DE102012009593B4

DE102012009593B4 - Verfahren zum Abbau von Polysacchariden ausgewählt aus den Stoffgruppen der Glykosaminoglykane und deren Derivaten sowie der Alginate

Info

Publication number: DE102012009593B4
Application number: DE102012009593.7A
Authority: DE
Inventors: Ralf Wyrwa; Matthias Schnabelrauch; Jana Becher
Original assignee: Innovent eV Technologieentwicklung
Current assignee: Innovent eV Technologieentwicklung
Priority date: 2012-05-07
Filing date: 2012-05-07
Publication date: 2019-03-07
Anticipated expiration: 2032-05-08
Also published as: DE102012009593A1

Abstract

Verfahren zum Abbau von Polysacchariden, dadurch gekennzeichnet, dass man Lösungen von Glykosaminoglykanen oder dessen Derivate sowie Alginaten mit Chlordioxid umsetzt und weiterhin gekennzeichnet dadurch, dass der Grad des Kettenabbaus durch die Konzentration des Chlordioxids und des Polysaccharides, die Reaktionstemperatur im Bereich von -5 °C bis +40 °C und die Reaktionszeit im Bereich von 30 min bis 240 h gesteuert wird.

Description

Gebiet der Erfindung
Beschrieben wird ein Verfahren zum gezielten Abbau von Polysacchariden ausgewählt aus den Stoffgruppen der Glykosaminoglykane und deren Derivaten sowie der Alginate durch Behandlung mit Chlordioxid. Das Verfahren erlaubt die Herstellung abgebauter Polysaccharide mit definierten Molekulargewichten durch eine gezielte Einstellung der Prozessparameter, wobei sich die hergestellten Produkte durch eine geringe Molmassenstreuung auszeichnen. Die Erfindung dient der Bereitstellung von Polysaccharidmaterialien für Anwendungen in der Medizin, Biologie, Medizintechnik sowie in der Kosmetik und der pharmazeutischen Industrie.
Stand der Technik
Polysaccharide liegen nach ihrer Gewinnung durch Fermentation (z. B. Hyaluronsäure) oder Isolation aus natürlichen Geweben (z. B. Alginat aus Braunalgen) als hochmolekulare Polymere vor. Die durch das große Molekulargewicht bedingte geringe Löslichkeit der Polysaccharide bzw. die hohe Viskosität ihrer Lösungen erschwert eine Vielzahl praktischer Anwendungen der genannten Substanzen. Durch einen gezielten Abbau der Kettenlänge kann die Löslichkeit der Polysaccharide enorm verbessert und die Viskosität der resultierenden Lösungen verringert werden, was die Verarbeitung und Derivatisierung der Polysaccharide wesentlich vereinfacht und eine Erschließung neuer Anwendungsfelder ermöglicht. Daher findet man in der Literatur zahlreiche Ansätze zum Kettenabbau von Polysacchariden. Im Hinblick auf die Erfindung werden bisher bekannte Verfahren hier kurz aufgeführt. Eine relativ gut etablierte Methode zum Kettenabbau von Polysacchariden ist deren enzymatischer Abbau (vergl. DE102007039490A1 ; WO001994005778A1 ; V. Prabhakar et al. „The structural elucidation of glycosaminoglycans.“ M. Mol. Biol. 2009, 534: 147-56; R. Stern und M. Jedrzejas „The Hyaluronidases: Their Genomics, Structures, and Mechanisms of Action." Chem. Rev. 2006, 106(3): 818-39; R. Linhardt et al. „Lyases: structure, activity, and applications in analysis and the treatment of diseases." Adv. Pharmacol. 2006, 53: 187-215). Bei den beschriebenen enzymatischen Verfahren besteht jedoch die Gefahr, dass Rückstände der verwendeten Enzyme im Abbauprodukt verbleiben, was vor allem hinsichtlich einer pharmazeutischen, medizinischen und kosmetischen Applikation aufgrund möglicher Auslösung allergischer Reaktionen unerwünscht ist. Eine weitere Methode zur Depolymerisation von Polysacchariden ist beispielsweise der thermische Abbau (K. Lowry et al. „Thermal stability of sodium hyaluronate in aqueous solution.“ J. Biomed. Mater. Res. 1994, 28: 1239-44; H. Holme et al. „Thermal depolymerization of chitosan chloride.“ Carbohydr. Polym. 2001, 46: 287-94). Außerdem kommen noch Verfahren wie säurekatalysierte Umsetzungen ( CN000101429255A , CN000001537869A ), Oxidationsprozesse in Gegenwart von H₂O₂ ( CN000101294180A , Abbau in der Mikrowelle in Gegenwart von Oxidationsmitteln ( CN000101643516A , CN000001493577A ), Depolymerisationen mit Ultraschall ( DE19646901A1 ) oder durch Gamma-Bestrahlung ( CN000001944466A ) zum Einsatz. WO002008137517A1 beinhaltet die Degradation von Cellulose und Stärke in Gegenwart von Metallkomplexen und unterschiedlichen Oxidationsmitteln. JP000S64111101A beschreibt den Abbau von Chitosan-Flocken mit Chlordioxid bei höheren Temperaturen, was aber bei thermisch empfindlichen Polysacchariden zu unerwünschten Zersetzungen führt. Zum Stand der Technik wird zusätzlich auf die DE 693 18 320 T2 verwiesen.
Nachteilig ist einerseits die Arbeits- und Kostenintensität der genannten Verfahren, die beispielsweise die Anschaffung eines speziellen Geräteequipments, wie z. B. von Mirowellen- und Ultraschallerzeugern erfordern, welches zudem in der Durchsatzkapazität beschränkt ist. Zum anderen besteht ein großer Nachteil der genannten Verfahren darin, dass sie wenig reproduzierbar sind und häufig zu breiten Molmasseverteilungen führen. Teilweise werden auch Nebenreaktionen beobachtet, die unerwünschte Nebenprodukte ergeben. Aus diesen Tatsachen ergibt sich, dass die hergestellten molmassereduzierten Polysaccharide hinsichtlich einer Weiterverarbeitung bzw. Aufarbeitung z. B. für pharmazeutische Anwendungen, wo definierte Edukte eingesetzt werden müssen, ungeeignet sind. Ein gezielter, stufenweiser Abbau ohne unerwünschte Nebenreaktionen zu Produkten mit definierten Molekulargewichten ist derzeit insbesondere für Glykosaminoglykane und deren Derivate sowie Alginate nur mit hohem Aufwand und anschließenden komplizierten Reinigungsprozessen realisierbar.
Daher besteht die dringende Notwendigkeit an prozesstechnisch einfachen Verfahren, die eine reproduzierbare Herstellung abgebauter Glykosaminoglykane und deren Derivate sowie Alginaten mit definierten Molmassen ermöglichen, um den steigenden Bedarf aus Medizin, Biologie, Medizintechnik sowie der Kosmetik und der pharmazeutischen Industrie zu decken.
Darstellung der Erfindung
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, Glykosaminoglykane und deren Derivate sowie Alginate gegebenenfalls mit ionischen Gruppen wie z. B. Sulfat, Carboxymethyl, Amin, Phosphat und Phosphonat in einem technisch unkomplizierten und steuerbaren Prozess gezielt abzubauen und so Verbindungen mit definierten Molekulargewichten und einer geringen Molmassenstreuung herzustellen. Die erhaltenen abgebauten Polysaccharide sollen strukturell den Ausgangspolymeren weitestgehend gleichen und sich nur in einer geringeren Kettenlänge unterscheiden. Das Verfahren zur Herstellung der abgebauten Polysaccharide soll reproduzierbar und einfach durchzuführen sein, wobei Nebenreaktionen in einer hohen Variationsbreite der Prozessparameter vermieden werden.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst, indem eine Lösung eines oder mehrerer Polysaccharide ausgewählt aus den Stoffgruppen der Glykosaminoglykane und deren Derivaten sowie der Alginate hergestellt und anschließend mit Chlordioxid versetzt wird. Chlordioxid ist nach Ozon das zweitstärkste Oxidationsmittel der Natur, ist jedoch preiswerter und einfacher in der Produktion und Handhabung. Als instabile Verbindung, die keine gefährlichen Reaktionsprodukte bildet, ist es zur Trinkwasserdesinfektion zugelassen und findet Anwendung in der Lebensmittelindustrie oder als Bleichmittel, vor allem in der Zellstoffherstellung ( DE202005017232U1 , DE000002501719A1 , DE000069011636T2 , E. Schmidt und E. Graumann „Zur Kenntnis pflanzlicher Inkrusten. Methode zur Reindarstellung pflanzlicher Skelettsubstanzen." Ber. D. Chem. Ges. 1921, 54(8): 1860-73).
Überraschend wurde gefunden, dass unter Einwirkung von Chlordioxid auf Polysaccharide ein Kettenabbau stattfindet, der schneller und spezifischer erfolgt, als ein rein saurer und/oder thermischer Abbau. Diese Reaktion stellt unter Einhaltung weiterer Reaktionsbedingungen wie z. B. der Temperatur und Polysaccharid- und Chlordioxidkonzentration einen reproduzierbaren Prozess dar. Der Mechanismus zur Polysaccharidspaltung mit Chlordioxid ist bisher nicht bekannt.
Die unkomplizierte Herstellung von Chlordioxid ermöglicht die Bereitstellung des Reagenzes in unterschiedlichen Konzentrationen. Dabei wurde ebenfalls überraschend gefunden, dass in Abhängigkeit der Konzentration der Grad des Kettenabbaus definiert und wiederum reproduzierbar einstellbar ist. So kann beispielsweise hochmolekulare Hyaluronsäure mit einem Ausgangsmolekulargewicht von M_w = 1*10⁶ g/mol konzentrationsabhängig bis zum Oligosaccharid abgebaut werden.
Zudem wurde gefunden, dass durch die Einstellung weiterer Reaktionsbedingungen wie der Reaktionstemperatur die Reaktionszeit des Abbaus optimiert werden kann. Vorteilhaft gegenüber anderen Verfahren ist beim Abbau mit Chlordioxid der geringe technische und energetische Aufwand, da keine zusätzlichen Geräte benötigt werden und in der Regel eine Reaktionsführung bei Raumtemperatur ausreichend ist. Der Kettenabbau erfolgt ohne nachweisbare Nebenreaktionen und die gewonnenen Abbauprodukte zeichnen sich durch eine hohe Reinheit aus, wodurch eine aufwendige Reinigung entfällt.
Wege zur Ausführung der Erfindung
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine wässrige Lösung von Chlordioxid einer definierten Konzentration durch Umsetzung von Natriumchlorit und Salzsäure frisch hergestellt. Diese Chlordioxidlösung wird zu einer wässrigen Lösung einer bestimmten Menge eines Polysaccharids aus den Stoffgruppen der Glykosaminoglykane und deren Derivate sowie der Alginate gegeben. Anschließend wird bei einer vorgegebenen Temperatur im Bereich von -5 - 40 °C über einen definierten Zeitraum von 30 min bis 240 h gerührt. Nach Ende der Reaktionszeit kann durch Zugabe eines Reduktionsmittels wie beispielsweise Natriumthiosulfat das überschüssige Chlordioxid zersetzt und so die Reaktion abrupt abgebrochen werden. Die Lösung wird mit einer Base wie z. B. 1N Natronlauge neutralisiert und durch Dialyse von den Zerfallsprodukten des Chlordioxids und eventuellen anderen Salzen befreit.
Die nachstehenden Beispiele dienen der näheren Erläuterung der Erfindung, ohne sie einzuschränken.
Beispiel 1
Chlordioxidlösung
190 ml einer 7,5 % Natriumchloritlösung werden mit 10 ml einer 9 %igen Salzsäure versetzt. Die Mischung wird 2 Stunden bei Raumtemperatur zur Reaktion gebracht. Die Lösung färbt sich dabei intensiv gelb und kann direkt eingesetzt werden.
Beispiel 2
Hyaluronsäure (507.000 g/mol)
5 g Hyaluronsäure (M_w = 923.000 g/mol) werden in 500 ml destilliertem Wasser gelöst. Nun gibt man 200 ml einer frisch hergestellten Chlordioxidlösung zu (2 g/l) und rührt für 6 h bei Raumtemperatur. Nach beendeter Reaktion wird die Lösung mit 1N Natronlauge neutralisiert, gegen Wasser dialysiert und anschließend gefriergetrocknet. Das erhaltene Produkt wird bei 40 °C im Vakuum bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Das Produkt hat ein Molekulargewicht von M_w = 507.000 g/mol.
Beispiel 3
Hyaluronsäure (83.000 g/mol)
2,5 g Hyaluronsäure werden in 250 ml destilliertem Wasser gelöst. Nun gibt man 200 ml einer frisch hergestellten Chlordioxidlösung zu (2 g/l) und rührt bei Raumtemperatur für 48 h. Nach beendeter Reaktion wird eine Spatelspitze Natriumthiosulfat zugegeben, bis die Lösung entfärbt ist. Nun wird mit 1N Natronlauge neutralisiert, gegen Wasser dialysiert und anschließend gefriergetrocknet. Das erhaltene Produkt wird bei 40 °C im Vakuum bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Das Produkt hat ein Molekulargewicht von M_w = 83.000 g/mol.
Beispiel 4
Hyaluronsäure (7.000 g/mol)
2,5 g Hyaluronsäure werden in 250 ml destilliertem Wasser gelöst. Nun gibt man 200 ml einer frisch hergestellten Chlordioxidlösung zu (2 g/l) und rührt bei Raumtemperatur für 72 h. Nach beendeter Reaktion wird die Lösung mit 1N Natronlauge neutralisiert, gegen Wasser dialysiert und anschließend gefriergetrocknet. Das erhaltene Produkt wird bei 40 °C im Vakuum bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Das Produkt hat ein Molekulargewicht von M_w = 7.000 g/mol.
Beispiel 5
Chondroitinsulfat (12.500 g/mol)
2,5 g Chondroitinsulfat (M_w = 20.000 g/mol) werden in 250 ml destilliertem Wasser gelöst. Nun gibt man 200 ml einer frisch hergestellten Chlordioxidlösung zu (2 g/l) und rührt bei Raumtemperatur für 120 h. Nach beendeter Reaktion wird die Lösung mit 1N Natronlauge neutralisiert, gegen Wasser dialysiert und anschließend gefriergetrocknet. Das erhaltene Produkt wird bei 40 °C im Vakuum bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Das Produkt hat ein Molekulargewicht von M_w = 12.000 g/mol.
Beispiel 6
Alginat (59.000 g/mol)
5 g Alginat (M_w = 250.000 g/mol) werden in 500 ml destilliertem Wasser gelöst. Nun gibt man 200 ml einer frisch hergestellten Chlordioxidlösung zu (2 g/l) und rührt bei Raumtemperatur für 48 h. Nach beendeter Reaktion wird die Lösung mit 1N Natronlauge neutralisiert, gegen Wasser dialysiert und anschließend gefriergetrocknet. Das erhaltene Produkt wird bei 40 °C im Vakuum bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Das Produkt hat ein Molekulargewicht von M_w = 59.000 g/mol.

Claims

Verfahren zum Abbau von Polysacchariden, dadurch gekennzeichnet, dass man Lösungen von Glykosaminoglykanen oder dessen Derivate sowie Alginaten mit Chlordioxid umsetzt und weiterhin gekennzeichnet dadurch, dass der Grad des Kettenabbaus durch die Konzentration des Chlordioxids und des Polysaccharides, die Reaktionstemperatur im Bereich von -5 °C bis +40 °C und die Reaktionszeit im Bereich von 30 min bis 240 h gesteuert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Polysacchariden um Gemische aus unterschiedlichen Polysacchariden handelt.
Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die verwendeten Polysaccharide zusätzliche funktionelle Gruppen enthalten.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den funktionellen Gruppen um anionische und/oder kationische Gruppen, insbesondere um Sulfat-, Carboxymethyl-, Amin-, Phosphat- und Phosphonat-Gruppen handelt.
Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass Chlordioxid als Gas oder Lösung, bevorzugt als wässrige Lösung verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Grad des Kettenabbaus durch die Konzentration des Chlordioxides gesteuert wird, wobei die Chlordioxidkonzentrationen im Reaktionsgemisch 0,001 - 5,0 g/l, bevorzugt 0,05 - 2,0 g/l beträgt.