JPS6248702A - ヘテロ多糖s−657 - Google Patents
ヘテロ多糖s−657Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
本発明は微生物性多糖類の分野に関するものである。こ
の分野では、或種の微生物に共通する特質として細胞ヘ
テロ多糖類を産生ずることが知られている。ヘテロ多糖
類は高分子量の、一般には線状の炭水化物ポリ−7−で
あり、m合の繰り返し!e位とな−、ている2種または
多種の単糖類を含有している。 大川、の・\フルロ多糖類の有用性は水↑(l育容液の
粘度お、Iミびl、オc+ >;−を多化させる能力Q
、:基づいている。こり、aこ加えて、−\テし]多糖
類は乳濁化、)懸濁化、安定化、凝集などのような副次
的機能をも持っている。、これについては、たとえば、
米国特許第4,326,052号および第4.40L″
760号乙ご記載されている。 一2テロ多糖類は食品、さく井、農芸および広汎なその
他の産業的用途に広く使用されている。これらの水溶性
ガムに対する需要はこの数lO年間に大きく伸びた。さ
らにまた新らしい工業技術が、新らしい物性をもつヘテ
ロ多IJ!類の需要を作り出j−でいる。こうし2て、
産業上の要求に見合うさまざまな機能範囲を4)つヘテ
ロ多糖類に対するニーズは、新らたのまたさまざまの物
性をもつヘテロ多糖類の開発の必要性を示している。 本発明の[−1的は、徹りIE、吻Vザンtモナスカ2
、ベストリス(Xanthomonas (、IBpe
s tr i s )の♀斤株によって産出される新規
の一\テ0多季Jgのi7供であイ)。 本発明の別の目的は、この新型・〜・テロ多糖の製i;
シ法の提供である。またさらに他の[=1的は、−の切
1蜆化合物製造用の徽イト物類の提供である。さC′−
)に他のUJ1的はこの新規へ、う〜D多糖を含有する
調合物の擾供である。本発明のこれらのおよび他のIl
lll的上以後の記述から明らかとなろう。 主要部−一シての炭水化物、約12%のタンバイア質お
よび約′1%(O−アセチルとし7゛で計算した)のア
シル基から構成され、−その炭水化物部分は約19重量
%のグルタ1−1ン酸およびおよそ2;1のモル比に、
おける中性糖ラムノース点グルコースとを含有する新規
なヘテロ多糖が、選択された炭素源へのキザント千ナス
カムペストリスの新株の作用によって産出されることが
ここに発見されるに至った。この新規化合物はキナン[
・モナスカムペストリスの新株による適当な水性栄養培
地の好気性発酵によって産出される。 この生物の生物学的純粋培養のブタベスト条約ニ基ツ(
寄託がアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
(American Type Cu1ture C′
111ect、1on)、ロックビル、メリーランド(
Rockville、 Maryland)にたいして
1985年6月19日付けで行われ、その受入番号はA
TCC53159であった。このヘテロ多糖をここでは
ヘテロ多糖S−657と称するが、これは水性系におい
て望ましい性質をもっており、また油井処理用流体の調
合用にとくに有用である。 本発明の新規の生物は1.カリフA・ルニア州ユリーカ
(Eureka)近くの湿地から採取された藻類ザンブ
ルから単離されたものである。この生物は30℃におけ
る4日間の培養後のワイエム(YM)寒天プレートから
のガJ、状コロニーとして採取された。このm離動をつ
ぎに栄養寒天J二、において純粋培養された。 フラスコシードはこの単離物の栄養寒天培養から開始し
た。このシードをつぎに炭素源としての加水分解でんぷ
んを含む栄養培地を入れた別のフラスコへの接種に使用
した。培養後、このフラスコの内容物は粘稠なビールと
なり、イソプロピルアルコール添加時には繊維状物質が
沈殿するのが見られた。別のフラスコシートも行われ、
これはガムの製造にたいする各種の栄養培地の効宋の測
定およびこの微生物に対する最良の成育培地および発酵
条件の決定に使用した。 J1酒り条J牛。 ヘテロ多糖S−657は制御条件下、生物ATCC53
159の培養による適当な水性栄養培地の好気性発酵中
6、:生産される。この培地は同化OT能の炭素、窒素
、および無機塩類を含イイする。 一般に、炭水化物(たとえば、グルコース、フルクトー
ス、マルトース、4スクロース、キジYコース、ラクト
ースなど)は栄養培地中の同化liJ能炭素源として一
東独にまたは組み合わせて使用できる。 この培地中に利用される単数または複数の炭水化物源の
正確な量は、−・部はこの培地の他の成分によって決ま
るが、〜般に炭水化物の量は培地の約2重量%乃至5重
量%にわたる。これらの炭素源は培地中において単独に
または組み合わせて使用すればよい。 通常、多くのタンパク性物質は発酵プロセスに対する窒
素源として使用できる。適当な窒素源には、たとえば、
イースト加水分解物質、プライマリ−・イースト、大豆
ミール、綿実細粉、カゼインの加水分解物類、コーン・
ステイープ・リカー、ディスティラーズ・ソリュブル(
Distiller’55o1ubles)またはトマ
トペーストなどがある。単独または組み合わせにおける
窒素源は好ましくは水性培地の0.05重量%乃至0.
2重量%にわたる量で使用される。 この培地中に含ませることができる栄養無機塩類は、ナ
トリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、リン
酸塩、塩化物、硫酸塩、炭酸塩、などのイオンを生成で
きる慣用の塩類である。また痕跡量のコバルト、マンガ
ン、鉄およびマグネシウムのような金属も含まれる。 ここに挙げた栄養培地は単に使用できる培地の広汎さを
説明するためであって制限するつもりではない点に留意
されなければならない。 別の培地として、S−657が低カルシウムイオン条件
下で増殖できるもの、すなわち、脱イオン水または実質
的にカルシウムイオンのない(すなわち、最終発酵スー
プ中にCa”がガム1%あたり約4 ppmよりも少い
)水性系もある。 発酵は約25℃乃至35℃にわたる温度において行われ
るが、最良の成果を得るためにはこの発酵が約28℃乃
至32℃の温度で行われるのが好ましい。ATCC53
159培養を成育させ、またヘテロ多糖S−657を製
造する栄養培地のpHは約6乃至8にわたることができ
る。 S−657は表面培養、液中培養のどちらででも製造で
きるが、液中でこの発酵を行うのが好ましい。 小規模での発酵は、この培養物を適当な栄養培地へ接種
し、また製造用培地へ移したのち、振とう機上において
数日間約30°Cの一定温度でこの発酵を行うのが便利
である。 この発酵は培地を入れた殺菌フラツフの中で、1段階ま
たは多段階のシード成長を経由して開始される。このシ
ード段階用の栄養培地は炭素および窒素源のどのような
適当な組み合わせでもよい。 シードフラスコは約30°Cの定温室の中で1−2日間
、または充分に成育するまで振とうされ、得られる増殖
物の一部は第2段階シードまたは製造用培地への接種に
使用される。中間段階シードフラスコが使用される場合
、これは木質的に同じ方法によって進められる。すなわ
ち、最終シード段階からのフラスコの内容物の一部が製
造用培地への接種に使用される。接種されたフラスコは
一定温度で数日間振とうされ、この培養期間の終了時に
フラスコの内容物はイソプロパツールのような適当なア
ルコールによる沈殿化によって回収される。 大規模操作にたいしては、攪拌機およびこの発酵培地に
通気する手段を備えた適当なタンクの中で発酵を行うの
が好ましい。この方法では、栄養培地はタンク中で作成
され、また約121℃以下の温度に加熱して殺菌される
。冷却後、この殺菌された培地に製造用培養株の予め生
育させたシードを接種し、この発酵は、たとえば、2乃
至4日間のような期間、この栄養培地をかきまぜながら
、および/または通気しながら、また温度を約30℃に
維持しながら進められる。S−657を製造するこの方
法は大量生産にとくに適している。 ヘテロ 糖S−657 ATCC53159によって製造されたベテロ多塘は、
主要成分としての炭水化物、約12%のタンパク質およ
び約7重量%(O−アセチル基として計算した)のアシ
ル基から構成されており、実質的にピルビン酸を含まな
い。S−657の炭水化物置部分は約19%(ガムの重
量基4りのグルクロン酸およびおよそ2:1のモル比に
おける中性糖のラムノースとグルコースとを含有する。 約7%というアセチル含有率は2種の異なる方法によっ
て測定した。S−657ガムの0.2%水溶液をアルカ
リ性、ヒドロキシルアミン試薬によって処理し、つづい
て酸性塩化第2鉄試薬によって処理し、比色分析にかけ
た。〔ニス、ヘストリン(S、IIestrin )
(1949)ジャーナル・イン・バイオロジカルゲミ
ストリ−180,249−261頁参照)0−アシル基
ば0−アセチルとして同定し、液相クロマトグラフィに
よって測定j、また。 5 657の中性糖類は種々の方法によって分析した。 その第1の方法はLM H2SO41mj2中の50
■のS−657を100℃において4時間加水分解を行
うものである。冷却後、3■/ m 1キシロース0.
5m7!を内部標準として添加した。 飽和Ba(OH)z 3 ml、つぎに2滴のコンゴ−
L/ソド、およびさらにBa(OH)zを色が赤変する
まで添加してサンプルを中和させた。遠心分離(300
ORPMにおいて20分間)ののち、全サンプルの」二
澄液を蒸発させた。乾燥サンプルを0.1ml!のヒド
ロキシル塩酸塩(乾燥ピリジン中40■、/mff)の
中へ溶解させ、90℃において45分間加熱した。冷却
後、0.1mlの無水酢酸を添加し1、二のサンプルを
ふたたび90″Cにおいて45分間加熱した。この糖類
はそれらのアルトノニ1−リルアセテート講膚体類の気
相〜液相クロマトグラフィによって分離し、標準品と比
較して同定および定量を行った。(ジ。、イ、ゲイ、ヘ
アー ト’ (J、に、Ba1rd ) 1、J’−ム
4 ジr−イ、 ホiしc イF(Mj、Ho1roy
de) 、およびディー4 ジー、エルウッド(D、C
,Ell、wood ) (1973)カルボヒドロ
。 1/ス、 (Carbohydr、Res、) 2
j、 464−4.67頁〕 この多糖の多種の中性糖類もまた、およそ2■のS−6
57を0.7Mのトリフルオロ酢酸(2mf)の中−・
溶解させる第2の方法によって特徴づけを行った。この
サンプルを一晩中100℃に保持し、蒸発乾固させ、水
(21I11)へ溶解させた。水素化ホウ素ナトリウム
(25■)峻添加し5,2時間後にこの溶液をダウエッ
クス50(H”) (Dowex5O(H”))によっ
て処理したのちpHを3.5へ下げた。濾過後、この溶
液を濃縮し、メタノールとともに共蒸留(5mlにて3
回)した。残渣を無水酢酸(1miV、)とピリジン(
1m#)との混合物の中へ溶解させ、100℃において
1時間保持し、濃縮した。トルエンとの共蒸留(5m!
!にて3回)ののち、この残渣を塩化メチレンへ溶解さ
せ、気相一液相クロマトグラフィによって分析した。 1表 Σ〜657 U4:I(D’i!:#寸U番Uモルパー
セント モルパーセント ラムノース グルコース 第1の方法 57 43く3廿ンブル暑 第2の方法 64 36(9ナンブル) この多糖のグリクロン酸含有率は、17%塩酸による脱
カルボキシル化につづく遊離二酸化炭素の標準水酸化ナ
トリウム中−・の捕捉および逆滴定によって測定した。 〔ビー、エル2ブラウニング(B、L、Brownir
+g) (1967)木材化学の方法(Method
s of Wood Chemistry ) 2 、
632−633頁〕。この脱カルボキシル化方によるS
−657の3種の異るサンプルの値は17.6%と19
.6%との間であった。 上記の中和された酸加水分解物中にあるウロン酸類の分
離および同定にはペーパー電気泳動を使用した。このア
リコートと既知のウロン酸標準品の了りコートを電気泳
動ペーパーへかけ、pH2,7謹衝液中において2時間
電気泳動を行った。クロマ1−グラムを風乾し、硝酸銀
によって着色して分離されるウロン酸類の位置を求めた
。確認されたただ1個のウロン酸スポットはグルクロン
酸ごあると判明し7た。 ピルビン酸塩の不在は、S−657の21T1!/ m
tl?8液の1 mpを培養チューブへ添加し、また
0、2Nnc7!のl mlを添加し、i o o ’
cにおいて4時間加熱することによって測定した。加水
分解のサンプルo、 5 me ’に:0.1 meの
還元ジフォスフオピリジンヌクレオチド(NADH)お
よび2.4m1.の[リエタノールアミンの溶液へ添加
した。吸光度を分光光度計によって探知し、ピルビン酸
塩を測定したウ 〔ダックワース(Ducksorth
)およびヤフェ(Yaphe ) 、ケミストリー・
アンド・、インダストリー(1970)747頁〕、有
意曾のビルビン酸塩は検出されなかった。 窒素分析はケルダール分解によって行い、約1.5重量
%(3サンプルにたいして約1.3%と1.9%との間
)の窒素の測定値が得られた。固形分および灰分の分析
からS−657は約94重量%(91,8%−95,8
%)の固形分および9重量%(7,8%−10,3%)
の灰分を含有することが分かった。タンパク含有率は、
“標準としてウシの血清アルブミンを使用するローリイ
ら(Lowry etal、)(ジャー・ナル・イン・
バイオロジカルケミストリー(1951)、193.2
56頁〕の方法によって約12%(7,5%−14,5
%)となることが測定された。 透析および凍結乾燥後のS−657の不完全精製サンプ
ルについてメチル化分析を行った。このサンプルはスタ
ンフォードアンドコンラッド(Stanford&Co
nrad) (1966年)バイオケム(Bioch
em、) 5.1508−1507頁に概説された方
法にしたがってメチル化を行った。アジド−フレアセテ
ートとしてのこの*唐のO−メチルエーテル誘導体類を
気相クロマトグラフィによって分離し、信頼できる標準
品とのコンピュータ照合によって同定した。同定された
主要なメチル化#M類を下記の第2表に示す。 213.4Me、ラムノース 12.3 M
e、 ラムノース 1. 42+4 Me
z グルコース l、3.62+6 Me
z グルコース 1,3.4ここに述べたヘ
テロ多糖の分析法は下記組成に到達するのに実際に使用
された方法であるが、当業者にとっては他の分析法も当
然利用できることが理解される。他の分析法を利用して
もこのヘテロ多糖の同じ特性値が得られるはずではある
が、わずかに異る測定値が得られることはありうる。 ヘテロ多糖S−657は水溶液において顕著な性質、と
くにきわめて低濃度におけるきわめて高い粘度、良好な
温度安定性および良好な発泡安定性、をもつことが知ら
れている。このため増粘、懸濁、乳濁、安定、潤滑、造
膜または結合のための薬剤として有用である。S−65
7は、高粘度および良好な熱および発泡安定性が望まれ
る多種の工業、石油および食品用途に利用される。とく
にこれは下記の用途または製品として使用される:接着
剤類、壁補修セメント類、水保持グラウトおよびモルタ
ル類、スパッタリング(Spackling )コンパ
ウンド、かん封止剤類、ボイラー化合物類、ラテックス
クリーミング、溶接棒フラックス類、ブレイジングペー
スト類、セラミックうわ薬類および押し出し剤類、清浄
剤類および研磨剤類、おもちゃ類、乳濁液類(ラテック
ス、アスファルト、シリコーン樹脂)、銀回収、シード
コーティング、殺虫剤または除草剤の噴霧制御、乳濁化
可能濃縮物質および流動可能殺虫剤や除草剤類、タバコ
バインダ類、水基体インク類、リソグラフインクつぼ溶
液、皮革仕上げ剤類、ハイドロマルチング(hydro
mulching )およびハイドロシーディング(h
ydro−seeding ) 、織布印なつおよび仕
上げ製紙用ウェットエンド添加剤類、製紙用ウェットエ
ンド歩留り向上剤および製紙助剤類、すべり止めコンパ
ウンド類、離型剤類、液状樹脂類、スラリーおよびパッ
ケージ爆薬類、石油および水井戸堀さくマッド、油井改
修(workover)および仕上げ用(comple
tion)流体類、石油スティミュレーション(sti
mulation )用流体類、化粧品類、調薬上の懸
濁液類および乳濁液類。 このガムはまた、ゼリー類およびその他の多糖食品類、
クエン酸基体ドリンク類を含む飲料類、アイスクリーム
やヨーグルトを含む乳製品、サラダドレッシング類、ド
ライミックス類(dry m1xes)、砂糖ごろも類
、およびグレーズ類、シロップ類、プディング類、穀粉
製食品類、かんずめおよびレトルト食品類およびパン菓
子の中味のような食品系にも利用される。 とくに価値のある利用は石油および水井戸処理用流体類
およびマッドの分野におけるものである。 ヘテロ多糖S−657は水性媒体、とくに井戸処理用流
体に調合される水性媒体として有用であることがすでに
判明している。 井戸処理用流体類とは、ガス井または油井のような井戸
の堀さくおよび使用の諸段階中に操作を容易にするため
に使用される法尻な媒体である。 この“井戸処理用流体類”という用語は、たとえば、循
環堀さく用流体類、改修および仕上げ用流体類、コアリ
ング用(coring)流体類、およびスティミュレー
ション用流体類(水圧破砕および酸性化)および石油回
収率向上用流体類を含む。このような流体類中に含まれ
る材料には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸バリ
ウム、無定形シリカ、炭酸カルシウム、ベントナイト、
アクパルガイドメタ硫酸ナトリウム、ケブラチョウ、リ
グニンスルホン酸カルシウム、石灰、硫酸カルシウム、
塩化カルシウム、石油スルホネート、トール消石けん、
原油およびディーゼル油、でんぷん類、殺生物剤類、お
よびCMC,ポリアクリルアミド類およびポリアクリレ
ート類のようなポリマー類がある。これらの化合物類の
すべてが特定の流体中に加えられるのではなく、むしろ
、これらの化合物類は特定の仕事に必要な量だけ井戸作
業者によって選ばれることが理解されよう。井戸の堀さ
く中と堀さく後に遭遇する地下条件は異るので、井戸処
理用流体の成分調整および成る流体の他の流体との置換
は考えられることである。 S−657は、懸濁液性向上のための高粘度、耐熱性お
よび耐塩性安定性、剪断安定性、および加熱および冷却
後の良好な粘度回復性などの諸性質を示し、そのために
S−657が井戸処理用流体のレオロジー改良剤として
望ましいものであることが知られている。 代表的な井戸処理用流体の調合物は実施例4および5に
提示される。これらの調合物はS−657によって調製
できる井戸処理用流体調合の可能性範囲を示すためのも
のであってその範囲を限定するものではない。ヘテロ多
糖S−657は0.01%乃至1.0重量%の範囲にお
いて調合物に使用できる。 S−657のtfL tjM度における高粘度のため、
このヘテロ多糖は石油回収率向上用の増粘剤とじてとく
に有用なものである。S−657は0,01%乃至0.
2重量%の範囲内、好ましくは0.02%乃至0,1%
の範囲内の濃度で上記の操作に使用できる。 ヘテロ多Pi S −657は、この多糖の顕著な特性
である溶液緒特性の特別なプロファイルをもっており、
このことがS−657に他のヘテロ多糖類に比べてきわ
たった特徴を与えている。S−657は下記の諸性質を
もっている。 ■、レオロジーデータ 1%STW’の粘度 6RPM、 1950
0cp〔ブルックフィールド 60RPM、 2
200cp(Brookfield) 、LVF )
6/60比 8,90.1%STW粘度(ULアダ
プタ によるブルックフィールドLVF ) 6RPM、
95cp■、相溶性データ(相溶=Y、非相溶=N)ミ
リンググリーン(アニオン性)相溶性、1%ガム濃度、
目視 Yメチレンブルー(カチオン性
)相溶性、1%ガム濃度、目視 NC
TAB (カチオン性)相溶性、 0.5%ガム?農度、目視 Nカチオン
ラテックス相溶性、 0.5%ガム濃度、目視 Nカチオン界
面活性剤相溶性、 0.4%ガム濃度、目視 N■2機能
データ 海水粘度(I PPB(O,28%ガム濃度)、3PP
M、ファン(FANN) 35 〕850cp温度応
答試験2 〔ファン50℃粘度計100sec四において〕26.
7°C(80°F)における初期粘度 86cp140
°C(300°F)到達時の粘度 78cp (9
1χ)140℃(300’ F)で1時間後の粘度 6
3cp (73%)26.7°C(80°F)へ冷却時
の粘度 73cp (85χ)飽和NaC!!粘度(
I PPB (O,28%ガム濃度) 、3RPM、フ
ァン35J 20cp飽和CaC1、粘度CI
PPB (O,28%ガム濃度)、3RPM、ファン
35 J l0cp剪断安定性(1%ガム濃度
)、 15分間、ブレンダ、初期粘度、 (60PPM) 1%変化 2200c
p/+16アクリルラテソクス増粘〔ラテックスペイン
ト接着剤(PSA)) 0.5%ガム濃度ブルックフィ
ールド粘度、60PPM 、cp 2250cp6R
PM/60RPM 0.9酢酸+加熱(
80℃、2時間) 0.5%ガム濃度 初期粘度(9,6sec−’) /% 変化2時間、室温7%変化 2時間、80°C1000cp/+2/+6加熱だけ(
80℃、2時間)0.5%ガム濃度初期粘度(9,6s
ec−’) /%変化 1000cp/+4■、注釈
および観察 ■ 合成タップ水(Synthetic Tap Wa
ter ) :11000ppのNaClおよび14
7ppmのCaCl2・2H□0を含有する脱イオン水
。 2500ppmのNa2SO3を含有する海水中の0.
4%ポリマー。 謂」ぼJ
の分野では、或種の微生物に共通する特質として細胞ヘ
テロ多糖類を産生ずることが知られている。ヘテロ多糖
類は高分子量の、一般には線状の炭水化物ポリ−7−で
あり、m合の繰り返し!e位とな−、ている2種または
多種の単糖類を含有している。 大川、の・\フルロ多糖類の有用性は水↑(l育容液の
粘度お、Iミびl、オc+ >;−を多化させる能力Q
、:基づいている。こり、aこ加えて、−\テし]多糖
類は乳濁化、)懸濁化、安定化、凝集などのような副次
的機能をも持っている。、これについては、たとえば、
米国特許第4,326,052号および第4.40L″
760号乙ご記載されている。 一2テロ多糖類は食品、さく井、農芸および広汎なその
他の産業的用途に広く使用されている。これらの水溶性
ガムに対する需要はこの数lO年間に大きく伸びた。さ
らにまた新らしい工業技術が、新らしい物性をもつヘテ
ロ多IJ!類の需要を作り出j−でいる。こうし2て、
産業上の要求に見合うさまざまな機能範囲を4)つヘテ
ロ多糖類に対するニーズは、新らたのまたさまざまの物
性をもつヘテロ多糖類の開発の必要性を示している。 本発明の[−1的は、徹りIE、吻Vザンtモナスカ2
、ベストリス(Xanthomonas (、IBpe
s tr i s )の♀斤株によって産出される新規
の一\テ0多季Jgのi7供であイ)。 本発明の別の目的は、この新型・〜・テロ多糖の製i;
シ法の提供である。またさらに他の[=1的は、−の切
1蜆化合物製造用の徽イト物類の提供である。さC′−
)に他のUJ1的はこの新規へ、う〜D多糖を含有する
調合物の擾供である。本発明のこれらのおよび他のIl
lll的上以後の記述から明らかとなろう。 主要部−一シての炭水化物、約12%のタンバイア質お
よび約′1%(O−アセチルとし7゛で計算した)のア
シル基から構成され、−その炭水化物部分は約19重量
%のグルタ1−1ン酸およびおよそ2;1のモル比に、
おける中性糖ラムノース点グルコースとを含有する新規
なヘテロ多糖が、選択された炭素源へのキザント千ナス
カムペストリスの新株の作用によって産出されることが
ここに発見されるに至った。この新規化合物はキナン[
・モナスカムペストリスの新株による適当な水性栄養培
地の好気性発酵によって産出される。 この生物の生物学的純粋培養のブタベスト条約ニ基ツ(
寄託がアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
(American Type Cu1ture C′
111ect、1on)、ロックビル、メリーランド(
Rockville、 Maryland)にたいして
1985年6月19日付けで行われ、その受入番号はA
TCC53159であった。このヘテロ多糖をここでは
ヘテロ多糖S−657と称するが、これは水性系におい
て望ましい性質をもっており、また油井処理用流体の調
合用にとくに有用である。 本発明の新規の生物は1.カリフA・ルニア州ユリーカ
(Eureka)近くの湿地から採取された藻類ザンブ
ルから単離されたものである。この生物は30℃におけ
る4日間の培養後のワイエム(YM)寒天プレートから
のガJ、状コロニーとして採取された。このm離動をつ
ぎに栄養寒天J二、において純粋培養された。 フラスコシードはこの単離物の栄養寒天培養から開始し
た。このシードをつぎに炭素源としての加水分解でんぷ
んを含む栄養培地を入れた別のフラスコへの接種に使用
した。培養後、このフラスコの内容物は粘稠なビールと
なり、イソプロピルアルコール添加時には繊維状物質が
沈殿するのが見られた。別のフラスコシートも行われ、
これはガムの製造にたいする各種の栄養培地の効宋の測
定およびこの微生物に対する最良の成育培地および発酵
条件の決定に使用した。 J1酒り条J牛。 ヘテロ多糖S−657は制御条件下、生物ATCC53
159の培養による適当な水性栄養培地の好気性発酵中
6、:生産される。この培地は同化OT能の炭素、窒素
、および無機塩類を含イイする。 一般に、炭水化物(たとえば、グルコース、フルクトー
ス、マルトース、4スクロース、キジYコース、ラクト
ースなど)は栄養培地中の同化liJ能炭素源として一
東独にまたは組み合わせて使用できる。 この培地中に利用される単数または複数の炭水化物源の
正確な量は、−・部はこの培地の他の成分によって決ま
るが、〜般に炭水化物の量は培地の約2重量%乃至5重
量%にわたる。これらの炭素源は培地中において単独に
または組み合わせて使用すればよい。 通常、多くのタンパク性物質は発酵プロセスに対する窒
素源として使用できる。適当な窒素源には、たとえば、
イースト加水分解物質、プライマリ−・イースト、大豆
ミール、綿実細粉、カゼインの加水分解物類、コーン・
ステイープ・リカー、ディスティラーズ・ソリュブル(
Distiller’55o1ubles)またはトマ
トペーストなどがある。単独または組み合わせにおける
窒素源は好ましくは水性培地の0.05重量%乃至0.
2重量%にわたる量で使用される。 この培地中に含ませることができる栄養無機塩類は、ナ
トリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、リン
酸塩、塩化物、硫酸塩、炭酸塩、などのイオンを生成で
きる慣用の塩類である。また痕跡量のコバルト、マンガ
ン、鉄およびマグネシウムのような金属も含まれる。 ここに挙げた栄養培地は単に使用できる培地の広汎さを
説明するためであって制限するつもりではない点に留意
されなければならない。 別の培地として、S−657が低カルシウムイオン条件
下で増殖できるもの、すなわち、脱イオン水または実質
的にカルシウムイオンのない(すなわち、最終発酵スー
プ中にCa”がガム1%あたり約4 ppmよりも少い
)水性系もある。 発酵は約25℃乃至35℃にわたる温度において行われ
るが、最良の成果を得るためにはこの発酵が約28℃乃
至32℃の温度で行われるのが好ましい。ATCC53
159培養を成育させ、またヘテロ多糖S−657を製
造する栄養培地のpHは約6乃至8にわたることができ
る。 S−657は表面培養、液中培養のどちらででも製造で
きるが、液中でこの発酵を行うのが好ましい。 小規模での発酵は、この培養物を適当な栄養培地へ接種
し、また製造用培地へ移したのち、振とう機上において
数日間約30°Cの一定温度でこの発酵を行うのが便利
である。 この発酵は培地を入れた殺菌フラツフの中で、1段階ま
たは多段階のシード成長を経由して開始される。このシ
ード段階用の栄養培地は炭素および窒素源のどのような
適当な組み合わせでもよい。 シードフラスコは約30°Cの定温室の中で1−2日間
、または充分に成育するまで振とうされ、得られる増殖
物の一部は第2段階シードまたは製造用培地への接種に
使用される。中間段階シードフラスコが使用される場合
、これは木質的に同じ方法によって進められる。すなわ
ち、最終シード段階からのフラスコの内容物の一部が製
造用培地への接種に使用される。接種されたフラスコは
一定温度で数日間振とうされ、この培養期間の終了時に
フラスコの内容物はイソプロパツールのような適当なア
ルコールによる沈殿化によって回収される。 大規模操作にたいしては、攪拌機およびこの発酵培地に
通気する手段を備えた適当なタンクの中で発酵を行うの
が好ましい。この方法では、栄養培地はタンク中で作成
され、また約121℃以下の温度に加熱して殺菌される
。冷却後、この殺菌された培地に製造用培養株の予め生
育させたシードを接種し、この発酵は、たとえば、2乃
至4日間のような期間、この栄養培地をかきまぜながら
、および/または通気しながら、また温度を約30℃に
維持しながら進められる。S−657を製造するこの方
法は大量生産にとくに適している。 ヘテロ 糖S−657 ATCC53159によって製造されたベテロ多塘は、
主要成分としての炭水化物、約12%のタンパク質およ
び約7重量%(O−アセチル基として計算した)のアシ
ル基から構成されており、実質的にピルビン酸を含まな
い。S−657の炭水化物置部分は約19%(ガムの重
量基4りのグルクロン酸およびおよそ2:1のモル比に
おける中性糖のラムノースとグルコースとを含有する。 約7%というアセチル含有率は2種の異なる方法によっ
て測定した。S−657ガムの0.2%水溶液をアルカ
リ性、ヒドロキシルアミン試薬によって処理し、つづい
て酸性塩化第2鉄試薬によって処理し、比色分析にかけ
た。〔ニス、ヘストリン(S、IIestrin )
(1949)ジャーナル・イン・バイオロジカルゲミ
ストリ−180,249−261頁参照)0−アシル基
ば0−アセチルとして同定し、液相クロマトグラフィに
よって測定j、また。 5 657の中性糖類は種々の方法によって分析した。 その第1の方法はLM H2SO41mj2中の50
■のS−657を100℃において4時間加水分解を行
うものである。冷却後、3■/ m 1キシロース0.
5m7!を内部標準として添加した。 飽和Ba(OH)z 3 ml、つぎに2滴のコンゴ−
L/ソド、およびさらにBa(OH)zを色が赤変する
まで添加してサンプルを中和させた。遠心分離(300
ORPMにおいて20分間)ののち、全サンプルの」二
澄液を蒸発させた。乾燥サンプルを0.1ml!のヒド
ロキシル塩酸塩(乾燥ピリジン中40■、/mff)の
中へ溶解させ、90℃において45分間加熱した。冷却
後、0.1mlの無水酢酸を添加し1、二のサンプルを
ふたたび90″Cにおいて45分間加熱した。この糖類
はそれらのアルトノニ1−リルアセテート講膚体類の気
相〜液相クロマトグラフィによって分離し、標準品と比
較して同定および定量を行った。(ジ。、イ、ゲイ、ヘ
アー ト’ (J、に、Ba1rd ) 1、J’−ム
4 ジr−イ、 ホiしc イF(Mj、Ho1roy
de) 、およびディー4 ジー、エルウッド(D、C
,Ell、wood ) (1973)カルボヒドロ
。 1/ス、 (Carbohydr、Res、) 2
j、 464−4.67頁〕 この多糖の多種の中性糖類もまた、およそ2■のS−6
57を0.7Mのトリフルオロ酢酸(2mf)の中−・
溶解させる第2の方法によって特徴づけを行った。この
サンプルを一晩中100℃に保持し、蒸発乾固させ、水
(21I11)へ溶解させた。水素化ホウ素ナトリウム
(25■)峻添加し5,2時間後にこの溶液をダウエッ
クス50(H”) (Dowex5O(H”))によっ
て処理したのちpHを3.5へ下げた。濾過後、この溶
液を濃縮し、メタノールとともに共蒸留(5mlにて3
回)した。残渣を無水酢酸(1miV、)とピリジン(
1m#)との混合物の中へ溶解させ、100℃において
1時間保持し、濃縮した。トルエンとの共蒸留(5m!
!にて3回)ののち、この残渣を塩化メチレンへ溶解さ
せ、気相一液相クロマトグラフィによって分析した。 1表 Σ〜657 U4:I(D’i!:#寸U番Uモルパー
セント モルパーセント ラムノース グルコース 第1の方法 57 43く3廿ンブル暑 第2の方法 64 36(9ナンブル) この多糖のグリクロン酸含有率は、17%塩酸による脱
カルボキシル化につづく遊離二酸化炭素の標準水酸化ナ
トリウム中−・の捕捉および逆滴定によって測定した。 〔ビー、エル2ブラウニング(B、L、Brownir
+g) (1967)木材化学の方法(Method
s of Wood Chemistry ) 2 、
632−633頁〕。この脱カルボキシル化方によるS
−657の3種の異るサンプルの値は17.6%と19
.6%との間であった。 上記の中和された酸加水分解物中にあるウロン酸類の分
離および同定にはペーパー電気泳動を使用した。このア
リコートと既知のウロン酸標準品の了りコートを電気泳
動ペーパーへかけ、pH2,7謹衝液中において2時間
電気泳動を行った。クロマ1−グラムを風乾し、硝酸銀
によって着色して分離されるウロン酸類の位置を求めた
。確認されたただ1個のウロン酸スポットはグルクロン
酸ごあると判明し7た。 ピルビン酸塩の不在は、S−657の21T1!/ m
tl?8液の1 mpを培養チューブへ添加し、また
0、2Nnc7!のl mlを添加し、i o o ’
cにおいて4時間加熱することによって測定した。加水
分解のサンプルo、 5 me ’に:0.1 meの
還元ジフォスフオピリジンヌクレオチド(NADH)お
よび2.4m1.の[リエタノールアミンの溶液へ添加
した。吸光度を分光光度計によって探知し、ピルビン酸
塩を測定したウ 〔ダックワース(Ducksorth
)およびヤフェ(Yaphe ) 、ケミストリー・
アンド・、インダストリー(1970)747頁〕、有
意曾のビルビン酸塩は検出されなかった。 窒素分析はケルダール分解によって行い、約1.5重量
%(3サンプルにたいして約1.3%と1.9%との間
)の窒素の測定値が得られた。固形分および灰分の分析
からS−657は約94重量%(91,8%−95,8
%)の固形分および9重量%(7,8%−10,3%)
の灰分を含有することが分かった。タンパク含有率は、
“標準としてウシの血清アルブミンを使用するローリイ
ら(Lowry etal、)(ジャー・ナル・イン・
バイオロジカルケミストリー(1951)、193.2
56頁〕の方法によって約12%(7,5%−14,5
%)となることが測定された。 透析および凍結乾燥後のS−657の不完全精製サンプ
ルについてメチル化分析を行った。このサンプルはスタ
ンフォードアンドコンラッド(Stanford&Co
nrad) (1966年)バイオケム(Bioch
em、) 5.1508−1507頁に概説された方
法にしたがってメチル化を行った。アジド−フレアセテ
ートとしてのこの*唐のO−メチルエーテル誘導体類を
気相クロマトグラフィによって分離し、信頼できる標準
品とのコンピュータ照合によって同定した。同定された
主要なメチル化#M類を下記の第2表に示す。 213.4Me、ラムノース 12.3 M
e、 ラムノース 1. 42+4 Me
z グルコース l、3.62+6 Me
z グルコース 1,3.4ここに述べたヘ
テロ多糖の分析法は下記組成に到達するのに実際に使用
された方法であるが、当業者にとっては他の分析法も当
然利用できることが理解される。他の分析法を利用して
もこのヘテロ多糖の同じ特性値が得られるはずではある
が、わずかに異る測定値が得られることはありうる。 ヘテロ多糖S−657は水溶液において顕著な性質、と
くにきわめて低濃度におけるきわめて高い粘度、良好な
温度安定性および良好な発泡安定性、をもつことが知ら
れている。このため増粘、懸濁、乳濁、安定、潤滑、造
膜または結合のための薬剤として有用である。S−65
7は、高粘度および良好な熱および発泡安定性が望まれ
る多種の工業、石油および食品用途に利用される。とく
にこれは下記の用途または製品として使用される:接着
剤類、壁補修セメント類、水保持グラウトおよびモルタ
ル類、スパッタリング(Spackling )コンパ
ウンド、かん封止剤類、ボイラー化合物類、ラテックス
クリーミング、溶接棒フラックス類、ブレイジングペー
スト類、セラミックうわ薬類および押し出し剤類、清浄
剤類および研磨剤類、おもちゃ類、乳濁液類(ラテック
ス、アスファルト、シリコーン樹脂)、銀回収、シード
コーティング、殺虫剤または除草剤の噴霧制御、乳濁化
可能濃縮物質および流動可能殺虫剤や除草剤類、タバコ
バインダ類、水基体インク類、リソグラフインクつぼ溶
液、皮革仕上げ剤類、ハイドロマルチング(hydro
mulching )およびハイドロシーディング(h
ydro−seeding ) 、織布印なつおよび仕
上げ製紙用ウェットエンド添加剤類、製紙用ウェットエ
ンド歩留り向上剤および製紙助剤類、すべり止めコンパ
ウンド類、離型剤類、液状樹脂類、スラリーおよびパッ
ケージ爆薬類、石油および水井戸堀さくマッド、油井改
修(workover)および仕上げ用(comple
tion)流体類、石油スティミュレーション(sti
mulation )用流体類、化粧品類、調薬上の懸
濁液類および乳濁液類。 このガムはまた、ゼリー類およびその他の多糖食品類、
クエン酸基体ドリンク類を含む飲料類、アイスクリーム
やヨーグルトを含む乳製品、サラダドレッシング類、ド
ライミックス類(dry m1xes)、砂糖ごろも類
、およびグレーズ類、シロップ類、プディング類、穀粉
製食品類、かんずめおよびレトルト食品類およびパン菓
子の中味のような食品系にも利用される。 とくに価値のある利用は石油および水井戸処理用流体類
およびマッドの分野におけるものである。 ヘテロ多糖S−657は水性媒体、とくに井戸処理用流
体に調合される水性媒体として有用であることがすでに
判明している。 井戸処理用流体類とは、ガス井または油井のような井戸
の堀さくおよび使用の諸段階中に操作を容易にするため
に使用される法尻な媒体である。 この“井戸処理用流体類”という用語は、たとえば、循
環堀さく用流体類、改修および仕上げ用流体類、コアリ
ング用(coring)流体類、およびスティミュレー
ション用流体類(水圧破砕および酸性化)および石油回
収率向上用流体類を含む。このような流体類中に含まれ
る材料には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸バリ
ウム、無定形シリカ、炭酸カルシウム、ベントナイト、
アクパルガイドメタ硫酸ナトリウム、ケブラチョウ、リ
グニンスルホン酸カルシウム、石灰、硫酸カルシウム、
塩化カルシウム、石油スルホネート、トール消石けん、
原油およびディーゼル油、でんぷん類、殺生物剤類、お
よびCMC,ポリアクリルアミド類およびポリアクリレ
ート類のようなポリマー類がある。これらの化合物類の
すべてが特定の流体中に加えられるのではなく、むしろ
、これらの化合物類は特定の仕事に必要な量だけ井戸作
業者によって選ばれることが理解されよう。井戸の堀さ
く中と堀さく後に遭遇する地下条件は異るので、井戸処
理用流体の成分調整および成る流体の他の流体との置換
は考えられることである。 S−657は、懸濁液性向上のための高粘度、耐熱性お
よび耐塩性安定性、剪断安定性、および加熱および冷却
後の良好な粘度回復性などの諸性質を示し、そのために
S−657が井戸処理用流体のレオロジー改良剤として
望ましいものであることが知られている。 代表的な井戸処理用流体の調合物は実施例4および5に
提示される。これらの調合物はS−657によって調製
できる井戸処理用流体調合の可能性範囲を示すためのも
のであってその範囲を限定するものではない。ヘテロ多
糖S−657は0.01%乃至1.0重量%の範囲にお
いて調合物に使用できる。 S−657のtfL tjM度における高粘度のため、
このヘテロ多糖は石油回収率向上用の増粘剤とじてとく
に有用なものである。S−657は0,01%乃至0.
2重量%の範囲内、好ましくは0.02%乃至0,1%
の範囲内の濃度で上記の操作に使用できる。 ヘテロ多Pi S −657は、この多糖の顕著な特性
である溶液緒特性の特別なプロファイルをもっており、
このことがS−657に他のヘテロ多糖類に比べてきわ
たった特徴を与えている。S−657は下記の諸性質を
もっている。 ■、レオロジーデータ 1%STW’の粘度 6RPM、 1950
0cp〔ブルックフィールド 60RPM、 2
200cp(Brookfield) 、LVF )
6/60比 8,90.1%STW粘度(ULアダ
プタ によるブルックフィールドLVF ) 6RPM、
95cp■、相溶性データ(相溶=Y、非相溶=N)ミ
リンググリーン(アニオン性)相溶性、1%ガム濃度、
目視 Yメチレンブルー(カチオン性
)相溶性、1%ガム濃度、目視 NC
TAB (カチオン性)相溶性、 0.5%ガム?農度、目視 Nカチオン
ラテックス相溶性、 0.5%ガム濃度、目視 Nカチオン界
面活性剤相溶性、 0.4%ガム濃度、目視 N■2機能
データ 海水粘度(I PPB(O,28%ガム濃度)、3PP
M、ファン(FANN) 35 〕850cp温度応
答試験2 〔ファン50℃粘度計100sec四において〕26.
7°C(80°F)における初期粘度 86cp140
°C(300°F)到達時の粘度 78cp (9
1χ)140℃(300’ F)で1時間後の粘度 6
3cp (73%)26.7°C(80°F)へ冷却時
の粘度 73cp (85χ)飽和NaC!!粘度(
I PPB (O,28%ガム濃度) 、3RPM、フ
ァン35J 20cp飽和CaC1、粘度CI
PPB (O,28%ガム濃度)、3RPM、ファン
35 J l0cp剪断安定性(1%ガム濃度
)、 15分間、ブレンダ、初期粘度、 (60PPM) 1%変化 2200c
p/+16アクリルラテソクス増粘〔ラテックスペイン
ト接着剤(PSA)) 0.5%ガム濃度ブルックフィ
ールド粘度、60PPM 、cp 2250cp6R
PM/60RPM 0.9酢酸+加熱(
80℃、2時間) 0.5%ガム濃度 初期粘度(9,6sec−’) /% 変化2時間、室温7%変化 2時間、80°C1000cp/+2/+6加熱だけ(
80℃、2時間)0.5%ガム濃度初期粘度(9,6s
ec−’) /%変化 1000cp/+4■、注釈
および観察 ■ 合成タップ水(Synthetic Tap Wa
ter ) :11000ppのNaClおよび14
7ppmのCaCl2・2H□0を含有する脱イオン水
。 2500ppmのNa2SO3を含有する海水中の0.
4%ポリマー。 謂」ぼJ
【吸
ペテロ多糖S−657はキサントモナスカムペストリス
の新株である新規の微生物により適当な栄養培地の発酵
によって製造できる。本ヘテロ多糖の生産に使用される
微生物の生物学的純粋培養の、ブタペスト条約に基づく
寄託はアメリカンタイプカルチャーコレクション、ロッ
クビル、メリーランド、1985年6月19日に行われ
、その受入番号は、第ATCC53159号である。 このATCCではまた細菌単離物S−657の分類学上
の同定も行われた。ATCCによってさきに特性づけの
行われたキサントモナスカムペストリスにたいするAT
CC内部データは、ヘルゲイの系統的細菌学のマニュア
ル(Bergey’s Manualof Syste
matic Bacteriology) 1984
年、第1巻、クラゲおよびホルトm (Krug&Ho
1t eds、)、+ウィリアムズ(Williams
)およびウィルキンス(Wilkins ) ;ディ
ー、ダブリユウ、ダイ(D、W。 Dye ) 、エフ、ジーランドジェイ、メト(N。 Zealand J、Med、) 、5.393−41
6頁(1962)およびエム、ビー、スクール(M、P
。 5tarr ) 、原核生物における属キサントモナス
(The Genus Xanthomonas in
the Prokaryotes) 。 (1981)などの刊行文献において多種の分類ととも
に引用された。 このキサントモナス微生物にたいして縁毛類べん毛(p
eritrichous flagella )が確認
されたとき、クラーク、ピー9エイチ、 (C1ar
k、P、H,)およびエム、エイチ、リソチモンド(M
、Il、Richmond)(1975)、シュードモ
ナスの遺伝学および生化学(Genetics and
Biochemistry of Pseudomo
nas)5−6頁、ワイリイアンドサンズ(Wilye
y&5ons) ;パレロニ、エフ(Palleron
i、N) : ヘルゲイの系統的細菌学マニュアル(1
984)、第1巻、142頁; (Hugh、R,)
およびゲー、ギラルディ (G。 G11ardi ) :レネッテ(Lennette
) 、バローズ(Balows ) 、ハウスラー(H
ausler )およびトルアント(Truant)、
(1980)の臨床微生物学のマニュアル(Manua
l of C11nical Microbiolog
y)、290頁、米国微生物学会(American
5ocietyfor Microbiology)に
おけるハーグ、アール;バレロニ、エフ、、エム、ドー
ドロフ(M、Doudoroff)、アール、ワイ、ス
タニア−(R,Y、5tanier ) 、アール、イ
ー、ソランズ(R,E、5olanes )およびエム
、メンデル(M、Mendel) (1970) 、
ジャーナル・イン・ゼネラル・ミクロバイオロジー(J
ournal of General Microbi
ology ) 、第60巻、215−231頁;ニー
リッツ、ニス(Ulitzwr、S)、(1975)ア
ーク・ミクロバイオロジー(Arch、旧crobio
logy ) 、第104巻、285−288頁および
ジッダ、ニス、 (5hinoda。 S、)およびオカモト、ケイ (Okamoto、 K
、) (1977)、ジャーナル・イン・バクテリオロ
ジイ (Journa 1of Bacteriolo
gy ) 、第129巻、1266−1271頁、など
の最新文献を調査した。 この文献について検討した後、最近まで典型的と考えら
れていたキサントモナスの極べん毛発生(polar
flagellation)の形態学的特性は、異常(
すなわち側方)べん毛発生のケースであるため分類学上
の意義を大きく低下させるものと判断された。それゆえ
、この微生物を適切な緒特性をもつゆえにキサントモナ
スカムペストリスとして分類した。 一般にキサントモナスカムペストリスは純粋培養発酵に
よってキサンタンガムを産出する。キサンタンガムの炭
水化物部分はグルクロン酸および中性糖であるグルコー
スとマンノースとを含有する。キサンタンガムであると
は考えられないヘテロ多WS−657はグルコースとラ
ムノースとを含有するが、マンノースを含有しない。そ
こでヘテロ多this−657を産出するキサントモナ
スカムペストリスの新規な菌株がATCC53159に
よって提供される。 A、コロニーの形態学特性 栄養寒天上に、30℃における2日間で直径が約0.5
1.0 mmに達するコロニーが現われる。このコロ
ニーは円形で、金縁の、半透明で、滑らかなものであり
また色素は明黄色である。栄養寒天への1%グルコース
の添加によってこのコロニーは粘液状、ドーム形の光る
ものとなる。 B、細胞の形態学特性 この細胞の大きさは栄養寒天上では約0.8−1、 O
X 2. O−3,0μmであり、1個で、または対と
なって、または長鎖状となって現れる。この細胞はダラ
ム陰性であり、先細の末端をもち活発に動きまわる棒状
体である。べん毛は周毛性である。 C0生、掌上および生化学上の特性 この微生物の同定に使用した多数の生化学上および生理
学上の試験の結果を下記の第3表に示す。 S−657単離物にたいす。 4°C生育 − 25℃生育 + 30℃生育 + 37℃生育 + 41 ’C生育 −フルオレスセ
イン産出 − ビオシアニン産出 − 黄色非拡散色素 十 メラニン色素産出 − pH6,0生育 十1%NaCβ
生育(+)+ 3%NaC1生育(−)− 6,5%NaCI!生育 −マノクコン
ケイ寒天生育 − スキムミルク寒天生育 十 ニスキュリン加水分解 十 カゼイン加水分解 − でんぷん加水分解 十 グルコース寒天上の粘液生育 十 〇、 1%TTC生育 −〇、02%T
TC生育 十TTC=l−リフェニルーテ
トラヅリウムクロW−弱い陽性 □L−表 6生化学的および生理学的試験結果 ゲラチナーゼ Wト
イーン20加水分解 十トイ
ーン80加水分解 十インド
ール −シモンズク
エン酸塩生育 −ウレアーゼ
−硝酸塩から
亜硝酸塩へ −硝酸塩還元
−亜硝酸塩から窒
素ガスへ 一硫化水素(TSI
) −酢酸鉛ストリッ
プ +リシンデカルボ
キシラーゼ −アルギニル(モラ
ーズ) −オルニチンデカル
ボキシラーゼ −フェニルアラニン脱
アミノ化 −レシチナーゼ
−フォスファターゼ
−力タラーゼ
+オキシダーゼ
−グルコネート酸化
−3O8としてのマロネート上
の生育 −チロシン分解
−dJ−ヒドロキシブチレート生育
−PHB蓄積
−デオキシリボヌクレーゼ
WO005%セトルイミド(cetriw
ide)上の生育 −8O8としてのアセテート上
の生育 十テストステロン分解
−リド 本発明の他の実施態様は本明細書から考えれば当業者に
は明らかであろう。したがって本明細書および諸実施例
は例示だけであり、本発明の真の範囲および精神は特許
請求の範囲によって示されると了解されたい。 実施M↓ ジャイロータリイ振とう機にかけた30℃における48
時間栄養寒天培養からYMフラスコシードを開始した。 およそ24時間後、このシードを炭素源として3%の加
水分解でんぷんをもつE1培地を含有するフラスコへの
接種に使用した。この培地も30℃においてジャイロー
クリイ振とう機にかけた。およそ72時間後、このフラ
スコは粘稠なビール(beer)をもっているのが見ら
れ、2倍量の99%のイソプロピルアルコールを添加す
ると繊維状の沈殿が見られた。 E1培地は5gのリン酸2カリウム、0.1gの硫酸マ
グネシウム、0.9gの亜硝酸アンモニウム、0.5g
のブロモソイ100 (Promosoy 100
)〔セントラル・ツヤ・ケマージー・ディビジョン(C
eutral 5oya Chemurgy Divi
sion)から販売されている大豆ミールの酵素消化物
)、30gのデキストロースおよび1リツトルのクソプ
水を含有する。E1培地のpiは約7.6−7.8であ
る。 上記の方法によって他のYMシードフラスクを調製し2
4時間後に種々の培地を含有する5個のフラスコへ接種
し、これらのフラスコをジャイロータリイ振とう機上3
0℃において72時間培養し、そのときのpi(、粘度
、ガム収率および生成物粘度を測定した。結果を下記の
第4表に示す。 ガム産出にたいする ビ 培 地 炭素源 pH粘
E、 3%グルコース
6.6 1000’ND:測定せず 2未利用でんぷんはイソプロピルアルコールによる沈殿
化のまえコホール塩類:下記のものを含む(1mj!/
j!培地にて使用する最終培地中の濃度(ppa+ ) HJO30,05B” MnC1、−41,00,5Mn” Fe5Ot 0.5Fe*tCuCl z
O,01Cu”ZnCl z
0.02Zn”CoCl z・611zo
0.0ICo”NaJoOt・2tlz0 0.0
1Mo”酒石酸ナトリウム 1.8 培地の効果 2.12 ND NDl、8
6 N D N D2.14
ND NDl、IQ
560/14 560/131.20
880/33 960/32にグ
ルコアミラーゼによって加水分解した。 )水溶液 上記の結果から分かるように最良の生育培地は3%の加
水分解でんぷんおよびホーレ塩類(IloLeSalt
s )を含むE、である。 実施例2 大量のヘテロ多糖S−657を製造する発酵法を使用す
る100mj!のYMブロス〔ジフコ(Difco))
を含有する500n7!の三角フラスコへ48時間栄養
寒天プレートからのループのS−657の細胞を接種し
た。このフラスコを40゜rpmに設定し7たジャイロ
ータリイ振とう機の上で30℃において24時間培養し
た。つぎに1%の接種材料を作成し、各100m/のシ
ード培地を含有する2個の500mf三角フラスコへ分
けた。 このシード培地は、 グルコース 3 % に2HPO40,5% NHaNO:+ 0.09%Mg
5Oa・7H200,01% ブロモソイ100 0.05%ホーレ・塩類
1mβ/lを含有していた。 この培地はタップ水によって調製した。ホーレ塩類は1
リツトルの脱イオン水または蒸留水へ下記の諸成分を添
加して調製した。 IhBo、 285■MnC
it 2 ・41120 1800mg
FeSO41360mg CuC(! z 26.9+n
gZnC7!z 20.8nw
CoC7!z 40.4ngM
gJOO4・2Hz0 25.211N酒
石酸ナトリウム 1770■400rpmに
おけるジャイロータリイ振とう機上30℃において24
時間これらのフラスコを培養し、この時点でそれらを3
000mj2(最終容量)の同じ培地を含有する5リツ
トルの発酵器への接種に使用した。この発酵は30°C
および11Jットル/分の通気速度において制御した。 かくはん400rpmから開始し、その後良好な混合を
確保するため増大させた。24時間後、およそ2.5リ
ツトルのこのシードを50リツトル(最終容量)の下記
の培地を含有する70リツトル発酵器への接種※こ使用
した。 グルコース 3.0 %に2HPO,
0,05% Nl14NOi o、 09%M
gSO4・7H20o、 01% ブロモソイ100 0.05%ホーレ塩類
1mff/AFe”
1 ppmサグ5691 (Sag5691) 〔ユニオンカーバイド(Union Carbide)
から入手した消泡剤)0.05% 温度は30℃に維持し、また通気速度はこの発酵の25
時間までは10リットル/分とし、この時点で20リッ
トル/分に調整した。この速度は発酵の残余期間中その
ままとした。pHは40%KOHの添加により、必要に
応じて自動pH制御系を使用して6.0よりも上に調整
した。かくはんは初期には300rpmに設定し、25
時間後には550rpmへ、48時間後には750rp
mへ、また72時間後には800rpmへ上げた。残余
の発酵時間は800 rpmのままとした。この発酵の
結果を下記の第5表に示す。 第5表 時間1)Hビールの ガム収率 残 存粘度 (g
/100m l ) 炭素源0時間 7.0 5
cp ND 3.0%25時間 6.5
230 cp O,51N048時間 6.2
960 cp O,801,2772時間 6.
3 2250 cp 1..22 0.701
16時間 6.2 3550 cp 1.64
0.24141時間 7.1 4000 cp
1.63 0.1.7この発酵期間中のpl+の制
御に合計150m1の40%KOHを使用した。この発
酵母液をおよそ75℃に15分間加熱してから、およそ
30°Cにまで冷却した。この発酵母液へ3倍量の99
%イソプロパツールを添加した。多糖は繊維状物質とし
て沈殿し、これはふるいを使用して容易に回収できた。 このセンイ状物は粉砕して粉末とするまえに強制空気ト
レイ乾燥機中で60“c(140’F)において2.5
時間乾燥させた。 実施例3 分類学上の同定は、この単離S−657の若干の生理学
上および生化学上の緒特性と、ゲルヘルの1984年マ
ニュアルにおいてまたATCCによってすでに特定化さ
れた28株特性化の結果について同定されたキサントモ
ナスカムペストリスの代表緒特性との比較によって行わ
れた。結果を下記の第6表に示す。 聾さ c++1+ +++++++11 冊の Q。 Oヘ ト1+ 1+ +++++++111 くτト = ; 州づ e 呻榊区 べべべ自自自 ・9 づulべに区III++1 h −6”? a ’HべI I +−’−七二、、L
44二八10費胎nロ\へシへ11111 へ−Lト5J (z +さ全へへ心ロ全二へさにトート
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10 へ + + 十 寸 111 l
l + + + + + +
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1 It’−’−−’−妖 1 ムへ 1 セ
ムトハロjllムセ・吟I+)(槃 ・き・\・きコく蜀1トΔ1℃、き1トヘト姦自p−z
凶Δのや二Δ 口 へへ 1 八〇G’xh’er
Y’−C)ト”:’+””;S”+1−−コi(Rの
養ス」u」1 盪述で璽djル又批 ヘテロ多#Ms−657を油井堀さく用のマッドに使用
する。海水マッドにたいする調合およびデータを下記に
示す。 S−6570,45kg (1ポンド)海水
15!IM!(1バーレル、42ガロン)ファン35粘
度データ 速度(RPM) 3 6 100 200
300 600ダイアルの読み (fL O,Z、プリング) 7.88.4 12.4
14.8 17.0 22.4粘度(cp)
780420 37.222.2 17.0 11.
2実施炭】 新鮮水ベントナイトマッド 他の堀さく用調合においてヘテロ多Its−657は下
記のような機能を発揮する。 S−6570,45kg (1ポンド)ヘントナイト
約3.2kg(7ポンド)新鮮水 159f
(1バーレル)ファン35粘度データ 速度(RPM) 主 工 、辿虹 晟 赳虹 靭虹
粘度(cp) 1160 610 48 28.2
21.6 14.5実施±工 隻jjj塞臘」醪度 ヘテロ多糖は多種の塩含有系に溶解する。 0.45kg(1ポンド)のS−657を下記の159
β (1バーレル、42ガロン)の・水性成分と混合し
、フアン35粘度を下記のように測定する。
の新株である新規の微生物により適当な栄養培地の発酵
によって製造できる。本ヘテロ多糖の生産に使用される
微生物の生物学的純粋培養の、ブタペスト条約に基づく
寄託はアメリカンタイプカルチャーコレクション、ロッ
クビル、メリーランド、1985年6月19日に行われ
、その受入番号は、第ATCC53159号である。 このATCCではまた細菌単離物S−657の分類学上
の同定も行われた。ATCCによってさきに特性づけの
行われたキサントモナスカムペストリスにたいするAT
CC内部データは、ヘルゲイの系統的細菌学のマニュア
ル(Bergey’s Manualof Syste
matic Bacteriology) 1984
年、第1巻、クラゲおよびホルトm (Krug&Ho
1t eds、)、+ウィリアムズ(Williams
)およびウィルキンス(Wilkins ) ;ディ
ー、ダブリユウ、ダイ(D、W。 Dye ) 、エフ、ジーランドジェイ、メト(N。 Zealand J、Med、) 、5.393−41
6頁(1962)およびエム、ビー、スクール(M、P
。 5tarr ) 、原核生物における属キサントモナス
(The Genus Xanthomonas in
the Prokaryotes) 。 (1981)などの刊行文献において多種の分類ととも
に引用された。 このキサントモナス微生物にたいして縁毛類べん毛(p
eritrichous flagella )が確認
されたとき、クラーク、ピー9エイチ、 (C1ar
k、P、H,)およびエム、エイチ、リソチモンド(M
、Il、Richmond)(1975)、シュードモ
ナスの遺伝学および生化学(Genetics and
Biochemistry of Pseudomo
nas)5−6頁、ワイリイアンドサンズ(Wilye
y&5ons) ;パレロニ、エフ(Palleron
i、N) : ヘルゲイの系統的細菌学マニュアル(1
984)、第1巻、142頁; (Hugh、R,)
およびゲー、ギラルディ (G。 G11ardi ) :レネッテ(Lennette
) 、バローズ(Balows ) 、ハウスラー(H
ausler )およびトルアント(Truant)、
(1980)の臨床微生物学のマニュアル(Manua
l of C11nical Microbiolog
y)、290頁、米国微生物学会(American
5ocietyfor Microbiology)に
おけるハーグ、アール;バレロニ、エフ、、エム、ドー
ドロフ(M、Doudoroff)、アール、ワイ、ス
タニア−(R,Y、5tanier ) 、アール、イ
ー、ソランズ(R,E、5olanes )およびエム
、メンデル(M、Mendel) (1970) 、
ジャーナル・イン・ゼネラル・ミクロバイオロジー(J
ournal of General Microbi
ology ) 、第60巻、215−231頁;ニー
リッツ、ニス(Ulitzwr、S)、(1975)ア
ーク・ミクロバイオロジー(Arch、旧crobio
logy ) 、第104巻、285−288頁および
ジッダ、ニス、 (5hinoda。 S、)およびオカモト、ケイ (Okamoto、 K
、) (1977)、ジャーナル・イン・バクテリオロ
ジイ (Journa 1of Bacteriolo
gy ) 、第129巻、1266−1271頁、など
の最新文献を調査した。 この文献について検討した後、最近まで典型的と考えら
れていたキサントモナスの極べん毛発生(polar
flagellation)の形態学的特性は、異常(
すなわち側方)べん毛発生のケースであるため分類学上
の意義を大きく低下させるものと判断された。それゆえ
、この微生物を適切な緒特性をもつゆえにキサントモナ
スカムペストリスとして分類した。 一般にキサントモナスカムペストリスは純粋培養発酵に
よってキサンタンガムを産出する。キサンタンガムの炭
水化物部分はグルクロン酸および中性糖であるグルコー
スとマンノースとを含有する。キサンタンガムであると
は考えられないヘテロ多WS−657はグルコースとラ
ムノースとを含有するが、マンノースを含有しない。そ
こでヘテロ多this−657を産出するキサントモナ
スカムペストリスの新規な菌株がATCC53159に
よって提供される。 A、コロニーの形態学特性 栄養寒天上に、30℃における2日間で直径が約0.5
1.0 mmに達するコロニーが現われる。このコロ
ニーは円形で、金縁の、半透明で、滑らかなものであり
また色素は明黄色である。栄養寒天への1%グルコース
の添加によってこのコロニーは粘液状、ドーム形の光る
ものとなる。 B、細胞の形態学特性 この細胞の大きさは栄養寒天上では約0.8−1、 O
X 2. O−3,0μmであり、1個で、または対と
なって、または長鎖状となって現れる。この細胞はダラ
ム陰性であり、先細の末端をもち活発に動きまわる棒状
体である。べん毛は周毛性である。 C0生、掌上および生化学上の特性 この微生物の同定に使用した多数の生化学上および生理
学上の試験の結果を下記の第3表に示す。 S−657単離物にたいす。 4°C生育 − 25℃生育 + 30℃生育 + 37℃生育 + 41 ’C生育 −フルオレスセ
イン産出 − ビオシアニン産出 − 黄色非拡散色素 十 メラニン色素産出 − pH6,0生育 十1%NaCβ
生育(+)+ 3%NaC1生育(−)− 6,5%NaCI!生育 −マノクコン
ケイ寒天生育 − スキムミルク寒天生育 十 ニスキュリン加水分解 十 カゼイン加水分解 − でんぷん加水分解 十 グルコース寒天上の粘液生育 十 〇、 1%TTC生育 −〇、02%T
TC生育 十TTC=l−リフェニルーテ
トラヅリウムクロW−弱い陽性 □L−表 6生化学的および生理学的試験結果 ゲラチナーゼ Wト
イーン20加水分解 十トイ
ーン80加水分解 十インド
ール −シモンズク
エン酸塩生育 −ウレアーゼ
−硝酸塩から
亜硝酸塩へ −硝酸塩還元
−亜硝酸塩から窒
素ガスへ 一硫化水素(TSI
) −酢酸鉛ストリッ
プ +リシンデカルボ
キシラーゼ −アルギニル(モラ
ーズ) −オルニチンデカル
ボキシラーゼ −フェニルアラニン脱
アミノ化 −レシチナーゼ
−フォスファターゼ
−力タラーゼ
+オキシダーゼ
−グルコネート酸化
−3O8としてのマロネート上
の生育 −チロシン分解
−dJ−ヒドロキシブチレート生育
−PHB蓄積
−デオキシリボヌクレーゼ
WO005%セトルイミド(cetriw
ide)上の生育 −8O8としてのアセテート上
の生育 十テストステロン分解
−リド 本発明の他の実施態様は本明細書から考えれば当業者に
は明らかであろう。したがって本明細書および諸実施例
は例示だけであり、本発明の真の範囲および精神は特許
請求の範囲によって示されると了解されたい。 実施M↓ ジャイロータリイ振とう機にかけた30℃における48
時間栄養寒天培養からYMフラスコシードを開始した。 およそ24時間後、このシードを炭素源として3%の加
水分解でんぷんをもつE1培地を含有するフラスコへの
接種に使用した。この培地も30℃においてジャイロー
クリイ振とう機にかけた。およそ72時間後、このフラ
スコは粘稠なビール(beer)をもっているのが見ら
れ、2倍量の99%のイソプロピルアルコールを添加す
ると繊維状の沈殿が見られた。 E1培地は5gのリン酸2カリウム、0.1gの硫酸マ
グネシウム、0.9gの亜硝酸アンモニウム、0.5g
のブロモソイ100 (Promosoy 100
)〔セントラル・ツヤ・ケマージー・ディビジョン(C
eutral 5oya Chemurgy Divi
sion)から販売されている大豆ミールの酵素消化物
)、30gのデキストロースおよび1リツトルのクソプ
水を含有する。E1培地のpiは約7.6−7.8であ
る。 上記の方法によって他のYMシードフラスクを調製し2
4時間後に種々の培地を含有する5個のフラスコへ接種
し、これらのフラスコをジャイロータリイ振とう機上3
0℃において72時間培養し、そのときのpi(、粘度
、ガム収率および生成物粘度を測定した。結果を下記の
第4表に示す。 ガム産出にたいする ビ 培 地 炭素源 pH粘
E、 3%グルコース
6.6 1000’ND:測定せず 2未利用でんぷんはイソプロピルアルコールによる沈殿
化のまえコホール塩類:下記のものを含む(1mj!/
j!培地にて使用する最終培地中の濃度(ppa+ ) HJO30,05B” MnC1、−41,00,5Mn” Fe5Ot 0.5Fe*tCuCl z
O,01Cu”ZnCl z
0.02Zn”CoCl z・611zo
0.0ICo”NaJoOt・2tlz0 0.0
1Mo”酒石酸ナトリウム 1.8 培地の効果 2.12 ND NDl、8
6 N D N D2.14
ND NDl、IQ
560/14 560/131.20
880/33 960/32にグ
ルコアミラーゼによって加水分解した。 )水溶液 上記の結果から分かるように最良の生育培地は3%の加
水分解でんぷんおよびホーレ塩類(IloLeSalt
s )を含むE、である。 実施例2 大量のヘテロ多糖S−657を製造する発酵法を使用す
る100mj!のYMブロス〔ジフコ(Difco))
を含有する500n7!の三角フラスコへ48時間栄養
寒天プレートからのループのS−657の細胞を接種し
た。このフラスコを40゜rpmに設定し7たジャイロ
ータリイ振とう機の上で30℃において24時間培養し
た。つぎに1%の接種材料を作成し、各100m/のシ
ード培地を含有する2個の500mf三角フラスコへ分
けた。 このシード培地は、 グルコース 3 % に2HPO40,5% NHaNO:+ 0.09%Mg
5Oa・7H200,01% ブロモソイ100 0.05%ホーレ・塩類
1mβ/lを含有していた。 この培地はタップ水によって調製した。ホーレ塩類は1
リツトルの脱イオン水または蒸留水へ下記の諸成分を添
加して調製した。 IhBo、 285■MnC
it 2 ・41120 1800mg
FeSO41360mg CuC(! z 26.9+n
gZnC7!z 20.8nw
CoC7!z 40.4ngM
gJOO4・2Hz0 25.211N酒
石酸ナトリウム 1770■400rpmに
おけるジャイロータリイ振とう機上30℃において24
時間これらのフラスコを培養し、この時点でそれらを3
000mj2(最終容量)の同じ培地を含有する5リツ
トルの発酵器への接種に使用した。この発酵は30°C
および11Jットル/分の通気速度において制御した。 かくはん400rpmから開始し、その後良好な混合を
確保するため増大させた。24時間後、およそ2.5リ
ツトルのこのシードを50リツトル(最終容量)の下記
の培地を含有する70リツトル発酵器への接種※こ使用
した。 グルコース 3.0 %に2HPO,
0,05% Nl14NOi o、 09%M
gSO4・7H20o、 01% ブロモソイ100 0.05%ホーレ塩類
1mff/AFe”
1 ppmサグ5691 (Sag5691) 〔ユニオンカーバイド(Union Carbide)
から入手した消泡剤)0.05% 温度は30℃に維持し、また通気速度はこの発酵の25
時間までは10リットル/分とし、この時点で20リッ
トル/分に調整した。この速度は発酵の残余期間中その
ままとした。pHは40%KOHの添加により、必要に
応じて自動pH制御系を使用して6.0よりも上に調整
した。かくはんは初期には300rpmに設定し、25
時間後には550rpmへ、48時間後には750rp
mへ、また72時間後には800rpmへ上げた。残余
の発酵時間は800 rpmのままとした。この発酵の
結果を下記の第5表に示す。 第5表 時間1)Hビールの ガム収率 残 存粘度 (g
/100m l ) 炭素源0時間 7.0 5
cp ND 3.0%25時間 6.5
230 cp O,51N048時間 6.2
960 cp O,801,2772時間 6.
3 2250 cp 1..22 0.701
16時間 6.2 3550 cp 1.64
0.24141時間 7.1 4000 cp
1.63 0.1.7この発酵期間中のpl+の制
御に合計150m1の40%KOHを使用した。この発
酵母液をおよそ75℃に15分間加熱してから、およそ
30°Cにまで冷却した。この発酵母液へ3倍量の99
%イソプロパツールを添加した。多糖は繊維状物質とし
て沈殿し、これはふるいを使用して容易に回収できた。 このセンイ状物は粉砕して粉末とするまえに強制空気ト
レイ乾燥機中で60“c(140’F)において2.5
時間乾燥させた。 実施例3 分類学上の同定は、この単離S−657の若干の生理学
上および生化学上の緒特性と、ゲルヘルの1984年マ
ニュアルにおいてまたATCCによってすでに特定化さ
れた28株特性化の結果について同定されたキサントモ
ナスカムペストリスの代表緒特性との比較によって行わ
れた。結果を下記の第6表に示す。 聾さ c++1+ +++++++11 冊の Q。 Oヘ ト1+ 1+ +++++++111 くτト = ; 州づ e 呻榊区 べべべ自自自 ・9 づulべに区III++1 h −6”? a ’HべI I +−’−七二、、L
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l + + + + + +
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Y’−C)ト”:’+””;S”+1−−コi(Rの
養ス」u」1 盪述で璽djル又批 ヘテロ多#Ms−657を油井堀さく用のマッドに使用
する。海水マッドにたいする調合およびデータを下記に
示す。 S−6570,45kg (1ポンド)海水
15!IM!(1バーレル、42ガロン)ファン35粘
度データ 速度(RPM) 3 6 100 200
300 600ダイアルの読み (fL O,Z、プリング) 7.88.4 12.4
14.8 17.0 22.4粘度(cp)
780420 37.222.2 17.0 11.
2実施炭】 新鮮水ベントナイトマッド 他の堀さく用調合においてヘテロ多Its−657は下
記のような機能を発揮する。 S−6570,45kg (1ポンド)ヘントナイト
約3.2kg(7ポンド)新鮮水 159f
(1バーレル)ファン35粘度データ 速度(RPM) 主 工 、辿虹 晟 赳虹 靭虹
粘度(cp) 1160 610 48 28.2
21.6 14.5実施±工 隻jjj塞臘」醪度 ヘテロ多糖は多種の塩含有系に溶解する。 0.45kg(1ポンド)のS−657を下記の159
β (1バーレル、42ガロン)の・水性成分と混合し
、フアン35粘度を下記のように測定する。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、主要部としての炭水化物、約12%のタンパク質お
よび約7%(O−アセチルとして計算した)のアシル基
を含み、その炭水化物部分は約19%のグルクロン酸お
よび2:1のモル比の中性糖類ラムノースおよびグルコ
ースを含有することを特徴とするヘテロ多糖S−657
。 2、微生物キサントモナスカムペストリス、ATCC5
3159の生物的純粋培養株。 3、微生物キサントモナスカムペストリス、ATCC5
3159を含み、その培養株は好気性発酵によって回収
可能量のヘテロ多糖S−657を産出できることを特徴
とする培養株。 4、水性栄養培地中での同化可能炭素源の好気性発酵に
よる微生物キサントモナスカムペストリス、ATCC5
3159の増殖およびヘテロ多糖S−657の回収を含
むことを特徴とするヘテロ多糖S−657の製造方法。 5、同化可能炭素源が炭水化物である特許請求の範囲第
4項に記載の方法。 6、炭水化物が加水分解されたでんぷんである特許請求
の範囲第5項に記載の方法。 7、栄養培地が実質的にカルシウムイオンを含まない特
許請求の範囲第4項に記載の方法。 8、水性栄養培地中での同化可能炭素源の好気性発酵に
よる微生物キサントモナスカムペストリス、ATCC5
3159の増殖およびヘテロ多糖S−657の回収を含
むことを特徴とするヘテロ多糖S−657の製造方法に
よって製造された製品。 9、水および約0.01重量%乃至約1.0重量%のヘ
テロ多糖S−657を含むことを特徴とする井戸処理用
流体。
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