CN101061230A - 制备黄原胶生物聚合物的方法 - Google Patents

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Abstract

一种从加入到发酵培养基中的黄单胞菌株和/或树生黄单胞菌李属致病变种菌株中获得黄原胶类生物聚合物的方法，其中所述的发酵培养基含有与带壳稻米和蒸米加工相关的剩余水和产物以及所述的其它营养物。该方法从初始的预接种物开始(步骤110)，生产最终的预接种物(步骤120，步骤220)，然后是接种物，根据操作条件将所述的接种物在第一发酵罐中发酵(步骤130和步骤230)，然后在第二发酵罐中发酵(步骤140，步骤250)，接着灭活发酵液并进行沉淀以回收生物聚合物产物(步骤150)，干燥生物聚合物(步骤160)，将其碾磨或粉碎成期望的粒径分布(步骤170)，并以粉末或水溶液的形式回收生物聚合物(步骤180)。或者在第二次发酵之后(步骤240)，离心发酵液以分离细胞(步骤250)，并且回收或破碎分离的细胞(步骤260a)。

Description

制备黄原胶生物聚合物的方法
本发明属于制备生物聚合物的方法的领域，更具体地是属于从来源于树生黄单孢菌属(Xanthomonas arboricola)和/或树生黄单胞菌李属(xanthomonas arboricola pruni)菌株的培养物中制备黄原胶(xantan)样微生物的生物聚合物的方法。
背景技术
微生物的生物聚合物是通过利用真菌、酵母或细菌并借助于生物技术方法而获得的多糖。生物聚合物在广泛的工业领域中的适宜和潜在的用途，属于公知常识，例如在粮食、药物产品、涂剂、杀虫剂、石油工业等等中作为增稠剂、稳定剂、胶凝剂以及乳化剂。目前，传统的多糖逐渐地被微生物的相关产品所替代。在其它优点中，这主要是由于可以通过控制除与气候和批料质量管理(batch quality control)无关之外的发酵参数来调节这些产物的流变学特征的可能性。
黄原胶是由五糖单元重复2,000至6,000次的形成的胞外阴离子多糖，具有2.106至12.106g.mol-1的高分子量。使用商品化野油菜patovar菌，通过野油菜黄单胞菌的好氧发酵可获得黄原胶。它是由单糖D-甘露糖(mannose)、D-单糖和D-葡糖醛酸以及丙酮酸和乙酸基团形成。
黄原胶的主要特征是它能调节溶液的流变学或流动特性。它的性质取决于其化学成分、结构和分子键。尽管作为进口货物，巴西跟随着全球不断增长的黄原胶消耗的趋势。到目前为止，尽管巴西是世界上生产这些生物聚合物的原材料(蔗糖和酒精)的主要来源国，并且获得各种生物聚合物生产菌，但巴西并不能制备黄原胶。
细菌多糖呈现出规则的化学结构、可再现的化学和物理特性、以及恒定的供应来源的优点，因为它们并不依赖于生产的气候条件。
在50年代，在美国，出于对由微生物产生的水溶性胶体的关注，当能观察到野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv campestris)NRRL B 1459菌株可产生非常胶质粘稠的菌落时，黄原胶生物聚合物被发现了。
与通过野油菜黄单胞菌野油菜致病变种产生黄原胶产物相关的第一件专利文件是美国专利3,000,790。随后，美国农业部和许多公司(例如Esso Research、Jersey ProductionResearch Co.、Kelco Co.、Rhone Poulec Industries、Pfizer Inc.、Standard Oil Co.、Sanofi-Societe Nationale EIf Aquitaine)在发酵方法上提交了的许多其它专利，例如US3,020,206、US3,251,749、US3,328,262、US3,391,060、US3,391,061、US3,485,719、FR2,342,339、FR2,414,555、US4,282,321、EP66,961、EP66,377、US4,352,882、US4,328,310、US4,400,467、US4,407,950、US4,407,951、FR2,671,097，它们都与野油菜黄单胞菌的用途相关；并且在所述方法中，温度控制在25℃-30℃之间，在含有3gL-1酵母提取液、3gL-1麦芽提取液、5gL-1蛋白胨、10gL-1葡萄糖和20gL-1琼脂的培养基中培育24h至72h，来产生接种物。
所涉及的发酵培养基使用含有0.01至0.5％质量/体积比的无机盐(例如K2HPO4和MgSO4)、和0.1至0.5％质量/体积比的有机酸(例如丁二酸)以及0.01％至1％质量/体积比的有机化合物(例如大豆糠、尿素和硝酸盐)的培养基。
有用的碳源包括蔗糖、蔗糖蜜、咖啡和马铃薯农产品、乳清以及其他等等。
其它专利，例如US3,119,812和US3,773,752，涉及在加入或不加入盐时而通过乙醇来回收聚合物的方法。
所引用的专利文件指出黄原胶的制备基于野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)生产黄原胶的事实。得到的聚合物显示下列组分：除了丙酮酸和乙酸基团之外，还有甘露糖、葡萄糖和葡糖醛酸。
商品化黄原胶所表现出的缺点是：尽管它们具有优良的特性，但单独使用时它们不能生产真正的胶体，但只有当这些产物被混合到半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖时才显示出而所述的特性。令人惊讶地是，通过该方法获得的生物聚合物具有这种性质：当单独使用时，它们可生产真正的胶。
另外，当前技术水平生产的这些生物聚合物的粘性不随温度的升高而上升，这样的特性可有所应用。概括来说，所有由野油菜黄单胞菌生产的聚合物的粘度会随着温度升高而下降。相反，一些树生黄单孢菌属菌株会导致假塑性生物聚合物的生成，是一个最为相关的技术特征。
除此之外，商品化黄原胶生物聚合物对盐的加入显示出低耐受性(即使低至0.001至1％质量/体积比(m/v)的低水平)，通常加入超过1m/v的盐会使其粘度降低，这意味着如果黄原胶聚合物用于石油工业或用于粮食生产，收益会大大地减少。
因此，尽管技术已有所进展，仍然需要通过使用来自稻米工业加工和蒸米(parboilizedrice)的剩余水和相关产物，来从树生黄单胞菌和/或树生黄单孢菌李属菌株的发酵培养基的培养物中生产微生物的黄原胶类生物聚合物的加工方法。该方法中接种物在具有低浓度蔗糖或葡萄糖的培养基(更进一步地指是含有常量营养元素和微量营养元素以及其它成分的液体发酵培养基)中，并在特殊加工条件下来实施发酵，之后，获得的生物聚合物被沉淀和分离，这些方法所获得的生物聚合物、培养基以及生物聚合物的用途在该申请中得以描述并要求予以保护。
发明概要
概括地说，用于生产黄原胶类的生物聚合物的方法，包括步骤：
a)通过将在固体培养基上生长的树生黄单孢菌和/或树生黄单孢菌李属致病变种的分离菌落或冻干的分离菌落，加入特殊细胞生长培养基中，来制备初始的预接种物；
b)将所述的初始预接种物导入液体培养基并在20℃至35℃、pH4.5至9.0、以100至250rpm转速的条件下搅拌温育24或48小时，以便获得最终的预接种物；冻干最终的预接种物以备另外的使用，或者将其立即转入发酵罐中；
c)将所得的最终预接种物输送到含有液体培养基和占培养基直至10％质量/体积比的蔗糖或葡萄糖的第一无菌发酵罐中，搅拌并通气，并在20℃至35℃温度和pH 4.5至9.0下、以50rpm和1,200rpm范围中进行搅拌温育24或48小时，优选以100至800rpm范围中的转速并以0.5和4体积/体积/分钟(vvm)的通风比加入氧气、更优选是0.5和3.0vvm的通风比，以便获得接种物；当被冻干时，最终的预接种物应当通过重悬浮激活，并在被转入所述的第一发酵罐之前的原来条件下进行进一步温育，同时将最新制备的最终预接种物直接转入所述的第一发酵罐中；
a)d)根据50至1,200rpm的转速、优选100至800rpm的转速和0.5至4体积/体积/分钟(vvm)的通风比、优选0.5至3.0的vvm加入氧气来进行通风，并在22℃至35℃之间的温度和在pH4.5至9.0下，将接种物导入第二无菌发酵罐中，并进行发酵24至120小时、优选48至72小时，其中所述的第二无菌发酵罐含有用于通过深层发酵而生产生物聚合物的液体发酵培养基，或者将所述的无菌培养基加入含有接种物的发酵罐；除了纤维素、米糠和/或麦麸之外，和/或除了在0.1至4.2gL-1之间的氮、磷和钾常量元素、和除了0.01至1.7gL-1的镁和铁微量元素之外，和除了复合维生素B、维生素E和直至25％质量/体积比的蔗糖之外，以及除了50至200ppm的硅油或米糠油之外，发酵培养基由脱壳稻米(hull-bearing rice)浸泡液或煮饭水或来自蒸米水的水组成；
e)发酵结束后，过滤发酵液以分离细胞；
f)通过加热杀菌或用氯化化合物化学杀菌，直接在第二发酵罐中灭活发酵发酵液的细胞，以便获得期望的生物聚合物；
g)或者在离心之后，通过将极性有机溶剂(醇类优选)加入到添加了或未添加0.2至10％m/v的一价盐和/或二价盐的、离心的或非离心的发酵液中，来沉淀所获得的生物聚合物；
h)通过蒸馏回收醇溶剂；
i)通过在传送带上排干液体来分离生物聚合物产物，并将其转入干燥器中；
j)在普通碾磨机中碾磨和压碎生物聚合物；和
k)回收做好的黄原胶生物聚合物。
因此，本发明提供从树生黄单孢菌和/或树生黄单孢菌李属致病变种培养物中生产黄原胶类生物聚合物的方法，该方法涉及使用与工业加工稻米和煮蒸稻米相关的剩余水和产物，来在营养培养基中制备接种物的过程。
本发明也提供由所述方法生产的黄原胶类生物聚合物的方法。
本发明提供所获得的生物聚合物的另外一些用途。
本发明还提供用于实施所述方法的树生黄单胞菌和/或树生黄单孢菌李属致病变种的发酵培养基。
本发明还提供用于实施该方法的树生黄单胞菌和/或树生黄单孢菌李属致病变种培养物的用途。
附图简要说明
图1和图2是说明生物聚合物生产方法的流程图，图1显示了在细胞存在下的发明模式，同时图2显示了生物聚合物生成过程中细胞已经被提取的加工模式，然后干燥和碾磨生物聚合物。
图3是举例说明两种树生黄单胞菌株发酵培养基的粘度值的曲线图。
图4和图5是举例说明在25℃下从生物聚合物水溶液获得的粘度值的曲线图，包括1％m/v的菌株在不同时间(24、48和72h)的粘度值，以及3％m/v浓度下的不同树生黄单胞菌株的粘度值。这些图也举例说明这些生物聚合物溶液的假塑性特性。
图6是显示不同树生黄单胞菌株的生物聚合物随温度上升粘性变化的曲线图。
图7是显示72小时发酵后，不同菌株组生产生物聚合物的生产间隔(productioninterval)方框图。
图8显示通气条件对生物聚合物生产的影响或依赖。将树生黄单胞李属致病变种菌株06置于容积为3L的发酵罐中，条件分别以条件A(转速：250rpm，通气比：1.5体积/体积/分钟-vvm)和条件B(转速：350rpm；通气比：2.0体积/体积/分钟-vvm)加工黄原胶(g.L-1)。
图9显示发酵时期对生物聚合物的表观粘度的影响，其中生物聚合物的生产条件是：树生黄单胞菌李属致病变种06菌株浓度为1％m/v和2％m/v时，转速为6rpm。
在图10中的一组曲线显示了：与商品化黄原胶聚合物相比，由3％m/v的树生黄单胞菌株101水溶液在加入或不加入1％m/v盐的情况下，得到的黄原胶类生物聚合物的粘度和剪切速率的变化曲线图。图10的曲线举例说明了根据本发明所得到的生物聚合物与所添加盐的兼容性。
图11中的一组曲线显示了：与不加入盐的商品化黄原胶聚合物相比，106菌株的粘度和剪切速率中的变化，或者在由树生黄单胞菌的1％m/v水溶液在不加入盐和加入0.1％、1.0和3％m/v盐的条件下，得到的黄原胶类生物聚合物的粘度和剪切速率中的变化。
图12中的一组曲线显示了，与已经被加入1％m/v至3％m/v之间盐量的商品化黄原胶聚合物相比，106菌株的粘度和剪切速率中的变化，或者由树生黄单胞菌的水溶液在不加入盐和加入0.1％、1.0和3％m/v盐的条件下，得到的黄原胶类生物聚合物的粘度和剪切速率中的变化。
图13中的一组曲线图显示了，与商品化黄原胶相比，在任意的和控制的pH下，由树生黄单胞菌06、101和106菌株所生产的黄原胶的粘度和剪切速率的变化。
优选方式的详细说明
因此，本发明涉及用于从树生黄单胞菌(xanthomonas arboricola)和/或树生黄单胞菌李属致病变种(xanthomonas arboricola pv pruni)菌株的发酵培养基的培养物中生产微生物的黄原胶(xantan)样的生物聚合物的方法，其中所述的发酵培养基含有与稻米和蒸米的加工相关的剩余水和产物。
属于Pseudomoniaceae家族的黄单孢菌属细菌，为革兰氏阴性菌、单鞭毛运动、严格好氧、耐链霉素，并且除了嗜麦芽黄单胞菌(Xanthomonas maltophilia)之外，黄单孢菌属细菌基本上是植物致病菌。它们广泛地分布于并能感染超过240种的单子叶和双子叶植物种类(gender)。数量最多且含量丰富的野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)，自身分为约125种patovar菌，它们可感染各种宿主并成为其病原菌。
树生黄单孢菌李属致病变种
通常，黄原胶生产者使用野油菜(campestris)patovar菌，更具体地是NRRL B-1459及相关菌株。然而，考虑到这种生物聚合物的巨大工业用途，其它潜在的黄原胶生产微生物，以及细胞生长的优化，和生产、回收以及纯化所得到的EPS(胞外多糖，exopolysaccharide)的研究正在进行。
李属patovar菌按种类是李属树种(例如桃树、扁桃树和李树)的细菌性斑点病(李属细菌性斑点病，PBS)的病原菌。这种病害存在于各大洲，并且在炎热潮湿气候的区域更为严重。在辨别方法中，野油菜黄单胞菌显示出对植物作用的全身性：它的危害遍及植物全身，而黄单胞菌李属致病变种(X pv pruni)具有局部危害。在位于巴西最南部的Rio Grande doSuI的州，这种细菌天生感染所有的李属栽培种，并已成为巴西国家农业研究公司(EMBRAPA-CPACT)进行植物病理学研究的对象。出于这种目的，已经分离并鉴定了超过一百种菌株。然而，只在最近才开始研究从这种patovar菌中制备黄原胶的研究。
目前，根据核糖体核糖核酸(rRNA)的寡核苷酸序列或相应基因的序列的比较研究、以及在细胞总DNA的杂交水平中表达的同源定量DNA的同源表达定量的比较研究，对黄单胞菌种类进行新的分类。根据这种新的分类法，将李属黄单胞菌(xanthomonas pruni)重新分类为树生黄单胞菌。
申请人指出：本方法研究中使用的所有菌株，都属于EMBRAPA收集的树生黄单胞菌和树生黄单胞菌李属致病变种菌株。
因此，本发明的第一个方面是从树生黄单胞菌和/或树生黄单胞菌李属菌株的冻干培养物中生产黄原胶类生物聚合物的方法是本发明的第一个方面。
根据本发明，从李属树种的坏死组织中、从具有高纤维素含量的宿主的坏死组织中、以及从桃树和李树的坏死果实和树叶中分离树生黄单胞菌和/或树生黄单胞菌李属菌株的冻干培养物，并根据说明书中以下详述的适宜操作条件，在深层发酵培养基中进行发酵。
术语“高纤维素含量”意指纤维素含量占总成分的38％至56％。
利用树生黄单胞菌和/或树生黄单胞菌李属致病变种的最显著结果是，由本方法生产的黄原胶生物聚合物不同于目前市场上可得到的黄原胶生物聚合物，因为甚至当它们单独使用时，鼠李糖的存在可赋予所述的产物形成真正的胶体的能力。如上文所提到的那样，这种特性是当前黄原胶生物聚合物领域所缺少的。
另一个优点是由于利用如上所述的稻谷加工的剩余水而降低了生产成本。
利用这种生物聚合物的主要优点是可应用于要求高粘度、耐热聚合物的石油勘探中。
由于与常规黄原胶生物聚合物相比，减少了所需量，也可设想其用于食品中的好处，因为仅仅已经存在于产物配制剂中的盐就足以提高粘度。
其它用途包括作为杀虫剂中的涂剂增稠剂，它能有利于促进杀虫剂附着在植物叶片并避免产品流失到土壤中，以及在兽药产品中作为疫苗稳定剂。
为了更好地理解本方法，以下详细描述了本方法的步骤。
根据在流程图1例举的本方法的方式中(通常由数字(100)表示的)，其中在糖浓度达到发酵培养基的25％质量/体积比(或250g.L-1)的液体培养基中进行第二次发酵，所述的方法包括下列步骤：
a)a)提供预先生长在固体培养基中或已冻干的树生黄单胞菌和/或树生黄单胞菌李属致病变种的或已冻干的分离菌落；
b)通过将所述的菌落加入适宜的细胞生长的培养基来制备初始的预接种物，并将菌落以100至250rpm的转速并在20℃至30℃之间的温度以及在pH 4.5至9.0的条件下温育24h或48h(即步骤110)，其中所述的培养基含有13至55gL-1的蔗糖或葡萄糖、1.0至37gL-1的蛋白胨、10至20gL-1琼脂、0.03至0.90g.L-1的K2HPO4以及0.001至2.5g.L-1的MgSO4和/或复合维生素B；
优选地，细胞生长培养基包含10至30g.L-1蔗糖或葡萄糖，3至15g.L-1蛋白胨、10至20g.L-1琼脂、0.09至0.7g.L-1 KH2PO4以及0.01至1.0g.L-1 MgSO4和/或复合维生素B。优选pH范围在5.5到7.5之间。
c)将初始的预接种物导入含有下列成分的液体培养基：13至55gL-1的蔗糖或葡萄糖、1.0至37gL-1的蛋白胨、0.03至0.90g.L-1的K2HPO4和0.001至2.5g.L-1的MgSO4和/或复合维生素B，然后将菌落以100至250rpm的转速在20℃至35℃的温度和pH 4.5至9.0的条件下温育24h或48h，并在温育期之后获得最终液体预接种物(即步骤120)；
优选地，细胞生长培养基包含10至30g.L-1蔗糖或葡萄糖，3至15g.L-1蛋白胨、10至20g.L-1琼脂、0.09至0.7g.L-1 KH2PO4以及0.01至1.0g.L-1 MgSO4和/或复合维生素B。优选pH范围在5.5到7.5之间。
最终预接种物可以冻干备用，或直接将其转入第一发酵罐。
d)根据50至1,200rpm的转速、优选100至800rpm的转速和0.5至4体积/体积/分钟的通风比、优选0.5至3体积/体积/分钟的通风比加入氧气，直接将最终预接种物导入第一无菌发酵罐中进行发酵，并在20℃至35℃之间的温度和在pH4.5至9.0下培育24或48h来获得发酵期结束的接种物(即步骤130)，其中所述的第一发酵罐含有由直至100gL-1的蔗糖或葡萄糖、1.0至37gL-1蛋白胨、0.03至0.90gL-1 K2HPO4以及0.001至2.5gL-1 MgSO4和/或复合维生素B组成的液体培养基；
至于初始的和最终的预接种物，则使用优选量。
当被冻干时，在被转入第一发酵罐之前，应根据重悬浮并在先前的条件下进行新鲜孵毓(fresh incubation)来活化冻干的最终预接种物。另一方面，直接将新近制备的预接种物转入发酵罐。
e)根据50至1,200rpm的转速、优选100至800rpm的转速和0.5至4体积/体积/分钟的通风比、优选0.5至3体积/体积/分钟的通风比加入氧气，并在22℃至35℃之间的温度、优选22℃至32℃之间的温度和在pH4.5至9.0下，直接将接种物导入第二无菌发酵罐中，并根据生物聚合物的最终期望用途，进行发酵24至120小时、优选48至72小时(即步骤140)，其中所述的无菌发酵罐含有用于通过深层发酵而生产生物聚合物的液体发酵培养基，或者将所述的无菌培养基加入含有接种物的发酵罐；除了纤维素、米糠和/或麦麸之外，和/或除了0.1至7.2gL-1之间的氮、磷和钾常量元素，和除了0.01至1.7gL-1的镁、铁微量元素之外，和除了复合维生素B和维生素E以及占液体培养基直至25％质量/体积比(或250gL-1)的蔗糖之外，以及除了50至200ppm的硅酮和/或植物油之外，培养基由带壳稻米的浸泡液或煮饭水或来自蒸米的水组成；
除了米汤之外，培养基优选包含常量元素(例如1.2至4.0gL-1的氮、磷、钾)、微量元素(例如0.1t至1.0gL-1的镁和铁)、0.06mgL-1至2mgL-1的复合维生素B、10至30μgL-1的维生素E、直至25％质量/体积比的蔗糖以及50至200ppm的硅酮或米糠油。
e)发酵结束后，过滤发酵液以分离细胞(即步骤150)；
f)通过用121℃的流动蒸汽(live steam)加热杀菌或用氯化化合物进行化学灭活的方法，灭活发酵罐中过滤发酵液中自带的细胞(步骤160)；
借助于温度在121℃左右的流动蒸汽，来实施加热杀菌。
用于化学灭活培养基的氯化物，包含无机化合物，例如氯含量为100至200ppm次氯酸钠和次氯酸。用于化学灭活的有机化合物包括0.01至0.1％m/v的双氯苯双胍己烷。
当需要回收细胞时，将所得到的生物聚合物在离心之后进行沉淀(参见图2)。
当不需要回收细胞时，在细胞灭活后进行沉淀聚合物。
g)通过将极性有机溶剂加入灭活的培养液中，来进行沉淀(步骤170)，其中培养液中加入或不加入浓度为0.2至10％质量/体积比的NaCl、KCl和CaCO3其中的一价和/或二价盐；
当溶剂浓度达到总体积的50％至80％时，发生聚合物沉淀。所需的溶剂体积取决于所加入盐的百分比。
用于本发明目的的溶剂包括极性有机溶剂，主要是纯的或以任意量混合的C2和C3醇。
h)通过蒸馏和再次投入生产过程的方法回收极性溶剂例如醇(步骤170a)；
i)通过最初在传送带上排干聚合物液体的方法来干燥生物聚合物产物，然后将分离的产物转入表面干燥器或其它类似装置中(步骤180)，随后在任何适于碾碎的常规装置中进行碾磨或压碎(步骤180a)；以及
f)i)回收做好的黄原胶类生物聚合物以备使用(步骤190)。
或者，使用喷雾干燥器或表面干燥器来直接干燥发酵液，然后在球磨机或万能磨粉机中将其粉碎成所要求的粒径分布。
或者，通过降低初始pH约为中性的反应系统的pH降低至下限值的不调节pH(或在任意pH条件下)的方法来实施该加工过程。
当发酵液粘度在10s-1下超过250mPas时，用水或用水和极性有机溶剂(优选C1至C3醇，例如乙醇和异丙醇)的混合液稀释发酵液，直至粘度降至在10s-1下的250mPas。这是重要的加工特征，因为太粘稠的发酵液意味着本可避免的、回收步骤中的产物损失。
在流程图2中描述了实施本发明方法的另一种方式，通常由数字(200)表示。根据这种方式，引入了用于细胞分离的离心步骤(250)和用于细胞回收或破碎步骤(260a)的其它步骤。
根据图2，步骤(210)通过将固体培养基中的树生黄单胞菌和/或树生黄单胞菌李属致病变种菌落或冻干的菌落，加入发酵培养基中，来制备初始的预接种物。步骤(220)和步骤(230)具有与图1中对应数字(120)和(130)的相同含义。
步骤(240)是在含有达直至500gL-1糖(蔗糖或葡萄糖)的液体培养基中进行的第二次发酵的步骤。
步骤(240a)是设计被用于细胞灭活的步骤。
紧跟第二次发酵步骤之后的是细胞破碎步骤(240b)。
步骤(250)涉及用于细胞分离的离心步骤。以10,000至15,000g的速度实施离心。
然后将离心过的培养液用醇(醇按体积比最大量为40％)进行稀释，并通过沉淀来回收生物聚合物，即步骤(260)。
步骤(260a)是蒸馏回收醇以作为再次利用的溶剂。
沉淀之后，将生物聚合物产物进行干燥(270)、碾磨或压碎(280)，并回收最终的生物聚合物(290)。
就所获得的生物聚合物而言，本方法所用的菌株的生产力达到5.7至26.4gL-1，平均在15至22gL-1之间。
本发明的第二个方面是用于实施可生产本发明的黄原胶类生物聚合物的方法中的第2次发酵步骤的发酵培养基。
如下所示优选的发酵培养基，其包括培养基A至J。
培养基A.
该发酵培养基包含：
a)带壳稻米的煮饭水或浸泡水，以及稻谷蒸煮处理(蒸米)的剩余水(又称淘米水)；
所述煮饭水或浸泡水包含约20mgL-1至80mgL-1总氮量，主要是有机氮，这是用于树生黄单胞菌李属致病变种的优良底物。此外，所述的水还包含10mgL-1至50mgL-1磷酸盐离子以及2至20mgL-1硫酸根离子。
b)市场上可买到的、含量在0.2mgL-1至40gL-1中的米糠；
c)市场上可买到的、含量在0.3gL-1至10gL-1中的麦麸；
d)0.1至7.2gL-1的氮、磷、钾常量元素，和0.01至1.7gL-1的镁、铁微量元素；
e)浓度在0.02mgL-1至3mgL-1的纯净形态的复合维生素B，包括市场上可买到的维生素B1、维生素B2和烟酸(维生素B3)，或是富含复合维生素B的天然基质。富含复合维生素B的基质是那些维生素总含量超过10％质量比的物质，例如啤酒酵母、酵母提取物、脱水酵母以及麦芽；
g)培养基中含量为10至30μg/L的维生素E，其在加工过程作为除泡剂，通常使用富含这种维生素的植物油(例如向日葵油、棉籽油或豆油)；
h)浓度达250gL-1或者直至500gL-1的糖，例如蔗糖或葡萄糖。
或者，本发明的生产方法可使用其它培养基。有时候，使用所述备选的培养基可将产量提高至50％。
培养基B.
培养基B的成分包括：0.15至5.0gL-1的KH2PO4、0.01至0.6gL-1的MgSO4·7H2O、10至250gL-1的蔗糖以及0.2至6gL-1的米糠。
培养基C.
培养基C的成分包括：0.2至1.5gL-1的NH4H2PO4、1至5gL-1的K2HPO4、0.1至0.6gL-1的MgSO4·7H2O、0.2至2.0gL-1的柠檬酸、2至5.0gL-1的KH2PO4、0.006gL-1的H3BO3、2.0gL-1的(NH4)2SO4、0.0024gL-1的FeCl3、0.002gL-1的CaCl2·2H2O、0.002gL-1的ZnSO4、10至250gL-1的蔗糖以及0.2至6gL-1的米糠。
培养基D至J.
在以下表1中列出了其它有用的发酵培养基，用g.L-1表示不同发酵培养基中的不用含盐量。
                                           表1
  反应物   培养基D   培养基E   培养基F   培养基G   培养基H   培养基I   培养基J
  NH4H2PO4   1.5   1.5   0   1.5   1.5   0.75   1.5
  MgSO4·7H2O   0   0.2   0.2   0.1   0.2   0.2   0.2
  KH2PO4   5.0   0   5.0   5.0   2.5   5.0   5.0
  蔗糖   50.0   50.0   50.0   50.0   50.0   50.0   50.0
将在有关的附图中进一步描述本发明。
图3是举例说明两种树生黄单胞菌株的发酵培养基中的粘度值对比剪切速率的实施例的曲线图。培养基1的曲线是关于菌株82的曲线，而培养基2的曲线是关于菌株87的曲线。
图4是举例说明25℃下，由单一菌株在不同时间(24、48和72小时)所产生的1％m/v生物聚合物水溶液的粘度值。曲线1指24小时之后获得的生物聚合物，而重叠的曲线2和曲线3分别指48小时和72小时之后获得的生物聚合物。
图5是举例说明由不同的树生黄单胞菌株所产生的3％m/v生物聚合物水溶液的粘度值的曲线图。曲线1、2、3、4、5、6分别是由菌株101、108、113、30、25、83所产生的生物聚合物的几个粘度值。
图4和图5还显示了被测的生物聚合物溶液的假塑性特性。
图6是举例说明了由不同的树生黄单胞菌株所产生的生物聚合物随温度上升而呈现粘性的柱形图。在该图中，实心框表示在25℃时的粘度值，而空心框表示在65℃时的粘度值。
附图7是显示72小时发酵后不同组菌株组生物聚合物的生产间隔(production interval)的柱形图。白色方框表示由菌株06、106、46、101、37以及20所显示的、在10至14gL-1之间的生产间隔。浅灰色方框表示由菌株18、07、39、36以及15所显示的、在15至18gL-1之间的生产间隔。黑灰色方框表示由菌株24、58、40以及31分别在10L容积发酵罐中获得的、在20至26gL-1之间的生产间隔。
图8是方框图，其显示通气条件对树生黄单胞菌李属致病变种菌株06在3L容积发酵罐中的黄原胶生物聚合物生产力(gL-1)的影响或依赖性的柱形图。实心方框表示搅拌和通气的条件A(250rpm和1.5vvm)，而空心方框表示条件B(350rpm和2.0vvm)。
图9是曲线图，其举例说明了生物聚合物的发酵时间和浓度以及测试温度对由树生黄单胞菌李属致病变种菌株06所产生的生物聚合物的表观粘度的影响的曲线图。曲线1、2、3涉及在不同时间所获得的、并分别在65℃、45℃和25℃所测量的2％质量/体积比生物聚合物水溶液的粘度值。曲线4、5和6涉及与曲线1、2、3所获得相同的、并且在相同温度下测量的1％质量/体积比的生物聚合物水溶液的粘度值。
在附图10中，举例说明了：1％m/v的树生黄单胞菌株101水溶液所得到的黄原胶类生物聚合物中的粘度和剪切速率的变化。与商品化黄原胶聚合物相比，或者溶液中可选择性的添加1％或3％m/v盐。该曲线图举例说明了本发明生物聚合物与加入的盐的相容性。曲线1是商品化的黄原胶生物聚合物加入1％m/v盐的商品化黄原胶生物聚合物的粘度曲线。曲线2是相同的商品化生物聚合物加入3％m/v盐的粘度曲线。曲线3是加入3％m/v盐的菌株101中所产生的生物聚合物的粘度曲线，而曲线4涉及加入1％m/v盐的菌株101中所产生的相同生物聚合物的粘度曲线。曲线5涉及没有加入任何盐的菌株101中所产生的生物聚合物的粘度曲线。应当注意：与未加入盐的并产生相同生物聚合物的曲线5相比，当加入3％m/v盐时，曲线3显示菌株101的生物聚合物的粘度提高了十倍。
在图11中，举例说明了：与未加入盐的商品化黄原胶聚合物相比，通过和不通过加热灭活以及加入或不加入盐，在树生黄单胞菌株106生产的1％m/v黄原胶类生物聚合物水溶液的粘度和剪切速率中的变化。曲线1涉及通过加热灭活和加入1％m/v盐而获得的生物聚合物。曲线2、3和4涉及未加热灭活和分别加入0.1、1和3％m/v盐而获得的聚合物。曲线5涉及未加入盐的商品化黄原胶聚合物水溶液的粘度。
图12是一组曲线图，其举例说明了与加入1％m/v和3％m/v盐的两种商品化黄原胶聚合物相比，106菌株中的粘度对剪切速率中的变化，或者由加入0.1％、1.0和3％m/v盐的1％m/v树生黄单胞菌水溶液所获得的黄原胶类生物聚合物的粘度和剪切速率的变化的一组曲线图。曲线1、2和3涉及菌株106的粘度，而曲线4和5涉及商品化黄原胶聚合物的粘度，曲线6和7涉及另一种商品化黄原胶聚合物的粘度。
图13是一组曲线图，其举例说明了与商品化黄原聚合物相比，在任意的和控制的pH下，由树生黄单胞菌06、101和106菌株所生产的黄原胶类聚合物的粘度对剪切速率的变化。曲线3是在10L容积的发酵罐中，pH7下的条件下，菌株106的1％m/v生物聚合物水溶液的粘度；曲线2是加入0.1％m/v盐的、菌株06的1％m/v生物聚合物水溶液在pH 7下的粘度；曲线3是加入3％m/v盐的、菌株101的1％m/v生物聚合物水溶液在pH 7下的粘度；而曲线4是加入1％m/v盐的、1％m/v的商品化黄原胶生物聚合物的浓度的粘度。
本说明书中使用的术语“树生黄单胞菌和/或树生黄单胞菌李属致病变种”，表示：在本发明原理中，菌株组合也是可行的。对于混合菌株仅有的限制是两者都需要包括相似的加工pH范围和通气条件的发酵条件。例如，适宜的组合是：相对低生产力和高粘度的一种菌株与相对高生产力和非高粘度的另一种菌株。与简单的两种菌株的平均参数相比，菌株组合可产生高产量和高粘度。
本发明的第三个方面是通过上述方法而获得的生物聚合物。
根据本方法生产的树生黄单胞菌和/或树生黄单胞菌李属致病变种的生物聚合物，特征包括：
a)组分，主要由单糖(例如葡萄糖、甘露糖)、葡糖醛酸、丙酮酸、乙酸形成的异胞外多糖，并且涉及在鼠李糖存在下树生黄单胞菌野油菜致病变种和manhiotis菌的辨别方法中；
b)在4.106至12.106g.mol-1之间的高分子量；
c)目前，生物聚合物最多的用途是制成粉末，不论加入或不加入盐，都易溶于冷水、热水或弱离子溶液。或者，可将生物聚合物制成可用的浓缩水溶液(2至6％m/v生物聚合物)的利用形式，以备加入所需产品中；
d)颜色：粉末状或在浓缩液中，其颜色都只会从淡灰色变化至淡黄色，很少呈暗褐色，并且所展现的颜色随操作条件的改变而变。通过纯化，生物聚合物为白色或浅黄色产品，可形成澄清溶液(即使浓度高达3％m/v或6％m/v)。
根据本申请所推荐的需氧发酵的条件，利用树生黄单胞菌和/或树生黄单胞菌李属致病变种联合新发酵培养基的使用，可获得新的黄原胶生物聚合物，其中所述的新发酵培养基的构成除了上文提到的其它培养基成分之外，还有来自稻米产业(例如稻米蒸煮)的剩余水和除了以上其它培养基所引用之外的、所添加的相关产品和副产品(如米糠)。
由树生黄单胞菌和/或树生黄单胞菌李属致病变种所生产的生物聚合物的化学组分是含量比为3∶3∶1∶1的D-甘露糖、D-葡萄糖、D-葡糖醛酸和鼠李糖，另外，乙酰基和丙酮酸基团的含量分别在1.1至5.5％和0.3至0.9％之间变化。
由于进行了改进，因此本发明的生物聚合物比商品化黄原胶更耐高温。这种生物聚合物的粘度值高于类似的商品化聚合物的粘度值。
并且，新的生物聚合物的盐相容性方面是非常高效的，因此可通过加入0.2至10％m/v盐，来使1％m/v和3％m/v生物聚合物水溶液的粘度值加倍。
本发明的生物聚合物与商品化黄原胶聚合物的特性差别在下表中例举。
因此，以下表2列举了在6rpm、25℃以及65℃时，来自树生黄单胞菌李属致病变种的3％m/v生物聚合物水溶液的表观粘度值与耐热值的比较。将在相同条件下的商品化黄原胶聚合物作为对照。
                        表2
  菌株号   粘度(mPas)，25℃   粘度(mPas)，65℃
  24   25,000   19,000
  87   22,000   15,000
  46   23,000   21,000
  20   15,000   15,000
  31   20,000   21,000
  15   34,000   38,000
  82   15,000   22,000
  06   27,000   32,000
  75   15,000   19,000
  对照   24,000   24,000
如上表2所示，根据对不同的树生黄单胞菌株和树生黄单胞菌李属致病变种菌株所实施的拓展实验，可以证明所获得生物聚合物的质量和流变特性随特定菌株而变。因此，从菌株24、87和46中获得的生物聚合物水溶液随温度上升而粘度下降，这是生物聚合物溶液的普遍特征。
菌株20和菌株31的产物粘度值不会随温度上升而变化，而菌株15、82、06以及75的产物随温度上升而导致粘度值明显增加。
下表3说明特定菌株对水溶液中的生物聚合物的流变特性的影响。从所列数据可观察到，由菌株24产生的生物聚合物所显示的假塑性，低于商品化黄原胶聚合物以及菌株06产生的生物聚合物所显示的假塑性。粘度下降越剧烈，意味着假塑性越高。通常，高的假塑性产物在加工期间需要进行泵水。
表2中所列出的测试实验条件是：在25℃和不同的剪切速率下，商品化KelcoTM产品和树生黄单胞菌李属致病变种菌株06以及菌株24的3％m/v生物聚合物水溶液。
                               表3
  剪切速率(S-1)  粘度(mPas)
 KelcoTM黄单胞菌对照   本发明的黄单胞菌株06   本发明的黄单胞菌株24
  0.005  38,000   74,000   88,000
  10  3,300   4,040   7,000
  30  1,300   1,550   2,640
  60  700   810   1,430
以上表3的数据毫无疑义地说明根据本发明得到的生物聚合物的巨大多功能性。因此，菌株06表现出粘度和剪切速率明显降低的性质，使得它更适于石油用途，而粘度不随剪切速率而明显降低的菌株24，更适于食品和化妆品用途。
以下表4表明：粘度和流变特性是随着用于实施本方法的特定菌株而变化的。可参见从树生黄单胞菌李属致病变种中获得的生物聚合物与商品化黄原胶的粘度比较。使用条件是：在25℃下，由树生黄单胞菌李属致病变种菌株15产生的3％m/v黄原胶生物聚合物水溶液的表观粘度(mPas)，和由Kelko制造的dyalised黄原胶聚合物的表观粘度(mPas)。
                                  表4
  菌株号   6s-1   10s-1   12s-1   30s-1   60s-1
  101   20,600   12,700   10,600   4,080   2,080
  104   18,900   12,100   10,100   3,900   2,050
  108   18,200   11,200   9,320   3,750   1,970
  115   15,800   10,200   8,660   3,470   1,850
  106   15,900   9,930   8,200   3,270   1,750
  109   15,800   9,600   7,980   3,230   1,770
  26   14,200   8,930   7,410   2,980   1,620
  113   13,100   8,100   6,770   2,860   1,570
  112   12,400   7,830   6,600   2,770   1,490
  114   11,600   7,270   6,230   2,720   1,520
  105   12,800   7,920   6,650   2,700   1,480
  38   12,100   7,660   6,410   2,560   1,410
  27   11,800   7,600   6,370   2,550   1,340
  102   11,300   7,210   6,110   2,570   1,440
  100   11,200   7,010   5,940   2,530   1,400
  对照   11,700   7,120   6,080   3,120   2,030
对照：由Kelko制造的dyalised商品化黄原胶树胶体。
以下表5表明：通过测量两种剪切速率，培养基组分和发酵反应时间对所获得生物聚合物的粘度的影响。含有培养基B+C的组分表示含有等量的两种培养基的培养基。
                                   表5
  R.时间(h)   产量(gL-1)   粘度(mPas)
  培养基C  培养基B+C   培养基C   培养基B+C
  72   2.5  12.4   14,000*   28**   15,000*   30**
  96   12.2  16.4   80,000*   160**   26,000*   52**
*剪切速率0.5s-1
**剪切速率500s-1
表5的数据表明：组合培养基B+C，大大地提高了两种发酵周期的产量。然而，如果仅仅研究粘度，则单独使用培养基C效果更好。
以下表6列出：通过不同的树生黄单胞菌李属致病变种菌株在根据表1所配制的培养基中而生产黄原胶聚合物，在25℃和剪切速率10s-1时，其1％m/v的水溶液的表观粘度值(mPas)和pH值。
                                               表6
  培养基   树生黄单胞菌株/pH
  06   pH   15   pH   24   pH   31   pH   46   pH
  F   3,700   5.5   6,200   6.4   3,900   6.2   6,500   6.2   6,900   7.0
  G   3,000   5.5   8,300   6.5   3,900   6.3   9,400   6.5   5,900   6.5
  HI   6,800   6.3   8,300   6.8   5,600   6.6   7,900   6.9   10,000   7.0
  6,000   5.3   10,200   5.3   5,200   5.3   10,700   5.2   5,700   5.6
  C   4,400   4.9   9,400   4.6   4,400   5.0   6,600   4.5   7,600   4.6
                                  表7
  发酵反应时间(h)   任意pH/gL-1   pH5/gL-1   pH7/gL-1   pH9/gL-1
  24   9.2   8.8   8.9   10.0
  48   9.1   11.6   12.5   12.5
  54   10.3   12.3   11.2   12.0
  66   9.4   12.3   11.7   13.9
  72   9.8   13.2   13.3   13.3
“任意pH”指的发酵反应起始于中性以上的pH，并在没有加入任何可维持高于7.0的pH值的碱性化合物的情况下，来任其pH值下降。
以下表8显示：菌株106产生的生物聚合物的粘度随获取过程中所用的搅拌条件的不同而变化。
                  表8
 剪切速率s-1   粘度(mPas)
  10   30   60
 200rpm   600   250   144
 400rpm   1130   379   207
以下表9列出菌株106在灭活发酵液中的产量，并表明生物聚合物产量取决于搅拌和发酵反应时间。
                                 表9
  发酵反应时间(h)   200rpm   200rpm   400rpm   400rpm
  24   7.14   6.46   8.93   8.96
  48   8.73   8.86   12.3   12.5
  54   9.61   9.12   11.13   13.15
  66   10.42   10.27   11.6   13.85
  72   10.38   10.73   13.3   16.5
以下表10说明了发酵培养基的pH值对菌株106产生的生物聚合物产物粘度的影响。
                  表10
 剪切速率s-1   粘度(mPas)
  10   30   60
  任意pH*   632   274   152
  pH5   460   175   95.5
  pH6   1130   379   207
  pH7   986   343   183
任意pH*指如上述相同的含义。
下表11列出了：菌株06在不同发酵时间和两种不同的通气条件下，在三种剪切速率测得的发酵培养基的反应时间和通气条件对生物聚合物的表观粘度的影响，其中通过生产所述的生物聚合物。
                          表11
  反应时间(h)   A   B   A   B   A   B
  剪切速率   10s-1   30s-1   60s-1
  18   760   540   300   220   170   130
  24   770   540   310   220   180   120
  42   710   530   260   210   160   120
  48   640   500   240   210   130   100
  66   640   480   230   200   130   110
  72   610   360   230   160   120   90
条件：A 250rpm 1.5vvm
      B 350rpm 2.0vvm
说明书中的一些表和附图所提供的数据，证明了树生黄单胞菌和/或树生黄单胞菌李属致病变种建议用于生产高粘度的生物聚合物水溶液的优点，生物聚合物可单独使用，或与其他生物聚合物联合使用，还可以加入盐的形式使用生物聚合物。
另外，本发明的生物聚合物水溶液的粘度高于类似的商品化黄原胶聚合物的粘度。有利地是，如图10、图11和图12的曲线所示，该生物聚合物随浓度为0.2至10％m/v、优选0.5至6％m/v的盐(甚至一价盐)的加入而粘度增加。
除可加入耐盐产物之外，还可将抗菌剂例如叠氮化钠、戊二醛和甲醛加入黄原胶生物聚合物中，以便提高生物聚合物溶液在贮存期间的稳定性。
从某些菌株例如菌株82、15、06和75中获得的生物聚合物中，具有随温度上升而粘度增加的异常特征。在图4、图5和图6中举例说明了这种特性。
而且，本发明的生物聚合物在单独使用时或与其它聚合物联合使用时，能形成真正的胶体，并且当将二价盐例如CaCl2或CaCO3加入生物聚合物时，可促进凝胶强度。
10s-1、25℃时，1％m/v生物聚合物水溶液的粘度通常在1,000至5,000mPas之间变化。然而在10s-1、25℃时，粘度值可能在100mPas范围中波动是可能的，这并不意味着产生的是较低价值的产物，而是可用于非稠化剂用途的产物。
10s-1、25℃时，3％m/v生物聚合物水溶液的粘度值在4,000至28,000mPas之间波动。
本发明的第四个方面涉及所获得的聚合物的用途。
从本发明得到的生物聚合物中所获得的溶液的流变特性在测定其用途中具有最高的价值。如图3和图4中所示的高假塑性，是将生物聚合物应用于石油勘探活动中的必要参数。
因此，黄原胶或生物聚合物可用于石油生产的各个方面，包括通过配制含有或没有其他固体的钻井液而用于油井钻探、水力压裂、配制修井液(workover fluid)而用于油井维修、用于配制完井液(completion)、用于管道清洁和提高石油流体采收率。
该生物聚合物改变了水溶液的流变性质。它具有期望的性质例如稳定、改进活性组分的结构并控释活性组分，同时还能在冷冻时减少结冰以及消除锻烧化合物的脱水收缩作用。生物聚合物膜可用于食品包装用途。
同样可用于需要泵输液体步骤的粮食加工中，以及用于需要泵输液体的其它工业作业中。
根据上述特征，生物聚合物在冷水或热水中或在盐溶液或弱酸性溶液中的快速增溶作用以及与盐的相容性，同样与它们在食品用途或其它用途相关。
除了涂剂、杀虫剂组分以及兽药组分之外，聚合物的其他用途包括可用作药物组分和化妆品组分。

Claims (35)

1.一种制备黄原胶生物聚合物的方法，其中所述的方法包括下列步骤：
a)提供预先生长在固体培养基中的或已冻干的树生黄单胞菌和/或树生黄单胞菌李属致病变种的分离菌落；
b)通过将所述的菌落加入适宜的细胞生长培养基来制备初始的预接种物，并将菌落以100至250rpm的转速并在20℃至30℃之间的温度以及在pH 4.5至9.0的条件下温育24h或48h(即步骤110)，其中所述的培养基包含3至55g.L-1的蔗糖或葡萄糖、1.0至37g.L-1的蛋白胨、10至20g.L-1琼脂、0.03至0.90g.L-1的K2HPO4以及0.001至2.5g.L-1的MgSO4和/或复合维生素B；
c)将初始的预接种物导入含有下列成分的液体培养基：3至55g.L-1的蔗糖或葡萄糖、1.0至37g.L-1的蛋白胨、0.03至0.90g.L-1的K2HPO4和0.001至2.5g.L-1的MgSO4和/或复合维生素B，然后将菌落以100至250rpm的转速在20℃至35℃的温度和pH 4.5至9.0的条件下温育24h或48h，并在温育期之后获得最终液体预接种物(即步骤120)；
d)根据50至1,200rpm的转速、优选100至800rpm的转速和0.5至4体积/体积/分钟的通风比、优选0.5至3体积/体积/分钟的通风比加入氧气，直接将最终预接种物导入第一无菌发酵罐中进行发酵，并在20℃至35℃之间的温度和在pH4.5至9.0下培育24或48h来获得发酵期结束的接种物(即步骤130)，其中所述的第一发酵罐含有由维持在100gL-1的蔗糖或葡萄糖、1.0至37g.L-1蛋白胨、0.03至0.90g.L-1K2HPO4以及0.001至2.5g.L-1MgSO4和/或复合维生素B组成的液体培养基；
e)根据50至1,200rpm的转速、优选100至800rpm的转速和0.5至4体积/体积/分钟的通风比、优选0.5至3体积/体积/分钟的通风比加入氧气，并在22℃至35℃之间的温度、优选22℃至32℃之间的温度和在pH4.5至9.0下，或在不控制pH(任意pH)下，直接将接种物导入第二无菌发酵罐中，并根据生物聚合物的最终期望用途，进行发酵24至120小时、优选48至72小时(即步骤140)，其中所述的无菌发酵罐含有用于通过深层发酵而生产生物聚合物的液体发酵培养基，或者将所述的无菌培养基加入含有接种物的发酵罐；除了纤维素、米糠和/或麦麸之外，和/或除了0.1至7.2g.L-1之间的氮、磷和钾常量元素，和除了0.01至1.7g.L-1的镁、铁微量元素之外，和除了复合维生素B和维生素E以及直至250g.L-1的蔗糖之外，以及除了50至200ppm的硅酮和/或植物油之外，培养基由带壳稻米的浸泡液或煮饭水或来自蒸米的水组成；
e)发酵结束后，过滤发酵液以分离细胞(即步骤150)；
f)发酵结束之后，通过用121℃的直接蒸汽加热杀菌或用氯化物进行化学灭活，致使发酵液直接在发酵罐中被灭活细胞(步骤160)；
g)通过将极性有机溶剂加入灭活的发酵液中，来进行沉淀(步骤170)，其中发酵液中加入或不加入选自浓度为0.2至10％质量/体积比的NaCl、KCl和CaCO3的一价和/或二价盐；
h)通过蒸馏回收极性溶剂，并再次用于本方法(步骤170a，步骤260a)；
i)通过最初在传送带上排干液体来干燥生物聚合物产物，然后将分离的产物转入表面干燥器或其它类似装置中，随后在任何适于碾碎的常规装置中进行碾磨或压碎(步骤180a)；以及
i)回收做好的黄原胶类生物聚合物以备使用(步骤190)。
2.根据权利要求1中所述的方法，其中在步骤b)、步骤c)和步骤d)中，细胞生长培养基优选包含10至30g.L-1的蔗糖或葡萄糖，3至15g.L-1的蛋白胨、10至20g.L-1的琼脂、0.09至0.7g.L-1的KH2PO4以及0.01至1.0g.L-1的MgSO4和/或复合维生素B，优选pH范围在5.5到7.5之间。
3.根据权利要求1中所述的方法，其中将最终冻干的液体预接种物冻干以备另外使用，或者将其直接转入第一发酵罐中。
4.根据权利要求3中所述的方法，其中在被转入第一发酵罐的使用之前，根据先前的条件重悬浮并进行新近温育来活化冻干的最终预接种物。
5.根据权利要求1中所述的方法，其中或者通过起始于约中性的pH值并使反应系统降低pH值降低至下限值，并且不调节pH值(或在任意pH值条件下)来实施该方法。
6.根据权利要求1中所述的方法，其中为了促进产物回收，当发酵液粘度在10s-1下超过250mPas时，用水或用水和极性有机溶剂的混合液稀释发酵液，直至粘度降至在10s-1下的250mPas，其中极性有机溶剂选自C1至C3醇，例如乙醇和异丙醇。
7.根据权利要求1中所述的方法，其中在步骤f)中，用于化学灭活发酵液的氯化化合物包括无机化合物，例如使用氯浓度在100至200ppm之间的次氯酸钠和盐酸，而有机化合物包括0.01至0.1％m/v的双氯苯双胍己烷。
8.根据权利要求1中所述的方法，其中在第二次发酵之后，或者以10,000至15,000g实施离心步骤(250)来进行细胞分离，并实施另外的步骤来回收细胞，或者实施破碎步骤(240b)。
9.根据权利要求1中所述的方法，其中或者在液体发酵培养基中实施第二次发酵步骤(240)，所述的发酵培养基含有总量占所述培养基达500gL-1的蔗糖或葡萄糖。
10.根据权利要求1中所述的方法，其中就所获得的生物聚合物而言，菌株的生产力达到5.7至26.4gL-1，平均在15至22gL-1之间。
11.根据权利要求1中所述的方法，其中经受过所述处理的菌落包含了可产生协同效应的菌株组合，并且所提供的菌株在pH范围和通气条件方面需要相似的发酵工艺条件。
12.一种旨在用于根据权利要求1的方法中的第二次发酵步骤的发酵培养基，其中所述的培养基包括：
a)带壳稻米的煮饭水或浸泡水，以及稻谷蒸煮加工的剩余水；
b)含量在0.2mgL-1至40gL-1中的米糠；
c)含量在0.3gL-1至10gL-1的麦麸；
d)0.1至7.2g.L-1的氮、磷、钾常量元素，和0.01至1.7g.L-1的镁、铁微量元素；
e)浓度在0.02mgL-1至3mgL-1之间的纯净形态的复合维生素B，包括维生素B1、维生素B2和烟酸(维生素B3)，或者是富含复合维生素B的天然基质；
f)来自植物油并且含量在10至30μg/L的维生素E；
g)浓度直至250gL-1或直至500gL-1的糖，例如蔗糖或葡萄糖。
13.根据权利要求12中所述的培养基，其中所述的煮饭水或稻米浸泡水的组分包含约20mgL-1至80mgL-1的总氮量，主要是有机氮，这是适于黄单胞菌李属致病变种细菌的优良底物。此外，所述的水还包含10mgL-1至50mg.L-1的磷酸盐离子以及2至20mgL-1的硫酸根离子。
14.一种旨在用于根据权利要求1的方法中的第二次发酵步骤的发酵培养基，其中所述培养基的组分包括0.15至5.0gL-1的KH2PO4、0.01至0.6gL-1的MgSO4·7H2O、10至250gL-1的蔗糖以及0.2至6gL-1的米糠。
15.根据权利要求14中所述的发酵培养基，其中或者所述的培养基不含米糠。
16.一种旨在用于根据权利要求1的方法中的第二次发酵步骤的发酵培养基，其中所述培养基的组分包括0.2至1.5gL-1的NH4H2PO4、1至5gL-1的K2HPO4、0.1至0.6gL-1的MgSO4·7H2O、0.2至2.0gL-1的柠檬酸、2至5.0gL-1的KH2PO4、0.006gL-1的H3BO3、2.0gL-1的(NH4)2SO4、0.0024gL-1的FeCl3、0.002gL-1的CaCl2·2H2O、0.002gL-1的ZnSO4、10至250gL-1的蔗糖、0.2至6gL-1的米糠。
17.根据权利要求16中所述的发酵培养基，其中或者所述的培养基不含米糠。
18.由树生黄单胞菌和/或树生黄单胞菌李属致病变种所生产的黄原胶生物聚合物，其中化学组分除了含有含量分别为1.1至5.5％和0.3至0.9％的乙酰基和焦葡萄酸基之外，还包括含量比为3∶3∶1∶1的D-甘露糖、D-葡萄糖、D-葡糖醛酸和鼠李糖。
19.根据权利要求18中所述的黄原胶生物聚合物，其中黄原胶生物聚合物的分子量在4.106gmol-1至12.106gmol-1之间。
20.根据权利要求18中所述的黄原胶生物聚合物，其中所述的生物聚合物可用作粉末。
21.根据权利要求18中所述的黄原胶生物聚合物，其中所述的生物聚合物可用作2％至6％质量/体积比的澄清水溶液使用。
22.根据权利要求18中所述的黄原胶生物聚合物，其中所述的生物聚合物具有耐盐性，1％m/v和3％m/v的生物聚合物水溶液，其粘度值随着加入0.2至10％m/v盐的加入而增加。
23.根据权利要求18中所述的黄原胶生物聚合物，其中当来源于某些菌株时，所述的生物聚合物具有假塑性特性。
24.根据权利要求18中所述的黄原胶生物聚合物，其中在10s-1和25℃时，1％m/v的生物聚合物水溶液的粘度在1,000至5,000mPas之间变化。
25.根据权利要求24中所述的黄原胶生物聚合物，其中在10s-1和25℃时，或者所述溶液的粘度在100mPas范围之内。
26.根据权利要求18中所述的黄原胶生物聚合物，其中即使当单独使用时，所述的生物聚合物可形成真正的胶体。
27.根据权利要求18中所述的黄原胶生物聚合物，其中所述的生物聚合物用于石油勘探作业。
28.根据权利要求27中所述的黄原胶生物聚合物，其中通过配制具有或没有额外固体的钻井液，所述的用途包括油井钻探、水力压裂、油井维修、完井、清洁管道以及提高石油采收率。
29.根据权利要求18中所述的黄原胶生物聚合物，其中所述的生物聚合物用于食品工业。
30.根据权利要求29中所述的黄原胶生物聚合物，其中将所述的生物聚合物加入食品组合物中或用于食品包装用途。
31.根据权利要求18中所述的黄原胶生物聚合物，其中将所述的生物聚合物加入药物组合物中。
32.根据权利要求18中所述的黄原胶生物聚合物，其中将所述的生物聚合物加入化妆品组合物中。
33.根据权利要求18中所述的黄原胶生物聚合物，其中将所述的生物聚合物加入涂剂组合物中。
34.根据权利要求18中所述的黄原胶生物聚合物，其中将所述的生物聚合物加入杀虫剂组合物中。
35.根据权利要求18中所述的黄原胶生物聚合物，其中将所述的生物聚合物加入兽药组合物，优选兽用疫苗。
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