM BP-4579) wurde in ein Nährkulturmedium inokuliert und gemäß dem Verfahren von Experiment 9 etwa 20 Stunden lang unter Rühren und aeroben Bedingungen in einem Fermenter fermentiert. Etwa 18 l der so erhaltenen Kultur wurden zentrifugiert, wodurch man etwa 0,4 kg nasse Zellen erhielt, die dann in 4 l 10 mM Phosphatpuffer suspendiert und zum Aufbrechen der Zellen mit "MODEL US300", einem im Handel von Nippon Seiki Co., Ltd., Niigata, Japan, erhältlichen Ultraschallzertrümmerer, behandelt wurden. Die so erhaltene Mischung wurde zentrifugiert, wodurch man einen Überstand erhielt, der mit einer UF-Membran eingeengt wurde, worauf man etwa 400 ml einer konzentrierten Enzymlösung mit 3,8 Einheiten/ml eines Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms zurückgewann. Eine 10%ige Kartoffelsuspension (pH 5,5) wurde mit 2 Einheiten/g Stärke, TG, "SPITASE HS", einer im Handel von Nagase Biochemicals, Ltd., Kyoto, Japan, erhältlichen α-Amylase gemischt, gelatinisiert und durch Erhitzen unter Rühren verflüssigt, worauf 20 min bei 120°C autoklaviert, auf 50°C abgekühlt und auf einen pH-Wert von 5,5 eingestellt wurde. Die so erhaltene Mischung wurde mit 500 Einheiten/g Stärke, TG, einer im Handel von Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan, erhältlichen Pullulanase und 20 Einheiten/g Stärke, TG, einer im Handel von Nagase Biochemicals, Ltd., Kyoto, Japan, erhältlichen β-Amylase versetzt und einer 24stündigen enzymatischen Umsetzung unterzogen, worauf eine Saccharidlösung mit etwa 92% Maltose zurückgewonnen wurde. Die Saccharidlösung wurde 20 min auf 100°C erhitzt, auf 40°C und einen pH-Wert von 7,0 eingestellt, mit 1,5 Einheiten/g des oben hergestellten Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms versetzt und einer 72stündigen enzymatischen Umsetzung unterzogen. Die Reaktionsmischung wurde 10 min auf 95°C erhitzt, abgekühlt, und auf herkömmliche Weise mit Aktivkohle entfärbt und filtriert, worauf entsalzt und das so erhaltene Material mit Ionenaustauschern in H- und OH-Form aufgereinigt und die so erhaltene Lösung in einer Ausbeute von etwa 97% zu einem Sirup mit einer Konzentration von etwa 70% (w/v), TG, eingeengt wurde. Das Produkt enthielt etwa 65% Trehalose, TG, und hatte eine relativ geringe Reduktionskraft von lediglich DÄ 16,2, sowie eine mäßige Süße und eine angemessene Viskosität und Fähigkeit zum Zurückhalten von Feuchtigkeit, und läßt sich deshalb je nach Gutdünken als Süßstoff, geschmackverbesserndes Mittel, Stabilisator, Füllstoff, Verdünnungsmittel und Hilfsstoff in verschiedenen Zusammensetzungen wie Lebensmittelprodukten, Kosmetika und Pharmazeutika verwenden.
  • Beispiel A-10
  • Eine nach dem Verfahren von Beispiel A-9 gewonnene, nach der Umsetzung erhaltene Reaktionsmischung des Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms wurde zum Desaktivieren des verbliebenen Enzyms 10 min auf 95°C erhitzt, auf einen pH-Wert von 5,0 und 55°C eingestellt, mit 10 Einheiten/g Stärke, TG, "GLUCOZYME", einer im Handel von Nagase Biochemicals, Ltd., Kyoto, Japan, erhältlichen Glucoamylase gemischt und einer 24stündigen enzymatischen Umsetzung unterzogen. Die Reaktionsmischung wurde auf die gewöhnliche Weise zum Desaktivieren des verbliebenen Enzyms erhitzt, entfärbt, entsalzt, aufgereinigt und zu einer 55%igen Saccharidlösung eingeengt. Ähnlich wie in Beispiel A-2 wurde die so erhaltene Saccharidlösung einer Säulenchromatographie mit "DOWEX 99 (Ca++-Form, Polymerisierungsgrad 6%)", einem im Handel von Dow Chemical Co., Midland, Michigan, USA, erhältlichen stark sauren Erdalkali-Kationenaustauscher unterzogen, worauf die Fraktionen mit hohem Trehalosegehalt zurückgewonnen wurden. Die Fraktionen wurden gepoolt, aufgereinigt und unter Einengen kontinuierlich kristallisiert, und die so erhaltene Füllmasse wurde in einer Korbzentrifuge abgetrennt, worauf die so erhaltenen Kristalle mit einer geringen Menge Wasser besprüht wurden, wodurch man hochreine wasserhaltige kristalline Trehalose in einer Ausbeute von etwa 25%, TG, erhielt. Das Produkt zeigt die gleichen physikochemischen Eigenschaften wie das Produkt in Experiment 23 und kann ähnlich wie das Produkt in Beispiel A-8 je nach Gutdünken in verschiedenen Zusammensetzungen wie Lebensmittelprodukten, Kosmetika und Pharmazeutika sowie industriellen Reagentien und chemischen Materialien verwendet werden.
  • Beispiel A-11
  • Eine Impfkultur von Pseudomonas putida H262 (FERM BP-4579) wurde in einem Nährkulturmedium ähnlich wie in Experiment 9 kultiviert, und die so erhaltenen Zellen wurden durch Zentrifugieren gewonnen, wodurch man 100 g nasse Zellen mit einer Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzymaktivität von etwa 400 Einheiten erhielt, die dann mit 100 ml 10 mM Phosphatpuffer, in dem 2,5% Natriumalginat mit einer Viskosität von 300–400 cp gelöst worden war, verknetet wurde. Die die Zellen enthaltende Aufschlämmung wurde aus einer Höhe von etwa 20 cm über der Oberfläche der Lösung kontinuierlich in eine mit einem Magnetrührer gerührte 0,1 M CaCl2-Lösung gegossen, wodurch sich kugelförmige Gele mit einem Durchmesser von etwa 2 mm bildeten. Die Gele wurden bei Raumtemperatur etwa 2 Stunden lang in der CaCl2-Lösung stehengelassen und mit einem Büchnertrichter filtriert, wodurch man mit Natriumalginat immobilisierte Zellen erhielt. Die immobilisierten Zellen wurden in eine ummantelte Glassäule mit einem Durchmesser von 30 mm und einer Länge von 200 mm gepackt und bei 35°C gehalten. Der Säule wurde von oben fließend eine 40%ige Maltoselösung (pH 6,8) mit einer RG von 0,1 zugeführt, wodurch man eine 67%ige Trehaloselösung erhielt. Die Trehaloselösung wurde nach dem Verfahren von Beispiel A-9 auf gereinigt, eingeengt, kristallisiert und sprühgetrocknet, wodurch man ein füllmasseartiges wasserhaltiges kristallines Trehalosepulver in einer Ausbeute von etwa 90%, TG, erhielt. Das Produkt hat eine relativ geringe Reduzierkraft, eine milde Süße und eine angemessene Fähigkeit zum Zurückhalten von Feuchtigkeit und kann aufgrund dieser Eigenschaften je nach Gutdünken ähnlich dem Produkt von Beispiel A-9 als verschiedene Zusammensetzungen verwendet werden.
  • Beispiel A-12
  • Eine Impfkultur von Thermus aquaticus (ATCC 33923) wurde in ein Nährkulturmedium inokuliert und gemäß dem Verfahren in Experiment 15 etwa 20 Stunden lang unter Rühren und Belüften kultiviert. Die Kultur hatte eine Aktivität von etwa 0,32 Einheiten/ml des Maltose- Trehalose-umwandelnden Enzyms. Aus etwa 18 l der Kultur gewonnene 0,18 kg nasser Zellen wurden in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert. Etwa 1,5 l der Zellsuspension wurden zum Aufbrechen der Zellen mit einem Ultraschallzertrümmerer behandelt. Die so erhaltenen Zelltrümmer wurden zentrifugiert, und der Überstand wurde zurückgewonnen und anschließend mit einer UF-Membran eingeengt, was etwa 500 ml Konzentrat mit einer Aktivität von etwa 10 Einheiten/ml des Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzyms lieferte. 15%ige Maisstärkesuspension (pH 5,5) wurde mit 2 Einheiten/g Stärke "SPITASE HS", einer im Handel von Nagase Biochemicals, Ltd., Kyoto, Japan, erhältlichen α-Amylase versetzt und unter Rühren und Erhitzen gelatinisiert und verflüssigt. Unmittelbar im Anschluß daran wurde die Mischung 20 min bei 120°C autoklaviert, auf 55°C abgekühlt und auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt. Die auf diese Weise erhaltene Mischung wurde mit 300 Einheiten/g Stärke einer im Handel von Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan, erhältlichen Isoamylase und 20 Einheiten/g Stärke einer im Handel von Nagase Biochemicals, Kyoto, Japan, erhältlichen β-Amylase versetzt und einer 24stündigen enzymatischen Umsetzung unterzogen, wodurch man eine etwa 92%ige Maltoselösung erhielt. Die so erhaltene Lösung wurde 20 min auf 100°C erhitzt, auf 50°C abgekühlt, auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt, mit dem oben hergestellten Maltose-Trehalose-umwandelnden Enzym in einer Menge von 1,5 Einheiten/g Trockengewicht gemischt und einer 72stündigen enzymatischen Umsetzung unterzogen. Im Anschluß daran wurde die so erhaltene Kultur 10 min auf 95°C erhitzt, abgekühlt und auf herkömmliche Weise mit Aktivkohle entfärbt und filtriert, worauf die so erhaltene Lösung mit Ionenaustauschern in H- und OH-Form entsalzt und aufgereinigt wurde. Die auf diese Weise erhaltene Lösung wurde eingeengt, was einen 70%igen Sirup in einer Ausbeute von etwa 95%, TG, lieferte. Das Produkt enthält etwa 64% Trehalose, TG, und hat eine geringe Reduzierkraft von DÄ 18,0 sowie eine milde Süße, eine angemessene Viskosität und eine zufriedenstellende Fähigkeit zum Zurückhalten von Feuchtigkeit. Aufgrund dieser Eigenschaften kann es je nach Gutdünken als Süßstoff, geschmacksverbesserndes Mittel, Stabilisator, Füllstoff, Verdünnungsmittel und Hilfsstoff in verschiedenen Zusammensetzungen wie Nahrungsmittelprodukten, Kosmetika und Pharmazeutika verwendet werden.
  • Beispiel A-13
  • Ein nach dem Verfahren von Beispiel A-12 erhaltener Sirup wurde zu einem etwa 80%igen Sirup eingeengt, der dann in ein Kristallisiergerät geegeben und ähnlich wie in Beispiel A-8 kristallisiert und abgetrennt wurde, was eine hochreine wasserhaltige kristalline Trehalose in einer Ausbeute von etwa 20%, TG, lieferte. Das Produkt zeigt die gleichen physikochemischen Eigenschaften wie das Produkt aus Experiment 23 und läßt sich je nach Gutdünken ähnlich wie das Produkt aus Beispiel A-8 als industrielles Reagens, industrielles Material und chemisches Material in verschiedenen Zusammensetzungen wie Nahrungsmittelprodukten, Kosmetika und Pharmazeutika verwenden.
  • Beispiel A-14
  • Eine Impfkultur von Thermus aquaticus (ATCC 33923) wurde in ein Nährkulturmedium inokuliert und ähnlich wie bei dem Verfahren in Experiment 15 kultiviert, worauf die auf diese Weise erhaltene Kultur zentrifugiert wurde, was 50 g nasse Zellen mit etwa 1,500 Einheiten an Maltose-Trehalose-umwandelnder Enzymaktivität lieferte. Die Zellen wurden in 100 ml 2,5%igem Natriumalginat mit einer Viskosität von 300–400 cp, einem im Handel von Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Tokio, Japan, erhältlichen Reagens, suspendiert. Die so erhaltene Aufschlämmung wurde aus einer Höhe von etwa 20 cm über der Oberfläche der Lösung kontinuierlich in eine mit einem Magnetrührer gerührte 0,1 M CaCl2-Lösung gegossen, wodurch sich kugelförmige Gele mit einem Durchmesser von etwa 2 mm bildeten. Die Gele wurden bei Raumtemperatur etwa 2 Stunden lang in der Lösung stehengelassen und dann mit einem Büchnertrichter filtriert, worauf mit Alginat immobilisierte Zellen zurückgewonnen wurden. Die immobilisierten Zellen wurden in eine ummantelte Glassäule mit einem Durchmesser von 30 mm und einer Länge von 200 mm gepackt und auf 60°C erhitzt. Der Säule wurde von oben fließend eine 40%ige Maltoselösung (pH 6, 5) mit einer RG von 0, 2 zugeführt, wodurch man eine etwa 66%ige Trehaloselösung erhielt, die dann auf herkömmliche Weise aufgereinigt, eingeengt und sprühgetrocknet wurde, was eine pulverförmige Trehalose in einer Ausbeute von etwa 90%, TG, lieferte. Das Pulver hat eine relativ geringe Reduzierkraft und eine milde Süße, weshalb es sich ähnlich wie das Produkt aus Beispiel A-12 je nach Gutdünken für verschiedene Zusammensetzungen wie Nahrungsmittelprodukte, Kosmetika und Pharmazeutika eignet.
  • Beispiel B-1
  • Süßstoff
  • Ein Gewichtsteil eines wasserhaltigen kristallinen Trehalosepulvers, erhalten nach dem Verfahren in Beispiel A-8, wurde homogen mit 0,01 Gewichtsteilen " αG SWEET", einem im Handel von Toyo Sugar Refining Co., Ltd., Tokio, Japan, erhältlichen α-Glycosylsteviosidprodukt und 0,01 Gewichtsteilen "ASPARTAME", einem im Handel von Ajinomoto Co., Ltd., Tokio, Japan, erhältlichen L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylesterprodukt versetzt, und die so erhaltene Mischung wurde in einen Granulator gegeben, wodurch man ein Süßstoffgranulat erhielt.
  • Das Produkt hat eine zufriedenstellende Süße und eine etwa 2,5fach größere Süßkraft als Saccharose sowie einen Kalorienwert, der lediglich 2/5 des Wertes von Saccharose beträgt.
  • Da das Produkt eine zufriedenstellende Stabilität aufweist und andere damit zu mischende Süßstoffe nicht zersetzt, kann es geeigneterweise als kalorienarmer Süßstoff für kalorienarme Nahrungsmittel für übergewichtige Personen und Diabetiker, bei denen die Kalorienzufuhr eingeschränkt ist, verwendet werden.
  • Das Produkt bildet bei der Einwirkung von zahnkariesinduzierenden Mikroorganismen im wesentlichen keine Säuren und unlöslichen Glucane, und hierdurch eignet es sich für das Süßen von Nahrungsmittelprodukten zum Verhindern von Zahnkaries.
  • Beispiel B-2
  • Hartes Bonbon
  • 100 Gewichtsteile einer 55%igen (w/v) Saccharoselösung wurden unter Erhitzen mit 30 Gewichtsteilen eines nach dem Verfahren in Beispiel A-1 erhaltenen Trehalosesirups gemischt, und die so erhaltene Lösung wurde im Vakuum eingeengt, bis der Feuchtigkeitsgehalt auf unter 2% abgesenkt worden war. Das Konzentrat wurde mit 1 Gewichtsteil Citronensäure und angemessenen Mengen eines Zitronengeschmacks und eines Farbstoffs gemischt, und die so erhaltene Mischung wurde auf die herkömmliche Weise zum gewünschten Produkt geformt.
  • Bei dem Produkt handelt es sich um ein qualitativ hochwertiges Bonbon mit einem zufriedenstellenden Geschmack und zufriedenstellenden Bißeigenschaften, bei dem weiterhin nicht befürchtet werden muß, daß Saccharose auskristallisiert.
  • Beispiel B-3
  • Kaugummi
  • 3 Gewichtsteile einer Gummibasis wurden durch Erhitzen bis zum Erweichen geschmolzen, und das auf diese Weise erhaltene Material wurde mit 3 Gewichtsteilen kristallinem Maltit und 4 Gewichtsteilen eines nach dem Verfahren in Beispiel A-3 erhaltenen wasserhaltigen kristallinen Trehalosepulvers gemischt und weiter mit angemessenen Mengen eines Geschmackstoffs und eines Farbstoffs gemischt. Die so erhaltene Mischung wurde auf herkömmliche Weise mit einer Rolle geknetet, geformt und verpackt, wodurch man das gewünschte Produkt erhielt.
  • Bei dem Produkt handelt es sich um ein Kaugummi mit zufriedenstellender Beschaffenheit und zufriedenstellendem Geschmack, das geeigneterweise als Kaugummi mit relativ geringer bzw. im wesentlichen keiner zahnkariesinduzierenden Wirkung verwendet wird.
  • Beispiel B-4
  • Gepulverter Saft
  • 33 Gewichtsteile eines durch Sprühtrocknen hergestellten gepulverten Orangensafts wurden bis zur Homogenität mit 50 Gewichtsteilen eines nach dem Verfahren von Beispiel A-7 erhaltenen, füllmasseartigen Pulvers mit hohem Trehalosegehalt, 10 Gewichtsteilen Saccharose, 0,65 Gewichtsteilen wasserfreier Citronensäure, 0,1 Gewichtsteilen Äpfelsäure, 0,1 Gewichtsteilen L-Ascorbinsäure, 0,1 Gewichtsteilen Natriumcitrat, 0,5 Gewichtsteilen Pullu1an und einer angemessenen Menge eines gepulverten Geschmacksstoffs gemischt. Die so erhaltene Mischung wurde pulverisiert und in einem Wirbelschichtgranulator 30 min granuliert, wodurch man ein Granulat erhielt, das als Bindemittel mit einem durch das Verfahren aus Beispiel A-6 erhaltenem Trehalosesirup besprüht und bei einer Fließgeschwindigkeit von 150 m3 mit 40°C warmer Luft belüftet wurde. Das auf diese Weise erhaltene Granulat wurde gewogen und verpackt, was das gewünschte Produkt lieferte.
  • Das 30% Orangensaft, TG, enthaltende Produkt behielt seine hohe Qualität über einen relativ langen Zeitraum bei, ohne daß ein nicht zufriedenstellender Geschmack bzw. Geruch auftrat.
  • Beispiel B-5
  • Milchsäurebakteriengetränk
  • 175 Gewichtsteile entrahmtes Milchpulver, 130 Gewichtsteile nach dem Verfahren von Beispiel A-9 erhaltenem Trehalosesirup und 50 Gewichtsteile des in der japanischen offengelegten Patentschrift Nr. 281795/92 offenbarten Pulvers mit hohem Lactosaccharosegehalt wurden in 1150 Gewichtsteilen Wasser gelöst, und die Lösung wurde durch 30minütiges Erhitzen auf 65°C sterilisiert, auf 40°C abgekühlt, auf herkömmliche Weise mit 30 Gewichtsteilen Milchsäurebakterien als Starter gemischt und 8 Stunden lang bei 37°C inkubiert, wodurch man das gewünschte Produkt mit einem zufriedenstellenden Geschmack und Aroma erhielt. Da das Produkt Oligosaccharide enthält, sind die Milchsäurebakterien darin stabil, und das Wachstum wird gefördert.
  • Beispiel B-6
  • Eierkrem
  • 100 Gewichtsteile Maisstärke, 100 Gewichtsteile eines nach dem Verfahren in Beispiel A-6 erhaltenen Trehalosesirups, 80 Gewichtsteile Maltose, 20 Gewichtsteile Saccharose und 1 Gewichtsteil Salz wurden hinreichend gemischt. Die Mischung wurde mit 280 Gewichtsteilen Ei gemischt und schrittweise mit 1000 Gewichtsteilen kochender Milch gemischt. Die so erhaltene Mischung wurde unter Erhitzen weitergerührt, das Erhitzen wurde beendet, als die Maisstärke in der Mischung vollständig gelatinisiert war, so daß alle Bestandteile halbdurchsichtig erschienen, worauf das auf diese Weise erhaltenen Material abgekühlt und mit einer angemessenen Menge Vanillearoma versetzt wurde. Die so erhaltene Mischung wurde gewogen und verpackt, was das gewünschte Produkt lieferte.
  • Das Produkt hat eine glatte Oberfläche und Glanz sowie einen milden Geschmack und eine milde Süße.
  • Beispiel B-7
  • "Uiro-no-moto" (Vormischung für süßes Reisgelee)
  • Ein uiro-no-moto wurde hergestellt, indem man 90 Gewichtsteile Reispulver mit 20 Gewichtsteilen Maisstärke, 40 Gewichtsteilen Saccharose, 80 Gewichtsteilen einer nach dem Verfahren in Beispiel A-11 erhaltenen füllmasseähnlichen wasserhaltigen kristallinen Trehalose und 4 Gewichtsteile Pullulan homogen vermischte. Das Produkt wurde mit Wasser und einer angemessenen Menge matcha (gepulvertem Tee) verknetet, und die so erhaltene Mischung wurde in einen Behälter gegeben und 60 min mit Dampf behandelt, wodurch man einen uiro erhielt. Das Produkt hat einen zufriedenstellenden Glanz, zufriedenstellende Bißeigenschaften, Aroma und Geschmack sowie eine relativ lange Haltbarkeit, da die Rückumwandlung der darin enthaltenen Stärke gut gehemmt wird.
  • Beispiel B-8
  • Pulverförmiges Peptid
  • 1 Gewichtsteil "HINUTE S", einer im Handel von Fuji Oil Co., Ltd., Tokio, Japan, erhältlichen Peptidlösung, die zu 40% aus eßbaren Sojabohnen besteht, wurde mit 2 Gewichtsteilen einer nach dem Verfahren von Beispiel A-10 hergestellten wasserhaltigen kristallinen Trehalose gemischt, und die auf diese Weise erhaltene Mischung wurde in ein Kunststoffgefäß gegeben, im Vakuum bei 50°C getrocknet und pulverisiert, wodurch man ein pulverförmiges Peptid erhielt. Das Produkt hat einen zufriedenstellenden Geschmack und ein zufriedenstellendes Aroma und kann je nach Gutdünken als Material für Süßigkeiten wie Vormischungen, Sorbets und Eiscremes, sowie Babynahrung und therapeutischen Nahrungsmitteln für eine Ernährung auf oralem Wege oder durch Intubation verwendet werden.
  • Beispiel B-9
  • Gepulvertes miso
  • 1 Gewichtsteilen akamiso (eine miso-Art) wurde mit 3 Gewichtsteilen einer nach dem Verfahren in Beispiel A-4 erhaltenen pulverförmigen wasserfreien kristallinen Trehalose versetzt, und die Mischung wurde in eine Metallplatte gegossen, die auf ihrer Oberfläche halbkugelförmige Vertiefungen aufwies, und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen, wodurch man miso-Feststoffe mit einem Gewicht von jeweils etwa 4 g erhielt, die dann pulverisiert wurden, was das gewünschte Produkt lieferte.
  • Das Produkt läßt sich je nach Gutdünken als Gewürzstoff für Instantnudeln und Suppen sowie als miso-Süßigkeit verwenden.
  • Beispiel B-10
  • Gepulvertes Eigelb
  • Aus frischen Eiern gewonnenes Eigelb wurde bei 60–64°C mit einer Heizplatte sterilisiert, und 1 Gewichtsteil der auf diese Weise erhaltenen Flüssigkeit wurde mit 4 Gewichtsteilen einer nach dem Verfahren von Beispiel A-4 hergestellten pulverförmigen wasserfreien kristallinen Trehalose, bezogen auf 1 Gewichtsteil der Flüssigkeit, gemischt. Die so erhaltene Mischung wurde in ein Gefäß überführt und über Nacht stehengelassenen, wobei sich ein Block bildete, während die wasserfreie kristalline Trehalose in wasserhaltige kristalline Trehalose umgewandelt wurde. Der auf diese Weise erhaltene Block wurde in einem Schneidegerät pulverisiert, was ein gepulvertes Eigelb lieferte.
  • Das Produkt kann je nach Gutdünken als Material für Süßigkeiten für Vormischungen, Sorbets, Eiscremes und Emulgatoren sowie Babynahrung und therapeutische Nahrungsmittel für eine Ernährung auf oralem Wege oder durch Intubation verwendet werden. Das Produkt kann auch als Hautverschönerungsmittel und Haarpflegemittel angewendet werden.
  • Beispiel B-11
  • An (Bohnenpaste)
  • 10 Gewichtsteile Adzuki-Bohnen als Material wurden auf herkömmliche Weise mit Wasser gemischt und gekocht, wodurch der strenge Geschmack der Bohnen und wasserunlösliche Verunreinigungen entfernt wurde, was etwa 21 Gewichtsteile "adzuki-tsubu-nama-an" lieferte. Das so erhaltene Material wurde mit 14 Gewichtsteilen Saccharose, 5 Gewichtsteilen eines nach dem Verfahren von Beispiel A-12 erhaltenen Trehalosesirups und 5 Gewichtsteilen Wasser versetzt, und die auf diese Weise erhaltene Mischung wurde gekocht, mit einer geringen Menge Salatöl gemischt und vorsichtig geknetet, um die Bohnen nicht zu einer Paste zu zerdrücken. Dies lieferte etwa 35 Gewichtsteile des gewünschten Produkts.
  • Das Produkt ist frei von durch Kochen induzierten Verfärbungen und hat einen einen zufriedenstellenden Geschmack und ein zufriedenstellendes Aroma, und es eignet sich daher als an-Material für Bohnenmarmeladegebäck, Gebäck mit Bohnenmarmeladefüllung, Knödel, mit Bohnenmarmelade gefüllte Oblaten, Sorbets und Eiscremes.
  • Beispiel B-12
  • Brot
  • 100 Gewichtsteile Weizenpulver, 2 Gewichtsteile Hefe, 5 Gewichtsteile Zucker, 1 Gewichtsteil einer nach dem Verfahren von Beispiel A-14 erhaltenen pulverförmigen wasserhaltigen kristallinen Trehalose und 0,1 Gewichtsteile einer anorganischen Hefenahrung wurde auf herkömmliche Weise mit Wasser geknetet, 2 Stunden lang bei 26°C fermentiert, 30 min gehengelassen und fertigbacken.
  • Bei dem Produkt handelt es sich um qualitativ hochwertiges Brot mit einer zufriedenstellenden Färbung, das in zufriedenstellender Weise aufgegangen war sowie eine zufriedenstellende Elastizität und eine milde Süße aufwies.
  • Beispiel B-13
  • Schinken
  • 1000 Gewichtsteile von in Scheiben geschnittenem Schinkenfleisch wurden mit 15 Gewichtsteilen Salz und 3 Gewichtsteilen Kaliumnitrat versetzt und bis zur Homogenität verrieben, und die Schinkenfleischscheiben wurden aufeinandergelegt und über Nacht in einem Kühllager stehen gelassen. Im Anschluß daran wurden die so erhaltenen Scheiben zunächst 7 Tage lang in einem Kühllager in einer aus 500 Gewichtsteilen Wasser, 100 Gewichtsteilen Salz, 3 Gewichtsteilen Kaliumnitrat, 40 Gewichtsteilen eines nach dem Verfahren in Beispiel A-3 hergestellten wasserhaltigen kristallinen Trehalosepulvers und einer entsprechenden Menge Pfefferminze bestehenden Salzlösung einweichen gelassen, auf herkömmliche Weise mit kaltem Wasser gewaschen, mit einer Schnur zusammengebunden, geräuchert, gekocht, abgekühlt und abgepackt, was das gewünschte Produkt lieferte.
  • Bei dem Produkt handelt es sich um einen qualitativ hochwertigen Schinken mit zufriedenstellender Färbung, Geschmack und Aroma.
  • Beispiel B-14
  • Gesüßte Kondensmilch
  • In 100 Gewichtsteilen frischer Milch als Material wurden 3 Gewichtsteile eines nach dem Verfahren in Beispiel A-5 erhaltenen Trehalosesirups und 1 Gewichtsteil Saccharose gelöst, und die Mischung wurde durch Erhitzen mit einer Heizplatte zu einem 70%igen Sirup, TG, eingeengt, der dann keimfrei in Dosen abgefüllt wurde, wodurch man das gewünschte Produkt erhielt.
  • Da das Produkt eine milde Süße und ein mildes Aroma aufweist, kann es je nach Gutdünken zum Anrichten von Nahrungsmitteln für Kleinkinder und Kinder, für Früchte, Kaffee, Kakao und Tee verwendet werden.
  • Beispiel B-15
  • Kosmetische Creme
  • 2 Gewichtsteile Polyoxyethylenglykolmonostearat, 5 Gewichtsteile Glycerylmonostearat, selbstemulgierend, 2 Gewichtsteile eines nach dem Verfahren in Beispiel A-7 erhaltenen füllmasseartigen Pulvers mit hohem Trehalosegehalt, 1 Gewichtsteil α-Glycosylrutin, 1 Gewichtsteil Rohvaseline, 10 Gewichtsteile Glyceryltri-2-ethylhexanoat und eine angemessene Menge eines antiseptischen Mittels wurden auf die übliche Weise durch Erhitzen in Lösung gebracht. Die auf diese Weise erhaltene Lösung wurde mit 2 Gewichtsteilen L-Milchsäure, 5 Gewichtsteilen 1,3-Butylenglykol und 66 Gewichtsteilen gereinigtem Wasser gemischt, und die so erhaltene Mischung wurde mit einem Homogenisator emulgiert und unter Rühren mit einer angemessenen Menge eines Aromas gemischt, wodurch man eine kosmetische Creme erhielt.
  • Das Produkt, das eine relativ hohe Stabilität aufweist, läßt sich je nach Gutdünken als qualitativ hochwertiges Sonnenschutzmittel, Hautverschönerungsmittel und Mittel zur Aufhellung der Haut verwenden.
  • Beispiel B-16
  • Gepulverter Ginsengextrakt
  • ½ Gewichtsteil Ginsengextrakt wurde mit 1,5 Gewichtsteilen eines nach dem Verfahren von Beispiel A-4 hergestellten wasserfreien kristallinen Trehalosepulvers gemischt, und die so erhaltene Mischung wurde in einen einfachen Behälter gegeben, 2 Tage lang stehengelassen, um die wasserfreie kristalline Trehalose in wasserhal tige kristalline Trehalose umzuwandeln und einen Block zu bilden, worauf der Block mit einem Schneidegerät pulverisiert und das so erhaltene Material gesiebt wurde, wodurch man einen gepulverten Ginsengextrakt erhielt.
  • Das Produkt und angemessene Mengen an pulverförmigen Vitaminen B1 und B2 wurden in einem Granulator verarbeitet, was einen vitaminhaltigen gepulverten Ginsengextrakt lieferte.
  • Das so erhaltene Produkt kann je nach Gutdünken als Tonikum, als Mittel gegen Ermüdung und als Energie verleihendes Mittel verwendet werden. Das Produkt kann auch als Haarpflegemittel verwendet werden.
  • Beispiel B-17
  • Festes Pharmazeutikum
  • Eine Zubereitung von natürlichem humanem Interferon-α, hergestellt von Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayama, Japan, und im Handel erhältlich von Cosmo Bio, Tokio, Japan, wurde auf herkömmliche Weise auf eine Säule mit immobilisiertem Anti-Humaninterferon-α-Antikörper gegeben, um das Interferon-α zu absorbieren, und ein Kälberserumalbumin als Stabilisator enthaltender Puffer wurde der Säule zugeführt, worauf überschüssiges Albumin entfernt wurde. Im Anschluß daran wurde das Interferon-α mit einer physiologischen Kochsalzlösung, die zu 5% aus einem nach dem Verfahren von Beispiel A-2 hergestellten Pulver mit hohem Trehalosegehalt bestand, aus der Säule eluiert, wobei der pH-Wert der physiologischen Kochsalzlösung schwankte. Das auf diese Weise erhaltene Eluat wurde einer Membranfiltration unterzogen, und das Filtrat wurde durch Zugabe eines etwa 20fachen Volumens von "FINETOSE®", eines im Handel von Hayashibara Shoji, Inc., Okayama, Japan, erhältlichen wasserfreien kristallinen Maltosepulvers, dehydratisiert, worauf das so erhaltene dehydratisierte Produkt pulverisiert und das so erhaltene Pulver in einer Tablettiermaschine zu Tabletten verpreßt wurde, was Tabletten lieferte, die pro Tablette mit einem Gewicht von etwa 200 mg etwa 150 Einheiten natürliches humanes Interferon-α enthielten.
  • Das Produkt kann oral als sublinguale Tablette an Patienten in einer Dosis von 1-10 Tabletten/Erwachsener/Tag verabreicht werden und je nach Gutdünken zur Behandlung von Virenerkrankungen, Allergien, Rheumatismus, Diabetes und bösartigen Tumoren verwendet werden. Das Produkt läßt sich insbesondere geeigneterweise als therapeutisches Mittel für AIDS und Hepatitis einsetzen; die Anzahl von an diesen Krankheiten leidenden Patienten hat in bemerkenswerter Weise zugenommen. Die in das Produkt eingearbeitete Trehalose und Maltose wirken als Stabilisator für das natürliche humane Interferon-α, so daß die Wirksamkeit selbst bei Raumtemperatur über einen relativ langen Zeitraum aufrechterhalten bleibt.
  • Beispiel B-18
  • Dragees
  • Eine Rohtablette mit einem Gewicht von 150 mg wurde als Kern mit einer aus 40 Gewichtsteilen einer nach dem Verfahren von Beispiel A-3 erhaltenen pulverförmigen wasserhaltigen kristallinen Trehalose, 2 Gewichtsteilen Pullulan mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 200000, 30 Gewichtsteilen Wasser, 25 Gewichtsteilen Talkum und 3 Gewichtsteilen Titanoxid bestehenden Lösung überzogen, bis ein Gesamtgewicht von etwa 230 mg erreicht worden war, und das so erhaltene Material wurde weiter mit einer aus 65 Gewichtsteilen einer frischen Zubereitung der gleichen pulverförmigen wasserhaltigen kristallinen Trehalose, 1 Gewichtsteil Pullulan und 34 Gewichtsteilen Wasser bestehenden Lösung überzogen und mit einem flüssigen Wachs poliert, wodurch man ein Dragee mit zufriedenstellendem Glanz und zufriedenstellendem Aussehen erhielt.
  • Das Produkt hat eine relativ hohe Stoßunempfindlichkeit und behält seine hohe Qualität über einen relativ langen Zeitraum.
  • Beispiel B-19
  • Zahnputzmittel
  • Ein Zahnputzmittel wurde auf die übliche Weise durch Mischen der folgenden Bestandteile hergestellt:
    Figure 00910001
  • Das Produkt wird zufriedenstellend als Zahnputzmittel für Kleinkinder verwendet, da es eine ausreichende Süße aufweist.
  • Beispiel B-20
  • Feste Zubereitung für eine Nahrungszufuhr durch Intubation
  • Es wurde eine aus den folgenden Zusammensetzungen bestehende Zusammensetzung hergestellt: 500 Gewichtsteile einer nach dem Verfahren von Beispiel A-8 hergestellten wasserhaltigen kristallinen Trehalose, 270 Gewichtsteile gepulvertes Eigelb, 209 Gewichtsteile entrahmte Milch, 4,4 Gewichtsteile Natriumchlorid, 1,8 Gewichtsteile Kaliumchlorid, 4 Gewichtsteile Magnesiumsulfat, 0,01 Gewichtsteile Thiamin, 0,1 Gewichtsteile Natriumascorbat, 0,6 Gewichtsteile Vitamin-E-acetat und 0,04 Gewichtsteile Nicotinamid. 25-g-Aliquots der Zusammensetzung wurden in kleine feuchtigkeitsunempfindliche laminierte Beutel injiziert und hitzeversiegelt, wodurch man das gewünschte Produkt erhielt.
  • Ein Beutel des Produkts wird in etwa 150–300 ml Wasser zu einer Flüssignahrung gelöst und oral oder parenteral durch Intubation an die Nasenhöhle, den Magen oder den Darm verabreicht, für die Versorgung von Lebewesen mit Energie.
  • Beispiel B-21
  • Hyperalimentation
  • Eine nach dem Verfahren von Beispiel A-10 hergestellte hochreine wasserhaltige kristalline Trehalose wurde in Wasser zu einer etwa 10%igen (w/v) wäßrigen Trehaloselösung gelöst, die dann zum Entfernen von Pyrogenen auf die übliche Weise membranfiltriert und aseptisch in eine Kunststofflasche injiziert wurde, die dann verschlossen wurde, was das gewünschte Produkt lieferte.
  • Das Produkt, bei dem es sich um eine zufriedenstellend stabile Hyperalimentation handelt, die beim Stehenlassen im wesentlichen keinen Veränderungen unterliegt, eignet sich für intravenöse und intraperitoneale Verabreichungen. Eine 10%ige (w/v) Lösung des Produkts ist isotonisch mit Blut, und dies bedeutet, daß man hiermit Lebewesen mit einer 2fach höheren Konzentration wie im Fall von Glucose Energie zuführen kann.
  • Beispiel B-22
  • Hyperalimentation
  • Eine nach dem Verfahren von Beispiel A-13 hergestellte hochreine wasserhaltige kristalline Trehalose und eine Aminosäurezusammensetzung bestehend aus den folgenden Komponenten wurde durch Rühren in Wasser gelöst, wodurch sich Konzentrationen von 5% (w/v) bzw. 30% (w/v) ergaben, und die auf diese Weise erhaltene Lösung wurde ähnlich wie in Beispiel B-10 aufgereinigt, wodurch man eine pyrogenfreie Lösung erhielt, die anschließend in eine Kunststofflasche injiziert wurde, die dann verschlossen wurde, was das gewünschte Produkt lieferte.
  • Figure 00930001
  • Obwohl es sich bei dem Produkt um eine Mehrfachhyperalimentation mit Trehalose und Aminosäuren handelt, ist sie zufriedenstellend stabil und unterliegt beim Stehenlassen keinen wesentlichen Veränderungen und läßt sich in geeigneter Weise Lebewesen intravenös und intraperitoneal verabreichen. Das Produkt kann je nach Gutdünken zur Zufuhr von Energie sowie Aminosäuren an Lebewesen verwendet werden.
  • Beispiel B-23
  • Salbe zur Behandlung von Trauma
  • 200 Gewichtsteile eines nach dem Verfahren von Beispiel A-2 hergestellten Pulvers mit hohem Trehalosegehalt und 300 Gewichtsteile Maltose wurden mit 50 Gewichtsteilen einer Methanollösung, die 3 Gewichtsteile Iod enthielt, gemischt, und die auf diese Weise erhaltene Lösung wurde mit 200 Gewichtsteilen einer 10%igen (w/v) wäßrigen Pullulanlösung gemischt, wodurch man das gewünschte Produkt mit einer zufriedenstellenden Spreitbarkeit und Haftfähigkeit erhielt.
  • Das in dem Produkt enthaltene Iod wirkt bakterizid, und die Trehalose in dem Produkt wirkt als energieergänzendes Mittel für lebensfähige Zellen, und aufgrund dieser Eigenschaften verkürzt das Produkt den Heilungszeitraum und heilt eine Wundoberfläche in zufriedenstellender Weise.
  • Wie aus dem obengenannten ersichtlich ist, wandelt das erfindungsgemäße neue Maltose-Trehalose-umwandelnde Enzym Maltose in einer zufriedenstellend hohen Ausbeute in Trehalose um. Die durch die erfindungsgemäße enzymatische Umsetzung erhaltene erfindungsgemäße Trehalose und die diese enthaltende Saccharidzusammensetzung haben eine relativ hohe Stabilität und Qualität sowie eine wunderbare Süße. Sie werden von lebenden Organismen bei oraler Verabreichung als Energiequelle assimiliert, absorbiert und verwendet. Sie können daher je nach Gutdünken als Süßstoff, geschmackverbesserndes Mittel, qualitätsverbesserndes Mittel, Stabilisator, Hilfsstoff, Verdünnungsmittel und Füllstoff in verschiedenen Zusammensetzungen wie Nahrungsmittelprodukten, Kosmetika und Pharmazeutika verwendet werden.
  • Mit der vorliegenden Erfindung wird somit ein neues Verfahren zur Herstellung von Trehalose aus Maltose, die sich aus Stärke als billiger und im wesentlichen unerschöpflicher natürlicher Quelle herstellen läßt, und zum Herstellen einer die Trehalose enthaltenden Saccharidzusammensetzung in großtechnischem Maßstab und mit relativ geringen Kosten bereitgestellt. Die vorliegende Erfindung hat daher einen unermeßlich großen Einfluß auf Gebiete wie Stärkewissenschaft, Enzymwissenschaft und biochemische Wissenschaften und andere industrielle Gebiete, insbesondere die Lebensmittelindustrie, die kosmetische Industrie und die pharmazeutische Industrie, sowie die Forstwirtschaft, die Fischerei, die Landwirktschaft, die Viehzucht und die chemische Industrie. Der Einfluß der vorliegenden Erfindung auf diese Gebiete ist daher unermeßlich groß.
  • Was beschrieben wurde ist, was gegenwärtig als die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung angesehen werden, es versteht sich jedoch, daß man verschiedene Modifikationen vornehmen kann, und die beigefügten Ansprüche sollen alle diese Modifikationen, die in den Geist und den Schutzbereich der Erfindung fallen, abdecken.

Claims (8)

  1. Ein Verfahren zur Herstellung eines Produktes mit hohem Trehalosegehalt mit: (a) Bereitstellen einer maltose- und trehalosehaltigen Lösung, (b) Ermöglichen der Einwirkung von Glucoamylase und/oder α-Glucosidase auf die Lösung zur Hydrolyse der Maltose zu Glucose, (c) Entfernen der Glucose aus der resultierenden Mischung durch Ionenaustausch-Säulenchromatographie und (d) Rückgewinnen des resultierenden Produktes mit hohem Trehalosegehalt.
  2. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Ionenaustausch-Säulenchromatographie in Schritt (c) einen starksauren Kationenaustauscher benutzt.
  3. Das Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Lösung hergestellt wird durch: (a) Ermöglichen des Kontaktes eines Enzyms, das Maltose in Trehalose umwandelt und umgekehrt, mit einer Maltoselösung zur Bildung von Trehalose und (b) Rückgewinnen der resultierenden maltose- und trehalosehaltigen Lösung.
  4. Das Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Enzym aus einem Mikroorganismus gewonnen wird.
  5. Das Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Mikroorganismus der Art Pimelobacter, Pseudomonas oder Thermus angehört.
  6. Das Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Mikroorganismus Pimelobacter sp. R48 (FERM BP-4315), Pseudomonas putida H262 (FERM BP-4579) oder Thermus aquaticus (ATCC 33923) ist.
  7. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, wobei das Enzym folgende physikochemische Eigenschaften aufweist: (1) Molekulargewicht Ungefähr 57.000–120.000 Dalton nach Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE), (2) Isoelektrischer Punkt (pI) Ungefähr 3.8–5.1 nach Isoelektrophorese mit Ampholyt; und (3) Inhibierung der Aktivität Inhibiert durch ein mM Cu++, 50 mM Tris-HCl Puffer.
  8. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 7, wobei das Enzym eine Aminosäureteilsequenz ausgewählt aus folgender Gruppe aufweist: (1) Trp – X1 – Arg – X2 – Ala – X3 – Phe (wobei "X1" für "Phe" oder "Pro", "X2" für "Thr" oder "Pro" und "X3" für "Val" oder "Ala" steht); und (2) Ala – Val – X4 – Tyr (wobei "X4" für "Phe" oder "Ile" steht).
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