DE69929226T2

DE69929226T2 - Heteropolysaccharid aus agrobacterium radiobacter

Info

Publication number: DE69929226T2
Application number: DE69929226T
Authority: DE
Inventors: Robert Cantiani; Alain Senechal; Sophie Vaslin; Paule Chevallereau; Jean-Luc Simon
Original assignee: Danisco France SAS
Current assignee: Danisco France SAS
Priority date: 1998-10-13
Filing date: 1999-10-08
Publication date: 2006-08-24
Anticipated expiration: 2019-10-09
Also published as: US6509176B1; EP1121453A1; BR9914405A; DE69929226D1; CN1323351A; WO2000022154A1; CA2346512A1; AU5991099A; JP2002527072A; JP3943335B2; EP1121453B1; CA2346512C; ATE314484T1; FR2784395A1; FR2784395B1; CN1192113C

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Heteropolysaccharid (HP), das durch Fermentation eines Mediums erhalten werden kann, das wenigstens einen Stamm Agrobacterium radiobacter I-2001 (oder DSM 12095), eine seiner rekombinanten Formen oder seiner Mutanten und eine durch besagten Stamm, eine seiner rekombinanten Formen oder eine seiner Mutanten assimilierbare Kohlenstoffquelle umfasst.
In zahlreichen Industriesparten ist man ständig auf der Suche nach neuen Verbindungen, die:

– verbesserte rheologische Eigenschaften aufweisen und Gele bilden können,
– eine gesteigerte Kompatibilität mit den Medien, denen sie zugesetzt werden, und
– eine hohe Stabilität in einer weiten Temperatur- und pH-Spanne aufweisen.

Im Fall der Verbindungen, die am Ende einer bakteriellen Fermentation erhalten werden, ist es auch wichtig, dass die Verbindung eine gute Produktivität besitzt.
Die Fähigkeit zu gelieren ist sehr interessant, weil dies aufgrund der Vielfalt der Gebiete, in denen sie Anwendungen finden, besonders attraktive System sind: bestimmte Anwendungen erfordern die Verwendung eines Gels.
So schlägt beispielsweise die Agrifood-Industrie eine große Palette von gelierten Produkten vor (Cremes, Joghurts, verschiedene Gelees, Eis ...), die Pharmaindustrie verwendet die Gele als Wirkstoffträger oder Verdickungsmittel.
Auf einem ganz anderen Gebiet tropfen bestimmte Farben nicht, weil sie in Ruhe Gelmerkmale besitzen, während sie sich unter der Wirkung eines Pinsels leicht verstreichen lassen (strukturviskoses Profil).
Die wässrigen Gele werden auch als Chromatographieträger oder auch für die Herstellung von Kontaktlinsen verwendet.
Die Heteropolysaccharide bakteriellen Ursprungs, wie beispielsweise Xanthangummi, wurden bereits beschrieben und wegen ihrer leistungsstarken rheologischen Eigenschaften unter extremen Temperatur- und pH-Bedingungen verwendet. Jedoch führen diese Heteropolysaccharide, die sich bei Anwendungen in Lösung eignen, nicht immer zu Gelen.
Es ist bekannt, dass die Gelierung eines Mediums stattfindet, wenn als Folge der Vernetzung der Bestandteile besagten Mediums ein dreidimensionales Netz gebildet wird.
Üblicherweise wird diese Gelierung durch Zugabe von zusätzlichen Kationen, insbesondere vom Typ Alkali oder Erdalkali (beispielsweise Calcium und/oder Magnesium) zu dem Medium, durch Kippen des pH zu sauren oder basischen pH-Werten, durch Zusatz einer weiteren Verbindung, insbesondere eines weiteren Polysaccharids (beispielsweise die Kombination von Xanthan und Johannisbrotkernmehl) oder durch Veränderung der Temperatur herbeigeführt.
Wie auch immer die angestrebte Anwendung sein mag, die zuvor angeführten Gelierungsbedingungen können:

– der Stabilität und der Kompatibilität des endgültigen Gels wegen der Wechselwirkungen zwischen den zusätzlichen Kationen oder dem Coadditiv, die man einführen muss, um das Gel zu erhalten, und den anderen Bestandteilen, die in besagten Zusammensetzungen vorhanden sind, schaden oder
– das Heteropolysaccharid und/oder die anderen Bestandteile, die in besagten Zusammensetzungen vorhanden sind, aufgrund der hohen Temperaturen und/oder der pH-Änderungen denaturieren.

US 4 247 639 und EP 0 001 895 beschreiben ein Heteropolysaccharid, das aus 33% Mannose, 29% Glucose, 21% Galactose und 17% Glucuronsäure besteht und 5,7% Acetyl und 4,9% Pyruvat enthält.
WO 94/06927 beschreibt ein mit Hilfe von Agrobacterium ATCC 55341 erhaltenes Heteropolysaccharid, das Glucose und Galactose in einem Molverhältnis von 7:1 enthält.
Mit "Gel" bezeichnet man im Rahmen der vorliegenden Erfindung einen Pseudo-Feststoff (Verhalten nahe am Feststoff), der aus der wenigstens teilweisen Assoziation von Heteropolysaccharidketten, die in einer Flüssigkeit dispergiert sind, resultiert. In einem Bereich von Beanspruchungsfrequenzen ω sind die pseudofesten Gele im Allgemeinen bezüglich ihrer festen Komponente durch einen Elastizitätsmodul G'(ω), der auch Speichermodul genannt wird, und bezüglich ihrer flüssigen oder viskosen Komponente durch einen Viskositätsmodul G''(ω), der auch Verlustmodul genannt wird, gekennzeichnet.
Die mechanischen Größen G'(ω) und G''(ω) können mit Hilfe eines deformationsgesteuerten Rheometers, das in oszillierendem Betrieb arbeitet, gemessen werden. Als Anhaltspunkt und nicht beschränkend kann man beispielsweise ein Rheometer Rheo-Fluid Spectrometer^® anführen.
G' und G'' können auch auf einem schubspannungsgesteuerten Rheometer, das in oszillierendem Betrieb arbeitet, gemessen werden. Als Anhaltspunkt kann man beispielsweise ein CARRIMED^®- Rheometer anführen.
Das Prinzip der Messung besteht darin, als Erstes das Gebiet der reversiblen mechanischen Deformation, in dem die Reaktion des Gels auf die mechanische Beanspruchung als Funktion besagter Deformation linear ist, zu bestimmen. Als Zweites wird das Gel einem festen Wert der mechanischen Deformation, der in dem zuvor bestimmten linearen Gebiet liegt, unterzogen. Dann nimmt das Rheometer einen Sweep der Frequenz ω vor.
Die Reaktion des Gels auf die Schubspannung, die mit der Deformation in Phase ist, ergibt den Zugang zu dem Elastizitätsmodul G'(ω). G'(ω) entspricht der Energie, die von dem Gel in elastischer Form aufgenommen wird und die wiedergewinnbar ist.
Die Reaktion des Gels auf die Schubspannung, die um einen Winkel von 90° zur Deformation phasenverschoben ist, ergibt den Zugang zu dem Viskositätsmodul G''(ω). G''(ω) entspricht der Energie, die durch viskoses Fließen dissipiert wird und die nicht wiedergewinnbar ist.
Ein Gel wird stark oder echt genannt, wenn in dem gesamten durchfahrenen Bereich der Beanspruchungsfrequenz (ω) das Verhältnis G'/G'' größer oder gleich 10 ist, das heißt wenn die Elastizität des Gels stark bleibt, und wenn der Wert von G'(ω) größer oder gleich 10 Pa ist.
Die vorliegende Erfindung hat genau zum Ziel, Heteropolysaccharide vorzuschlagen, die sehr gute rheologische Eigenschaften insbesondere bezüglich der verdickenden und pseudo-plastischen (strukturviskosen) Eigenschaften sowie die Fähigkeit besitzen, ohne Zugabe von zusätzlichen Kationen zu dem Medium, ohne Kippen des pH zu echten Gelen zu führen und dies bei Temperaturen unter oder gleich 40°C.
Die vorliegende Erfindung hat auch zum Ziel, ein Heteropolysaccharid vorzuschlagen, das sehr gute rheologische Eigenschaften bei geringen Konzentrationen aufweist.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich also auf ein Heteropolysaccharid (HP), das durch Fermentation eines Mediums erhalten werden kann, das wenigstens einen Stamm Agrobactenum radiobacter I-2001 (oder DSM 12095), eine seiner rekombinanten Formen oder eine seiner Mutanten und eine durch besagten Stamm, eine seiner rekombinanten Formen oder eine seiner Mutanten assimilierbare Kohlenstoffquelle umfasst.
Der Stamm Agrobacterium radiobacter wurde gemäß dem Budapester Vertrag bei der Collection Nationale de Culture des Micro-organismes (CNCM) am 3. April 1998 eingetragen, wo er unter der Nummer I-2001 öffentlich zugänglich ist. Er wurde auch bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) am 21. April 1998 eingetragen, wo er unter der Nummer DSM 12095 öffentlich zugänglich ist.
Die Reinkultur von Agrobactenum radiobacter I-2001 (oder DSM 12095) kann in einer Petrischale, die bei einer Temperatur zwischen 25°C und 30°C und spezieller zwischen 25°C und 28°C etwa 24 Stunden lang inkubiert wird, ausgeführt werden.
Die von Agrobacterium radiobacter I-2001 (oder DSM 12095) assimilierbaren Kohlenstoff- und Stickstoffquellen können ausgewählt sein unter Glucose, Fructose, Galactose, Trehalose, Mannose, Melobiose, Saccharose, Raffinose, Maltotriose. Maltose, Lactose, Lactulose, Methyl-β-galactopyranosid, Methyl-α-galactopyranosid, Cellobiose, Gentobiose, Methyl-β-D-glucopyranosid, Methyl-α-D-glucopyranosid, Esculin, Ribose, Arabinose, Xylose, Palatinose, Rhamnose, Fucose, Melezitose, D(+)-Arabitol, L(–)-Arabitol, Xylitol, Dulcitol, Tagatose, Glycerol, myo-Inositol, Mannitol, Maltitol, Turanose, Sorbitol, Adonitol, Lyxose, Erythritol, D(–)-Tartrat, D(+)- Malat, L(–)-Malat, cis-Aconitat, trans-Aconitat, 2-Keto-D-gluconat, N-Acetylglucosamin, Chinat, Betain, Succinat, Fumarat, Glycerat und Glucosamin.
Unter den möglichen Erhaltungsmedien für den Stamm wird das Erhaltungsmedium vom Typ MY-Agar von Difco (Artikelnummer 0712-01-8) als besonders vorteilhaft betrachtet. Besagtes MY-Agar-Medium von Difco hat die folgende Zusammensetzung:

– Bacto-Hefeextrakt^TM 3 g

– Malzextrakt 3 g

– Bacto-Pepton^TM 5 g

– Bacto-Dextrose^TM 10 g

– Bacto-Agar^TM 20 g
Für die Aufbewahrung des Stamms ist es vorzuziehen, wenigstens einen Schritt der Vorkultur vorzusehen. Unter Vorkulturschritt versteht man einen Schritt, der darin besteht, dass sich der Bakterienstamm ohne Produktion von Polysaccharid entwickelt und vermehrt.
Es konnte gezeigt werden, dass das Heteropolysaccharid (HP) ausschließlich Einheiten aus Glucose und/oder ihren Derivaten, Galactose und/oder ihren Derivaten, Glucuronsäure und/oder ihren Salzen, Essigsäure und/oder ihren Salzen, Brenztraubensäure und/oder ihren Salzen umfasst.
Die Grundeinheiten des Heteropolysaccharids (HP) liegen im Allgemeinen in folgenden molaren Anteilen vor, wobei man als Bezug Glucose gleich 1 setzt:

– Galactose und/oder ihre Derivate 0,2–5,
– Glucuronsäure und/oder ihre Salze 0,1–3,
– Essigsäure und/oder ihre Salze 0–5,
– Brenztraubensäure und/oder ihre Salze 0,01–2.

Spezieller sind besagte Einheiten in folgenden molaren Anteilen vorhanden, wobei man als Bezug Glucose gleich 1 setzt:

– Galactose und/oder ihre Derivate 0,5–4 und bevorzugt 0,8–2,
– Glucuronsäure und/oder ihre Salze 0,2–2 und bevorzugt 0,4–1,
– Essigsäure und/oder ihre Salze 0–4 und bevorzugt 0–3,
– Brenztraubensäure und/oder ihre Salze 0,01–2.

Glucuron-, Essig- und Brenztraubensäure können in Form von Salzen vorliegen. Als Salze kann man die Natrium-, Kalium-, Calcium- oder Ammoniumsalze anführen.
Die Verfahren zur Analyse des Heteropolysaccharids (HP), die es ermöglichten, seine Rohformel, wie oben spezifiziert, zu bestimmen, haben die Bestimmung der Grundelemente (Monosaccharide und Säuren) nach Hydrolyse besagten Heteropolysaccharids (HP) und chromatographische quantitative Bestimmungen durch internen oder externen Standard als Prinzip.
So wurde die quantitative Bestimmung der Monosaccharide auf die folgende Weise durchgeführt:
100 mg Heteropolysaccharid (HP) werden in hermetischen Röhrchen mit 5 ml molarer Trifluoressigsäure bei 105°C drei bis sechs Stunden lang hydrolysiert.
Diesem Vorgang folgt ein Verdampfen bis zur Trockne und eine Wiederaufnahme des trockenen Rückstands in 5 ml Pyridin, das 15 mg Sorbitol als internen Standard enthält; dann eine Silylierung an 1 ml Pyridinlösung mit 0,9 ml Hexamethyldisilazan. Die Silylierung wird mit 0,1 ml Trifluoressigsäure katalysiert.
Die quantitative Bestimmung der Monosaccharide wird dann durch Gaschromatographie mit FID-Detektion (Flame Ionisation Detection) auf einer Kapillarsäule aus Glas mit 25 m Länge und 0,25 mm Durchmesser, die mit einer Methylsiliconphase, die eine Filmdicke von 0,14 Mikrometer aufweist, belegt ist, ausgeführt. Das verwendete Trägergas ist Wasserstoff mit einem Durchsatz von 2 ml/Minute.
Die quantitative Bestimmung der Brenztraubensäure wird ausgehend von einer Mutterlösung durchgeführt, die durch Hydrolyse von 50 mg Heteropolysaccharid (HP) mit 5 ml 1 N Salzsäure während 1 Stunde bei 105°C, dann Zugabe von 2 mg Ketoglutarsäure (die den internen Standard darstellt) und Einstellen auf 25 ml mit destilliertem Wasser erhalten wird. Diesem Vorgang folgt eine Reaktion mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin (DNPH):

– zu 1 ml der vorhergehenden Lösung fügt man 1 ml DNPH-Lösung mit 7 mg/ml in 2 N HCl hinzu;
– die Reaktionszeit beträgt 5 Minuten; dann
– fügt man 2 ml Aceton und 6 ml Wasser-Acetonitril-Gemisch hinzu.

Die quantitative Bestimmung wird dann durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit einer Säule durchgeführt, die mit C-18 modifiziertem Kieselgel mit 5 Mikrometer Durchmesser belegt ist, deren Länge 250 mm und deren Durchmesser 4,6 mm beträgt. Das verwendete Eluierungsmittel ist ein 50/50-Volumengemisch von Phosphorsäure mit 0,02 mol/l und von Acetonitril. Der Durchsatz beträgt 2 ml/Minute.
Die Detektion der Brenztraubensäure erfolgt mit Ultraviolett bei 375 nm.
Die quantitative Bestimmung der Essigsäure erfolgt nach Hydrolyse von 100 mg Heteropolysaccharid (HP) mit 5 ml 2 N Salzsäure bei 105°C während einer Stunde. Dann fügt man 5 ml einer Propionsäurelösung mit 5 mg/ml als internen Standard hinzu und man füllt mit 15 ml entmineralisiertem Wasser auf. Die quantitative Bestimmung wird durch HPLC mit einer Säule, die mit C-18 modifiziertem Kieselgel mit 5 Mikrometer Durchmesser belegt ist, mit einer Länge von 250 cm und einem Durchmesser von 4,6 mm ausgeführt. Das Eluierungsmittel ist eine wässrige Phosphorsäurelösung mit 0,02 mol/l mit einem Durchsatz von 1,2 ml/Minute. Die Detektion erfolgt refraktometrisch.
Die Glucuronsäure wird quantitativ über das CO₂ bestimmt, das durch die Decarboxylierung als Folge der Behandlung des Gummis mit Salzsäure in der Hitze gemäß dem Verfahren, das in Food Chemical Codex, 4. Auflage, Seite 768 beschrieben ist, freigesetzt wird.
Das Gewichtsmittel der Molmasse wird durch Ausschlusschromatographie auf einer Säule TSK PW 4000^TM und 6000^TM in Reihe (Säulen mit einer Länge von 30 cm und einem Durchmesser von 7 mm) mit refraktometrischer Detektion bestimmt. Das Eluierungsmittel ist eine Natriumnitratlösung mit 0,1 mol/l. Das Heteropolysaccharid ist zu etwa 0,015 Gew.-% in dem Eluierungsmittel. Die Kalibrierung wird mit Pullulanen durchgeführt, die monodisperse Polysaccharide mit Molmassen zwischen 5·10³ und 1,6·10⁶ g/ml sind, die bis auf 10⁷ g/mol extrapoliert werden.
Das Gewichtsmittel der Molmasse (Mw) wird aus der aus dem Chromatogramm stammenden Massenverteilungskurve erhalten: es liegt im Allgemeinen zwischen 1·10⁵ und 5·10⁶ g/mol, vorzugsweise zwischen etwa 8·10⁵ und 5·10⁶ g/mol. Das Gewichtsmittel der Molmasse beträgt spezieller etwa 3·10⁶ g/mol.
Wie bereits erwähnt, weist das (HP) in Lösung, insbesondere in destilliertem Wasser oder in Leitungswasser sehr gute rheologische Eigenschaften auf.
So hat man feststellen können, dass beispielsweise Lösungen mit 1% in Gewicht/Gewicht (HP) in destilliertem Wasser bei 23°C und bei einer Frequenz von 1 Hz zu Werten von G' zwischen 0,1 und 200 Pa und von G'' zwischen 0,1 und 20 Pa führen.
(HP) führt zu starken oder echten Gelen, wenn die Werte von G' und G'' vorteilhafterweise zwischen 20 und 200 Pa für G' und zwischen 0,5 und 15 Pa für G'' liegen. Noch vorteilhafter liegt G' zwischen 20 und 150 Pa und G'' zwischen 0,5 und 10 Pa. Gemäß einer besonders bevorzugten Form beträgt der Wert von G' etwa 100 Pa und der von G'' etwa 5 Pa (in destilliertem Wasser).
Das (HP) verleiht dem wässrigen Medium Viskosität, die durch die Rheologie beim Fließen gemessen wird. Die rheologischen Messungen der Fließviskosität werden mit einem Rheometer mit vorgegebener Schubspannung oder mit vorgegebenem Schergradienten, wie beispielsweise mit einem Viskosimeter vom Typ RHEOMAT^® beziehungsweise CARRIMED^® durchgeführt.
In beiden Fällen misst die Apparatur die Schubspannung beim Fließen des Gemischs HP + Wasser, wenn dieses Gemisch irreversibel verformt wird. Aus der Schubspannung lässt sich die Fließviskosität berechnen.
Diese Apparatur ermöglicht so, die Höhe der Viskosität bei einem gegebenen Schergradienten quantitativ zu bestimmen.
Die Fließviskosität kann leichter mit Hilfe eines BROOKFIELD^®-Viskosimeters bestimmt werden.
Diese rheologischen Messungen der Fließviskosität des (HP) ermöglichen es zudem, die Fließgrenze der (HP)-Lösung und/oder der Formulierung, die es enthält, zu bestimmen. Besagte Grenze stellt die Kraft dar, die aufgebracht werden muss, um die Struktur des Mediums zu zerstören und es zum Fließen zu zwingen.
Die Rheologie beim Fließen ermöglicht es ebenfalls, quantitativ die Leichtigkeit zu bestimmen, mit der eine (HP)-Lösung und/oder eine Formulierung, die es enthält, fließt, wenn die vorgegebene Scherung steigt (pseudo-plastisches oder strukturviskoses Verhalten).
Man hat beispielsweise festgestellt, dass Lösungen mit 1% in Gewicht/Gewicht HP in destilliertem Wasser, das 1% in Gewicht/Gewicht NaCl enthält, bei 23°C zu Werten der Fließviskosität bei einem Schergradienten von 0,1 s^–1 zwischen 100 und 5000 Pa·s und spezieller zwischen 200 und 2000 Pa·s führen.
Unter gleichen Bedingungen bei einem Schergradienten von 10 s^–1 zwischen 0,5 und 300 Pa·s und spezieller zwischen 5 und 150 Pa·s.
Diese Rheologiedaten beim Fließen sind für das Verhalten der Formulierung bei ihrem Mastizieren, ihrem Umgießen, ihrem Aufschlagen usw. repräsentativ.
Die durch Zusatz von (HP) zu dem Medium erhaltenen Gele sind selbstheilende Gele, das heißt dass nach einer Scherung, selbst einer starken, die "gebrochenen" Gele die Fähigkeit haben, sich neu zu bilden und ihre anfänglichen Eigenschaften wieder zu finden.
Das Selbstheilungsvermögen der aus (HP) erhaltenen Gele wird durch Kompressionsmessungen bestimmt, die beispielsweise ausgeführt werden auf einem Texture Analyzer ETIA T2^TM, der aus einem zylindrischen Messkörper mit 12,7 mm Durchmesser besteht, einer Eindringgeschwindigkeit von 0,05 mm/s und einer Eindringtiefe von 15 mm. Der Kolben wird mehrere Male an derselben Stelle in das Gel während verschiedener Zeitintervalle eingedrückt und man nimmt die Kompressionskraft auf. Man bestimmt die Steigung am Ursprung, ausgedrückt in mN/mm, die für die Elastizität des Gels repräsentativ ist.
Beispielsweise wird ein Gel mit 1% in Gewicht/Gewicht (HP) in destilliertem Wasser hergestellt. Dieses Gel wird dann 24 Stunden gelagert, bevor man die Kompressionsmessungen entweder bei Raumtemperatur (etwa 25°C) oder in der Kälte bei etwa 6°C ausführt.
Kompressionsmessungen werden mit unterschiedlichen Zeitintervallen ausgeführt: 0, 5, 15 Minuten und 24 Stunden, wobei man zwischen jeder Messung 5 Minuten wartet.
So bleibt die Steigung konstant und ist etwa gleich 45 ± 1 mN/mm, unabhängig von der Messzeit (t = 0, 5, 15 Minuten und 24 Stunden).
Dies bedeutet, dass die Elastizität des Gels stabil ist und dass es die Fähigkeit hat, sich mehrere Male nacheinander im Verlauf der Zeit selbst zu heilen, wobei es gleichzeitig die gleiche Gelkraft behält.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Herstellung des Heteropolysaccharids (HP), wie zuvor definiert.
Das Herstellungsverfahren besteht zuerst aus der Fermentation eines Mediums, das wenigstens eine durch einen Stamm Agrobacterium radiobacter I-2001 (oder DSM 12095), eine seiner rekombinanten Formen oder eine seiner Mutanten assimilierbare Kohlenstoffquelle umfasst.
Außer besagter assimilierbarer Kohlenstoffquelle kann das Fermentationsmedium auch wenigstens eine Quelle für organischen oder anorganischen Stickstoff und gegebenenfalls ein oder mehrere anorganische Salze umfassen.
Das Medium wird auf herkömmliche Weise mit dem Stamm Agrobacterium radiobacter I-2001 (oder DSM 12095) geimpft.
Als organische Kohlenstoffquelle, die das Fermentationsmedium bildet, kann man außer den zuvor angeführten Zuckern auch Zucker, wie Stärke, vorteilhafterweise hydrolysierte, die Stärkehydrolysate, die Gemische dieser Zucker und die Gemische, die wenigstens einen dieser Zucker umfassen, anführen.
Spezieller kann man Glucose, Saccharose, vorteilhafterweise hydrolysierte Stärke, die Stärkehydrolysate, Lactose, die Gemische dieser Zucker und die Gemische, die wenigstens einen dieser Zucker umfassen, anführen. Glucose und Saccharose sind die noch stärker bevorzugten Zucker.
Die Konzentration an Kohlenstoffquelle in dem Fermentationsmedium kann zwischen 1 und 100 g/l und vorzugsweise zwischen 15 und 60 g/l liegen.
Als organische Stickstoffquelle kann man Casein und die Caseinate, die Fischhydrolysate, die Weizen-, Mais oder Sojamehle, die Hefeextrakte (Bäckerhefe, Bierhefe, Milchhefen usw.), corn steap liquor (CSL), Harnstoff und die Kartoffelproteine anführen.
Als anorganische Stickstoffquellen kann man die Ammonium- oder Natriumnitrate, die Ammoniumphosphate oder -sulfate anführen.
Die Fermentation kann auch mit einem Gemisch von organischen und anorganischen Stickstoffquellen stattfinden.
Die Konzentration an Stickstoffquelle (organisch, anorganisch oder Gemisch der beiden) in dem Fermentationsmedium kann zwischen 1 und 80 g/l und vorzugsweise zwischen 3 und 50 g/l liegen.
Das Fermentationsmedium kann auch Spurenelemente, wie Spuren von Eisen- und/oder Calcium- und/oder Mangan- und/oder Magnesiumsalzen sowie Vitamine und Nukleotide enthalten.
Die Fermentation kann bei Drücken zwischen 1 und 4 bar bei einer Temperatur zwischen 25°C und 35°C, vorzugsweise zwischen 25°C und 30°C unter aeroben Bedingungen durchgeführt werden.
Der pH des Fermentationsmediums kann zwischen 5 und 9 und vorzugsweise zwischen 6 und 8 liegen. Der pH kann je nach Fall mit einer Base, wie Natronlauge, Kalilauge oder Ammoniak, oder mit einer Säure, wie Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salzsäure oder Salpetersäure, eingestellt werden.
Das Fermentationsmedium, das in einen Fermentationstank oder -behälter gegeben wird, kann vorteilhafterweise gerührt werden. Dieses Rühren kann beispielsweise mittels eines Umkehrschüttlers, eines Kreisschüttlers, eines Rührwerks oder einer Blasensäule ausgeübt werden. Die Fermentationszeit beträgt üblicherweise mehr als 30 Stunden, liegt aber im Allgemeinen zwischen 40 und 100 Stunden.
Die Fementationsausbeuten sind im Allgemeinen höher als 40%, liegen spezieller zwischen 55 und 75% und ganz speziell zwischen 60 und 75 Gew.-% erzeugtem Heteropolysaccharid (HP), bezogen auf die eingesetzte Kohlenstoffquelle.
Nach der Fermentation wird das Heteropolysaccharid (HP) von der Fermentationsbrühe gemäß den folgenden Schritten abgetrennt:

i – man behandelt die Endfermentationsbrühe thermisch zwischen 80°C und 120°C 10 bis 60 Minuten lang, die aus dem Schritt (i) hervorgegangene Brühe wird bei der gleichen Temperatur wie die Temperatur der thermischen Behandlung gehalten;
ii – man fällt das Heteropolysaccharid (HP) heiß bei einer Temperatur, die höher als 80°C ist, mittels einer mit Wasser mischbaren organischen Flüssigkeit, die unter den Alkoholen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie Ethanol, Propanol, Isopropanol, Butanol, tert-Butanol oder ihr Gemisch, ausgewählt ist;
iii – man trennt das Heteropolysaccharid (HP) von der organischen Flüssigkeit ab.

Im Schritt (i) wird die Fermentationsbrühe, die das Heteropolysaccharid (HP) enthält, 10 bis 60 Minuten und vorzugsweise zwischen 15 und 45 Minuten lang auf Temperaturen zwischen 80°C und 120°C erhitzt.
Die obige thermisch behandelte Brühe weist vorteilhafterweise einen pH zwischen 6 und 8 auf.
Dieser pH kann jedoch, wenn notwendig, je nach Fall mit einer Base oder einer Säure eingestellt werden.
Diese Letzteren können unter den oben erwähnten Basen und Säuren ausgewählt werden, die für das Einstellen des pH des Fermentationsmediums verwendet werden.
Die aus dem Schritt (i) hervorgegangene Brühe wird bei der gleichen Temperatur wie die Temperatur der thermischen Behandlung gehalten.
Im Schritt (ii) gewinnt man das Heteropolysaccharid (HP) aus der im Schritt (i) erhaltenen Brühe durch Ausfällen mittels einer organischen Flüssigkeit, die wenigstens teilweise mit Wasser mischbar ist und in der das Heteropolysaccharid (HP) unlöslich oder praktisch unlöslich ist.
Besagte organische Flüssigkeit ist ausgewählt unter Aceton oder den Alkoholen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie Ethanol, Propanol, Isopropanol, Butanol, tert-Butanol oder ihr Gemisch.
Spezieller wird das Ausfällen von (HP) mit Isopropanol ausgeführt.
Das verwendete Volumen an organischer Flüssigkeit beträgt im Allgemeinen wenigstens das 2-fache von demjenigen des zu behandelnden Brühevolumens.
Das Ausfällen des Heteropolysaccharids (HP) durch eine organische Flüssigkeit kann auch in Gegenwart von Salzen, wie die Sulfate, die Chloride oder die Phosphate von Natrium, Kalium oder Calcium, durchgeführt werden.
Wenn das Heteropolysaccharid (HP) ausgefällt ist, kann es dann im Schritt (iii) von der organischen Flüssigkeit abgetrennt werden.
Das Verfahren zur Abtrennung an sich ist nicht entscheidend und kann gleichermaßen unter den bekannten üblichen Trennverfahren, wie beispielsweise Filtration, Zentrifugation oder Abnutschen, ausgewählt werden.
Die erhaltenen Fasern können optional beispielsweise mit Aceton oder einem Alkohol, wie Ethanol, Propanol oder Isopropanol, entwässert werden.
Das notwendige Gewicht an Alkohol, um diesen Entwässerungsvorgang auszuführen, liegt im Allgemeinen beim 1- bis 10-fachen von demjenigen der zu behandelnden Fasern.
Die entwässerten Fasern können neuen Filtrations-, Zentrifugations- oder Abnutschvorgängen unterzogen werden.
Gegebenenfalls können die Fasern getrocknet, zerkleinert und/oder gesiebt werden, um ein Pulver des Heteropolysaccharids (HP) zu erhalten.
Wenn man ein reineres Pulver erhalten möchte, ist es möglich, entweder die Fermentationsbrühe oder eine wässrige Lösung, die aus dem gemäß dem oben beschriebenen Verfahren erhaltenen Pulver wiederhergestellt wird, mit einem oder mehreren Enzymen zu behandeln.
Als Enzyme, die sich zu diesem Zweck eignen können, kann man die Proteasen, die Mutanasen, die Lipoproteasen, die Cellulasen und die Chitinasen anführen.
Die enzymatische Reinigung kann mit physikalischen Reinigungsverfahren, wie die verschiedenen Arten von Filtration, Zentrifugation, Dialyse, oder mit verschiedenen Chromatographietechniken kombiniert werden oder durch sie ersetzt werden.
Die Fermentationsbrühen und die wiederhergestellten Lösungen des Heteropolysaccharids (HP), die einer Reinigungsbehandlung unterzogen wurden oder nicht, können konzentriert werden.
Das Konzentrieren kann in bestimmten Fällen vorteilhaft sein, insbesondere wenn so die Transportkosten reduziert werden können. Zudem können die konzentrierten Lösungen schneller eingesetzt werden als die Pulver des Heteropolysaccharids (HP).
Das Konzentrieren kann durch alle dem Fachmann bekannten Techniken, insbesondere Verdampfen, Ultrafiltration oder Diafiltration, durchgeführt werden.
In der vorliegenden Erfindung liegt das Heteropolysaccharid (HP) vorteilhafterweise in Form eines Feststoffs vom Typ Fasern oder Pulver vor.
Wie bereits erwähnt, weist (HP) sehr gute rheologische Eigenschaften und insbesondere die Fähigkeit, echte Gele zu bilden, auf. Je nach den Fermentationsbedingungen, insbesondere je nach den Bestandteilen und ihren Konzentrationen in dem Kulturmedium und/oder den Ausfällungsbedingungen im Schritt (ii) des Verfahrens (spezieller, wenn das Ausfällen in Gegenwart von Salzen erfolgt oder nicht) hat (HP) den Vorteil, entweder als Verdickungsmittel oder als Geliermittel oder als beides verwendet werden zu können.
So betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des Heteropolysaccharids (HP), wie zuvor beschrieben oder wie durch das oben definierte Verfahren erhalten, als Verdickungs- und/oder Geliermittel.
(HP) kann als Verdickungs- und/oder Geliermittel beispielsweise in der Erdöl-, Agrochemie-, Lebensmittel-, Kosmetik-, Papier-, Textilindustrie sowie in Farben, Kontaktlinsen, Klebern, Druckfarben und Haushalts- oder Industriereinigungsmitteln verwendet werden.
Die Menge an Heteropolysaccharid (HP) der Erfindung, die in den kosmetischen Zusammensetzungen eingesetzt werden kann, ist abhängig von dem wässrigem Medium, das verdickt und/oder geliert werden soll. Diese kann etwa 0,01% bis 5%, vorzugsweise in der Größenordnung von 0,1% bis 0,3% des Gewichts des verdickten oder gelierten wässrigen Mediums darstellen.
Unter dem Ausdruck kosmetische Zusammensetzung oder Formulierung versteht man alle kosmetischen Produkte oder Zubereitungen vom Typ derjenigen, die im Anhang I ("Illustrative list by category of cosmetic products") der europäischen Richtlinie Nr. 76/768/CEE vom 27. Juli 1976, Kosmetikrichtlinie genannt, beschrieben sind.
Die kosmetischen Zusammensetzungen können in einer großen Anzahl von Produkttypen für die Haut und/oder das Haar formuliert werden, wie Schäume, Gele (insbesondere zum Frisieren), Konditionierer, Formulierungen für das Frisieren oder um das Kämmen der Haare zu erleichtern, Spülungen, Lotionen für die Hände und den Körper, Produkte, die die Hydratisierung der Haut regulieren, Toilettenmilch, Zusammensetzungen zum Abschminken, Cremes oder Lotionen zum Schutz gegen Sonne und Ultraviolettstrahlung, Pflegecremes, Zubereitungen gegen Akne, Lokalanalgetika, Maskara, Produkte, die dazu bestimmt sind, auf die Lippen oder andere Schleimhäute aufgebracht zu werden, Stifte und viele andere Zusammensetzung des gleichen Typs.
Diese kosmetischen Zusammensetzungen verwenden einen Träger oder ein Gemisch von mehreren Trägern, der in besagten Zusammensetzungen in Konzentrationen zwischen etwa 0,5% und 99,5%, im Allgemeinen zwischen etwa 5 und 90% vorhanden ist.
Die Wahl des geeigneten Trägers hängt von der Art der verwendeten Bestandteile und der Bestimmung besagter Zusammensetzungen ab, je nach dem, ob von dem formulierten Produkt erwartet wird, dass es auf der Oberfläche, wo es aufgebracht wurde, bleibt (beispielsweise Sprays, Schäume, Gesichtswässer oder Gele) oder im Gegensatz dazu nach der Verwendung abgespült wird (beispielsweise Shampoo, Konditionierer, Spüllotionen).
Die in den kosmetischen Zusammensetzungen vorhandenen wässrigen Träger können außerdem C₁-C₆-Alkohole, insbesondere Methanol, Ethanol, Isopropanol enthalten. Sie können auch ein weiteres Lösungsmittel enthalten, das es ermöglicht, die verschiedenen Bestandteile, die in besagten Zusammensetzungen verwendet werden, in dem wässrigen Medium zu lösen oder zu dispergieren.
Besagte Träger können so außerdem eine große Vielfalt weiterer Lösungsmittel enthalten, wie Aceton, Kohlenwasserstoffe, halogenierte Kohlenwasserstoffe, Linalol, Ester und flüchtige Silikone. Die verschiedenen Lösungsmittel, die in den wässrigen Trägern verwendet werden können, können untereinander mischbar oder nicht mischbar sein.
Wenn die kosmetischen Zusammensetzungen in Form von Sprays, Gesichtswässern, Gelen oder Schäumen vorliegen, umfassen die bevorzugten Träger neben Wasser Ethanol, flüchtige Silikonderivate und deren Gemische.
Die Formulierungen für Schäume und Aerosolsprays können auch ein Treibmittel enthalten, das in der Lage ist, die Produkte in Form von Schaum oder gleichmäßigen feinen Sprays hervorzubringen. Als Beispiele kann man Trichlorfluormethan, Dichlordifluormethan, Difluorethan, Dimethylether, Propan, n-Butan oder Isobutan anführen.
Besagte wässrige Träger können eine große Anzahl von Formen annehmen, insbesondere diejenigen von Emulsionen, die die Wasser-in-Öl-, Öl-in-Wasser-Emulsionen und die multiplen Emulsionen einschließen, deren angestrebte Viskosität bis zu 2 000 000 mPa·s gehen kann.
Neben dem wässrigen Träger können die kosmetischen Zusammensetzungen Tenside enthalten, die eingesetzt werden, um verschiedene, insbesondere wegen ihrer erweichenden oder befeuchtenden Eigenschaften verwendete Verbindungen zu dispergieren, zu emulgieren, zu lösen, zu stabilisieren. Sie können vom anionischen, nicht ionischen, kationischen, zwitterionischen oder amphoteren Typ sein; als Beispiele kann man anführen:

– anionische Tenside in einer Menge, die von 3% bis 50%, vorzugsweise von 5% bis 20% gehen kann, Mittel wie
• die Alkylestersulfonate
• die Alkylsulfate
• die Alkylamidsulfate
• die Salze von gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren
– nicht ionische Tenside in einer Menge, die von 0,1% bis 30%, vorzugsweise von 2% bis 10% gehen kann, Mittel wie
• die Polyoxyalkylen-alkylphenole
• die Glucosamide, Glucamide
• die von N-Alkylaminen abgeleiteten Glycerolamide
• die aliphatischen Polyoxyalkylen-C₈-C₂₂-Alkohole
• die Produkte, die aus der Kondensation von Ethylenoxid mit einer hydrophoben Verbindung resultieren, die aus der Kondensation von Propylenoxid mit Propylenglykol hervorgeht
• die Aminoxide
• die Alkylpolyglycoside und ihre Polyoxyalkylen-Derivate
• die Amide von C₈-C₂₀-Fettsäuren
• die ethoxylierten Fettsäuren
• die ethoxylierten Amide, Amine, Amidoamine
– amphotere und zwitterionische Tenside in einer Menge, die von 0,1% bis 30%, vorzugsweise von 1% bis 10% gehen kann, Mittel wie
– diejenigen vom Betain-Typ, wie
• die Betaine
• die Sulfobetaine
• die Amidoalkylbetaine
• und die Sulfobetaine
– die Alkylsulfaine
– die Kondensationsprodukte von Fettsäuren und Proteinhydrolysaten
– die Cocoamphoacetate und Cocoamphodiacetate
– die Alkylamphopropionate oder -dipropionate
– die amphoteren Derivate der Polyalkylamine.

Es können auch konditionierende Mittel vorhanden sein in Mengen, die von 0,05% bis 5%, vorzugsweise von 0,1% bis 1% gehen können.
Unter diesen kann man diejenigen synthetischen Ursprungs anführen, die bekannter sind unter dem Namen Polyquaternium, wie Polyquaternium-2, -7 und -10, die kationischen Derivate von Polysacchariden, wie Cocodimonium-hydroxyethylcellulose, Guar Hydroxypropyl Trimoniumchlorid, Hydroxylpropyl Guar Hydroxypropyl Trimoniumchlorid, die nicht flüchtigen Siliconderivate, wie Amodimethicon, die Cyclomethicone, die nicht wasserlöslichen und nicht flüchtigen Organopolysiloxane, wie die Öle, Harze oder Gummis, wie die Diphenyldimethicon-Gummis.
Die kosmetischen Zusammensetzungen können auch Polymere enthalten, die filmbildende Eigenschaften aufweisen und die verwendet werden können, um eine fixierende Funktion beizubringen. Diese Polymere sind im Allgemeinen in Konzentrationen vorhanden, die zwischen 0,01 und 10%, vorzugsweise zwischen 0,5 und 5% liegen. Sie sind vorzugsweise vom Typ Polyvinylpyrrolidon, Copolymere von Polyvinylpyrrolidon und Methylmethacrylat, Copolymer von Polyvinylpyrrolidon und Vinylacetat, Polyethylenglykolterephthalat/Polyethylenglykol- Copolymere, sulfonierte Terephthalcopolyester-Polymere.
Die kosmetischen Zusammensetzungen können auch Polymerderivate, die eine Schutzfunktion ausüben, in Mengen in der Größenordnung von 0,01–10%, vorzugsweise etwa 0,1–5 Gew.-% enthalten, Derivate wie

• die Cellulosederivate
• die auf Polyalkylenrümpfe gepfropften Polyvinylester
• die Polyvinylalkohole
• die sulfonierten Terephthalcopolyester-Polymere
• die ethoxylierten Monoamine oder Polyamine, die ethoxylierten Aminpolymere.

Die Leistungen der kosmetischen Zusammensetzungen können auch durch die Verwendung von Weichmachern in einer Menge, die von 0,1 bis 20% der Formulierung, vorzugsweise von 1 bis 15% gehen kann, verbessert werden. Unter diesen Mitteln kann man die Adipate, die Phthalate, die Isophthalate, die Azelate, die Stearate, die Copolyolsilikone, die Glykole, Rizinusöl oder deren Gemische anführen.
Man kann auch vorteilhafterweise zu diesen Zusammensetzungen Mittel, die Metalle komplexieren, spezieller diejenigen, die Calcium komplexieren, wie die Citrationen, oder dispergierende Polymermittel in einer Menge in der Größenordnung von 0,1–7 Gew.-% hinzufügen, um die Härte an Calcium und Magnesium zu kontrollieren, Mittel, wie

• die wasserlöslichen Salze von Polycarbonsäuren
• die Polyethylenglykole mit einer Molekülmasse in der Größenordnung von 1000 bis 50 000.

Man kann den kosmetischen Zusammensetzungen auch befeuchtende Mittel zusetzen; man kann Glycerol, Sorbitol, Harnstoff, Kollagen, Gelatine anführen, und weich machende Mittel, die im Allgemeinen unter den Alkylmonoglyceriden, den Alkyldiglyceriden, den Triglyceriden, wie die Öle, die aus Pflanzen und Gewächsen extrahiert werden, oder die Öle tierischen Ursprungs oder ihre hydrierten Derivate, den Mineralölen oder den Paraffinölen, den Diolen, den Fettestern, den Siliconen ausgewählt sind.
Zu diesen Verbindungen kann man als Kombination mineralische Pulver oder Teilchen hinzufügen, wie Calciumcarbonat, anorganische Oxide in Form von Pulver oder in kolloidaler Form, wie Titandioxid, Siliciumdioxid, Aluminiumsalze, Kaolin, Talk, Tone und deren Derivate.
Zu diesen Bestandteilen fügt man im Allgemeinen einen oder mehrere Duftstoffe, Farbstoffe und/oder trübende Mittel, wie Pigmente hinzu.
Um die Haut und/oder die Haare vor Angriffen der Sonne und der UV-Strahlen zu schützen, kann man zu diesen Formulierungen Sonnenfilter hinzufügen, die entweder chemische Verbindungen sind, die die UV-Strahlung stark absorbieren, oder mineralische Teilchen, wie Zinkoxid, Titandioxid oder die Ceroxide.
Konservierungsmittel, wie p-Hydroxybenzoesäure, Natriumbenzoat oder jedes chemische Mittel, das die Vermehrung von Bakterien oder Schimmel verhindert und herkömmlicherweise in den kosmetischen Zusammensetzungen verwendet wird, werden im Allgemeinen in einer Höhe von 0,01 bis 3 Gew.-% zu diesen Zusammensetzungen zugesetzt.
Manchmal kann man Mittel verwenden, die die Aktivität des Wassers verändern und den osmotischen Druck stark erhöhen, wie die Kohlenhydrate oder Salze.
Die kosmetische Zusammensetzung kann auch andere viskositätserhöhende und/oder gelierende Polymere enthalten, wie die vernetzten Polyacrylate, die durch Fermentation erhaltenen Hydrokolloide, wie Xanthangummi und Rheozan, die Cellulosederivate, wie Hydroxypropylcellulose, Carboxymethylcellulose, die Guar und deren Derivate ..., die allein oder kombiniert verwendet werden.
Die Erfindung betrifft spezieller die Verwendung des Heteropolysaccharids als Verdickungs- und/oder Geliermittel in Lebensmittelformulierungen.
Die Lebensmittelformulierungen, zu denen das Heteropolysaccharid (HP) hinzugefügt wird, sind herkömmlicherweise einfache oder multiple Emulsionen von Flüssigkeiten, komplexe Emulsionen von Gasen und Flüssigkeiten (aufgeschlagene Systeme), Suspensionen von Flüssigkeiten und Feststoffen oder jedes andere System, das diese Möglichkeiten kombiniert.
In diesen Formulierungen ist die Flüssigkeit vorteilhafterweise Wasser oder eine Flüssigkeit, die wenigstens teilweise Wasser umfasst.
Die Lebensmittelformulierungen werden erhalten, indem man die herkömmlichen Verfahren zur Herstellung der Lebensmittelformulierungen je nach ihrem Typ anwendet. So wird das (HP) vorteilhafterweise in Form eines Feststoffs vom Typ Fasern oder Pulver mit den anderen für die Formulierung notwendigen Bestandteilen gemischt. Das Ganze kann gegebenenfalls homogenisiert werden.
Die Temperatur, bei der die Formulierung hergestellt wird, ist an sich nicht entscheidend. Die Formulierungen, die das (HP) umfassen, können ohne jeglichen Schaden für ihre Gebrauchseigenschaften sterilisiert werden. Ein weiterer Vorteil von (HP) ist, dass es möglich ist, die Lebensmittelformulierungen herzustellen, ohne die Bestandteile zuvor erhitzt haben zu müssen.
Trotz der Vielfalt der Lebensmittelformulierungen (pH, Ionenstärke, Zusammensetzung) bleibt (HP) kompatibel und behält im Wesentlichen seine Eigenschaften.
Die interessanten rheologischen Eigenschaften, die mit dem Heteropolysaccharid (HP), das Gegenstand der Erfindung ist, verknüpft sind, sowie die Fähigkeit dieses Letzteren, bei Temperaturen unter oder gleich 40°C zu echten Gelen zu führen, und dies in einer weiten pH-Spanne, ermöglichen es außerdem, den Formulierungen, in denen es allein oder im Gemisch mit anderen Zusätzen verwendet wird, eine Textur zu verleihen, die derjenigen der Formulierungen, die ausschließlich besagte Zusätze enthaften, nahe kommt.
Die messbaren Parameter, um die Textur der Lebensmittelformulierungen zu charakterisieren, sind rheologischen Natur und bestehen im Wesentlichen darin, den Elastizitätsmodul (G') und den Viskositätsmodul (G'') und die Fließviskosität bei einem gegebenen Schergradienten zu messen. G' und G'' sowie die Viskosität wurden zuvor definiert.
Diese rheologischen Merkmale haben zum Ziel, das viskoelastische und/oder das pseudo-plastische Verhalten der Formulierungen aufzuzeigen, um sie untereinander zu vergleichen.
(HP), vorteilhafterweise in Form eines Feststoffs vom Typ Faser oder Pulver, hat die Fähigkeit, der Formulierung, die es umfasst, ein strukturviskoses Profil zu verleihen.
(HP) hat desgleichen die Fähigkeit, zu echten Gelen zu führen, die nach Anwendung einer mechanischen Beanspruchung selbst heilen können.
Es muss betont werden, dass die Module G' und G'' sowie die Viskosität, die für eine Formulierung gemessen werden, verschieden sein können von denjenigen, die für (HP) in destilliertem Wasser gemessen werden.
In den gelierten Milchdesserts, wie beispielsweise Puddings, kann man vorteilhafterweise wenigstens teilweise die üblichen Geliermittel, insbesondere die Gelatine, durch (HP) ersetzen.
In den salzig-sauren Medien, wie beispielsweise die Salatsoßen, kann man das enthaltene wässrige Medium durch Zugabe von geringen Mengen (HP) strukturieren.
Auf dem Gebiet der Süßwaren, insbesondere in den gelierten Bonbons vom Typ HARIBO^® kann man vorteilhafterweise wenigstens teilweise die Geliermittel, wie beispielsweise die Gelatine, durch (HP) ersetzen.
In den Medien mit hoher Ionenstärke, insbesondere in den Wurstwaren, kann (HP) zu den Carraghenanen hinzugefügt werden, um die Textur, insbesondere den elastischen Aspekt der Würste beispielsweise zu verstärken.
In den Formulierungen, die dazu bestimmt sind, aufgeschlagen zu werden, wie Schlagsahne, Nappage, Eiscremes, kann (HP) als Verdickungs- und/oder Geliermittel angewandt werden.
Desgleichen kann (HP) in Formulierungen, wie Mayonnaisen, Gemüsemousses, Proteine enthaltende Mousses, wie Fleisch-, Fischmousses, Albumin enthaltende Mousses, wie Meringuen, verwendet werden.
Als Verdickungs- und/oder Geliermittel kann (HP) auch in die Zusammensetzung von Joghurts eingehen.
In den oben angeführten Lebensmittelanwendungen verwendet man im Allgemeinen 0,01 bis 5 Gew.-% und vorzugsweise zwischen 0,05 und 2 Gew.-% Heteropolysaccharid (HP), bezogen auf das Gewicht der Zusammensetzung oder Formulierung, die es enthält. Noch stärker bevorzugt verwendet man 0,1 bis 1 Gew.-% Heteropolysaccharid (HP), bezogen auf das Gewicht der Zusammensetzung oder Formulierung.
Es muss hervorgehoben werden, dass das Heteropolysaccharid (HP) den Geschmack der Lebensmittel, denen es zugegeben wird, nicht beeinträchtigt.
Die Erfindung betrifft schließlich die Lebensmittelzusammensetzungen oder -formulierungen, die das Heteropolysaccharid (HP), wie zuvor definiert, umfassen.
Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung, ohne dadurch jedoch die Reichweite einzuschränken.
BEISPIELE
Beispiel 1
Dieses Beispiel beschreibt die Reinkultur von Agrobacterium radiobacter I-2001 (oder DSM 12095) und die Aufbewahrungsbedingungen des Stamms.
Reinkultur von Agrobactenum radiobacter I-2001 (oder DSM 120951:
Das Erhaltungsmedium des Stamms Agrobacterium radiobacter I-2001 (oder DSM 12095) ist das Medium MY-Agar von Difco (Artikelnummer 0712-01-8). Die Zusammensetzung dieses bereits fertigen Mediums ist:

– Bacto-Hefeextrakt^TM 3 g

– Malzextrakt 3 g

– Bacto-Pepton^TM 5 g

– Bacto-Dextrose^TM 10 g

– Bacto-Agar^TM 20 g
Man verdünnt 21 g dieses Mediums in einem Liter destilliertem Wasser. Nach Auflösen wird das Medium 15 Minuten lang bei 121°C im Autoklaven sterilisiert. Man verteilt dann das Medium in Petrischalen.
Die Kultur wird auf der Petrischale, die zwischen 25°C und 30°C, vorzugsweise zwischen 25°C und 28°C, wenigstens 24 Stunden lang inkubiert wird, durchgeführt.
Vorkultur – Aufbewahrung:
Der Stamm wird dann in Form von Röhrchen, die bei –196°C durch das Gefrierverfahren mit flüssigem Stickstoff (CAL) eingefroren werden, aufbewahrt.
Für ein Einfrieren mit flüssigem Stickstoff (CAL) stellt man eine Vorkultur auf PYG10-Medium her, das die folgende Zusammensetzung hat:
Für die Herstellung des Mediums werden alle Bestandteile in Mineralwasser dispergiert. Der pH wird mit 10%iger H₂SO₄ auf 6,5 eingestellt. Das Medium wird 20 Minuten im Autoklaven bei 120°C sterilisiert.
Nach 24 Stunden Inkubation bei 28°C auf einem Kreisschüttler mit 220 U/min und einer Amplitude = 50 mm werden 10 Vol.-% steriles reines Glycerol zu der Kultur hinzugefügt. Die Kultur wird dann in Kryoröhrchen mit Inhalten, die von 1 ml bis 10 ml, vorzugsweise von 2 ml bis 4 ml variieren, verteilt.
Diese Röhrchen werden in flüssigem Stickstoff aufbewahrt.
Beispiel 2
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung und den Erhalt des Heteropolysaccharids gemäß zwei Fermentationsverfahren, das eine mit einer organischen Stickstoffquelle und das andere mit einer anorganischen Stickstoffquelle.
In diesem Beispiel kommen zwei "Vorkultur"schritte vor. Diese Schritte finden in Erlenmeyerkolben mit 500 ml statt, was 100 ml Medium entspricht.
Der Produktionsschritt, der dem Schritt entspricht, in dessen Verlauf der Bakterienstamm das Polysaccharid produziert, findet in einem Fermenter mit 20 Litern, davon 15 Nutzliter, statt.
Die Rührbedingungen des Kreisschüttlers sind: Geschwindigkeit = 220 U/min und Amplitude = 50 mm.
Vorkulturschritt 1:
Der Vorkulturschritt 1 wird mit einem PYG 10-Medium der folgenden Zusammensetzung durchgeführt:
Alle Bestandteile werden in destilliertem Wasser q.s. für 1 l dispergiert. Der pH wird vor Sterilisieren mit 10%iger H₂SO₄ auf 6,5 eingestellt. Das Medium wird 20 Minuten bei 120°C im Autoklaven sterilisiert.
Nach Sterilisieren und vor Beimpfen mit dem Kryoröhrchen (qsp) beträgt der pH 7,33.
Jeder Erlenmeyer wird mit der Menge qsp des CAL beimpft.
Nach 24 Stunden Inkubation bei 28°C auf einem Kreisschüttler (220 U/min, A = 50 mm) weist das Medium die folgenden Merkmale auf:

– pH = 6,82
– Viskosität = 100 mPa·s
– die auf MY-Agar (Difco-Medium, Artikelnummer 0712-01-8) nach 72 Stunden bei 28°C abgelesene Population = 1,8·10⁹ ufc/ml

Nach 24 Stunden Inkubation wird die Vorkultur 1 verwendet, um die Vorkultur 2 zu impfen.
Vorkulturschritt 2:
Der Vorkulturschritt 2 wird mit einem Medium der folgenden Zusammensetzung durchgeführt:
Eine Glucoselösung mit 100 g/l wird in destilliertem Wasser hergestellt, dann bei natürlichem pH 15 Minuten bei 121°C sterilisiert.
Der Rest der Bestandteile wird in enthärtetem Wasser q.s. für 900 ml dispergiert, dann auf pH 6,8 eingestellt vor der Sterilisation bei 121°C für 15 Minuten.
Nach Sterilisation gibt man 10 ml der Glucoselösung in jeden Erlenmeyer.
Nach Sterilisation und vor Beimpfen beträgt der pH 6,88.
Jeder Erlenmeyer wird mit der für die Vorkultur 1 ausreichenden Menge beimpft.
Nach 24 Stunden Inkubation bei 28°C auf einem Kreisschüttler (220 U/min, A = 50 mm) weist das Medium die folgenden Merkmale auf:

– pH = 6,82
– Viskosität = 50–100 mPa·s
– die auf MY-Agar (Difco-Medium, Artikelnummer 0712-01-8) nach 72 Stunden bei 28°C abgelesene Population = 1,6·10⁹ ufc/ml

Nach 24 Stunden Inkubation wird die Vorkultur 2 verwendet, um die zwei Fermentationsmedien (Fermenter 1 und 2) beim Produktionsschritt zu impfen.
Produktionsschritt:
Der letzte Schritt ist der Schritt zur Produktion des Heteropolysaccharids (HP). Das Medium des Fermenters 1 hat die folgende Zusammensetzung:
Glucose ⇒ Qsp Gramm Glucose werden in enthärtetem Wasser q.s. für 3 l aufgelöst. Der pH wird mit 10%iger H₂SO₄ auf 5 abgesenkt. Die Lösung wird in einem Mariotte-Kolben 30 Minuten bei 120°C im Autoklaven sterilisiert.
Stickstoff + Salze ⇒ Qsp Gramm corn-steep-liquor (CSL), 15 g K₂HPO₄, 12 g MgSO₄·7H₂O, 23 ml einer MnSO₄·H₂O-Lösung mit 10 g/l und 3 ml Entschäumer werden in enthärtetem Wasser q.s. für 7 l gelöst. Der pH wird mit 10%iger H₂SO₄ auf 6,5 eingestellt. Dieses Gemisch wird in situ 30 Minuten bei 120°C sterilisiert.
1 N Natronlauge ⇒ 40 g NaOH-Pastillen werden in destilliertem Wasser q.s. für 1 l gelöst. Die Lösung wird in einem Mariotte-Kolben 30 Minuten bei 120°C im Autoklaven sterilisiert.
Wenn alle Bestandteile auf 28°C sind, werden sie in dem Fermenter gemischt. Der Fermenter wird dann mit qsp Vorkultur 2 beimpft.
Die Fermentationsbedingungen im Fermenter 1 sind die folgenden:
Rühren ⇒200 U/min von 0 bis 20 Stunden Alter, dann 400 U/min bis zum Ende der Fermentation
Belüftung ⇒ 400 l/h von 0 bis 18 Stunden, dann 825 l/h von 24 Stunden bis zum Ende der Fermentation
Die Temperatur wird auf 28°C eingestellt.
Der pH wird mit 1 N NaOH auf 6,8 eingestellt.
Der Druck ist der Atmosphärendruck.
Das Medium des Fermenters 2 hat die folgende Zusammensetzung:
Glucose ⇒ Qsp Gramm Glucose werden in enthärtetem Wasser q.s. für 3 l aufgelöst. Der pH wird mit 10%iger H₂SO₄ auf 5 eingestellt. Die Lösung wird in einem Mariotte-Kolben 30 Minuten bei 120°C im Autoklaven sterilisiert.
Stickstoff + Salze ⇒ 18 g NaNO₃, 3,75 g NH₄NO₃, 4,5 g CaSO₄·2H₂O, 23 ml einer MnSO₄·H₂O-Lösung mit 10 g/l, 12 g MgSO₄·7H₂O, 75 ml einer FeSO₄·7H₂O-Lösung mit 2 g/l, 4,5 g Na₂HPO₄ und 3 ml Entschäumer werden in enthärtetem Wasser q.s. für 7 l gelöst. Der pH dieser Lösung wird mit 10%iger H₂SO₄ auf 6 eingestellt. Dieses Gemisch wird in situ 30 Minuten bei 120°C sterilisiert.
1 N Natronlauge ⇒ 40 g NaOH-Pastillen werden in destilliertem Wasser q.s. für 1 l gelöst. Die Lösung wird in einem Mariotte-Kolben 30 Minuten bei 120°C im Autoklaven sterilisiert.
Wenn alle Bestandteile auf 28°C sind, werden sie in dem Fermenter gemischt. Der Fermenter wird dann mit qsp Vorkultur 2 beimpft.
Die Fermentationsbedingungen im Fermenter 2 sind die folgenden:
Rühren ⇒ 200 U/min von 0 bis 20 Stunden Alter, dann 400 U/min bis zum Ende der Fermentation
Belüftung ⇒ 400 l/h von 0 bis 24 Stunden, dann 825 l/h von 24 Stunden bis zum Ende der Fermentation
Die Temperatur wird auf 28°C eingestellt.
Der pH wird mit 1 N NaOH auf 6,8 eingestellt.
Der Druck ist der Atmosphärendruck.
Ergebnisse der Fermentation:
Je nach dem untersuchten Kulturmedium variieren die Fermentationsdauern von 65 bis 90 Stunden, die mit Isopropanol fällbaren Trockensubstanzen variieren von 15 bis 26 g/kg und die Gewichtsausbeute, bezogen auf die eingesetzte Kohlenstoffquelle, variiert von 33 bis 60%.
Extraktion und Reinigung
Die Brühe am Ende der Fermentation wird mit 10% reinem Isopropanol (Gewicht/Gewicht) stabilisiert. Sie wird dann 25 Minuten lang thermisch bei 110°C bei natürlichem pH (hier pH = 7) behandelt. Der pH variiert während der thermischen Behandlung nicht.
Wenn die Brühe aus der thermischen Behandlung kommt, wird sie in der Hitze (Temperatur > 80°C) extrahiert.
Die Bedingungen des Fällens sind:
= Isopropanol = 53% in Gewicht/Gewicht
= Na₂SO₄ = 0,2% in Gewicht/Gewicht
= Trockensubstanz = 0,4% in Gewicht/Gewicht.
Nach dem Fällen werden die Fasern gehackt, dann gewaschen und mit Isopropanol mit einem Gehalt von 78% entwässert.
Die Fasern werden dann im belüfteten Trockenschrank bei 80–85°C bis zum Erhalt eines Produkts mit einer Feuchtigkeit von etwa 10 Gew.-% getrocknet.
Die Fasern werden dann gemahlen und gesiebt.
Beispiel 3
Dieses Beispiel hat die Verwendung von (HP), das in Beispiel 2 erhalten wurde, in einer Lebensmittelformulierung für Nappage zum Gegenstand.
In den folgenden Beispielen wurden die Fließviskositäten, ausgedrückt in mPa·s, mit einem BROOKFIELD^TM RVT 20-2-Viskosimeter bei Raumtemperatur gemessen.
Die Werte der Elastizitätsmodule, ausgedrückt in Pa, wurden mit einem CARRIMED^TM CSL 100 Rheometer mit vorgegebener Schubspannung ausgeführt. Sie wurden im oszillierendem Betrieb – Frequenz von 0,01 bis 10 Hz gemessen.
Die Messungen der Volumenzunahmen, ausgedrückt in%, wurden auf die folgende Weise durchgeführt:

• in ein Becherglas mit bekanntem Volumen (V) und bekannter Masse gibt man den Schaum, man klopft drei Mal kurz an und man streicht ab;
• man wiegt das Becherglas, um die Masse (M) des Schaums, den es enthält, zu bestimmen;
• Volumenzunahme = [M(g)/V(ml)] × 100

Man stellt zwei Formulierungen her:
Formulierung 3.1: die das erfindungsgemäße Heteropolysaccharid/HP) umfasst,
Formulierung 3.2 (zum Vergleich): die Natriumcaseinat und Natriumalginat umfasst.
Die Zusammensetzungen der Formulierungen sind in der Tabelle 1 zusammengefasst.
Tabelle 1
Wässrige Phase:
In ein Becherglas, das mit einem Entflockungsrührblatt versehen ist, wiegt man die erforderliche Wassermenge ein und man dispergiert unter heftigem Rühren (500 U/min) das in der obigen Tabelle beschriebene Pulvergemisch.
Nach Zugabe besagter Pulver rührt man 5 Minuten weiter.
Ölige Phase
In einem Becherglas erhitzt man im Wasserbad bei 70°C das Fett und die Emulgatoren.
Man fügt dann unter Rühren mit 1000 U/min die ölige Phase zu der wässrigen Phase hinzu.
Nach Zugabe der öligen Phase rührt man 5 Minuten weiter. Während dieses Vorgangs kompensiert man das Verdampfen des Wassers.
Das Ganze wird dann mit dem Ultraturrax 2 Minuten lang bei 20000 U/min homogenisiert.
Man kühlt das Gemisch auf eine Temperatur unter 10°C ab, bevor man das Aufschlagen vornimmt. Dieses findet unter Verwendung eines Labormischers vom Typ KENNWOOD^TM CHEF mit maximaler Geschwindigkeit 3 Minuten lang bei einer Temperatur nahe 5°C statt.
Die Ergebnisse sind in der Tabelle II zusammengefasst.
Tabelle II
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Formulierung 3.1, die das erfindungsgemäße (HP) verwendet, eine geringere Viskosität als diejenige der Vergleichsformulierung 3.2 aufweist, und die deshalb leichter aufzuschlagen ist.
Außerdem ist die Formulierung 3.1 (erfindungsgemäß) andererseits stärker geliert (G' größer bei hoher Frequenz) und weist eine verbesserte Volumenzunahme auf.

Claims

Heteropolysaccharid (HP), dadurch gekennzeichnet, dass es durch Fermentation eines Mediums erhalten werden kann, das wenigstens einen Stamm Agrobacterium radiobacter I-2001 (oder DSM 12095), eine seiner rekombinanten Formen oder seiner Mutanten und eine durch besagten Stamm, eine seiner rekombinanten Formen oder eine seiner Mutanten assimilierbare Kohlenstoffquelle umfasst, und dadurch, dass es ausschließlich Einheiten aus Glucose und/oder ihren Derivaten, Galactose und/oder ihren Derivaten, Glucuronsäure und/oder ihren Salzen, Essigsäure und/oder ihren Salzen, Brenztraubensäure und/oder ihren Salzen umfasst.
Heteropolysaccharid (HP) gemäß dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass es besagte Einheiten in folgenden molaren Anteilen umfasst, wobei man als Bezug Glucose gleich 1 setzt: – Galactose und/oder ihre Derivate 0,2–5, – Glucuronsäure und/oder ihre Salze 0,1–3, – Essigsäure und/oder ihre Salze 0–5, – Brenztraubensäure und/oder ihre Salze 0,01–2.
Heteropolysaccharid (HP) gemäß dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass es besagte Einheiten in folgenden molaren Anteilen umfasst, wobei man als Bezug Glucose gleich 1 setzt: – Galactose und/oder ihre Derivate 0,5–4 und bevorzugt 0,8–2, – Glucuronsäure und/oder ihre Salze 0,2–2 und bevorzugt 0,4–1, – Essigsäure und/oder ihre Salze 0–4 und bevorzugt 0–3, – Brenztraubensäure und/oder ihre Salze 0,01–2.
Heteropolysaccharid (HP) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass Glucuron-, Essig- und Brenztraubensäure in Form von Salzen vorliegen.
Heteropolysaccharid (HP) gemäß dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass besagte Säuren in Form von Natrium-, Kalium-, Calcium- oder Ammoniumsalzen vorliegen.
Heteropolysaccharid (HP) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Gewichtsmittel der Molmasse (Mw) zwischen 1·10⁵ und 5·10⁶ g/mol, vorzugsweise zwischen 8·10⁵ und 5·10⁶ g/mol aufweist.
Heteropolysaccharid (HP) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Gewichtsmittel der Molmasse (Mw) von 3·10⁶ g/mol aufweist.
Heteropolysaccharid (HP) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass Lösungen mit 1% in Gewicht/Gewicht besagten Heteropolysaccharids (HP) in destilliertem Wasser bei 23°C zu Werten des Elastizitätsmoduls G' zwischen 0,1 und 200 Pa und zu Werten des Viskositätsmoduls G'' zwischen 0,1 und 20 Pa, gemessen bei einer Frequenz von 1 Hz, führen.
Heteropolysaccharid (HP) gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Lösungen mit 1% in Gewicht/Gewicht besagten Heteropolysaccharids (HP) in destilliertem Wasser bei 23°C zu Werten des Elastizitätsmoduls G' zwischen 20 und 200 Pa und zu Werten des Viskositätsmoduls G'' zwischen 0,5 und 15 Pa, gemessen bei einer Frequenz von 1 Hz, führen.
Heteropolysaccharid (HP) gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Wert des Elastizitätsmoduls G' zwischen 20 und 150 Pa und derjenige des Viskositätsmoduls G'' zwischen 0,5 und 10 Pa liegt.
Heteropolysaccharid (HP) gemäß einem der Ansprüche 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Elastizitätsmodul G' 100 Pa beträgt und der Viskositätsmodul G'' 5 Pa beträgt.
Heteropolysaccharid (HP) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass Lösungen mit 1% in Gewicht/Gewicht an besagtem HP in destilliertem Wasser, das 1% in Gewicht/Gewicht NaCl enthält, bei 23°C zu Werten der Fließviskosität bei einem Schergradienten von 0,1 s^–1 zwischen 100 und 5000 Pa·s und spezieller zwischen 200 und 2000 Pa·s führen.
Heteropolysaccharid (HP) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass Lösungen mit 1% in Gewicht/Gewicht besagten Heteropolysaccharids (HP) in destilliertem Wasser, das 1% in Gewicht/Gewicht NaCl enthält, bei 23°C zu Werten der Fließviskosität bei einem Schergradienten von 10 s^–1 zwischen 0,5 und 300 Pa·s und spezieller zwischen 5 und 150 Pa·s führen.
Heteropolysaccharid (HP) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass es in Form eines Feststoffs vom Typ Fasern oder Pulver vorliegt.
Verfahren zur Herstellung des Heteropolysaccharids (HP), wie in einem der Ansprüche 1 bis 14 definiert, dadurch gekennzeichnet, dass das Heteropolysaccharid (HP) aus der Fermentationsbrühe gemäß den folgenden Schritten abgetrennt wird: i – man behandelt die Endfermentationsbrühe thermisch zwischen 80°C und 120°C 10 bis 60 Minuten lang, die aus dem Schritt (i) hervorgegangene Brühe wird bei der gleichen Temperatur wie die Temperatur der thermischen Behandlung gehalten; ii – man fällt besagtes Heteropolysaccharid (HP) heiß bei einer Temperatur, die höher als 80°C ist, mittels einer mit Wasser mischbaren organischen Flüssigkeit, die unter den Alkoholen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie Ethanol, Propanol, Isopropanol, Butanol, tert-Butanol oder ihr Gemisch, ausgewählt ist; iii – man trennt das Heteropolysaccharid (HP) von der organischen Flüssigkeit ab.
Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass im Schritt (i) die thermisch behandelte Brühe einen pH zwischen 6 und 8 aufweist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass im Schritt (ii) das Ausfällen des Heteropolysaccharids (HP) durch eine organische Flüssigkeit in Gegenwart von Salzen, wie die Sulfate, die Chloride oder die Phosphate von Natrium, Kalium oder Calcium, durchgeführt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die am Ende des Schritts (iii) erhaltenen Fasern entwässert werden.
Verfahren gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Fasern getrocknet, zerkleinert und/oder gesiebt werden, um ein Pulver des Heteropolysaccharids (HP) zu erhalten.
Verwendung des Heteropolysaccharids (HP), wie in einem der Ansprüche 1 bis 14 beschrieben, als Verdickungs- und/oder Geliermittel.
Verwendung des Heteropolysaccharids (HP), wie in einem der Ansprüche 1 bis 14 beschrieben, als Verdickungs- und/oder Geliermittel in der Erdöl-, Agrochemie-, Lebensmittel-, Kosmetik-, Papier-, Textilindustrie sowie in Farben, Kontaktlinsen, Klebern, Druckfarben und Haushalts- oder Industriereinigungsmitteln.
Verwendung des Heteropolysaccharids (HP), wie in einem der Ansprüche 1 bis 14 beschrieben, als Verdickungs- und/oder Geliermittel in Lebensmittelformulierungen in Mengen von 0,01 bis 5 Gew.-% und vorzugsweise von 0,05 bis 2 Gew.-% Heteropolysaccharid (HP), bezogen auf das Gewicht der Zusammensetzung oder Formulierung.
Zusammensetzung oder Formulierung, umfassend das Heteropolysaccharid (HP), wie in einem der Ansprüche 1 bis 14 beschrieben, die sich für eine Verwendung in den Bereichen Erdöl, Agrochemie, Lebensmittel, Kosmetik, Papier, Textilien, Farben, Kontaktlinsen, Kleber, Druckfarben, Haushalts- oder Industriereinigungsmittel eignet.