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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neuartiges Herstellungsverfahren für
Trehalose-Derivate, im besonderen auf ein Herstellungsverfahren für Trehalose-
Derivate, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es einen Schritt umfasst, einen
reaktiven Stoff mit wasserfreier Trehalose unter wasserfreien Bedingungen reagieren
zu lassen.
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In der neueren Zeit werden Säureester und Alkyläther der Trehalose, wie z.B.
Fettsäureester und Sulfonsäureester der Trehalose, besonders erwähnt. Nishikawa
et al. berichtete in "The Chemical Society of Japan", No. 10, pp. 1,661-1,666
(1982), dass Trehaloseester der Stearinsäure, Palmitinsäure und Myristinsäure das
Wachstum von bösartigen Tumoren sowohl in vivo als auch in vitro stark behindern,
und äußerte die Vermutung, dass diese Derivate als Antitumor-Reagenzien wirksam
sein könnten. Zum Beispiel beschreibt die japanische Patent-Offenlegungsschrift No.
290,808/92, dass Trehalosesulfate auf zufriedenstellende Weise den
Wasserhaushalt der Haut bewahren und der Haut eine geeignete Feuchtigkeit
verleihen. Deshalb können diese Sulfate in einigen Kosmetika als zufriedenstellende
Feuchtigkeitsspender und Aufhellungsmittel für die Haut eingesetzt werden.
Trehalose-Äther mit Alkylgruppen von 8-25 Kohlenstoffatomen sind als geeignete
oberflächenaktive Stoffe mit einer relativen hohen Sicherheit und Aktivität bekannt.
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Wie von C. K. Lee in "Developments in Food Carbohydrate-2", pp. 1-89 (1980),
veröffentlicht von Applied Science Publishers, und K. Yoshimoto in "Chemical and
Pharmaceutical Bulletin", Vol. 30, No. 4, pp. 1,169-1,174 (1982) beschrieben wird,
werden Trehalose-Derivate allgemein durch Reaktion von reaktiven Stoffen mit
kristallinem Trehalose-Hydrat unter wasserfreien Bedingungen hergestellt und die
Qualität und die Ausbeute der Endprodukte hängt besonders davon ab, ob die
Feuchtigkeit in den Reaktionssystemen in einem höchst möglichen Ausmaß entfernt
werden kann. Kristallines Trehalose-Hydrat enthält jedoch, selbst wenn es in fester
Form hergestellt wird, im allgemeinen ca 10 Gew.-% Feuchtigkeit und ergibt
lediglich eine nicht zufriedenstellende Qualität und eine geringe Ausbeute, wenn es
unverändert eingesetzt wird. Daher wird Trehalose-Hydrat vor dem Einsatz unter
Einsatz eines Trockenmittels, wie z.B. Diphosphorpentoxid, bis zu einem
wasserfreien Zustand getrocknet, jedoch ist die Entfernung des Kristallwassers
äußerst schwierig. Somit konnten Trehalose-Derivate von einer zufriedenstellend
hohen Qualität nicht ohne weiteres in einer beträchtlich hohen Ausbeute und mit
geringen Kosten erhalten werden.
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Angesichts des oben Gesagten hat die vorliegende Erfindung das Ziel, ein
Herstellungsverfahren für Trehalose-Derivate in einer relativ hohen Qualität und mit
einer beträchtlich hohen Ausbeute und geringen Kosten bereitzustellen.
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Dementsprechend liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren, das einen Schritt
umfasst, einen reaktiven Stoff unter wasserfreien Bedingungen mit wasserfreier
Trehalose reagieren zu lassen.
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Die vorliegende Erfindung wird nun in weiteren Einzelheiten lediglich beispielhaft
unter Bezugnahme auf die folgenden Experimente und Beispiele beschrieben.
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Die wasserfreie Trehalose, die als Substrat in der vorliegenden Erfindung eingesetzt
wird, ist im wesentlichen frei von Feuchtigkeit. Daher können Trehalose-Derivate von
einer relativ hohen Qualität auf einfache Weise in einer beträchtlich hohen Ausbeute
unter Einsatz einer solchen wasserfreien Trehalose ohne zusätzliche Behandlung
oder nach einem leichten Vortrocknen erhalten werden.
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Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden
Experimente und Beispiele erklärt, wobei die Bezeichnung "Trehalose-Derivate", auf
die in der vorliegenden Patentschrift Bezug genommen wird, allgemein solche
Derivate, wie z.B. Ester, Äther, Halogenide, Stickstoff enthaltende Derivate und
Schwefel enthaltende Derivate von Trehalose umfasst, die allgemein dadurch
erhalten werden, dass man reaktive Stoffe mit wasserfreier Trehalose unter
wasserfreien Bedingungen reagieren lässt. Die Bezeichnung "reaktive Stoffe", auf die
in der vorliegenden Patentschrift Bezug genommen wird, bedeutet Säuren, Salze,
Alkohole, Ketone, Halogene, Amine und reaktive Derivate, aus denen die
erfindungsgemäßen Trehalose-Derivate gebildet werden können, wenn sie unter
wasserfreien Bedingungen mit wasserfreier Trehalose umgesetzt werden. Die
vorliegende Erfindung ist allgemein anwendbar auf chemische Reaktionssysteme,
bei denen die Feuchtigkeit im System die Reaktivität des reaktiven Stoffes verringert,
unbefriedigende Nebenreaktionen hervorruft, die Hauptreaktion behindert und zu
einer Verschlechterung der Qualität und/oder einer Reduzierung der Ausbeute der
gewünschten Trehalose-Derivate sowie zu einem Anstieg ihrer Produktionskosten
führt.
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Die Bezeichnung "wasserfreie Trehalose", auf die in der vorliegenden Erfindung
Bezug genommen wird, bedeutet wasserfreie kristalline und wasserfreie amorphe
Trehalosen, die im wesentlichen frei von Feuchtigkeit sind, d.h. solche, die eine
Feuchtigkeit von weniger als 3 Gew.-%, bestimmt nach der Karl Fischer Methode,
enthalten. Solche eine wasserfreie Trehalose kann ebenfalls bei der vorliegenden
Erfindung eingesetzt werden und wasserfreie kristalline Trehalose ist besonders
geeignet, weil sie im allgemeinen einen relativ hohen Trehalose-Gehalt aufweist und
zu relativ geringen Kosten erhalten werden kann. In Abhängigkeit von dem
Reaktionstyp und dem Einsatz der Trehafose-Derivate ist es um so
zufriedenstellener im sinne der vorliegenden Erfindung, je höher der Trehalose-
Gehalt in der wasserfreien Trehalose ist: Allgemein kann wasserfreie Trehalose mit
einem Trehalose-Gehalt von 70 Gew.-% oder mehr, bevorzugt 80 Gew.-% oder
mehr, bezogen auf eine trockne und feste Basis (d.s.b.) zufriedenstellend eingesetzt
werden.
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Von den wasserfreien Trehalose kann amorphe wasserfreie Trehalose durch
Auflösen von Trehalose in einer geringen Menge Wasser und Gefriertrocknen der
wässerigen Lösung oder durch Trocknen über die Sprühtrocknung etc. bei einer
Temperatur, die den Schmelzpunkt der wasserfreien kristallinen Trehalose
überschreitet, üblicherweise bei einer Temperatur über 100ºC, erhalten werden.
Beispielsweise beschreibt die japanische Offenlegungsschrift No. 170,221/94 ein
Herstellungsverfahren für wasserfreie kristalline Trehalose, welches die Schritte
umfasst: das Konzentrieren einer Saccharid-Verbindung, die mindestens 60 Gew.-%
Trehalose enthält (d.s.b.), um einen Feuchtigkeitsgehalt von weniger als 10 Gew.-%
zu ergeben, vorzugsweise zu einem sirupartigen Produkt mit einem
Feuchtigkeitsgehalt von mehr als 2.0 Gew.-%, aber weniger als 9.5 Gew.-%; die
Zugabe von 0.01-20 Gew.-% (d.s.b.) wasserfreier Trehalose als Kristallisationskeim
zu dem sirupartigen Produkt, das Halten der Bestandteile auf 40-140ºC, um
Trehalose auszukristallisieren und das Auffangen der gebildeten wasserfreien
kristallinen Trehalose aus der erhaltenen Masse oder das Trocknen der Masse zu
einem festen Produkt. Im allgemeinen enthält die so erhaltene wasserfreie Trehalose
im wesentlichen keine Feuchtigkeit, d.h. sie enthält lediglich eine Feuchtigkeit von
weniger als 3 Gew.-%.
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Die Quelle und der Ursprung der Trehalose, die als Ausgangsmaterial für wasserfreie
Trehalose in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden kann, sind nicht
spezifisch eingeschränkt. Irgendeine von denen, die aus Hefezellen stammen, von
denen, die dadurch erhalten werden, dass man komplexe Enzymsysteme, die
Maltose- und Trehalose-Phosphorylase enthalten, auf Maltose einwirken lässt, von
denen, die dadurch erhalten werden, dass man Maltose/Trehalose umwandelnde
Enzyme auf Maltose einwirken lässt, um diese direkt in Trehalose umzuwandeln und
von denen, die dadurch erhalten werden, dass man partielle Stärke-Hydrolysate
enzymatisch in Zucker umwandelt, kann eingesetzt werden. Von dem Gesichtspunkt,
Trehalose-Derivate mit einer zufriedenstellend hohen Qualität zu relativ niedrigen
Kosten herzustellen, können Trehalose-Ausgangsmaterialien entsprechend der
vorgenannten dritten und vierten Methode zufriedenstellend eingesetzt werden.
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Um Trehalose aus Stärke zu gewinnen, lässt man, wie in den japanischen
Patentanmeldungen Nos. 349,216/93; 90,705/94; 166,011194 und 190,183/94
beschrieben wird, nicht reduzierende Saccharide bildende Enzyme auf reduzierende
partielle Stärke-Hydrolysate, die Maltooligosaccharide mit einem Glucose-
Polymerisationsgrad von mindestens 3 enthalten, wie z.B. Maltotriose, Maltotetraose,
Maltopentaose und Maltohexaose, die durch Gelieren und Verflüssigen von Stärke
mit Säuren und/oder α-Amylase erhalten wurden, einwirken, um die
Maltooligosaccharide in nicht reduzierende Saccharide, die eine Trehalose-Struktur
als eine Endgruppe besitzen, umzuwandeln. Die nicht reduzierenden Saccharide
werden, wie in den japanischen Patentanmeldungen Nos. 59,834/94; 79,291/94;
166,126/94 und 190,180/94 beschrieben wird, der Reaktion mit Trehalose
freisetzenden Enzymen ausgesetzt, um Trehalose aus den Sacchariden
freizusetzen. In diesem Fall können diese verschiedenen Arten von nicht
reduzierende Saccharide bildenden Enzymen und Trehalose freisetzenden Enzymen
gleichzeitig oder hintereinander eingesetzt werden und der kombinierte Einsatz von
diesen zwei verschiedenen Arten von Enzymen und Verzweigungsenzymen, wie z.B.
Isoamylase und Pullulanase, kann den Trehalose-Gehalt in der Reaktionsmischung
weiter erhöhen. Um Maltose direkt in Trehalose umzuwandeln, lässt man, wie
beispielsweise in den japanischen Patentanmeldungen Nos. 144,092/94; 156,399/94;
187,901/94 und 260,984/94 beschrieben wird, Maltose/Trehalose umwandelnde
Enzyme auf Maltose oder Saccharid-Zusammensetzungen, die Maltose enthalten,
einwirken. Diese Patentschriften beschreiben Verfahren zur Herstellung von
Trehalose unter Einsatz von Maltose/Trehalose umwandelnden Enzymen und jedes
von diesen kann eingesetzt werden, um wasserfreie Trehalose herzustellen, die bei
der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird. Wenn eine Trehalose von höherer
Reinheit benötigt wird, können die Reaktionsmischungen, die bei diesen Verfahren
erhalten werden, säulenchromatographisch unter Einsatz eines stark sauren
Kationenaustauschers im Festbett-, Flüssigbett- oder Pseudo-Flüssigbett-Verfahren
behandelt werden, um die mit Trehalose angereicherten Fraktionen aufzufangen. Die
Zusammensetzungen und Fraktionen, die so erhalten werden, enthalten mindestens
70 Gew.-% Trehalose (d.s.b.) und können auf geeignete Weise als
Ausgangsmaterial für wasserfreie Trehalose eingesetzt werden.
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Um reaktive Stoffe mit wasserfreier Trehalose umzusetzen, können konventionelle
Verfahren eingesetzt werden. Beispielsweise können Verfahren, wie sie von C.K.
Lee in "Developments in Food Carbohydrate", pp. 1-89 (1980), veröffentlicht von
Applied Science Publishers, und von K. Yoshimoto et al. in "Chemical and
Pharmaceutical Bulletin", Vol. 30, No. 4, pp. 1,169-1,174 (1982) beschrieben
werden, sowie solche, die in "Carbohydrates as Organic Raw Materials" (1991),
veröffentlicht von VCH Publishers, New York, USA, beschrieben werden, im Sinne
der vorliegenden Erfindung eingesetzt und passend ausgewählt werden, um die
gewünschten Trehalose-Derivate zu erhalten.
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Die typischen Verfahren zur Herstellung von Trehalose-Derivaten sollen nun kurz
erklärt werden: Carbonsäureester der Trehalose, wie z.B. Trehalose-Acetat und
Trehalose-Benzoat, können durch Reaktion von wasserfreier Trehalose mit ihren
entsprechenden Säureanhydriden oder Säurehalogeniden in alkalischen organischen
Lösungsmitteln, wie z.B. Pyridin, erhalten werden. Um Trehalose-Sulfat herzustellen,
lässt man wasserfreie Trehalose mit Komplexen aus Schwefeltrioxid und
Demethylsulfoxid oder Pyridin in einem Inert- oder Edelgasstrom reagieren.
Fettsäureester der Trehalose, hergestellt durch die Umsetzung von Trehalose mit
Fettsäuren, wie z.B. Laurylsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure,
Ölsäure, Linolsäure und Linolensäure, können durch Kondensationsreaktionen von
wasserfreier Trehalose mit diesen Fettsäuren in Gegenwart von alkalischen
Katalysatoren oder durch Umsetzung von wasserfreier Trehalose mit ihren
korrespondierenden Fettsäurehalogeniden erhalten werden. Äther der Trehalose
können durch Umsetzung von wasserfreier Trehalose mit einem Überschuss ihrer
korrespondierenden Alkohole in Gegenwart von sauren Katalysatoren oder durch
Umsetzung von wasserfreier Trehalose mit ihren korrespondierenden
Alkylhalogeniden in Gegenwart von alkalischen Katalysatoren erhalten werden.
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In Abhängigkeit von ihrer Verwendung werden die so erhaltenen Trehalose-Derivate
üblicherweise unverändert eingesetzt, nachdem die restlichen reaktiven Stoffe
und/oder Lösungsmittel durch Filtration, Extraktion, Separation, trennende
Sedimentation, Dialyse und Destillation entfernt wurden. Wenn hochreine Trehalose-
Derivate benötigt werden, können die unveränderten oder teilweise gereinigten
Trehalose-Derivate mit konventionellen Methoden, die auf diesem Gebiet eingesetzt
werden, wie z.B. Dünnschicht-Chromatographie, Säulenchromatographie,
Ionenaustauscher-Säulenchromatograhie, Gaschromatographie, Destillation und
Kristallisation, die eingesetzt werden, um Saccharide und Saccharid-Derivate zu
reinigen, behandelt werden. Zwei oder mehr dieser Reinigungsmethoden werden in
Kombination eingesetzt, um die Endprodukte zu erhalten. Wie sehr wohl bekannt ist,
stellt Trehalose bei der normalen Substitutionsreaktion, wobei hauptsächlich nicht
isomere Hydroxylgruppen reagieren, 8 reaktive funktionelle Gruppen zur Verfügung.
Dies bedeutet, dass die Reaktionsprodukte eine Vielzahl von Trehalose-Derivaten
mit unterschiedlichem Substitutionsgrad in Abhängigkeit vom Reaktionstyp und den
Reaktionsbedingungen enthalten können. Üblicherweise können diese Produkte
unverändert eingesetzt werden und bei Bedarf können sie nach einem oder
mehreren der vorgenannten Reinigungsverfahren behandelt werden, um die
gewünschte(n) Komponente(n) zu isolieren.
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Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Trehalose-Derivate finden
eine breite Anwendbarkeit auf dem Gebiet der Nahrungsmittel-, Kosmetik- und
Arzneimittelindustrie. Die Fettsäureester und Alkyläther der Trehalose besitzen eine
relativ hohe Aktivität sind als grenzflächenaktiver Stoff für Nahrungsmittel, Kosmetika
und Arzneimittel einsetzbar In Abhängigkeit von der Art der Fettsäuren, geht man
davon aus, dass die Trehalose-Derivate als Mittel gegen Tumore eingesetzt werden
können. Trehalose-Sulfate können in Kosmetika als Mittel zum Bewahren der
Feuchtigkeit oder als Mittel zur Aufhellung der Haut eingebaut werden, während
Trehalose-Halogenide als Zwischenprodukte für die Synthese einer Vielzahl von
Derivaten einsetzbar sind.
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Die folgenden Experimente erklären die Wirkungsweise und die Funktion der
vorliegenden Erfindung.
Experiment 1
Enzymherstellung
Experiment 1-1
Herstellung von nicht reduzierende Saccharide bildenden Enzymen
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Proben von je 100 ml einer flüssigen Nährlösungskultur (pH 7.0), die 2.0 Vol.-%
Maltose, 0.5 Vol.-% Pepton, 0.1 Vol.-% Hefeextrakt, 0.1 Vol.-%
Dinatriumhydrogenphosphat und 0.1 Vol-% Natriumdihydrogenphosphat enthielt,
wurden in 500 ml Erlenmeyer-Kolben gegeben und durch Umsetzung für 20 Minuten
im Autoklaven bei 120ºC sterilisiert. Nach dem Kühlen der Kolben wurde jedes
Medium mit einem Keim des Rhizobium sp. M-11 (FERM BP-4130) geimpft und für
24 Stunden bei 27ºC unter rotierenden Schüttelbewegungen gezüchtet, um eine
Keimkultur zu erhalten. Danach wurden Proben von 20 Liter eines frisch zubereiteten
Präparats der gleichen Nährlösungskultur in 30 Liter Gärbehälter gegeben, sterilisiert
und mit einem Vol.-% der Keimkultur geimpft und anschließend bei einem pH von 6-
8 für 24 Stunden bei 30ºC unter Durchleiten von Luft gezüchtet.
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Ca. 18 Liter der erhaltenen Kultur wurden in eine Ultra-Hochdruck-
Zellzerkleinerungs-Apparatur gegeben, um die Zellen zu zerkleinern, und die
Suspension wurde zentrifugiert, um eine überstehende Flüssigkeit zu erhalten. Zu
ca. 16 Liter der überstehenden Flüssigkeit wurde Ammoniumsulfat gegeben, um
einen Sättigungsgrad von 20 Vol.-% zu ergeben, und die Lösung wurde 1 Stunde bei
4ºC stehengelassen und dann zentrifugiert, um das Sediment zu entfernen. Die so
erhaltene überstehende Flüssigkeit wurde mit Ammoniumsulfat gemischt, um einen
Sättigungsgrad von 60 Vol.-% zu ergeben, für 24 Stunden bei 4ºC stehengelassen,
zentrifugiert, um das Sediment aufzufangen, das dann in einer Mindestmenge von 10
mM Phosphat-Puffer (pH 7.0) gelöst, für 24 Stunden gegen 10 mM Phosphat-Puffer
(pH 7.0) dialysiert und dann zentrifugiert wurde, um die unlöslichen Substanzen zu
entfernen. Die resultierende überstehende Flüssigkeit wurde auf eine mit "DEAE-
TOYOPEARL®", einem Ionenaustauscher, der von Tosoh Corporation, Tokyo, Japan,
vertrieben wird, gepackte Säule, die vorher mit 10 mM Phosphat-Puffer (pH 7.0) ins
Gleichgewicht gebracht worden war, gegeben und aus der Kolonne mit einem
linearen, in 10 mM Phosphat-Puffer (pH 7.0) von 0 M auf 0.5 M anwachsenden
Natriumchlorid-Gradienten eluiert. Die Fraktionen mit einer Enzymaktivität wurden
aus dem Eluat aufgefangen, zusammengegeben, 10 Stunden gegen 50 mM
Phosphat-Puffer (pH 7.0), der 2 M Ammoniumsulfat enthielt, dialysiert und dann
zentrifugiert, um die unlöslichen Substanzen zu entfernen. Die resultierende
überstehende Flüssigkeit wurde auf eine mit "BUTYL-TOYOPEARL®", einem Gel für
die hydrophobe Saulenchromatographie, das von Tosoh Corporation, Tokyo, Japan,
vertrieben wird, gepackte Säule, die voher mit 50 mM Phosphat-Puffer (pH 7.0), der
2 M Ammoniumsulfat enthielt, in Gleichgewicht gebracht worden war, gegeben und
mit einem linearen, in 50 mM Phosphat-Puffer (pH 7.0) von 2 M auf 0 M abfallenden
Natriumchlorid-Gradienten aus der Säule eluiert. Die Fraktionen mit einer
Enzymaktivität wurden aus dem Eluat aufgefangen, zusammengefasst und auf eine
mit "TOYOPEARL® HW-55", einem Gel für Gel-Filtration Säulenchromatographie,
das von Tosoh Corporation, Tokyo, Japan, vertrieben wird, gepackte Säule, die
vorher mit 50 mM Phosphat-Puffer (pH 7.0) ins Gleichgewicht gebracht worden war,
gegeben und aus der Säule mit 50 mM Phosphat-Puffer (pH 7.0) eluiert, um die
Fraktionen mit einer Enzymaktivität aufzufangen. Bei dem resultierenden,
gereinigten, nicht reduzierende Saccharide bildenden Enzym handelte es sich um ein
Protein mit einer spezifischen Aktivität von ca. 195 Einheiten pro mg Protein und die
Ausbeute betrug ca. 220 Einheiten pro Liter der Kultur.
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Über die gesamte vorliegenden Patentschrift wird die Aktivität des nicht reduzierende
Saccharide bildende Enzyms nach der folgenden Methode geprüft und durch den
Wert von Einheiten zum Ausdruck gebracht: Man gebe 4 ml eines 50 mM Phosphat-
Puffers (pH 7.0) in ein Versuchsreagenzglas, das 1.25 Vol.-% Maltopentaose enthält,
gebe 1 ml einer Enzymlösung in das Reagenzglas, züchte die Mischung für 60
Minuten bei 40ºC, um eine Enzymreaktion auszulösen, und heize die resultierende
Mischung für 10 Minuten bei 100ºC, um die Reaktion zu unterbinden. Man löse die
Reaktionsmischung in der 10-fachen Menge an destilliertem Wasser und prüfe die
Reduktionskraft über die Somogyi-Nelson-Methode. Zur Kontrolle wurde eine
Enzymlösung, die für 10 Minuten bei 100ºC vorgeheizt war, um das Enzym zu
deaktivieren, auf die gleiche Weise behandelt. Eine Aktivitätseinheit des nicht
reduzierende Saccharide bildenden Enzyms ist definiert als die Menge an Enzym,
welche die Reduktionskraft entsprechend zu ein umol Maltopentaose pro Minute
verringert.
Experiment 1-2
Herstellung von Trehalose freisetzenden Enzymen
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Proben von jeweils 100 ml einer flüssigen Nährlösungskultur (pH 7.0), die 2.0 Vol.-%
"PINE-DEX #4", ein partielles Stärke-Hydrolysat, das von Matsutani Chemical Ind.,
Co., Ltd., Hyogo, Japan, vertrieben wird, 0.5 Vol.-% Pepton, 0.1 Vol.-% Hefeextrakt,
0.1 Vol.-% Dinatriumhydrogenphosphat und 0.1 Vol.-% Natriumdihydrogenphosphat
enthielt, wurden in 500 ml Erlenmeyer-Kolben gegeben und durch Umsetzung für 20
Minuten im Autoklaven bei 120ºC sterilisiert. Nach dem Kühlen der Kolben wurde
jedes Medium mit einem Keim des Rhizobium sp. M-11 (FERM BP-4130) geimpft
und für 24 Stunden bei 27ºC unter rotierenden Schüttelbewegungen gezüchtet, um
eine Keimkultur zu erhalten. Danach wurden Proben von 20 Liter eines frisch
zubereiteten Präparats der gleichen Nährlösungskultur in 30 Liter Gärbehälter
gegeben, sterilisiert und mit einem Vol.-% der Keimkultur geimpft und anschließend
bei einem pH von 6-8 für 24 Stunden bei 30ºC unter Durchleiten von Luft
gezüchtet.
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Ca. 18 Liter der resultierenden Kultur wurde in analoger Weise wie in Experiment 1-1
behandelt, um die Zellen zu zerstören und die Suspension wurde gereinigt, um ein
Trehalose freisetzendes Enzym mit einer spezifischen Aktivität von ca. 240 Einheiten
pro mg Protein zu erhalten. Die Ausbeute betrug ca. 650 Einheiten pro Liter der
Kultur.
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Über die gesamte vorliegende Patentschrift wird die Aktivität des Trehalose
freisetzenden Enzyms nach, dem folgenden Verfahren geprüft und durch den Wert
von Einheiten zum Ausdruck gebracht: Man gebe 4 ml eines 50 mM Phosphat-
Puffers (pH 7.0) in ein Reagenzglas, das 1.25 Vol.-% α-Maltotriosyl-Trehalose
enthält, gebe 1 ml einer Enzym-Lösung in das Reagenzglas und züchte die
Mischung für 30 Minuten bei 40ºC, um die Enzymreaktion auszulösen. Ein ml der
Reaktionslösung wurde in ein Prüfreagenzglas gegeben, man gebe 2 ml der
Somogyi-Kupfer-Lösung wurden hinzu, um die Reaktion zu unterbinden und prüfe
die Reduktionskraft nach der Somogyi-Nelson-Methode. Zur Kontrolle wurde eine
Enzymlösung, die für 10 Minuten bei 100ºC vorgeheizt worden war, um das Enzym
zu deaktivieren, auf die gleiche Weise wie oben beschrieben behandelt. Eine
Aktivitatseinheit des Trehalose freisetzenden Enzyms ist definiert als die Menge an
Enzym, welche die Reduktionskraft entsprechend zu 1 umol Glucose pro Minute
erhöht.
Experiment 2
Herstellung von Trehalose
Experiment 2-1
Herstellung von wasserfreier kristalliner Trehalose
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Ein Gewichtsanteil Kartoffelstärke wurde in 10 Gewichtsanteilen Wasser suspendiert
und auf die übliche Weise mit einer bakteriell verflüssigenden α-Amylase vermischt,
anschließend wurde die Mischung auf 90ºC erhitzt, um die Bestandteile zu gelieren
und bis zu einem DE (Dextrose-Äquivalent) von 0.5 zu verflüssigen, dann wurde das
resultierende Zwischenprodukt unmittelbar auf 130ºC erhitzt, um die Enzymreaktion
zu unterbinden. Die verflüssigte Stärke wurde sofort darauf auf 45ºC gekühlt, dann
mit einer Einheit des nicht reduzierende Saccharide bildenden Enzyms, das in
Experiment 1-1 erhalten wurde, pro g Stärke (d.s.b.), einer Einheit des Trehalose
freisetzenden Enzyms, das in Experiment 1-2 erhalten wurde, pro g Stärke (d.s.b)
und 200 Einheiten einer Isoamylase, die von Hayashibara Biochemical Laboratories,
Inc., Okayama, Japan, vertrieben wird, pro g Stärke versetzt, anschließend wurden
die Bestandteile über 48 Stunden in Zucker umgewandelt, wobei der pH bei ca. 6.0
gehalten wurde, um eine Reaktionsmischung zu erhalten, die 80.5 Gew.-%
Trehalose (d.s.b) enthält Die Reaktionsmischung wurde auf die übliche Weise mit
Aktivkohle entfärbt, entsalzt und gereinigt mit Hilfe eines Ionenaustauschers, auf 75
Gew.-% konzentriert, in ein Kristallisationsgefäß gegeben, auf 50ºC erhitzt, mit 1
Gew.-% (d.s.b.) kristallinem Trehalose-Hydrat vermischt und über 24 Stunden unter
mäßigem Rühren auf 30ºC gekühlt. Die resultierende Masse, die das kristalline
Trehalose-Hydrat enthielt, wurde mit einer Korbzentrifuge separiert und die
aufgefangenen Kristalle wurden mit einer geringen Menge Wasser besprüht, um
kristallines Trehalose-Hydrat, das 99.0 Gew.-% Trehalose enthält, mit einer
Ausbeute von 47%, bezogen auf die Stärke als Ausgangsmaterial, zu erhalten.
Experiment 2-2
Herstellung von wasserfreier Trehalose
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Ein Teil des kristallinen Trehalose-Hydrats, das nach dem Verfahren in Experiment
2-1 erhalten wurde, wurde bereitgestellt, unter Erwärmen in einer geringen Menge
Wasser gelöst, in einen Reaktionsbehälter gegeben und unter reduziertem Druck zu
einem Sirup mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 9.5 Gew.-% konzentriert. Der Sirup
wurde in ein Kristallisationsgefäß gegeben, mit einem Gew.-% (d.s.b.) wasserfreier
kristalliner Trehalose als Impfkristall vermischt und für 5 Minuten unter Rühren bei
100ºC auskristallisiert. Die resultierende Masse wurde auf flache Plastikschalen
verteilt und durch Stehenlassen für 3 Stunden bei 70ºC gealtert. Danach wurde die
zu einer blockigen Form verfestigte Masse aus den Schalen entfernt und auf die
übliche Weise pulverisiert, um eine pulverförmige wasserfreie kristalline Trehalose
mit einem Feuchtigkeitsgehalt von ca. 1 Gew.-% in einer Ausbeute von ca. 90%,
bezogen auf den Ausgangsstoff (d.s.b.), zu erhalten.
Experiment 2-3
Herstellung von wasserfreier amorpher Trehalose
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Ein Teil des kristallinen Trehalose-Hydrats, das nach dem Verfahren in Experiment
2-1 erhalten wurde, wurde in Wasser gelöst, um eine Konzentration von ca. 40 Gew.-
% zu ergeben, gefriergetrocknet und pulverisiert, um ein wasserfreies amorphes
Trehalose-Pulver mit einem Feuchtigkeitsgehalt von ca. 2 Gew.-% in einer Ausbeute
von ca. 100%, bezogen auf den Ausgangsstoff (d.s.b.), zu erhalten.
Experiment 3
Herstellung von Octaacetyl-Trehalose
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Fünfundsechzig g trocknes Pyridin, das 50 g Essigsäureanhydrid enthielt, wurde in
einen Reaktionsbehälter gegeben, auf 0ºC gekühlt und jeweils entweder mit 3 g
kristallinem Trehalose-Hydrat, wasserfreier kristalliner Trehalose oder wasserfreier
amorpher Trehalose, die in Experiment 2-1 bzw. 2-3 erhalten wurden, vermischt,
anschließend wurde das Saccharid vollständig unter mäßigem Rühren in dem
Lösungsmittel gelöst. Die Lösung wurde für 18 Stunden bei Zimmertemperatur
stehengelassen, um die Bestandteile miteinander umzusetzen und die Lösung wurde
dann in Eiswasser gegossen und für eine Weile stehengelassen und durch
Dekantieren separiert, um die Phase des organischen Lösungsmittels aufzufangen,
die anschließend konzentriert wurde. Das Konzentrat wurde über konventionelle
Verfahren unter Einsatz der Gaschromatographie analysiert, um die gebildete
Octaacetyl-Trehalose zu quantifizieren, anschließend wurde die Farbe der
Octaacetyl-Trehalose makroskopisch beurteilt. Die Ergebnisse sind in der folgenden
Tabelle aufgeführt.
Tabelle
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Anmerkung: In der Tabelle bedeutet das Symbol "±", dass das Produkt bei der
makroskopischen Betrachtung leicht gefärbt war, und das Symbol "++"
bedeutet, dass das Produkt stark gefärbt war.
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Die Ergebnisse in der Tabelle zeigen, dass eine stark gefärbtes Octaacetyl-
Trehalose erhalten wird, mit einer Ausbeute von 60% der Theorie, wenn kristallines
Trehalose-Hydrat als Substrat eingesetzt wird, während eine qualitativ hochwertige
Octaacetyl-Trehalose mit einer nahezu theoretischen Ausbeute erhalten wird, wenn
wasserfreie kristalline Trehalose und wasserfreie amorphe Trehalose als Substrat
eingesetzt werden. Die Werte zeigen, dass die vorliegende Erfindung, bei der
wasserfreie Trehalose als Substrat eingesetzt wird, die Ausbeute und die Qualität
von Trehalose-Derivaten deutlich verbessert im Vergleich zu denen, die mit
Verfahren unter Einsatz von kristallinem Trehalose-Hydrat erhalten werden.
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Die folgenden Beispiele dienen zur Erklärung der vorliegenden Erfindung:
Beispiel 1
Trehalose-Linoleat
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Zweihundert ml wasserfreies Pyridin und die wasserfreie amorphe Trehalose, die
nach dem Verfahren in Experiment 2-3 erhalten wurde, wurden in ein
Reaktionsgefäß gegeben und mit 4 g Thiazolithion-Linolsäureamid, gelöst in 5 ml
wasserfreiem Pyridin, vermischt. Zur der Reaktionsmischung wurden 85 mg 60
Gew.-% öliges Natriumhydrid gegeben und die resultierende Mischung wurde für 2
Stunden bei Zimmertemperatur umgesetzt. Die Reaktionsmischung wurde mit 1.5 ml
gesättigter wässeriger Ammoniumchlorid-Lösung vermischt, anschließend wurde das
Pyridin im Vakuum entfernt, um 8.5 g Rückstand zu erhalten. Die Reinigung des
Rückstandes unter Einsatz der Silika-Gel-Chromatographie ergab 5.3 g Trehalose-
Linoleat mit einem mittleren Substitutionsgrad von 1.4.
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Das geschmack- und geruchlose Produkt mit einer bemerkenswert hohen Aktivität
kann wahlweise in Lebensmitteln, Kosmetika und Arzneimitteln als ein nicht ionischer
oberflächenaktiver Stoff zum Schutz eingesetzt werden. Zur Kontrolle wurde
kristallines Trehalose-Hydrat, das nach dem Verfahren in Experiment 2-1 erhalten
wurde, analog wie oben beschrieben umgesetzt, woraus lediglich 2.3 g stark
gefärbtes Trehalose-Linoleat resultierte.
Beispiel 2
Trehalose-Myristat
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Zweihundertundzwanzig g wasserfreie kristalline Trehalose, die nach dem Verfahren
in Experiment 2-2 erhalten wurde, wurde in 800 ml N,N'-Dimethylformamid gelöst,
mit 60 g Myristinsäure-Methylester und 4 g Calciumcarbonat vermischt und für 24
Stunden unter einem reduzierten Druck von 100-200 mm Hg bei einer Temperatur
von 85-95ºC einer Enzymreaktion unterzogen. Danach wurde das organische
Lösungsmittel im Vakuum aus der Reaktionsmischung entfernt und der Rückstand
wurde zweimal in 300 ml Aceton aufgenommen. Die Extrakte wurden
zusammengefasst und mit Benzol und Äther gewaschen, um ein viskoses, öliges
Produkt zu erhalten, das dann wiederum zweimal in 300 ml Aceton aufgenommen
wurde. Das so erhaltene Extrakt wurde gekühlt und das gebildete Sediment wurde
aufgefangen und zu 310 g Trehalose-Myristat mit einem mittleren Substitutionsgrad
von 1.7 getrocknet.
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Das geschmack- und geruchlose Produkt mit einer bemerkenswert hohen Aktivität
kann wahlweise in Lebensmitteln, Kosmetika und Arzneimitteln als nicht ionischer
oberflächenaktiver Stoff zum Schutz eingesetzt werden. Da das Produkt eine
Wirksamkeit zur Behinderung des Wachstums von bösartigen Tumoren besitzt, kann
es auch als wirksamer Bestandteil für Arzneimittel eingesetzt werden. Zur Kontrolle
wurde kristallines Trehalose-Hydrat, das nach dem Verfahren in Experiment 2-1
erhalten wurde, analog wie oben beschrieben umgesetzt, um lediglich 90 g stark
gefärbtes Trehalose-Myristat zu erhalten.
Beispiel 3
Trehalose-Dodecyläther
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Dreihundertundneunzig g n-Dodecanol wurden in ein Reaktionsgefäß gegeben, auf
125ºC erhitzt und mit 1 g p-Toluolsulfonat als Katalysator versetzt, anschließend
wurde der Innendruck des Gefäßes auf 5-10 mm HG reduziert. Einhundert g
wasserfreie amorphe Trehalose, die nach dem Verfahren in Experiment 2-3 erhalten
wurde, wurde in 130 g n-Dodecanol suspendiert und die Suspension wurde
tropfenweise mit einer Geschwindigkeit von 2.3 g/min innerhalb von 100 Minuten in
das Reaktionsgefäß gegeben. Die erhaltene Reaktionsmischung wurde mit
gesättigtem Natriumcarbonat neutralisiert, anschließend wurde das unverbrauchte n-
Dodecanol entfernt, um ca. 140 g einer Verbindung zu erhalten, die 79.9 Gew.-%
Trehalose-Dodecyläther (d.s.b.) enthielt.
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Das Produkt mit einer relativ hohen Aktivität kann wahlweise als oberflächenaktiver
Stoff zum Schutz in Waschmitteln für Wäscherei und Küche sowie für den
allgemeinen Gebrauch einschließlich Haarwaschmitteln eingesetzt werden. Zur
Kontrolle wurde kristallines Trehalose-Hydrat, das nach dem Verfahren in
Experiment 2-1 erhalten wurde, analog wie oben beschrieben eingesetzt, um ca. 80
g einer Verbindung zu erhalten, die 27.5 Gew.-% stark gefärbten Trehalose-
Dodecyläther (d.s.b.) enthielt.
Beispiel 4
Trehalose-Sulfat
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Ein Gewichtsanteil wasserfreier amorpher Trehalose, die nach dem Verfahren in
Experiment 2-3 erhalten wurde, wurde in ein Reaktionsgefäß gegeben und
tropfenweise mit 5 Gewichtsanteilen eines Schwefeltrioxid/Dimethylformamid-
Komplexes unter einem Stickstoffgasstrom versetzt. Die Mischung wurde sukzessive
einer Enzymreaktion für 4 Stunden bei Zimmertemperatur und für 1 Stunde bei 70ºC
unterzogen. Die Reaktionsmischung wurde mit einer adäquaten Menge an 5 N
Natriumhydroxid neutralisiert, mit dem 5-fachen Volumen an Methylalkohol vermischt
und für eine Zeitlang stehengelassen, anschließend wurde das gebildete Sediment
durch Filtration unter Absaugen aufgefangen, um ein Trehalose-Sulfat mit einem
mittleren Substitutionsgrad von 7.7 in einer Ausbeute von ca. 95 Gew.-% (d.s.b.) zu
erhalten.
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Das Produkt besitzt eine relativ hohe Qualität und kann allgemein in Kosmetika, wie
z.B. als Mittel zum Speichern von Feuchtigkeit und als Mittel zu Hautverschönerung,
eingesetzt werden. Zur Kontrolle wurde kristallines Trehalose-Hydrat, das nach dem
Verfahren in Experiment 2-1 erhalten wurde, einer analogen Enzymreaktion wie oben
beschrieben ausgesetzt, um ein stark gefärbtes Terhalose-Sulfat mit einem mittleren
Substitutionsgrad von 6.5 in einer Ausbeute von ca. 63 Gew.-% zu erhalten.
Beispiel 5
Trehalose-Sulfat
Beispiel 5-1
Herstellung von Maltose/Trehalose umwandelnden Enzymen
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Proben von je 100 ml flüssiger Nährlösungskultur (pH 7.2), die aus 2.0 Vol.-%
Glucose, 0.5 Vol.-% Polypepton, 0.1 Vol.-% Hefeextrakt, 0.1 Vol.-%
Dikaliumhydrogenphosphat, 0.06 Vol.-% Natriumdihydrogenphosphat, 0.05 Vol.-%
Magnesiumsulfat-Heptahydrat, 0.5 Vol.-% Calciumcarbonat und Wasser bestand,
wurden in 500 ml Kolben gegeben und die Kolben wurden durch Aufheizen für 30
Minuten auf 115ºC sterilisiert, gekühlt, mit Keimen von Pimerobacter sp. R48 (FERM
BP-4315) geimpft und anschließend für 24 Stunden unter Rühren mit 200 rpm bei 27
ºC gezüchtet, um eine Keimkultur zu erhalten. Danach wurden Proben von 20 Liter
eines frisch zubereiteten Präparats der gleichen flüssigen Nährlösungskultur in 30
Liter Gärbehälter gegeben, analog wie oben beschrieben sterilisiert, auf 27ºC
gekühlt, mit 1 Vol.-% Keimkultur geimpft und bei einem pH von 6.0-8.0 für 40
Stunden unter Durchleiten von Luft bei 27ºC gezüchtet.
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Die resultierende Kultur wurde zentrifugiert und ca. 0.5 kg der aufgefangenen nassen
Zellen wurden in 10 mM Phosphat-Puffer (pH 7.0) suspendiert und auf die übliche
Weise zerquetscht, anschließend wurde die resultierende Suspension zentrifugiert,
um ca. 4.5 Liter einer Rohenzym-Lösung zu erhalten. Zu der Suspension wurde
Ammoniumsulfat gegeben, um einen Sättigungsgrad von ca. 30 Vol.-% zu ergeben,
es wurde durch Stehenlassen für 4 Stunden bei 4ºC ausgesalzt und dann
zentrifugiert, um die überstehende Flüssigkeit zu erhalten. Zu der überstehenden
Flüssigkeit wurde Ammoniumsulfat gegeben, um einen Sättigungsgrad von 80 Vol.-
% zu ergeben, die überstehende Flüssigkeit wurde über Nacht bei 4ºC
stehengelassen und dann zentrifugiert, um das Sediment aufzufangen, welches dann
in einer kleinen Menge 10 mM Phosphat-Puffer (pH 7.0) gelöst und gegen 10 mM
Phosphat-Puffer (pH 7.0) für 24 Stunden dialysiert wurde. Die dialysierte innere
Lösung wurde zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit wurde auf eine Säule
gegeben, die mit "DEAE TOYOPEARL®", einem Harz für Ionaustauscher-
Chromatographie, das von Tosoh Corporation, Tokyo, Japan, vertrieben wird,
gepackt war, und mit einem linearen Natriumchlorid-Gradienten, der in 10 mM
Phosphat-Puffer (pH 7.0) von 0 M auf 0.4 M anstieg, eluiert. Aus dem Eluat wurden
die Fraktionen mit der gewünschten Enzymaktivität aufgefangen, zusammengefasst,
für 10 Stunden gegen 10 mM Phosphat-Puffer (pH 7.0), der 1 M Ammoniumsulfat
enthielt, dialysiert und dann zentrifugiert, um eine überstehende Flüssigkeit zu
erhalten. Die überstehende Flüssigkeit wurde auf eine mit "BUTYL TOYOPEARL®"
einem Harz für hydrophobe Säulenchromatographie, das von Tosoh Corporation,
Tokyo, Japan, vertrieben wird, gepackte Säule, die vorher mit 10 mM Phosphat-
Puffer (pH 7.0), der ein M Ammoniumsulfat enthielt, ins Gleichgewicht gebracht
worden war, gegeben und mit einem linearen Ammoniumsulfat-Gradienten, der in
10mM Phosphat-Puffer (pH 7.0) von 1 M auf 0 M zurückging, eluiert. Die Fraktionen
mit einer Enzymaktivität wurden aus dem Eluat aufgefangen, zusammengefasst, auf
eine mit "MONO Q HR5/5", einem Ionenaustauscher für Ionenaustauscher-
Säulenchromatographie, der von Pharmacia LKB Biotechnology AB Uppsala,
Sweden, vertrieben wird, gepackte Säule, die vorher mit 10 mM Phosphat-Puffer (pH
7.0) ins Gleichgewicht gebracht worden war, gegeben und mit einem linearen
Natriumchlorid-Grandienten, der in 10 mM Phosphat-Puffer (pH 7.0) von 0 M auf 0.5
M anstieg, aus der Säule eluiert, anschließend wurden die Fraktionen mit der
gewünschten Enzymaktivität aufgefangen. Das resultierende gereinigte Maltose-
Trehalose umwandelnde Enzym besaß eine spezifische Aktivität von ca. 17
Einheiten pro mg Protein bei einer Ausbeute von ca. 46 Einheiten pro Liter der
Kultur.
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Über die gesamte vorliegende Erfindung wurde die Aktivität des Maltose/Trehalose
umwandelnden Enzyms nach der folgenden Methode geprüft und durch den
Aktivitätswert (Einheit) zum Ausdruck gebracht:: Man gebe in ein
Versuchsreagenzglas ein ml eines 10 mM Phosphat-Puffers (pH 7.0), der 20 Vol.-%
Maltose enthält, gebe ein ml einer entsprechend gelösten Enzym-Lösung in das
Reagenzglas, unterziehe die Bestandteile einer Enzymreaktion durch Züchten für 60
Minuten bei 25ºC und heize die Reaktionsmischung für 10 Minuten auf 100ºC, um
die Reaktion zu unterbinden. Man löse die Reaktionsmischung in der 11-fachen
Menge 50 mM Phosphat-Puffer (pH 7.5), gebe 0.4 ml der gelösten Lösung in ein
Versuchsreagenzglas, gebe 0.1 ml einer Lösung, die pro ml eine Einheit Trehalase
enthält, in das Reagenzglas, züchte den Inhalt des Reagenzglases für 120 Minuten
bei 45ºC und quantifiziere den Glucose-Gehalt in der Reaktionsmischung durch das
Glucose-Oxidase-Verfahren. Parallel stelle man zur Kontrolle ein System unter
Einsatz einer Enzym-Lösung, die für 10 Minuten bei 100ºC vorgeheizt wurde, um
das Enzym zu deaktivieren, bereit und behandle das System analog wie oben
beschrieben. Auf Basis des quantifizierten Glucose-Gehalts schätze man den
gebildeten Trehalose-Gehalt. Eine Aktivitatseinheit des Maltose/Trehalose
umwandelnden Enzyms ist definiert als die Menge, die ein umol Trehalose unter der
oben genannten Bedingungen pro Minute bildet.
Beispiel 5-2
Herstellung von wasserfreier kristalliner Trehalose
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Kornstärke wurde in Wasser mit einer Konzentration von 15 Gew.-% suspendiert, auf
pH 5.5 eingestellt, mit 2 Einheiten "SPITASE HS", einer verflüssigenden α-Amylase,
die von Nagase Biochemicals, Ltd., Kyoto, Japan, vertrieben wird, pro g Stärke
(d.s.b.) vermischt und unter Rühren auf 90ºC erhitzt, um die Stärke zu gelieren und
zu verflüssigen. Die verflüssigte Stärke wurde für 20 Minuten bei 120ºC im
Autoklaven umgesetzt, um das Enzym zu deaktivieren, unmittelbar darauf auf 55ºC
gekühlt, auf pH 5.0 eingestellt, mit einer Isoamylase, die von Hayashibara
Biochemical Laboratories, Inc. Okayama, Japan, vertrieben wird, und einer β-
Amylase, die von Nagase Biochemicals, Ltd. Tokyo, Japan, vertrieben wird, jeweils in
einer Menge von 300 Einheiten bzw. 20 Einheiten pro g Stärke (d.s.b.) vermischt und
für 24 Stunden reagieren lassen, um eine Reaktionsmischung zu erhalten, die 92
Gew.-% Maltose (d.s.b.) enthielt. Die Reaktionsmischung wurde für 20 Minuten auf
100ºC erhitzt, um die restlichen Enzyme zu deaktivieren, auf 20ºC gekühlt, auf pH
7.0 eingestellt, mit 1.5 Einheiten des Maltose/Trehalose umwandelden Enzyms, das
nach Beispiel 5-1 erhalten wurde, pro g Stärke vermischt und für 72 Stunden einer
Enzymreaktion unterzogen, um eine Reaktionsmischung zu erhalten, die 71 Gew.-%
Trehalose (d.s.b.) enthielt. Die resultierende Reaktionsmischung wurde für 10
Minuten auf 95ºC erhitzt, um die restlichen Enzyme zu deaktivieren, gekühlt, ähnlich
wie in Experiment 2-1 gereinigt und konzentriert, um einen Feuchtigkeitsgehalt von
9.5 Gew.-% zu ergeben. Das Konzentrat wurde in ein Kristallisationsgefäß gegeben,
mit einem Gew.-% (d.s.b.) einer pulverförmigen wasserfreien kristallinen Trehalose
als Keim vermischt und für 10 Minuten bei 110ºC unter Rühren auskristallisiert. Die
erhaltene Masse wurde auf Plastikschalen verteilt und durch Stehenlassen bei 70ºC
für 3 Stunden gealtert. Danach wurde die verfestigte Masse in blockiger Form aus
den jeweiligen Schälen entfernt, auf die übliche Weise pulverisiert und einer
Trocknung im Fließbett unterzogen, um eine pulverförmige wasserfreie kristalline
Trehalose mit einem Feuchtigkeitsgehalt von ca. 2 Gew.-% in einer Ausbeute von ca.
95%, bezogen auf die Stärke als Ausgangsmaterial (d.s.b.), zu erhalten.
Beispiel 5-3
Herstellung von Trehalose-Sulfat
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Einhundert g wasserfreie kristalline Trehalose, die nach dem Verfahren in Beispiel 5-
2 erhalten wurde, wurde in ein Reaktionsgefäß gegeben und nach dem Verfahren in
Beispiel 4 sulfatisiert, um ca. 240 g einer Verbindung zu erhalten, die Trehalose-
Sulfat mit einem mittleren Substitutionsgrad von ca. 8 enthält. Das Produkt mit einer
relativ hohen Qualität kann wahlweise als Mittel zu Verleihen von Feuchtigkeit oder
allgemein als Mittel zur Verschönerung der Haut eingesetzt werden.
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Wie oben beschrieben wird, ermöglicht es die vorliegende Erfindung, qualitativ relativ
hochwertige Trehalose-Derivate, die nach konventionellen Methoden nicht einfach
erhalten werden können, durch die Reaktion von wasserfreier Trehalose mit
reaktiven Stoffen unter wasserfreien Bedingungen zu produzieren. Im Gegensatz zu
kristallinem Trehalose-Hydrat, besitzt wasserfreie Trehalose kein Kristallwasser, so
dass der für die Herstellung erforderliche Trockenschritt in großem Ausmaß
verringert wird oder ganz wegfällt und es zu einer bemerkenswert hohen
Reduzierung der Produktionskosten für die Trehalose-Derivate kommt. Die
Trehalose-Derivate, die durch die vorliegende Erfindung erhalten werden, können bei
einer Vielzahl von Einsatzgebieten in der Produktion, bei der chemischen Synthese
und bei der enzymatischen Synthese von Lebensmitteln, Kosmetika, Arzneimitteln,
Reinigungsmitteln und Chemikalien als oberflächenaktive Stoffe, Mittel zu Verleihung
von Feuchtigkeit, Mittel zu Verschönerung der Haut, Antitumor-Mittel und
Zwischenprodukte für chemische und enzymatische Synthesen eingesetzt werden.
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Während hier beschrieben wurde, was zur Zeit als die bevorzugten
Ausführungsformen der Erfindung angesehen wird, werden die verschiedenen
Modifikationen, die dabei durchgeführt werden können, durchaus erkannt und es ist
beabsichtigt mit den beigefügten Ansprüchen alle diese Modifikationen abzudecken
so dass sie unter den Umfang der Erfindung fallen.