DE102007039490B4

DE102007039490B4 - Verfahren zur Herstellung pulverförmiger Chitosan-Oligomere

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Publication number: DE102007039490B4
Application number: DE102007039490A
Authority: DE
Inventors: Vadim Gennadievich Frolov; Igor Mikhalovich Sheremet; Alexandr Vladimirovich Temnikov; Evgeny Mikhailovich Lunin; Vyacheslav Petrovich Nistratov
Original assignee: ZAKRYTOE AKTSIONERNOE OBSCHESTVO "BIO TEKHNOLOGII"
Current assignee: ZAKRYTOE AKTSIONERNOE OBSCHESTVO "BIO TEKHNOLOGII"
Priority date: 2006-09-11
Filing date: 2007-08-21
Publication date: 2010-02-11
Anticipated expiration: 2027-08-22
Also published as: RU2316592C1; DE102007039490A1

Abstract

Verfahren zur Herstellung pulverförmiger Chitosan-Oligomere, umfassend
– die Bildung einer Chitosanlösung in einer Säure;
– die Einführung von Fermenten in die erhaltene Chitosanlösung, welche eine fermentative Hydrolyse des Chitosans unter Herstellung eines Reaktionsgemisches sicherstellt;
– die Durchführung einer fermentativen Hydrolyse des Reaktionsgemisches, welche den Erhalt der Chitosan-Oligomere und eines durch organische Säure und Chitosan-Oligomere gebildeten Komplexsalzes gewährleistet;
– die Filtration des Reaktionsgemisches unter Isolierung der erhaltenen Hydrolyseprodukte daraus;
– die Trocknung der isolierten Produkte;
dadurch gekennzeichnet, dass
die Bildung der Chitosanlösung mit einer Chitosankonzentration von 3–4% in der wässrigen Lösung einer organischen Säure bei einem pH-Wert von 3,5 bis 4,4 erfolgt,
die Hydrolyse mit einem Enzymkomplex, der Chitosanase umfasst, die in Kombination mit Papain bei einem Verhältnis von 1:1–1,2 eingesetzt wird, bis zum Erreichen einer dynamischen Viskosität des Reaktionsgemisches von 1,50 bis 1,58 mPa·s (1,50 bis 1,58 cP) durchgeführt wird,...

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Technologie der Depolymerisation von Chitosan, genauer betrifft sie ein Verfahren zur Gewinnung pulverförmiger Chitosan-Oligomere.
Bekannt ist ein Verfahren zur Herstellung von niedermolekularem wasserlöslichem Chitosan durch fermentative Hydrolyse einer Chitosanlösung beispielsweise in einem Acetatpuffer zunächst bei pH 4,5–5,0 bei einer Temperatur von 45 bis 50°C während 16 Stunden, dann bei pH 6,0–6,5 bei einer Temperatur von 37°C während 8 bis 12 Stunden und unter Verwendung eines auf einem inerten Träger immobilisierten Chitinase-Komplexes bei einem Massenverhältnis Chitosan:Chitinase-Komplex 1:10 ( RU 2073016 C1 , IPK: C 08 B 37/08, veröff. am 10.02.1997). Gemäß dem genannten Verfahren wird ein Reaktionsgemisch, das ein als Resultat der fermentativen Hydrolyse gewonnenes Produkt enthält, einer Filtration zur Entfernung des Ferments unterzogen, wonach das Hydrolyseprodukt getrocknet wird.
Dieses Verfahren erlaubt es, ein pulverförmiges Produkt herzustellen, das ein Gemisch aus niedermolekularem wasserlöslichem Chitosan, welches das Endprodukt ist, und aus einem Nebenprodukt – einem Komplexsalz – darstellt, das durch eine organische Säure und das niedermolekulare wasserlösliche Chitosan gebildet wird. Das gewonnene Produkt läßt sich leicht vom Ferment reinigen, wobei das im Hydrolyseverfahren verwendete Ferment bei nachfolgenden Prozessen mehrfach benutzt werden kann. Jedoch ist für die genannte Technologie eine lange Prozessdauer und eine niedrige Produktivität charakteristisch. Die Zielstoffausbeute ist vermindert, weil im Endprodukt eine beträchtliche Menge an Hydrolyse-Nebenprodukt anwesend ist.
Als nächstliegender Stand der Technik gilt ein Verfahren zur Herstellung pulverförmiger Chitosan-Oligosaccharide (n = 2–25), bei welchem eine fermentative Hydrolyse von Chitosan in einer wäßrigen Lösung, die von 2,4 bis 3,8% organische Säuren enthält, eine Absonderung des Hydrolyseproduktes durch dessen Filtration, die eine Reinigung des Hydrolyseproduktes von nicht aufgelöstem und nicht in Reaktion getretenem Chitosan gewährleistet, und eine Trockung des abgesonderten Hydrolyseproduktes bis zum pulverförmigen Zustand durchgeführt werden ( RU 2250106 C1 , IPK: A 61 K 31/722, veröff. am 14.04.2005). Gemäß einer Ausführungsvariante der Verfahrensstufe der fermentativen Hydrolyse im genannten Verfahren wird zunächst eine Hydrolyse der 5%igen Chitosanlösung in Gegenwart eines Fermentes – der Chitosanase – in einer Menge von 1,5 Einheiten je 1 Gramm Chitosan bei 45°C während 30 Minuten durchgeführt, dann wird die Konzentration des Chitosans auf 10% erhöht, und dem Reaktionsgemisch wird die Chitosanase in einer Menge von 1,5 Einheiten je 1 Gramm Chitosan zugegeben. Die fermentative Hydrolyse wird bei einer Temperatur von 45°C fortgesetzt. Die Gesamtzeit der fermentativen Behandlung beträgt 24 Stunden. Gemäß einer zweiten Ausführungsvariante der Verfahrensstufe der fermentativen Hydrolyse im genannten Verfahren wird zunächst eine Hydrolyse der 5%igen Chitosanlösung in Gegenwart eines Fermentes – der Chitosanase – in einer Menge von 1,5 Einheiten je 1 Gramm Chitosan bei 45°C während 30 Minuten durchgeführt, dann wird die Konzentration des Chitosans auf 10% erhöht und dem Reaktionsgemisch die Chitosanase in einer Menge von 1,5 Einheiten je 1 Gramm des zugesetzten Chitosans zugegeben. Die fermentative Hydrolyse wird bei einer Temperatur von 45°C während 30 Minuten fortgesetzt, woraufhin die Konzentration des Chitosans auf 15% erhöht und dem Reaktionsgemisch die Chitosanase in einer Menge von 3,0 Einheiten je 1 Gramm des gesamten Chitosans zugegeben wird. Die fermentative Hydrolyse wird bei einer Temperatur von 45°C fortgesetzt. Die Gesamtzeit der fermentativen Behandlung beträgt 24 Stunden. Gemäß einer dritten Ausführungsvariante der Verfahrensstufe der fermentativen Hydrolyse im genannten Verfahren wird eine Hydrolyse der 10 bis 15%igen Chitosanlösung in Gegenwart eines Fermentes – der Chitosanase – in einer Menge von 3,0 Einheiten je 1 Gramm Chitosan bei 45°C während 24 Stunden durchgeführt.
Trotz des Vorhandenseins mehrerer Varianten der Durchführung des besagten Verfahrens wird dadurch insgesamt der Erhalt reiner Chitosan-Oligosaccharide nicht sichergestellt, weil das aus der fermentativen Hydrolyse gewonnene Produkt ein Gemisch der Chitosan-Oligosaccharide (n = 2–25) mit einem durch die verwendete organische Säure und Chitosan-Oligosaccharide gebildeten Komplexsalz darstellt.
Außerdem löst sich bei der Zubereitung der Ausgangs-Chitosanlösung im verwendeten wäßrig-sauren Medium die hochmolekulare Chitosanfraktion nicht auf und läßt sich im weiteren nicht hydrolysieren, was sich auf den Ausbeutewert des Hydrolyseproduktes negativ auswirkt.
Aus den vorgenannten Gründen ist nach Absonderung der Oligosaccharide (Oligomere) des Chitosans aus dem Produkt der fermentativen Hydrolyse die Endproduktausbeute nicht hoch.
Überdies stellen die gebildeten Chitosan-Oligosaccharide eine Fraktion dar mit einer ”n”-Zahl der sich wiederholenden Glieder – der Reste des D-Glucosamins und des linearen Aminopolysaccharids, bestehend aus N-Acetyl-2-amino-2-deoxy-D-glucose-Gliedern –, welche eine Zahl von 2 bis 25 darstellt.
Die angeführten Eigenschaften des erhaltenen Produktes zeugen von dessen nicht hoher biologischer Aktivität, erklärlich durch den Gehalt der gebildeten Chitosan-Oligosaccharide an geringaktiven Fraktionen mit einer ”n”-Zahl der sich wiederholenden Glieder von 2 bis 25.
Das dabei erhältliche Produkt weist keine hohen organoleptischen Kennziffern und eine niedrige Thermostabilität auf, außerdem wird die Ausbeute an pulverförmigem Hydrolyseprodukt zusätzlich vermindert wegen Verlusten (von 25% bis 35%) bei der Trocknung von bis zu 5 μm großen Teilchen. Darüber hinaus erschwert der hohe Gehalt des Endproduktes an feinen Teilchen erheblich dessen Weiterverarbeitung, insbesondere Pressung, Kapselung, Tablettierung; beim Auflösen solcher staubförmiger Pulver ist ein Verklumpen zu beobachten, was mit der Aggregation von Teilchen mit hochentwickelter Oberfläche zusammenhängt.
Somit wird zur Zeit das Problem der Gewinnung reiner Chitosan-Oligomere von hoher Ausbeute durch keines der bekannten Verfahren gelöst. Hierzu sind zur Erzeugung von hocheffektiven Mitteln der heilend-vorbeugenden Nahrung und von biologisch aktiven Lebensmittelzusatzstoffen und pharmazeutischen Präparaten reine, biologisch hochaktive Chitosan-Oligomere ohne Beimengungen sowohl von Nebenprodukten der fermentativen Hydrolyse als auch von pulverförmigen Hydrolyseprodukten mit bis zu 5 μm großen Teilchen erforderlich.
Versuche, aus den Produkten der fermentativen Hydrolyse die eigentlichen Chitosan-Oligosaccharide mit der erforderlichen Teilchengröße abzusondern, führen zu einer beträchtlichen Verminderung der Ausbeute an Endprodukt und zur Steigerung der Selbstkosten.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, durch maximale Verringerung des Gehalts des hergestellten Produktes an Stoffen mit Eigenschaften, die denen des Endproduktes nicht entsprechen, ein solches Verfahren zur Gewinnung pulverförmiger Chitosan-Oligomere zu entwickeln, das eine erhöhte Ausbeute an Endprodukt bei dessen höherer Qualität sicherstellt.
Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Gewinnung pulverförmiger Chitosan-Oligomere gelöst, umfassend die Bildung einer Chitosanlösung in einer Säure; die Einführung eines Ferments in die erhaltene Chitosanlösung, welches eine fermentative Hydrolyse des Chitosans unter Herstellung eines Reaktionsgemisches gewährleistet; die Durchführung der Hydrolyse des Reaktionsgemisches, welche die Gewinnung der Chitosan-Oligomere und eines aus organischer Säure und Chitosan-Oligomeren gebildeten Komplexsalzes gewährleistet; die Filtration des Reaktionsgemisches unter Isolierung der gewonnenen Hydrolyseprodukte aus diesem; die Trocknung der isolierten Produkte bis zum pulverförmigen Zustand, bei welchem Verfahren erfindungsgemäß die Bildung der Chitosanlösung mit einer Chitosankonzentration von 3–4% in einer wäßrigen Lösung einer organischen Säure mit einem pH-Wert von 3,5 bis 4,4 erfolgt und die Hydrolyse mit einem Enzymkomplex, der Chitosanase umfasst, die in Kombination mit Papain bei einem Verhältnis von 1:1–1,2 eingesetzt wird, bis zum Erreichen einer dynamischen Viskosität des Reaktionsgemisches von 1,50 bis 1,58 mPa·s (1,50 bis 1,58 cP) durchgeführt wird, wobei vor der Filtration in das Reaktionsgemisch, das ein durch die organische Säure und die Chitosan-Oligomere gebildetes Komplexsalz enthält, ein Anionenaustauscherharz eingeführt wird und die Umwandlung des genannten Komplexsalzes in Chitosan-Oligomere erfolgt, bis ein Reaktionsgemisch auf Basis der Chitosan-Oligomere, welches einen pH-Wert von 7 ± 0,05 hat, und ein Reste der organischen Säure enthaltendes Harz erhalten wird, während bei der Filtration, welche die Isolierung der Lösung der Chitosan-Oligomere aus dem Reaktionsgemisch sicherstellt, das die Reste der organischen Säure enthaltende Harz zusätzlich entfernt wird, wonach vor der Trocknung eine Konzentrierung der erhaltenen Lösung der Chitosan-Oligomere, die einen pH-Wert von 7 hat, bis zu einem Wassergehalt von 62 bis 80 Gewichts-% vorgenommen wird.
Durch die Erfindung ist es möglich geworden, bei einer 96,8% erreichenden Endproduktausbeute reine, keinerlei Beimengungen von Nebenprodukten der fermentativen Hydrolyse enthaltende pulverförmige Chitosan-Oligomere zu erhalten, die eine biologisch hochaktive Fraktion mit einer n-Zahl der sich wiederholenden Glieder von 2 bis 20 darstellen. Die Teilchengröße des gewonnenen Produktes liegt in einem Bereich von 65 bis 100 μm.
Erfindungsgemäß wird eine eine Chitosankonzentration von 3 bis 4% aufweisende Chitosanlösung in wäßriger Lösung einer organischen Säure verwendet, was optimale Bedingungen für den Ablauf der Hydrolysereaktion insbesondere wegen der geringen Viskosität, die bei einer solchen Chitosankonzentration erreicht wird, eine leichte Vermischung des Reaktionsgemisches und eine optimale Hydrolysegeschwindigkeit gewährleistet.
Um das Ferment mehrfach benutzen zu können und die Verunreinigung des Endproduktes zu reduzieren, ist es erfindungsgemäß vorteilhaft, als Ferment ein auf einem inerten Träger immobilisiertes Ferment zu verwenden.
Gemäß vorliegender Erfindung wird als Ferment eine Chitosanase, die in Kombination mit Papain im Verhältnis von jeweils 1:1–1,2 vorliegt, verwendet. Dabei wird eine Stabilisierung des Reaktionsgemisches und eine höchstmögliche Vergrößerung des Anteils an niedermolekularen Chitosan-Oligomerhomologen sowie eine engere Molekulargewichtsverteilung des Endproduktes erreicht.
Es ist gemäß vorliegender Erfindung zweckmäßig, die Hydrolyse bei einem Gehalt an Chitosanase-Ferment in einer Menge von 1,8 Einheiten je 1 Gramm Chitosan und an Papain in einer Menge von 0,5–0,6% der Chitosanmasse im Reaktionsgemisch durchzuführen, was eine Modifikation des Chitosans vermeidet, eine stetige Steuerung des Hydrolyseverfahrens erlaubt und außerdem die Ausbeute an Chitosan-Oligomeren mit einer vorgegebenen Molekulargewichtsverteilung sichert, und zwar:

n = 2 bis 6 54 bis 59%

n = 1 bis 12 38 bis 43%

n = 13 bis 20 3 bis 6%

n über 20 0%
Um eine Verunreinigung des Endproduktes mit Eiweiß zu vermeiden, ist zweckmäßigerweise ein auf einem inerten Träger immobilisiertes Ferment zu verwenden, was es gestattet, den Fermentkomplex mehrfach zu benutzen.
Gemäß vorliegender Erfindung ist es auch zweckmäßig, als Ferment eine gereinigte Chitosanase auf der Basis einer Kultur zu verwenden, die aus der Gruppe ausgewählt wurde, die Streptomyces kurssanovii, Streptomyces griseus, Serratia mancescens, Trichoderma harzianum und Bacillus subtilis, umfasst.
Weitere Ziele und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden ausführlichen Beschreibung des Verfahrens zur Herstellung von pulverförmigen Chitosan-Oligomeren und den konkreten Ausführungsbeispielen dieses Verfahrens.
Gemäß dem beanspruchten Verfahren wird ein Krabben-Chitosan – [Poly-β-(1→4)-2-amino-2-deoxy-D-glucose] – mit einem Deacetylierungsgrad von 90 bis 95% in wäßriger Lösung einer organischen Säure bei pH 3,5–4,4 gelöst. Beim Lösen des Chitosans in der Lösung mit dem erfindungsgemäß vorgeschlagenen Säuregehalt wird ein praktisch vollständiges Auflösen des Ausgangsproduktes und im weiteren eine engere Molekulargewichtsverteilung der erhaltenen Oligomere erreicht – die gewonnenen Chitosan-Oligomere stellen eine Fraktion mit einer Zahl (n) der sich wiederholenden Glieder dar – der Reste des D-Glucosamins und des linearen Aminopolysaccharids, das aus N-Acetyl-2-amino-2-deoxy-D-glucose-Gliedern besteht, welche eine Zahl von 2 bis 20 darstellt (hauptsächlich von 2 bis 12).
Als organische Säure können z. B. Essigsäure, Ascorbinsäure, Milchsäure oder Bernsteinsäure zur Verwendung kommen.
Erfindungsgemäß wird eine eine Chitosankonzentration von 3 bis 4% aufweisende Chitosanlösung in wäßriger Lösung einer organischen Säure verwendet. Untersuchungen haben gezeigt, dass bei der angegebenen Chitosankonzentration die Viskosität der Chitosanlösung gering ist und folglich eine leichte Vermischung des Reaktionsgemisches, eine optimale Hydrolysegeschwindigkeit und eine höhere Ausbeute an biologisch höchstaktiven Chitosan-Oligomeren mit n = 2–6 im Gemisch gewährleistet ist (die Ausbeute beträgt 54–59%, wohingegen gemäß RU 2250106 C1 die Ausbeute an biologisch höchstaktiven Chitosan-Oligomeren im Gemisch 16% beträgt).
Des weiteren wird in die erhaltene Chitosanlösung ein Ferment eingeführt, das für die fermentative Hydrolyse des Chitosans unter Herstellung eines Reaktionsgemisches sorgt.
Um zu ermöglichen, dass das Ferment mehrfach benutzt wird, ist es erfindungsgemäß vorteilhaft, ein auf einem inerten Träger immobilisiertes Ferment zu verwenden.
Gemäß der Erfindung wird als Ferment Chitosanase zu verwendet, die in Kombination mit Papain im Verhältnis von jeweils 1:1–1,2 vorliegt, wobei das in einer vorgegebenen Menge benutzte Papain das Reaktionsgemisch stabilisiert und die Ausbeute an am höchsten niedermolekularen Oligomeren vergrößert, während die Chitosanase, die in dem erfindungsgemäßen Verhältnis zu Papain vorliegt, eine engere Molekulargewichtsverteilung der erhaltenen Oligomere sicherstellt.
Erfindungsgemäß ist es zweckmäßig, die Hydrolyse bei einem Gehalt an Chitosanase im Reaktionsgemisch in einer Menge von 1,8 Einheiten je 1 Gramm Chitosan und an Papain in einer Menge von 0,5–0,6% der Chitosanmasse durchzuführen.
Werden in die Reaktionsmasse Fermentpräparate in einer Menge, die größer als die angegebene ist, eingebracht, geht die Ausbeute an Fraktion der Chitosan-Oligomere mit n = 2–20 um 20 bis 25% zurück, weil eine Inhibierung des Hydrolyseverfahrens durch Reaktionsprodukte erfolgt. Das Einbringen von Fermentpräparaten in einer Menge, die kleiner als die angegebene ist, führt dazu, daß ein Chitosan-Oligomer mit n über 20 erhalten wird, das in Wasser nicht vollständig löslich ist.
Bei dem erfindungsgemäßen Gehalt an Fermenten im Reaktionsgemisch wird eine Ausbeute an Chitosan-Oligomeren mit einer vorgegebenen Molekulargewichtsverteilung erreicht, und zwar:

n = 2 bis 6 54 bis 59%

n = 7 bis 12 38 bis 43%

n = 13 bis 20 3 bis 6%

n über 20 0%
Die Chitosan-Oligomere mit der angegebenen Molekulargewichtsverteilung besitzen eine hohe Wirksamkeit als Vorbeugungs- und komplementäres Heilmittel zur Bekämpfung einer Reihe von weit verbreiteten Krankheiten (des Herz-Kreislaufsystems, des Stütz- und Bewegungsapparates, des Magen-Darm-Trakts, der Leber, der Sehorgane).
Es wurde gefunden, daß jede Fraktion der Chitosan-Oligomere eine Aktivität gegenüber einer bestimmten Erkrankung aufweist. Die maximale immunostimulierende Aktivität haben Oligomere mit n gleich 4, 5 und 6; als Präbiotika (zur Normalisierung der Darmflora) sind Oligomere mit n von 2 bis 8 wirksam. Insgesamt zeigen die höchste biologische Aktivitat Oligomere mit n zwischen 2 und 10–12.
Die Erfindung sieht auch die Möglichkeit vor, Chitinasekomplexe auf der Basis einer Kultur zu benutzen, die ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Streptomyces kurssanovii, Streptomyces griseus, Serratia mancescens, Trichoderma harzianum, Bacillus subtilis.
Gemäß vorliegender Erfindung wird die fermentative Hydrolyse des Reaktionsgemisches vorwiegend während 20 bis 22 Stunden durchgeführt; diese Zeit ist, wie dies Untersuchungen gezeigt haben (bei Einhaltung aller anderen Bedingungen der Verfahrensdurchführung), für die Erreichung einer dynamischen Viskosität des Reaktionsgemisches von 1,50 bis 1,58 mPa·s (1,50 bis 1,58 cP) erforderlich und ausreichend. Bei einer dynamischen Viskosität des genannten Werts wird eine praktisch vollständige Hydrolyse des Chitosans erreicht, und als Ergebnis wird eine erhöhte Ausbeute an Chitosan-Oligomeren und Komplexsalzen, gebildet durch Chitosan-Oligomere und die beim Lösen des Chitosans verwendete organische Säure, erzielt.
Die dynamische Viskosität des Reaktionsgemisches kann beispielsweise an Viskosimetern ”Reotest”, ”Reotest-2” mit koaxialem Zylindersystem S/S in einem homogenen Schubfeld oder an einem Brookfield-Rotationsviskosimeter mit zylindrischem Rotor (6/RPM) bestimmt werden.
Bei Erreichen einer dynamischen Viskosität des Reaktionsgemisches von 1,50 bis 1,58 mPa·s (1,50 bis 1,58 cP) wird eine solche Molekulargewichtsverteilung der Chitosan-Oligomere erzielt, bei welcher die Anzahl der sich wiederholenden Glieder gleich 2 bis 20 ist, was durch die Ergebnisse der Gelchromatographie bestätigt wird.
Des weiteren wird erfindungsgemäß in das Reaktionsgemisch, das die vorstehend genannten Hydrolyseprodukte enthält, ein Anionenaustauscherharz eingeführt.
Als Beispiele für geeignete Anionenaustauscherharze können die in den USA, in Japan, Frankreich, Großbritannien und Deutschland unter den Handelsbezeichnungen Amberlit, Duolit, Dauex, Serolit, Levatit, Vofatit vertriebenen Produkte genannt werden.
Zweckmäßigerweise ist das vorläufig in die OH^–-Form übergeführte Anionenaustauscherharz dem Reaktionsgemisch in einer solchen Menge zuzugeben, daß der pH-Wert des Reaktionsgemisches nach Ablauf von ungefähr 30 bis Minuten 7,0 ± 0,05 beträgt.
Als Ergebnis der Behandlung des Reaktionsgemisches mit einem Anionenaustauscherharz werden aus dem Chitosan-Komplexsalz die Reste der organischen Säure entfernt, wobei sich das im Reaktionsgemisch enthaltene Komplexsalz abspaltet und Chitosan-Oligomere freigesetzt werden. Somit besteht erfindungsgemäß die Möglichkeit, ein Nebenprodukt der fermentativen Hydrolyse in das Endprodukt umzuwandeln.
Außerdem trägt diese Verfahrensmaßnahme zur Erhöhung der Thermostabilität des Produktes bei und verbessert seine rheologischen Eigenschaften.
Nach Beendigung der annähernd 30 bis 40 Minuten dauernden Behandlung mit Anionenaustauscherharz enthält das Reaktionsgemisch hauptsächlich Chitosan-Oligomere, die von Beimengungen des Komplexsalzes der Chitosan-Oligomere und der organischen Säure gereinigt sind, und das Reste der organischen Säure enthaltende Harz, wobei der pH-Wert dieses Reaktionsgemisches 7,0 ± 0,05 beträgt.
Das genannte Reaktionsgemisch wird dann einer Filtration über z. B. einen Polypropylen-Filter mit Öffnungen von 10 μm Durchmesser unterworfen. Die Filtration gewährleistet, daß aus dem Reaktionsgemisch das Reste der organischen Säure enthaltende Harz entfernt wird.
Weiterhin wird erfindungsgemäß eine Konzentrierung des erhaltenen Filtrats – einer Lösung der Chitosan-Oligomere mit einem pH von 7 – bis zu einem Wassergehalt von 62 bis 80 Gewichts-% vorgenommen. Danach wird die Lösung der Chitosan-Oligomere beispielsweise nach einem Zerstäubungsverfahren in einer Trockenanlage bis zum pulverförmigen Zustand getrocknet. Die Teilchengröße des getrockneten Produktes liegt im Bereich von 65 bis 100 μm.
Die Durchführung der Trockung der konzentrierten Lösung der Chitosan-Oligomere erlaubt es, den für die Herstellung des pulverförmigen Endproduktes erforderlichen Energieaufwand beträchtlich (bis auf 70%) zu reduzieren, seine granulometrischen Parameter zu verbessern und folglich Verluste an staubförmigen Teilchen zu vermeiden. Somit trägt die Einführung einer neuen Konzentrierungsstufe ebenfalls zur Erhöhung der Ausbeute an nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen Chitosan-Oligomeren bei. Überdies ist es durch die Anwendung niedrigerer Temperaturen bei der Produktkonzentrierung und -trocknung möglich, eine thermische Zersetzung (”Karamellisieren”) der Chitosan-Oligomere zu vermeiden.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten pulverförmigen Chitosan-Oligomere haben eine Teilchengröße, die in der Lebensmittel- und der pharmazeutischen Industrie optimal ist; die Teilchen sind in Wasser und einer physiologischen Lösung schnell löslich, mischen sich gut mit verschiedenen, bei der Produktion von bioaktiven Zusatzstoffen und Nahrungsmitteln benutzten Ingredienzien (mit wasserlöslichen Heilkräuterextrakten, Obst- und Gemüsepulvern) und sind im Vergleich zu den gemäß dem nächstliegenden Stand der Technik erhältlichen Oligomeren thermostabiler.
Die entsprechend dem beanspruchten Verfahren gewonnenen pulverförmigen Chitosan-Oligomere besitzen eine hohe Bioaktivität, insbesondere bakterizide Aktivität, Antivirenaktivität, Hepatoprotektoraktivität und immunostimulierende Aktivität. Die erhaltenen Verbindungen können als Vorbeugungs- und komplementäres Heilmittel zur Bekämpfung einer Reihe von weit verbreiteten Krankheiten (des Herz-Kreislaufsystems, des Stütz- und Bewegungsapparates, des Magen-Darm-Trakts, der Leber, der Sehorgane) verwendet werden.
Die nachfolgenden Beispiele beschränken in keiner Weise den Umfang der Patentansprüche und dienen lediglich dazu, das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung pulverförmiger Chitosan-Oligomere zu veranschaulichen.
Beispiel 1
Es wird eine 3%ige Lösung von Krabben-Chitosan mit einem Deacetylierungsgrad von 93% in wäßriger Essigsäurelösung mit einem pH-Wert von 3,5 zubereitet.
Der erhaltenen Chitosanlösung werden Papain mit einer Aktivität von 36000 NFPU/mg in einer Menge von 0,5% der Chitosanmasse und Chitosanase mit einer Aktivität von 250 U/g in einer Menge von 1,8 Einheiten der Aktivität je 1 g Chitosan zugeführt.
Es wird eine fermentative Hydrolyse des erhaltenen Reaktionsgemisches in einer inerten Atmosphäre während 20 Stunden bei einer Temperatur von 44°C durchgeführt. Während der fermentativen Hydrolyse wird die dynamische Viskosität des Reaktionsgemisches mittels eines Brookfield-Viskosimeters kontrolliert.
Die Molekularmassenverteilung wird mit der Gelchromatographiemethode mit einem Flüssigkeits-Chromatographen der Marke Bio-Rad mit Hilfe eines refraktometrischen Detektors und eines Systems der Computer-Registrierung bestimmt; Spalte Tosohaas TSK 30 SW_X, als Lösungs- und Elutionsmittel wird ein Phosphatpuffer (0,05 M; pH 3,7) unter Zugabe von 0,5 M NaNO₃ verwendet.
Nach Ablauf von 20 Stunden fermentativer Hydrolyse wird die dynamische Viskosität des Reaktionsgemisches bei 1,50 mPa·s (1,50 cP) eingestellt. Das Reaktionsgemisch stellt eine Lösung der entstandenen Chitosan-Ologomere und eines Komplexsalzes – des Oligochitosonium-Acetats – dar.
Des weiteren wird in das Reaktionsgemisch das Anionenaustauscherharz Levatit (vorläufig übergeführt in die OH^–-Form unter Verwendung einer 4%igen NaOH-Lösung) in einer Menge eingeführt, welche einen pH-Wert des Reaktionsgemisches von 7,0 gewährleistet. Die Behandlung mit Anionenaustauscherharz wird bei Zimmertemperatur während 30 Minuten durchgeführt. Die Anwesenheit des Anionenaustauscherharzes im Reaktionsgemisch gewährleistet die Umwandlung des Oligochitosonium-Acetats in Chitosan-Oligomere, wobei das Harz Levatit Reste der Essigsäure in seine Struktur aufnimmt.
Das Reaktionsgemisch, welches das Harz Levatit enthält, wird über z. B. einen Polypropylen-Filter mit Öffnungen von 10 μm Durchmesser filtriert, wobei die wäßrige Lösung der Produkte der fermentativen Hydrolyse, nämlich Chitosan-Oligomere, vom verwendeten Harz, welches Reste der Essigsäure enthält, abgetrennt wird.
Durch die mehrfache Verwendung des Harzes Levatit wird dessen Regenerierung mit schwacher NaOH-Lösung erreicht.
Die abgetrennte wäßrige Lösung der Chitosan-Oligomere wird in eine Vakuumabdampfanlage eingebracht (die Leistung bezogen auf das verdampfte Wasser beträgt 50 kg/h), wo bei einer Temperatur von 39°C eine Konzentrierung stattfindet, bis der Wassergehalt in der Lösung der Chitosan-Oligomere 62% beträgt.
Aus der Vakuumabdampfanlage wird die erhaltene Lösung in eine Zerstäubungs-Trockenanlage eingeleitet (die Zufuhrgeschwindigkeit der Lösung beträgt 30 l/h, die Temperatur des eintretenden Wärmeträgers 115°C, die Temperatur beim Austritt aus der Trockenanlage 65°C). Es wird ein pulverförmiges Produkt – Chitosan-Oligomere – erhalten. Das Produkt ist ein hellgelbes Pulver. Die Pulverteilchen haben eine Größe von 60 bis 80 μm. Das erhaltene pulverförmige Produkt läßt sich gut weiterverarbeiten, insbesondere pressen, einkapseln und tablettieren.
Es wird eine Elementaranalyse des gewonnenen Produktes angestellt: in den Fehlergrenzen entspricht der Gehalt des Produktes an Elementen dem in der Formel.
Die erhaltenen Chitosan-Oligomere weisen die folgende Molekulargewichtsverteilung auf:

n = 2 bis 6 59%

n = 7 bis 12 38%

n = 13 bis 20 3%

n über 20 0%.
Das hergestellte Produkt besitzt eine hohe Effektivität als Vorbeugungs- und komplementäres Heilmittel zur Bekämpfung einer Reihe von weit verbreiteten Krankheiten (des Herz-Kreislaufsystems, des Stütz- und Bewegungsapparates, des Magen-Darm-Trakts, der Leber, der Sehorgane). Eine maximale immunostimulierende Aktivität haben Oligomere mit n gleich 4, 5 und 6; als Präbiotika (zur Normalisierung der Darmflora) sind Oligomere mit n von 2 bis 8 wirksam. Insgesamt zeigen Oligomere mit n zwischen 2 und 10–12 die höchste biologische Aktivität.
Der Gehalt an Chitosan-Oligomeren im erhaltenen Produkt beträgt 95%. Die Ausbeute an Chitosan-Oligomeren, bezogen auf das Ausgangs-Chitosan, beträgt 96,8 Gewichts-%.
Beispiel 2
Die Herstellung von pulverförmigen Chitosan-Oligomeren erfolgt unter den Bedingungen gemäß Beispiel 1, wobei aber die fermentative Hydrolyse der Chitosanlösung, die einen pH-Wert von 3,5 hat, unter Zugabe eines Filtrats der Kulturflüssigkeit Streptomyces kurssanovii (1,8 Aktivitätseinheiten je 1 g Chitosan) bei 46°C während 22 Stunden durchgeführt wird.
Nach Ablauf von 22 Stunden fermentativer Hydrolyse wird die dynamische Viskosität des Reaktionsgemisches bei 1,58 mPa·s (1,58 cP) eingestellt. Das Reaktionsgemisch stellt eine Lösung der entstandenen Chitosan-Ologomere und eines Komplexsalzes – des Oligochitosonium-Acetats – dar.
Des weiteren wird in das Reaktionsgemisch das Anionenaustauscherharz Levatit in einer Menge eingeführt, welche einen pH-Wert des Reaktionsgemisches von 7,0 gewährleistet. Die Behandlung mit Anionenaustauscherharz wird bei Zimmertemperatur während 30 Minuten durchgeführt. Nach Ablauf von 30 Minuten wird durch die Einführung eines Anionenaustauschharzes in das Reaktionsgemisch die Umwandlung des Oligochitosonium-Acetats in Chitosan-Oligomere bewirkt, wobei das Harz Levatit Reste der Essigsäure annimmt und in seine Struktur aufnimmt.
Das Reaktionsgemisch, welches das Harz Levatit mit Resten der Essigsäure enthält, wird über z. B. einen Polypropylen-Filter mit Öffnungen von 10 μm Durchmesser filtriert, wobei die wäßrige Lösung der Produkte der fermentativen Hydrolyse, nämlich Chitosan-Oligomere, vom verwendeten Harz, welches Reste der Essigsäure enthält, abgetrennt wird.
Die abgetrennte wäßrige Lösung der Chitosan-Oligomere wird in eine Vakuumabdampfanlage eingebracht (die Leistung bezogen auf das verdampfte Wasser beträgt 50 kg/h), wo bei einer Temperatur von 39°C eine Konzentrierung der Lösung der Chitosan-Ologomere stattfindet, bis der Wassergehalt 71% beträgt.
Aus der Vakuumabdampfanlage wird die erhaltene Lösung in eine Zerstäubungs-Trockenanlage eingeleitet (die Zufuhrgeschwindigkeit der Lösung beträgt 30 l/h, die Temperatur des eintretenden Wärmeträgers 115°C, die Temperatur beim Austritt aus der Trockenanlage 65°C).
Es wird ein pulverförmiges Produkt erhalten – Chitosan-Oligomere mit einer mittels Viskositätsmessung bestimmten mittleren Molekularmasse von 2300 Da, ermittelt anhand der Gelchromatographiemethode mit einem Flüssigkeits-Chromatographen der Marke Bio-Rad mit Hilfe eines refraktometrischen Detektors und eines Systems der Computer-Registrierung; Spalte Tosohaas TSK 30 SW_XL erhalten, als Lösungs- und Elutionsmittel wird ein Phosphatpuffer (0,5 M, pH 3,7) unter Zugabe von 0,5 M NaNO₃ verwendet.
Die Größe der Teilchen der erhaltenen Chitosan-Oligomere liegt zwischen 70 und 90 μm.
Die erhaltenen Chitosan-Oligomere weisen die folgende Molekulargewichtsverteilung auf:

n = 2 bis 6 54%

n = 7 bis 12 40%

n = 13 bis 20 6%

n über 20 0%.
Das Produkt ist ein hellgelbes Pulver, welches eine hohe Effektivität als Vorbeugungs- und komplementäres Heilmittel zur Bekämpfung einer Reihe von weit verbreiteten Krankheiten (des Herz-Kreislaufsystems, des Stütz- und Bewegungsapparates, des Magen-Darm-Trakts, der Leber, der Sehorgane) aufweist, wobei die maximale immunostimulierende Aktivität Oligomere mit n gleich 4, 5 und 6 haben; als Präbiotika (zur Normalisierung der Darmflora) sind Oligomere mit n von 2 bis 8 wirksam. Insgesamt zeigen Oligomere mit n zwischen 2 und 10–12 die höchste biologische Aktivität.
Die Ausbeute an Chitosan-Oligomeren, bezogen auf das Ausgangs-Chitosan, beträgt 96,6 Gewichts-%.
Beispiel 3
Es wird eine 4%ige Chitosanlösung in wäßriger Ascorbinsäurelösung mit einem pH-Wert von 3,5 zubereitet.
Es wird eine Hydrolyse in Anwesenheit der Chitosanase (1,8 Einheiten je 1 g Chitosan) bei einer Temperatur von 48°C während 21 Stunden durchgeführt.
Nach Ablauf von 21 Stunden fermentativer Hydrolyse wird die dynamische Viskosität des Reaktionsgemisches bei 1,56 mPa·s (1,56 cP) eingestellt. Das Reaktionsgemisch stellt eine Lösung der gebildeten Chitosan-Ologomere und eines Komplexsalzes – des Oligochitosonium-Ascorbats – dar.
Des weiteren wird in das Reaktionsgemisch das Anionenaustauscherharz Amberlit in einer Menge eingeführt, welche einen pH-Wert des Reaktionsgemisches von 7,0 gewährleistet.
Nach Ablauf von 40 Minuten läßt sich die Umwandlung des Oligochitosonium-Ascorbats in die Chitosan-Oligomere beobachten, wobei das Harz Amberlit Reste der Ascorbinsäure in seine Struktur aufnimmt.
Das Reaktionsgemisch, welches das Harz Amberlit mit Resten der Ascorbinsäure enthält, wird über z. B. einen Polypropylen-Filter mit Öffnungen von 10 μm Durchmesser filtriert, wobei die wäßrige Lösung der Produkte der fermentativen Hydrolyse, nämlich Chitosan-Oligomere, vom verwendeten Harz, welches Reste der Ascorbinsäure enthält, abgetrennt wird.
Die abgetrennte wäßrige Lösung der Chitosan-Oligomere wird in eine Vakuumabdampfanlage eingebracht (die Leistung bezogen auf das verdampfte Wasser beträgt 50 kg/h), wo bei einer Temperatur von 39°C eine Konzentrierung stattfindet, bis der Wassergehalt in der Lösung der Chitosan-Oligomere 80% beträgt.
Aus der Vakuumabdampfanlage wird die erhaltene Lösung in eine Zerstäubungs-Trockenanlage eingeleitet (die Zufuhrgeschwindigkeit der Lösung beträgt 30 l/h, die Temperatur des eintretenden Wärmeträgers 115°C, die Temperatur beim Austritt aus der Trockenanlage 65°C).
Es wird ein pulverförmiges Produkt erhalten – Chitosan-Oligomere mit einer mittels Viskositätsmessung bestimmten mittleren Molekularmasse von 2600 Da, ermittelt anhand der Gelchromatographiemethode mit einem Flüssigkeits-Chromatographen der Marke Bio-Rad mit Hilfe eines refraktometrischen Detektors und eines Systems der Computer-Registrierung; Spalte Tosohaas TSK 30 SW_XL, als Lösungs- und Elutionsmittel wird Phosphatpuffer (0,5 M; pH 3,7) unter Zugabe von 0,5 M NaNO₃ verwendet.
Die Größe der Teilchen der erhaltenen Chitosan-Oligomere liegt zwischen 80 und 100 μm.
Die erhaltenen Chitosan-Oligomere weisen die folgende Molekulargewichtsverteilung auf:

n = 2 bis 6 56%

n = 7 bis 12 40%

n = 13 bis 20 4%

n über 20 0%.
Das Produkt ist ein hellgelbes Pulver, welches eine hohe Effektivität als Vorbeugungs- und komplementäres Heilmittel zur Bekämpfung einer Reihe von weit verbreiteten Krankheiten (des Herz-Kreislaufsystems, des Stütz- und Bewegungsapparates, des Magen-Darm-Trakts, der Leber, der Sehorgane) aufweist, wobei die maximale immunostimulierende Aktivität Oligomere mit n gleich 4, 5 und 6 haben; als Präbiotika (zur Normalisierung der Darmflora) sind Oligomere mit n von 2 bis 8 wirksam usw. Insgesamt zeigen Oligomere mit n zwischen 2 und 10–12 die höchste biologische Aktivität.
Die Ausbeute an Chitosan-Oligomeren, bezogen auf das Ausgangs-Chitosan, beträgt 96,6 Gewichts-%.
Der Energieaufwand wird im Vergleich zum Energieaufwand bei der Durchführung des in RU Nr. 2250106 C1 beschriebenen Verfahrens um 50% herabgesetzt durch die Einführung einer neuen Methode der Konzentrierung und Durchführung der Trocknung der konzentrierten Lösung der Chitosan-Oligomere. Außerdem ist es durch die Anwendung von niedrigeren Temperaturen bei der Produktkonzentrierung und -trocknung möglich, eine thermische Zersetzung (”Karamellisieren”) der Chitosan-Oligomere zu vermeiden.
Beispiel 4
Eine 3%ige Chitosanlösung in wäßriger Bernsteinsäure-Lösung, die einen pH-Wert von 4,0 hat, wird einer fermentativen Hydrolyse unter Verwendung eines auf einem inerten Träger immobilisierten Chitinase-Komplexes unterzogen, wobei als wasserunlöslicher Träger zur Immobilisierung des Chitinase-Komplexes Silochrom C-80 zur Verwendung kommt.
Es wird eine fermentative Hydrolyse während 22 Stunden bei einer Temperatur von 46°C durchgeführt, wobei eine dynamische Viskosität des Reaktiongemisches von 1,53 mPa·s (1,53 cP) erreicht wird.
Das Reaktionsgemisch stellt eine Lösung der gebildeten Chitosan-Oligomere und eines Komplexsalzes – des Oligochitosonium-Succinats – dar.
Des weiteren wird in das Reaktionsgemisch das Anionenaustauscherharz Amberlit in einer Menge eingeführt, welche einen pH-Wert des Reaktionsgemisches von 7,0 gewährleistet. Die Behandlung mit Anionenaustauscherharz wird bei Zimmertemperatur während 35 Minuten durchgeführt. Die Anwesenheit des Anionenaustauscherharzes im Reaktionsgemisch gewährleistet die Umwandlung des Oligochitosonium-Succinats in Chitosan-Oligomere, wobei das Harz Reste der Bernsteinsäure in seine Struktur aufnimmt.
Das Reaktionsgemisch, welches das Harz Amberlit mit Säureresten enthält, wird über z. B. einen Polypropylen-Filter mit Öffnungen von 10 μm Durchmesser filtriert, wobei die wäßrige Lösung der Produkte der fermentativen Hydrolyse, nämlich Chitosan-Oligomere, vom verwendeten Harz, welches Reste der Bernsteinsäure enthält, abgetrennt wird.
Die abgetrennte wäßrige Lösung der Chitosan-Oligomere wird in eine Vakuumabdampfanlage eingebracht (die Leistung bezogen auf das verdampfte Wasser beträgt 50 kg/h), wo bei einer Temperatur von 39°C eine Konzentrierung der Lösung der Chitosan-Oligomere stattfindet, bis der Wassergehalt 62% beträgt.
Aus der Vakuumabdampfanlage wird die erhaltene Lösung in eine Zerstäubungs-Trockenanlage eingeleitet (die Zufuhrgeschwindigkeit der Lösung beträgt 30 l/h, die Temperatur des eintretenden Wärmeträgers 115°C, die Temperatur beim Austritt aus der Trockenanlage 65°C).
Es wird ein pulverförmiges Produkt erhalten – Chitosan-Oligomere mit einem mittels Viskositätsmessung bestimmten mittleren Molekulargewicht von 2400 Da, ermittelt anhand der Gelchromatographiemethode mit einem Flüssigkeits-Chromatographen der Marke Bio-Rad mit Hilfe eines refraktometrischen Detektors und eines Systems der Computer-Registrierung; Spalte Tosohaas TSK 30 SW_XL, als Lösungs- und Elutionsmittel wird ein Phosphatpuffer (0,5 M; pH 3,7) unter Zugabe von 0,5 M NaNO₃ verwendet.
Die erhaltenen Chitosan-Oligomere weisen die folgende Molekulargewichtsverteilung auf:

n = 2 bis 6 58%

n = 7 bis 12 38%

n = 13 bis 20 4%

n über 20 0%.
Das Produkt ist ein hellgelbes Pulver, welches eine hohe Effektivität als Vorbeugungsmittel und komplementäres Heilmittel zur Bekämpfung einer Reihe von weit verbreiteten Krankheiten (des Herz-Kreislaufsystems, des Stütz- und Bewegungsapparates, des Magen-Darm-Trakts, der Leber, der Sehorgane) aufweist, wobei Oligomere mit n gleich 4, 5 und 6 die maximale immunostimulierende Aktivität haben; als Präbiotika (zur Normalisierung der Darmflora) sind Oligomere mit n von 2 bis 8 wirksam. Insgesamt zeigen Oligomere mit n zwischen 2 und 10–12 die höchste biologische Aktivität. Die Pulverteilchen haben eine Größe von 65 bis 80 μm.
Die Ausbeute an Chitosan-Oligomeren, bezogen auf das Ausgangs-Chitosan, beträgt 96,6 Gewichts-%.
Der Energieaufwand wird im Vergleich zum Stand der Technik ( RU Nr. 2250106 C1 , IPK: A 61 K 31/722, veröff. am 14.04.2005) um 50% herabgesetzt durch die Einführung einer neuen Methode der Konzentrierung und Durchführung der Trocknung der konzentrierten Lösung der Chitosan-Oligomere. Außerdem verhindert die Anwendung von niedrigeren Temperaturen eine thermische Zersetzung (”Karamellisieren”) der Chitosan-Oligomere bei der Produktkonzentrierung und -trocknung.

Claims

Verfahren zur Herstellung pulverförmiger Chitosan-Oligomere, umfassend – die Bildung einer Chitosanlösung in einer Säure; – die Einführung von Fermenten in die erhaltene Chitosanlösung, welche eine fermentative Hydrolyse des Chitosans unter Herstellung eines Reaktionsgemisches sicherstellt; – die Durchführung einer fermentativen Hydrolyse des Reaktionsgemisches, welche den Erhalt der Chitosan-Oligomere und eines durch organische Säure und Chitosan-Oligomere gebildeten Komplexsalzes gewährleistet; – die Filtration des Reaktionsgemisches unter Isolierung der erhaltenen Hydrolyseprodukte daraus; – die Trocknung der isolierten Produkte; dadurch gekennzeichnet, dass die Bildung der Chitosanlösung mit einer Chitosankonzentration von 3–4% in der wässrigen Lösung einer organischen Säure bei einem pH-Wert von 3,5 bis 4,4 erfolgt, die Hydrolyse mit einem Enzymkomplex, der Chitosanase umfasst, die in Kombination mit Papain bei einem Verhältnis von 1:1–1,2 eingesetzt wird, bis zum Erreichen einer dynamischen Viskosität des Reaktionsgemisches von 1,50 bis 1,58 mPa·s (1,50 bis 1,58 cP) durchgeführt wird, vor der Filtration in das Reaktionsgemisch ein Anionenaustauscherharz eingeführt und die Umwandlung des durch die organische Säure und die Chitosan-Oligomere gebildeten Komplexsalzes in Chitosan-Oligomere durchgeführt wird, bis ein Reaktionsgemisch auf der Basis von Chitosan-Oligomeren, das einen pH-Wert von 7 ± 0,05 hat, und eines Harzes, das Reste der organischen Säure enthält, erhalten wird, und bei der Filtration, welche die Isolierung der Lösung der Chitosan-Oligomere aus dem Reaktionsgemisch sicherstellt, das Säurereste enthaltende Harz zusätzlich entfernt wird, wonach eine Konzentrierung der erhaltenen Lösung der Chitosan-Oligomere, die einen pH-Wert von 7 hat, bis zu einem Flüssigkeitsgehalt von 62 bis 80 Gewichts-% vorgenommen wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Ferment ein auf einem inerten Träger immobilisiertes Ferment verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Hydrolyse bei einem Gehalt des Reaktionsgemisches an Chitosanase-Ferment in einer Menge von 1,8 Einheiten je 1 Gramm Chitosan und an Papain in einer Menge von 0,5–0,6% der Chitosanmasse durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Ferment eine gereinigte Chitosanase auf der Basis einer Kultur verwendet wird, welche aus der Gruppe, die Streptomyces kurssanovii, Streptomyces griseus, Serratia mancescens, Trichoderma harzianum, Bacillus subtilis umfaßt, ausgewählt wurde.