CN1034086C - 杂多糖s-657 - Google Patents

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Abstract

新型杂多糖S-657是由野油莱黄单胞菌的一个新菌株，ATCC53159，经过发酵而制备的。它有作为增稠剂，悬乳剂和在水溶液中稳定剂有用特性，在油井处理液使用上具有特殊价值。
杂多糖S-657主要由碳水化合物，约12%蛋白质和约7%酰基(以0-乙酰基计算)组成。碳水化合物部分含有约19%葡萄糖醛酸，以及中性糖鼠李糖和葡萄糖，两者的摩尔分子比约为2∶1。

Description

杂多糖S-657
本发明是关于微生物多糖类方面的。人们知道，在这个方面某些微生物具有一个共同特征，那就是能产生细胞外的杂多糖。杂多糖通常为高分子量的线性碳水化合物多聚体，含有两种或两种以上类型的单糖，这些单糖以重复单位互相聚合在一起。
大部分杂多糖的用处在于它们能够改变水溶液中的粘度和液流学性质。此外，杂多糖还有相关的次要功能，如乳化作用，悬浮，稳定，及絮凝作用等等。参见示例，美国专利4,326,052，4,401,760。
杂多糖被广泛用于食品，钻井，农业及各种各样其它工业应用上。近几十年来，商业上对这些水溶性胶的需求大大增加。另外，新的工业技求产生对新的物理性质的杂多糖的需要。所以，对不同功能性范围的杂多糖的需要，结合商业上的需求，都已明显地说明发展新的、有不同物理特性的新型杂多糖是十分需要的。
因而，本发明的一个目的就是提供一种新型杂多糖，该杂多糖是由一种微生物野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)的新菌株所产生的。本发明的另一个目的是提供制备这种新型杂多糖的方法。还有一个目的是提供生产这种新化合物的微生物。另外，本发明还提供配制含有这种新型杂多糖的配方。本项发明的所有这些目的将在下面详尽说明。
现已发现，野油菜黄单胞菌的一种新菌株通过在某一选择性碳源上作用可产生一种新型杂多糖。该杂多糖主要由碳水化合物，和大约12％蛋白以及7％酰基(以0-乙酰基计算)所组成。碳水化合物部分含有重量比为19％的葡萄糖醛酸及中性糖-鼠李糖和葡萄糖，这两种糖的摩尔分子数比例约为2∶1。这个新型化合物是通过野油菜黄单胞菌的新菌株在合适液体营养培养基中有氧发酵而制备的。根据布达佩斯条约，该微生物菌株的生物纯培养物于1985年6月19日，按注册号ATCC53159保存在美国马里兰州洛克菲勒的美国菌种保藏中心，根据中国专利法，也在中国武汉菌种保藏中心保藏，登记号为CCTCC NO.68-074。这种杂多糖，这里命名为杂多糖S-657，在水溶液系统中具有我们期望的那些特性，尤其适用于配制油井处理。
本发明的这种新型微生物是从一种采自美国加州尤里卡地区附近沼泽地的藻类样品中分离得到的。经过30℃温度下培养4天，从YM琼脂平板上挑选出这种呈胶状菌落的微生物，然后这种分离物在营养琼脂培养基上进一步纯化培养。
取在营养琼脂培养基上的分离株接种到种子三角瓶中培养。然后再取三角瓶中培养物用作种子接种到另一个含有以水解淀粉作为碳源的营养培养基的三角瓶中培养，培养后发现三角瓶中含有一种粘液，加入异丙醇后，可见一种纤维状物质沉淀下来。另一个三角瓶种子培养，用来测定各种营养培养基对胶产量的影响，以及测定这种微生物生长用最佳培养基和发酵条件。
杂多糖S-657是在控制的条件下，接种CCTCC 68-074菌株培养物，通过在营养培养液中有氧发酵而产生的。所用培养基含有可同化的碳源，氮源和无机盐。
一般来说，碳水化合物(例如葡萄糖，果糖，麦芽糖，蔗糖，木糖，乳糖等)在营养培养基中能被单独或联合在一起用作可同化的碳源。培养基中所用的一种或多种碳源的确切数量部分程度上取决于培养基中所含的其它成分。但是总的来说，所用碳水化合物量通常在培养基重量的2％～5％之间。这些碳源在培养基中能被单独或联合使用。
总的来说，许多蛋白质性物质可被用作发酵过程的氮源。合适的氮源包括如酵母水解物，粗酵母，大豆粉，棉籽粉，酪蛋白水解物，玉米浆，蒸馏酒厂废液浓缩物，蕃茄酱等等，这些氮源既可单独也可联合使用；用量范围通常为液体培养基重量的0.05％～0.2％。
那些可掺入培养基中的营养无机盐常为一些钠盐、钾盐、铵盐、钙盐、磷酸盐、硫酸盐、盐酸盐、碳酸盐及其类似的离子。也包括一些微量的金属元素如钴、锰、铁、镁。
提请注意的是，我们这里所列举的培养基仅仅是说明可被使用的培养基种类很多，而不是想就限制在这些。
用一种更替的培养基，S-657菌株可在低钙离子条件下生长也即在去离子水或一些实际上不含钙离子的其它水溶液系统中。(也即最终发酵培养基中每1％胶液中含有钙离子浓度小于4ppm)。
发酵在温度25°～35℃范围内进行，然而为获得最佳结果，常在温度28°～32℃下进行发酵，用以培养ATCC53159菌株和生产杂多糖S-657，培养基的PH值可在6-8范围内变动。
尽管杂多糖S-657用表面培养和浸没培养都能产生，但通常都选用在浸没状态下进行发酵。
小规模的发酵可以很方便地将培养物接种入合适的营养培养基中进行，转到生产培养基中后，就让发酵在大约30℃恒定温度下，在摇床上进行数天。
发酵过程从一个灭菌三角瓶起始，通过一级或多级的种子扩大。种子阶段的培养基可以是任何合适的碳源和氮源的联合物。含种子的三角瓶在恒温摇床上，约30℃，振摇培养1～2天，或者直到培养物生长到合适为止。有些生长的培养物既可作接种二级种子用，也可接种到生产培养基中。所用中间过程的种子三角瓶培养时，基本上也以相同的方式进行扩大，也即来自上一种子阶段的一部分摇瓶培养物可被用作接种到生产培养基上的种子。被接种的三角瓶在恒温下振摇培养几天，培养结束三角瓶中内含物可通过用一种合适的醇，如异丙醇沉淀而回收。
对大规模发酵来说，通常在合适的装备搅拌器和向发酵，培养基有通气装置的发酵罐中进行。根据这种方法，营养培养基可在罐中配制，然后在加温到121℃下灭菌。等冷却后，在无菌的培养基中接入原先为生产培养生长好的种子，然后进行一段时间的发酵，例如进行2～4天，同时搅拌和或向营养培养基中通气，并维持温度在30℃。大量制备时用这个方法生产S-657，特别合适。杂多糖-S657：
由ATCC53159菌株所产生的杂多糖主要是由碳水化合物，约12％蛋白质，和约7％重量比的酰基(以0-乙酰基计算)组成，实际上不含有丙酮酸。S-657中碳水化合物部分含有大约19％葡萄糖醛酸，(据胶液的重量计算)和中性糖鼠李糖和葡萄糖，两种糖的摩尔分子比为2∶1。
乙酰基含量大约为7％，这是根据两种分离技术确定的。0.2％的S-657胶的水溶液用一种碱，即羟胺试剂处理，紧接着用酸性氯化铁试剂处理，然后进行比色分析。(参阅S.Hestrin(1949)J.Biol. Chem.180，249-261〕。这种0-酰基被鉴定为0-乙酰基，并用液相层析测定。
S-657的中性糖也用各种技术进行了测定。其中有一个方法涉及到把50毫克S-657放入1毫升1MH2SO4中，在100℃水解4小时。冷却后，加0.5毫升的3毫克/毫升浓度的木糖溶液作为内标准。样品通过加入3毫升的饱和氢氧化钡而中和，然后加二滴刚果红而氢氧化钡加入直到溶液颜色变为红色止。经过离心(转速为3000转/分，离心时间20分钟)，所有样品上清液都蒸发干燥。干的样品溶解在0.1毫升盐酸羟胺中(40毫克/毫升在无水吡啶中)，然后在90℃加热45分钟。冷却后加入0.1毫升乙酸酐，再把样品在90℃下加热处理45分钟。这些糖可通过它们相应的醛糖酸腈的(aldononitrile)乙酸盐衍生物的气一液相层析而分离，并可通过与可靠的标准物比较而鉴定和定量。(参见文献J.K.Baird，M.J.Holroyde，和D.C.Ellwood(1973)Carbohydr.Res.27，464-467〕。
这种杂多糖中各种中性糖还可通过第二种方法鉴定。该方法涉及把2毫克S-657溶解于2毫升的0.5M三氟乙酸中。样品在100℃下过夜，然后浓缩到干燥，并再溶解于2毫升水中。加氢硼化钠25毫克，2小时后溶液用Dowex50(酸型)离子交换剂处理，以后溶液pH下降到35。过滤后，浓缩溶液，并与甲醇一起共蒸馏(三次，每次甲醇加入量5毫升)。残余物溶解在1毫升的乙酐和1毫升吡啶的混合液中，在100℃保持1小时，然后浓缩。再与甲苯共馏，(三次，每次甲苯加入量5毫升)，残存物溶解于二氯甲烷中，最后用气—液相层析进行分析。
                  表1
S-657中性糖总量方法1(三个样品)    鼠李糖摩尔百分比    葡萄糖摩尔百分比
                   57                    43方法2(9个样品)          64                    36
该多糖中的葡萄糖醛酸含量是通过用17％盐酸进行脱羧反应，接着把释放的二氧化碳收集在标准氢氧化钠中进行反滴定而测定的。〔参阅文献：B.L.Browning(1967)木材化学方法，2，623-633〕。用这种脱羧方法测定三种不同S-657样品，得出它们的葡萄糖醛酸含量在17.6％-19.6％之间。
纸电泳被用来分离和鉴定上述中性化的酸水解物中所存在的糖醛酸。取多份这种样品和已知的糖醛酸标准进行纸电泳，电泳缓冲液pH为2.7，电泳时间2小时。分离后的区带谱在空气中自然干燥，然后用硝酸银染色，确定被分离的糖醛酸位置。这里唯一确定的糖醛酸位置是葡萄糖醛酸。
鉴定S-657中不含有丙酮酸是通过加1毫升浓度为2毫克/毫升的S-657溶液到一个培养用试管中，再加1毫升0.2N盐酸，在100℃反应4小时。取0.5毫升水解液样品加入0.1毫升的还原型二磷酸吡啶核苷酸(NADH)和24毫升的三乙醇胺溶液中。在分光光度计上测定光吸收，从而测定丙酮酸〔参阅文献Duckworthand Yaphe，Chem，& Ind.(1970).P747〕。没有测出丙酮酸。
通过克氏消化法进行氮元素的分析。经测定氮含量为1.5％重量比(对三个不同样品其含量值在13％-1.9％之间)。固体和灰分分析表明，S-657含有约94％重量固体物质。(91.8％-95.8％)和9％(7.8-10.3％)重量的灰分。蛋白质含量经用Lowry氏方法〔Lowry et al J.R.iol.Chem，(1951)，193，P256〕测定用小牛血清白蛋白作为标准大约有12％(7.5％-14.5％)。
甲基化作用分析是用经透析和冰冻干燥的部分纯化的S-657样品进行的。样品甲基化过程是根据Sandford & Conrad提出的方法进行的〔参阅文献.Sandford & Conrad(1966)Bio Chem，51508-1507〕这些糖的0-甲基醚衍生物作为它们的aditol acetates可通过气相层析分离，并与可靠标准品比较，用计算机鉴定。鉴定过的主要甲基化糖列于下表2中。
                 表2
甲基化S-657的水解物中所含0-甲基糖甲基化糖                        连接形式2，3，4三甲基鼠李糖              12，3二甲基鼠李糖                 1，42，4二甲基葡萄糖                 1，3，62，6二甲基葡萄糖                 1，3，4
应该知道尽管这里所述各种分析杂多糖的方法实际上是我们采用以测定上述各种组分的方法，但对有这方面技术经验的人来说可以采用其他的分析方法。运用其它分析方法会获得该杂多糖的相同特性结果，但也许在定量结果上会有所不同。
杂多糖S-657在水溶液中具有突出的特性，尤其是在低浓度下有很高的粘度，良好的温度稳定性和泡沫稳定性。正因为如此，它常用作为增稠，悬浮，乳化，稳定，润滑，成膜或结合剂。S-657在各种工业上，石油和食品应用方面都有用处。在这些方面，高粘度和良好的热稳定和泡沫稳定性是最合乎需要的。S-657特别在下面这些应用和产品上有用处。例如，粘合剂，墙壁连接结合剂，保水灰浆和胶泥，发泡剂，罐头密封剂，锅炉防垢剂，胶乳乳化，电焊条的焊剂，煮蒸食物用的糊状物，陶器的上釉和挤压，清洗剂和抛光剂，玩具，乳化液(胶乳，沥青乳液，硅酮)，银回收，种子覆盖，杀虫剂和除草剂的喷洒控制，可乳化的浓缩物和可流性杀虫剂和除草剂，烟草结合剂，含水墨水，平板制版的润板液，皮革抛光剂，水覆盖和水插种，纺织品的印染和精加工，湿部纸添加剂，湿部纸的保持和形成剂，抗滑剂，铸模松脱剂，液体树脂，浆状和包装的炸药，石油和水井钻井泥浆，石油修井液和完井液，石油增产液，化妆品，药物的悬浊溶和乳浊液。
这种胶在食品系统中也有用处。例如凝胶软糖和其它高糖含量系统，饮料类包括那些含柠檬酸的饮料，奶制品包括冰淇淋，酸牛奶，色拉调味料，干粉，蛋糕的糖衣，糖衣，糖浆，淀粉类食物，布丁，罐头食品和灭过菌的食品，面包夹心馅。
在石油井及水井的处理液和泥浆这方面，这种胶具有特别的利用价值。已经发现杂多糖S-657在水相介质中很有用，尤其是把它配制成为用作油井处理液。
油井处理液是涉及范围很广的介质，它在钻探和使用矿井(包括天然气井和油井)的不同阶段中被用在推进操作和简化操作过程上。术语“油井处理液”包括下面这些液体，如循环钻井液，修井液和完井液，取心作业用液体，增产液(水力压裂和酸化)，以及增加石油回收液。在这些液体中可能存在的一些物质包括，氯化钠，氯化钾，硫酸钡，无定形氧化硅，碳酸钙，皂土，绿坡缕石，偏硫酸钠，白雀树皮汁，木素磺化钙，石灰，硫酸钙，氯化钙，石油磺酸盐，妥尔油皂，原油和柴油、淀粉、杀生剂，以及如羧甲基纤维素，聚丙烯酰胺和聚丙烯酸酯等聚合物。值得提出的是，并非所有这些化合物都存在于一些特定液体中，相反而由油井操作工根据要完成特别工作而选用必需量的化合物。
由于在钻井过程中和钻井完成以后地层经历情况不同，要对油井处理液进行调整，或者完全换用另一种油井处理液都是可能的。
S-657具备改进悬浊液使有高粘度，热稳定和盐稳定，剪切稳定，加热后和冷却后良好的粘度恢复等方面性质，所有这些使它在油井处理液中作为一种非常理想的液流学改良剂。
具有代表性的油井处理液配方列于例4和例5，这些配方并非想作为配方的限制，而只是用S-657制备油井处理液配方的一种可能范围的建议。杂多糖S-657在这些配方中所用的量的重量比是0.01％～1.0％的范围。
S-657在低浓度具备高粘度这个特性使得这个杂多糖作为一种增强原油回收特别有效粘化剂。在这些操作中，S-657可使用的浓度范围为0.01％～0.2％(重量比)，最好在0.02％～0.1％之间。
杂多糖S-657具有特殊方面的溶液特性，这点是这个多糖物质的一个显著特征，使它与其它杂多糖类区别开来。S-657有下列方面的特性：I、液流学数据：1％STW1粘度(Brookfield，LVF) 6转/分，19500厘泊
                         60转/分，2200厘泊
                         6/60比例 8.90.1％STW粘度(Brookfield，LVF)6转/分，95厘泊(附UL联接器)II、相容性数据(Y代表相容，N代表不相容)磨绿(阴离子)相容性， 1％胶浓度，可观察，                Y亚甲兰(阳离子)相容性，1％胶浓度，可观察，               N鲸蜡基三甲基溴化铵(阳离子)相容性，胶浓度0.5％，可观察，                                  N阳离子胶乳的相容性，0.5％胶浓度，可观察，               N阳离子表面活性剂相容性，0.4％胶浓度，可观察，           NIII、功能数据海水粘度〔浓度1ppB(0.28％胶浓度)
3转/分，Fann35，〕           850厘泊温度反应测试2〔Fann50℃粘度计处于100秒-1〕
起始粘度，80°F(华氏温度)：   86厘泊
温度300°F粘度：             78厘泊(91％)
温度在300°F一小时后粘度：    63厘泊(73％)
温度冷却到80°F后粘度：       73厘泊(85％)饱和氯化钠粘度〔浓度1ppB(0.28％胶浓度)，
3转/分，Fann 35，〕           20厘泊饱和氯化钙粘度〔浓度1ppB
(0.28％胶浓度)，
3转/分，Fann35〕              10厘泊剪切稳定性(1％胶浓度)，
15分钟混合，起始粘度
(60转/分)变化百分数           2200厘泊/+16丙烯胶乳增稠〔乳胶漆，粘合剂
(聚丙烯酸)〕，0.5％胶
浓度
Brookfield粘度，60转/分
厘泊                          2250厘泊
6转/分/60转/分比例             6.9乙酸，加热(80℃二小时)，
0.5％胶浓度，
9.6秒-1时起始粘度/二小时
反应时间的变化百分数/80℃
二小时变化百分数               1000厘泊/+2/+6仅在80℃加热二小时，0.5％胶浓度，
9.6秒-1时起始粘度/变化百分数  1000厘泊/+4IV、注解和观察：1  STW代表人工组合自来水(Synthetic Tap Water之缩写)：含有1000ppm Nacl和147ppm Cacl2·2H2O化合物的去离子水。2  0.4％多聚物溶于含500ppm Na2SO3海水中。菌株特性描述：
杂多糖S-657是由野油菜黄单胞菌中一个新菌株在合适的营养培养基上发酵而制备的，用以产生这种杂多糖的微生物菌的生物纯培养，按照布达佩斯条约于1985年6月19日，以注册号ATcc53159保存在美国马里兰州，洛克菲勒美国菌种保藏中心(ATCC)。
ATCC还对S-657细菌分离株完成了分类学鉴定。鉴定是参照ATCC原先鉴定野油菜黄单胞菌的ATCC内部材料，以及已发表在文献上的各种细菌分类。这些发表的文献包括：
伯杰氏细菌分类手册1984，Vol.l Krug & Holteds，Williams & Wilkins；D.W.Dye，N.Zealand J.Med.，5，P.393-416(1962)；
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在肯定了这种黄单胞菌微生物周身性鞭毛这一特性后，查对近期文献，包括：
Palleroni，N.in Clarke，P.H.and M.H.Richmond(1975)，Genetics and Bio Chemistry ofPseudomonas.pg.5-6，Wiley & Sons；
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在评阅了这些文献之后，可以确定黄单胞菌属具有极生鞭毛的形态特征，而该特征直到最近还被认为是黄单胞菌属的典型特征，但现已大大降低了其分类上意义，因为有异常鞭毛(即侧生鞭毛)情况存在。因而由于它有很多吻合的特征所以把这种S-657菌株分类野油菜黄单胞菌种(Xanthomonas campestris)内。
很典型的一点是野油菜黄单胞菌通过纯培养发酵过程产生一种多糖胶。这种多糖胶的碳水化合物部分为葡萄糖醛酸和中性糖如葡萄糖和甘露糖。而杂多糖S-657并不是一种多糖胶，它含有葡萄糖和鼠李糖，而不含甘露糖。因此，ATCC53159是野油菜黄单胞菌中一个新的菌株，它产生杂多糖S-657。A、菌落形态特征：
在营养琼脂上，在30℃培养两天出现菌落，直径达0.5～1.0毫米。菌落园形，完整，半透明、光滑、染色后呈浅黄色。向营养琼脂中加入1％葡萄糖后，菌落变成粘胶状，园形隆起，并有光泽。B、细胞形态特征：
在营养琼脂上细胞大小约为0.8-1.0×20-30微米。以单独成对或呈长链状出现，细胞属革兰氏阴性，棒状，端部渐尖，游动很活跃，周身鞭毛。C、生理和生化特征：
下表3列出在鉴定这种微生物中所进行的许多生理和生化试验的结果。
            表3.S-657分离株的生理生化试验结果4℃培养生长             -     明胶酶                     W25℃生长                +     吐温20水解                 +30℃生长                +     吐温80水解                 +37℃生长                +     吲哚                       -41℃生长                -     西蒙氏柠檬酸盐生长          -产荧光素                -     脲酶                       -产绿脓菌素              -     硝酸盐到亚硝酸盐            -非扩散黄色素            +     硝酸盐还原                  -产黑色素                -     亚硝酸盐到氮气              -pH6.0生长               +     硫化氢(TSI)                -1％Nacl生长(+)          +     醋酸铅带                   +3％Nael生长(-)          -     赖氨酸脱羧酶               -6.5％Nacl生长           -     精氨酸(Mollers)            -MacConkey琼脂生长       -     乌氨酸脱羧酶                -脱脂乳琼脂生长          +     苯丙氨酸脱氨                -七叶苷水解              +     卯磷脂酶                   -酪蛋白水解              -     磷酸酯酶                   -淀粉水解                +     过氧化氢酶                 +在葡糖琼脂上生长粘液状          +     氧化酶                   -
                                 葡糖酸盐氧化             -0.1％TTC生长                   -     以丙二酸作为唯一         -0.02％TTC生长                  +     碳源的生长
                                 酪氨酸降解              -
                                 外消  羟基丁酸盐上       -
                                 生长
                                 对羟基苯甲醛(pHB)累积    -
                                 脱氧核糖核酸酶           W
                                 0.05溴化十六烷基三       -
                                 甲铵上生长
                                 以乙酸盐为唯一碳         +
                                 源的生长
                                 睾酮降解                 -TTC＝三苯基四唑氯化物W＝弱阳性
在斯坦尼氏的无机物基质中单一碳源试验L-阿拉伯糖                  +        L-苹果酸盐               W纤维二糖                    +        壬酸盐                   -D-果糖                      W        丙酸盐                   -D-葡萄糖                    +        奎尼酸盐                 -乳糖                        +        琥珀酸盐                 W麦芽糖                      +        L-十一酒石酸盐           -D-甘露醇               -     戊酸盐              -L-鼠李糖               -     B-丙氨酸            -D-核糖                 -     D-A-丙氨酸          -D-山梨醇               -     甜菜碱              -蔗糖                   +     甘氨酸              -海藻糖                 -     L-组氨酸            -D-木糖                 +     DL-正亮氨酸         -核糖醇                 -     L-脯氨酸            -赤藓糖醇               -     D-色氨酸            -甘油                   -     L-缬氨酸            -乙醇                   -     DL-精氨酸           -牻牛儿醇               -     苄胺                -i-肌醇                 -     丁胺                -癸二酸                 W     腐胺                -乙酰胺                 -     甲基反丁烯二酸       -乙二酸                 -     DL-甘油酸盐         -苯甲酸盐               -     L-色氨酸            -丁酸盐                 -顺甲基丁烯二酸         -D-葡糖酸盐             -M-羟基苯甲酸盐         -2-酮葡糖酸盐           -DL-乳酸盐              -
            在O-F剖养基中碳水化合物的发酵L-阿拉伯糖产酸         +       核糖醇产酸             K纤维二糖产酸           +       半乳糖醇产酸           K乙醇产酸               K       D-半乳糖产酸           +D-果糖产酸             +       菊粉产酸               KD-葡萄糖AO2产酸        +       水杨苷产酸             -D-葡萄糖-AnO2产酸      -       D-山梨醇产酸           -D-葡萄糖中的碱性pH     -甘油产酸               Ki-肌醇产酸             K乳糖产酸               +麦芽糖产酸             +D-甘露醇产酸           KD-甘露糖产酸           +核糖产酸               K蔗糖产酸               +海藻糖产酸             KD-木糖产酸             +
+＝酸性
K＝碱性
-＝没有变化
本发明包含的其它试验实例对一个在这项技术上有经验的人来说，只需稍微考虑一下上述说明就会十分明瞭的。因此，我们的意图是这些说明和所有举例仅仅被看作是一个范例，而该发明真正的包括范围和实质在下面的权利要求书中有具体说明。例1.
YM三角瓶的种子是从48小时的营养琼脂培养物放在30℃的旋转摇床就开始。大约24小时后，把这个种子接种到一个含有以3％水解淀粉作为碳源的E1培养基的三角瓶中。培养基也放在旋转摇床上30℃培养。大约72小时后，可以看到，三角瓶中有粘状液出现，当加入2倍体积的99％异丙醇后，可以见到一种纤维状沉淀出现。
E1培养基含有5克磷酸氢二钾，0.1克硫酸镁，0.9克硝酸铵，0.5克的Promosoy100(CSCD公司所售大豆粉酶解物)，30克D-葡萄糖，加1升自来水。E1培养基pH为7.6-7.8。
如上方式准备另一个YM种子三角瓶，用为在24小时后五个含有不同培养基的三角瓶接种的种子，接种后把它们放置在旋转摇床上，30℃下摇瓶培养约72小时，此时测定其pH，粘度，胶产量，产物粘度，所得结果列于表4。
                      表4    培养基对胶产量影响培养基         碳源         PH   液体粘度  胶产量  去离子水产物粘度(厘泊)  1％KCl产物粘度
                              (厘泊)     ％           1％/0.1％          1％/0.1％
                                                                           (厘泊)E1            3％水解淀粉  6.6    1700     2.12            ND1                  NDE1(NH4NO3＋0.19％NaNO3)  3％水解淀粉  6.6    345      1.86            ND                    NDE1(含有0.2％Promosoy100)   3％水解淀粉  6.6    65       2.14            ND                    NDE1            3％葡萄糖    6.6    1000     1.10            560/14                560/13E1＋全盐溶液33％水解淀粉  6.5    17502   1.20            880/33                960/32注  ND1：没有测定
  2：在用异丙醇沉淀前未利用的淀粉用葡糖淀粉酶水解；
全盐溶液3：含有下列物质的水溶液(使用时按每升培养基加1毫升使用)：
                            最终培养基中的浓度(PPm)
H3BO3                    0.05B3+
MnCl2·4H2O              0.5Mn2+
Feso4                     0.5Fe2+
Cucl2                     0.01Cu2+
Zncl2                     0.02Zn2+
Cocl2·6H2O              0.01Co2+
Na2MoO4·2H2O           0.01Mo+6
酒石酸纳                    1.8
如上面这些结果所示，最佳生长培养基是含有3％水解淀粉和全盐液的E1培养基。例2：
这个示例提供了一个大量制备杂多糖S-657的发酵步骤。
在一个含有100毫升YM肉汁培养基(Difco公司)的500毫升埃氏三角瓶中接入一整环在营养琼脂平板上生长48小时的S-657菌株细胞。该三角瓶放置在施转摇床上，振摇速度400转/分，温度30℃摇瓶培养24小时。1％的接种物接入到二个每个内含100毫升种子培养基的500毫升埃氏三角瓶中。种子培养基成分是：
葡萄糖                     3％
K2HPO4                  0.5％
NH4NO3                  0.09％
MgSo4·7H2O             0.01％
Promosoy100               0.05％
全盐溶液             1毫升/升
这个培养基用自来水配制。全盐溶液的制备是把下列这些成分加到1升的去离子水或蒸馏水中：
H3BO3                285毫克
MnCl2·4H2o          1800毫克
Feso4                 1360毫克
Cucl2                 26.9毫克
ZnCl2                 20.8毫克
CoCl2                 40.4毫克
Mg2MoO4.2H2o        25.2毫克
酒石酸钠                1770毫克
这些三角瓶在旋转摇床上培养，温度30℃，摇床转速400转/分，培养24小时，此时，把它们接种到一个五升的发酵罐中，该罐中含有终体积为3000毫升的同样成分的培养基，发酵过程控制在30℃，通气速度为1升/分，开始时搅拌速度为400转/分，然后搅拌速度加决，以保证良好的混合效果。大约24小时后，将大约2.5升这个种子再接种到70升发酵罐中，该发酵罐含有终体积为50升的下面这些物质的培养基：
葡萄糖                3.0％
K2HPO4             0.05％
NH4NO3             0.09％
MgSO4·7H2o        0.01％
Promosoy100          0.05％
全盐溶液              1毫升/升
Fe++                       1PPm
Sag5691(一种由联合          0.005％
碳化物公司生产的去泡沫剂)
将温度维持在30℃，通气速度为10升/分，发酵进行25小时后通气速度调节到20升/分。其后整个发酵过程一直维持这个通气速度。利用一个自动的PH值控制系统，按器要通过加入40％氢氧化钾控制PH大于6.0。搅拌速度起始为300转/分，25小时后增到500转/分，48小时后为750转/分，72小时后为800转/分。其后整个发酵过程都维持在800转/分。下面表5列出这个发酵结果的数据。
                   表5菌令       PH    液体粘度    胶产量(克/100毫升)   残存的碳源0小时      7.0    5厘泊             ND               3.0％25小时     6.5    230厘泊           0.51             ND48小时     6.2    960厘泊           0.80             1.2772小时     6.3    2250厘泊          1.22             0.70116小时    6.2    3550厘泊          1.64             0.24141小时    7.1    4000厘泊          1.63             0.17
在整个发酵过程中总共需要加150毫升的40％氢氧化钾溶液以控制PH值。将发酵液在约75℃下加热15分钟，然后冷却到大约30℃。在发酵液中加三倍体积99％异丙醇。这种多糖化合物以纤维状物质的形式沉淀下来，用一个筛网很容易将它回收。纤维状物质在140°F下在加强通气的盘状干燥器上干燥2.5小时，然后再把它磨成粉末。例3：
通过把某些S-657分离株的生理生化特征与按伯杰氏鉴定手册(1984)和据ATTC原先所鉴定的28个菌株结果所确定的野油菜黄单胞菌的典型特征相比较，完成了分类学鉴定。结果列于下表6。
                      表6
                   伯杰氏手册    ATCC数据     S-657分
                     (1984)                     离株七叶苷                     +            +            +来自蛋白胨的硫化氢          +                         +脲酶                       -            -            -37℃下生长                 +            +            +在0-F培养基中产酸：阿拉伯糖                   +            +            +葡萄糖                     +            +            +蔗糖                       +            +            +甘露糖                     +            +            +半乳糖                     +            +            +纤维二糖                   +            +            +果糖                       +            +            +核糖醇                     -            -            -甘露醇                     -            -            -山梨醇                     -            -            -半乳糖醇            -          -            -水杨苷              -          -            -肌醇                -          -            -菊粉                -          -            -海藻糖              +          95           -唯一碳源利用：乙酸盐              +          25           +柠檬酸盐            +          +            -萍果酸盐            +          +            +丙酸盐              +          5            -琥珀酸盐            +          +            +乳酸盐              +          40           -L-酒石酸盐          -          -            -苯甲酸盐            -          -            -
注：数字表示呈阳性的百分率。例4：
海水泥浆成分
杂多糖S-657可在油井钻探泥浆中使用。海水泥浆配方和数据如下：
S-657                        1磅
海水                         1桶(42加仑)Fann35粘度数据：
速度(转/分)          3     6    100    200    300    600
刻度显示(f1.0跳动)   7.8   8.4  12.4   14.8   17.0   22.4
粘度(厘泊)     780    420    37.2    22.2    17.0    11.2例5：
    淡水皂土泥浆
另一个含有起作用的S-657杂多糖的钻井用配方如下：
S-657                   1磅
皂土                    7磅
淡水                    1桶(42加仑)Fann35粘度数据：
速度(转/分)    3        6    100      200     300    600
 粘度(厘泊)    1160     610   48      28.2    21.6   14.5例6：
     在含盐体系中溶解性
杂多糖可溶于各种含盐体系中。1磅S-657与1桶(42加仑)的下列水溶液混合，其Fann35粘度测定如下：Fann35粘度(厘泊)数据：
转速(转/分)    3       6     100     200     300     600
淡水           1020    540   36.0    19.8    14.6    9.2
3％Kcl         920     510   42      23.7    17.6    10.4
15％Nacl       580     320   31.2    16.2    15      9.9

Claims (5)

1.非食品、饮料、调味品及非药物用途的杂多糖S-657，该杂多糖S-657的制备方法包括：
1)在25-35℃和pH6-8的条件下将微生物野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris，ATCC53159，CCTCC No.68-074)在一种液体营养培养基中通过可同化碳源的有氧发酵进行培养，并且
2)回收所述的杂多糖S-657，
该杂多糖S-657主要由碳水化合物、约12％蛋白质和以0-乙酰基计算约7％酰基所组成，碳水化合物部分含有约19％葡糖醛酸和摩尔比约为2∶1的中性糖鼠李糖和葡萄糖。
2.按照权利要求1的杂多糖S-657，其中所述可同化的碳源是一种碳水化合物。
3.按照权利要求2的杂多糖S-657，其中所述碳水化合物是一种水解淀粉。
4.按照权利要求1的杂多糖S-657，其中营养培养基实际上不含钙离子。
5.一种油井处理液，它包含水和重量为0.01％-1.0％的权利要求1所述的杂多糖S-657。
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