DK143906B

DK143906B - Fremgangsmaade til fremstilling af amylase ved dyrkning af en streptomycesstamme i et naeringssubstrat der indeholder carbon- og nitrogenkilder

Info

Publication number: DK143906B
Application number: DK521171AA
Authority: DK
Inventors: Y Koaze; Y Nakajima; H Hidaka; T Niwa; T Adachi; K Yoshida; J Ito; T Niida; T Shomura; M Ueda
Original assignee: Meiji Seika Kaisha
Priority date: 1970-10-27
Filing date: 1971-10-26
Publication date: 1981-10-26
Also published as: NL175071C; DE2166121C3; DE2153232C3; DE2166121A1; DE2167078B1; CA973492A; US3868464A; DK143906C; NL175071B; DE2167078C2; NL7114799A; GB1377223A; DE2153232B2; FR2110070A5; DE2166121B2; DE2153232A1

Description

143906

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af amylase ved dyrkning af en Streptomycesstamme i et næringssubstrat, der indeholder carbon- og nitrogenkilder, og fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at 5 man i et næringssubstrat med et C/N-forhold på mellem 10/1 og 30/1, fortrinsvis ca. 20/1, under aerobe betingelser og ved en temperatur på mellem 28 og 35°C, fortrinsvis ca. 35°C, dyrker en stamme af Streptomyces albus (FRI 604) , Streptomyces aureofaciens (FRI 606) , Streptomyces hygroscopicus (FRI 602), 10 Streptomyces hygroscopicus var. angustomyceticus (FRI 607), Streptomyces viridochromogenes (FRI 603), Streptomyces fla-vus (FRI 605) eller Streptomyces tosaensis (FRI 601) og efter dyrkning imellem 3 og 5 døgn fjerner det dannede mycelium og af det således vundne dyrkningssubstrat isolerer et amylase-15 holdigt produkt ved udsaltning med et uorganisk salt eller ved udfældning med et med vand blandbart organisk opløsningsmiddel og tørring af bundfaldet til fremstilling af et råenzym i pulverform, eller ved adsorption på en ionbytterhar-piks og påfølgende eluering derfra, hvorefter man om ønsket 20 renser det vundne amylaseprodukt ved at opløse det i vand, dialysere den vandige opløsning og underkaste den søjlekroma-tografering på en harpiks, fortrinsvis på en med epichlorhydrin tværbundet dekstrangel.

Det er kendt at fremstille amylase ved dyrkning af stammer af 25 Streptomyces i et næringssubstrat indeholdende carbon- og nitrogenkilder. Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstilles en hidtil ukendt amylase, som har høj temperaturbestandig-hed, og som bevirker en høj maltosedannelse, hvilket belyses nærmere i det følgende.

30 De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendte Streptomyces-stammer er angivet i tabel 1 nedenfor.

143906 2 i (1)

G P

0 0) a s tt) g ro cm m

CM CM CM CM III

1 G r~~ r-' r*- i''

• 10 H f—I Η H

CJ tP CM CM CM CM

U G

gl ·Ρ S p tn tn

G

•iH

P

0) a 0 a 0)

• P

hcdh cm n -¾1 m co t" • go o o o ooo pj g CD CO CO CO co coco • 2

a G

tn 0) -μ - 0) tn i tn = o <l) oo 0) G in >t > o-Hin o id -p (Ud) g <D >icm >iE g g 4> q

hi g tn r^gtntji g o 0) -P

0) X5 tn P o G O tt) oo ΟΛ O id in o cn

G-Htu 4) id t! o 4) id -P >i G

d οή a ag --η ri as * 11 tn ^ g &>

¢) o 1' « a) in ^ in i tu —* m tn o G

XJ P Xi oo p Xi H a P -P H 00 0) G G Id — ΰ o in 04J flco * co 4) co ολή p m G h co [3 σι 0 co -P σι -d G h 4) in 0 a) — 1 η h tntDHG tt) id o p 00 ·π G S' P arG-P'-' fl) t) > ^ -P 'ϋ < <d

OflJtDOCOtU t) G 0) 0) XI — 01 >

HnJO lp S -P cm G 0) g P cm di CD

1 p tn G tn tu -H tn XI * σι Oil tn a η τ) s a) g x: ί> Ό λ a) xi in ^ = oo >iEh in g co dot) o in a) c g m o c >1 o g = Go

•P g g <1) -H -H p -P - O -P XI H tn HO 0) -P

mm g c a h x: xi = pH xio i-pg -pa •P p 0) id OGtn >1 XlGgH a a G oo in in 4) p o d) a) - tn o u ο to 0) g do

GipHcotu in χ! Λ = ο 0Όΐη=·Ρ—» Ptn tniptn <D tt) -rn Ο -P ιηΗ Ό -P to pel in 4-> X! GOO nj oio ·ρ p goo -P tntutuco g co id > α) p in 0) G 0) id tj! p O +J -P P P tt) 4-) 4) σι XI |S id P tn OO-Ptn+J >1 o> in CD XJ -P 0) G 0) Ο Η ΗΌ —» H G >i 4-) 0) X! H tt) X! OO > (I) O <d ^ cd <l) -P -—- cpitJX! p p tu Ό tutnipp a) tn tpffl g h moot! tngGgo tngog o in -Pco tntntn Q) H M-ι G ·Ρ O) g Ο O -P ^ (!) E E O tp C31 tt) X! 0) cn 0) 0) Q) OO -P O G -p G S! —* O Id O G ΟΌ Otn>H ooo >1 tn -P Η in >1+) Oj-P cm >i4-> p -p I >i-P 0> '—' >i >t >i g-P ao) g in O-Pflcn g in X! +) H co g-PP ggg

Η Ο 4) Ο > Ο Ο O fliui Ο U O id P- O GM ‘ OOO

tt) Hod) Η 4-> ID 10 C Η H 4)fl)OCGCO 4)Q)inCM 4)4)4)

Hg agtnop aco h ^ a g ό p axi <d aaa <ug O) g id xl XI tt)Gp(l)a Q) G ·Ρ 0) G 0) (U-PXIO 0)0)0)

Λ id p idti G in potnxian p Ο P xl ο Ό P G PPP

Id 4) 4J4Jaa)(D 4) T3 >t Eh CO 4) Ό -P Eh ^0 ·Ρ 4-> P P -P 4) 4) 4)

Eh to cocnotnA co—,G = = cm co ^- > = = in co a) tt) X3 cococo 3 143906 I tabel 1 er: F.R.I. en forkortelse af "Fermentation Research Institute",

Agency of Industrial Science & Technology of Ministry of International Trade & Industry of Japan, Inage, Chiba 5 City, Japan.

ATCC. en forkortelse af American Type Culture Collection, Washington D.C., U.S.A.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstilles en amylase, der har følgende enzymatiske karateristika og virk-10 ninger: den optimale aktivitet findes i pH-området 4,5-5,0-for stivelsesubstrat, graden af hydrolyse af stivelse med enzymet er mindst 75% af den teoretiske maltosemæng-de, forholdet mellem glucose og maltose, frembragt af stivelse ved den hydrofytiske virkning af dette enzym, er 15 højst 0,06/1, beregnet på vægtbasis.

Det ovenstående udsagn: "graden af hydrolyse af stivelse med dette enzym er mindst 75% af den teoretiske maltose-mængde" betyder, at reagerer en tilstrækkelig amylase-mængde med stivelsessubstrat i det optimale pH-amråde og 20 under optimale temperaturbetingelser, så vil hydrolysen af stivelsen vedblive, indtil der er dannet mindst 75% af den maltose, der teoretisk kan fås af stivelsessubstratet, forudsat at mængden af reducerende sukkerarter, der frigøres fra stivelsen under hydrolysen, bestemmes ved 25 titrering efter Somogyi og beregnes som maltose,

De særlige enzymatiske virkninger og karakteristika for amylasen, der fremstilles ved fremgangsmåder^ ifølge opfindelsen, er angivet i tabel 2 nedenfor.

4 143906 I > > > > > > > Ό irt -Η -Η -Η ·Η ·Η -Η Ή 0 ·Η +1+)+1 +)+)+)+! g Μ £ (d(d(ti id id id id QQ (TitTiOi (JitJitJiiJi tnd'a <u tu ø <u i) <u m § aac ccac ®i >>> >>>> > S c· Ή ·Η ·Η ·Η Η ·Η ·Η -Η .3 § +1+1+1 +1+)+)+) +ι ϋ ή id id id td id id id iriiritnCri

cp3g a) <0 <U OJ OJ CD CD

° ·* GGG GGGG

1 -I

id I

g (D i-l___ o o o o oo o ri ft 3 U vo vo vo vo vovo vo

+) g +>0 I I I 1 II I

ao Ido o o o o o o o Οΐ — in in m in mm in

Éd I

<U +1 H tn I tr> Η H iB ø +1 id > ε ø ε _

Sh »id

Φ 0 01 a Η H i—I H HH H

ri u ·* ·· ·· ·· ·· · ·· O 5 in oo ' oo m ro Hoo m j3d Hi ®t| m in in m mm m ΜΟωωωο o o o oo o Ο Μ O 0 U «- » - - - fe a U +> Λ o o o o oo o τ!

id i I

n a) >i tn m M g 0) Η ·Η id tn ø > >i > T3 vw r-l ·γ1 β 3

0 +1 -H 00 V0CVJ OiTiVOOV

S-ι in tr> 0 t'' t-· oo oo r· r* T3 d c! a >1+1 0 -H id K m > fin æ a +)

H OOO OOOO

idø · * s girt mmm mmmm

H old III I I I I

+)^1 mmm mmmm a s * ^ i- *· ^ " OO ^ "st*

G I

0 i i i 0 ω in w 0 o o 2 id P 0 G G -h > a iH AMtnen G <d w

>1 H P >1 >1 *rl H

g idid +! r£ in > +i 0 · 0 > in in in in g +) in in in 0

i—i øø 0 øidøømøøG

•h oo o o>ooøoo

+1 >i>i >i >1 >1 >t >|M

cm εε gø8«iggøgg-H

Μ OOinOGOGOOinOOM

ι-Ι 0 +)+>G+)0+>0+>4J04J+>£ 0 τι a a 0 a-π a-w m a ε a a ø æ r-i 0 ø-η øaøaø 00 0 ο id 0 *rl G GO GO MOtrSHM g gw ti w +i+)0+io+ioG+i+:+)+,o cn cn+i cη in w in id wo w w +> 5 143906

Den kendsgerning, at den ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede amylase har optimum ved en relativt lav pH-værdi og ved en høj temperatur samt en relativt høj hydrolysegrad for stivelse og et lavt glucose/maltose-for-5 hold, er meget fordelagtig, når amylasen anvendes til kommerciel fremstilling af maltose ud fra stivelse. På grund af det relativt lave pH-optimum og det høje temperaturoptimum kan hydrolyse af stivelse ske under betingelser, der hindrer forurening af forsukringsblandingen ved vækst af uønskede 10 mikroorganismer. Den relativt høje hydrolysegrad for stivelsen medfører en mere fuldstændig omsætning og effektivitet, og det lave glucose/maltoseforhold, der findes efter hydrolysen, er ensbetydende med en effektiv, dominerende dannelse af maltose, hvorfor fremstillingen af maltose kan gennem-15 føres glat, og maltoseudbyttet forøges betydeligt sammenlignet med det, der opnås med de kendte amylaser.

Stremptomyces tosaensis nov. sp. (deponeret henholdsvis hos F.R.I. under F.R.I.-deponeringsnummer 601 og hos ATCC under ATCC.-deponeringsnummer 21723) er en mikroorganisme, der før-20 ste gang er isoleret fra jord i forbindelse med den foreliggende opfindelse. Stammens mikrobiologiske egenskaber beskrives nu i detaljer. 1

Morphologiske karakteristika (1) Luftmycelium: dette dannes rigeligt i syntetiske 25 næringssubstrater, såsom glucose- asparagin-agar, stivelse-syntetisk agar, og er almindeligvis kort, énakset forgrenet. Mycelie-enderne er formet i spiraler (luk-30 kede).

6 143946 (2) Sporer: disse har en oval eller elliptisk til cylindrisk form, og sporestørrelsen er fra 0,6-0,7 micron til 0,8-1,0 micron. Sporernes overfla-5 destruktur er glat.

2. Egenskaber i forskellige næringssubstrater.

Oplysninger om Streptomyces tosaensis nov. sp.-kulturerne findes i tabel 3 nedenfor.

Tabel 3 10 Næringssubstrat Vækst Luftmycelium Opløseligt pigment

Saccharose- Meget ringe Meget sparsomt. Intet

Czapek's agar vækst, far- hvidt (dyrket ved veløs 28°C) 15 Glycerol- Meget ringe Meget sparsomt, Intet

Czapek’s agar vækst, far- hvidt (dyrket ved veløs 28°C)

Krainsky's Brun til Rigeligt, grønt Intet 20 glucoseaspa- rødligbrun, til grågrønt, raginagar væksten med hvide plet- (dgrket ved trænger ind ter 28°C) i agaren

Ushinsky's God vækst, Grønt til grå- Svagt rød- 25 glucose- rødligbrun grønt, med ligbrunt asparagin- hvide til lyseagar (dyrket røde pletter ved 28°C)

Calcium-malat- Sparsom Sparsomt, grå- Intet 30 agar (dyrket vækst,far- liggrønt ved 28°C) veløs

Glycerol- Sparsom Sparsomt, Intet calcium-malat- vækst, hvidt agar (dyrket flødefarvet 35 ved 28°C) 7 143906

Tabel 3 (fortsat) Næringssubstrat Vækst Luftmycelium Opløseligt pigment

Stivelse- God vækst, Rigeligt, Intet syntetisk agar brun til grønt til grå- 5 (dyrket ved 28 C) rødligbrun ligt, med hvi de og rosa pletter

Almindelig agar Gulligbrunt Intet Intet (dyrket ved 28¾) 10 Næringsagar God vækst, Sparsomt, Intet (dyrket ved 2ePc) svagt brunt hvidt rynket

Pepton-glucose- Svagt gullig- Intet Intet agar (dyrket brun 15 ved 28°C)

Tyrosin-agar Rødligbrun Gråt Rødligbrunt (dyrket ved 2^0

Kartoffelprop Ophøjetf god Intet Intet (dyrket ved 2(Pc) vækst, svagt 20 grålig fløde farvet, men rødligbrun øverst på det skrå stykke 25 Gulerodsprop Svagt grålig Grønt til Intet (dyrket ved 28¾) flødefarvet gråliggrønt

Skummetmælk Ringformet Intet Intet (dyrket ved 37¾) vækst, svagt gulligbrun 30 Æg (dyrket Sparsom Intet Intet ved 37 C) vækst, svagt gul

Loeffler's koa- Sparsom Intet Intet gulerede serum- vækst, svagt 35 medium (dyrket gråliggul ved 28°C)

Glucose- Ringformet Intet Intet

Czapek's opløs- vækst, flø- ning (dyrket defarvet 40 ved 28°C)

Gelatinesubstrat Svagt fløde- Intet Intet (dyrket ved20°C) farvet

Cellulosesub- Ingen vækst strat (dyrket 45 ved 28°C) 8 143906 3. Fysiologiske egenskaber

Dannelse af melanin negativ

Fremstilling af hydrogensulfid negativ

Fremstilling af tyrosinase negativ 5 Reduktion af nitrat positiv

Hydrolyse af stivelse positiv

Peptonisering af skummetmælk positiv

Koagulering af skummetmælk negativ

Opløsning af Loeffler's koagule-10 rede serum negativ

Gelatinesmeltning positiv

Hydrolyse af cellulose negativ 4. Udnyttelse af carbonkilder (1) Udnyttelse: xylose, glucose, galactose, 15 maltose, lactose, raffinose, dekstrin, stivelse, glycerol, mannitol, natriumacetat, natriumcitrat, natriumsuccinat, salicin og mannose.

20 (2) Tvivlsom udnyttelse: arabinose og saccharose.

(3) Ingen udnyttelse: rhamnose, fructose, inulin, dulcitol, sorbitol, inositol og cellulose.

De ovennænvte mikrobiologiske karakteristika for Streptomyces 25 tosaensis nov. sp. kan sammenfattes således: luftmyceliet frembringer et antal spiraler. Sporerne har en glat overflade. På syntetiske næringssubstrater dannes grønne til grågrønne luftmycelier på brun til rødligbrun vækst, uden at der dannes opløseligt pigment. På den anden side fås på 30 organiske næringssubstrater gulligbrun til rødligbrun vækst, men sparsom, med undtagelse af en grøn vækst på gulerods-prop. Opløselige pigmenter frembringes i almindelighed ikke, undtagen et rødligbrunt opløseligt pigment på tyrosin-agar-substratet. Stammen er derfor ikke-kromogen.

143906 9

Stammen karakteriseres i hovedsagen af, at den ikke er kro-mogen og giver et grønt luftmycelium. Kendte arter af mikroorganismer, der har lignende mikrobiologiske karakteristika, kan identificeres efter Waksman's "The Actinomycetes", 5 bind 2 (1961). Således er Streptomyces prasinus, Strepto-myces hirsutu^. Streptomyces prasinopilosus, Streptomyces viridans, Streptomyces alboviridis, Streptomyces viridis og Streptomyces glaucus alle arter, der ligner mikroorganismen Streptomyces tosaensis nov. sp. Imidlertid kan den 10 skelnes fra disse kendte arter, som beskrevet nedenfor.

(1) Overfladen af sporerne fra Streptomyces prasinus og Streptomyces hirsutus er tornet, medens Streptomyces tosaensis nov. sp.'s sporer er glatte.

(2) Overfladen af sporerne fra Streptomyces prasinopilo-15 sus er håret, medens Streptomyces tosaensis nov. sp.'s sporer er glatte.

(3) Streptomyces viridans har grøn til olivengrøn vækst på glycerol·· Czapek's agar og giver et grønt til olivengrønt opløseligt pigment både på glycerol- Czapek's agar 20 og på kartoffelprop, hvorimod Streptomyces tosaensis nov. sp. har en brun til rødligbrun vækst på agarsubstrat, men ikke giver opløseligt pigment på kartoffelprop.

(4) Streptomyces alboviridis giver gult opløseligt pigment på glucose-asparagin-agar og grønligbrunt opløseligt pig- 25 ment på gelatinesubstrat, mørkner kartoffelprop og koagulerer skummetmælk. Medens Streptomyces tosaensis nov. sp. hverken giver opløseligt pigment på glucose-asparagin-agar eller på gelatinesubstrat, ikke mørkner kartoffelprop og ej heller koagulerer skummetmælk.

30 (5) Streptomyces viridis danner ikke spiraler, men har en grøn vækst på diverse agarsubstrater, og luftmyceliet er normalt gråt. Modsat har Streptomyces tosaensis nov. sp.

ίο 143906 mange spiraler og brun til rødligbrun vækst på diverse agarsubstrater, og luftmyceliet er grønt til grågrønt.

(6) Streptomyces glaucus har brunt opløseligt pigment på saccharose- Czapek's agar, danner grønt luftmycelium på 5 næringsagar og kartoffelprop samt har god vækst på cellulosesubstrat. Modsat danner Streptomyces tosaensis nov. sp. intet opløseligt pigment på saccharose, Czapek's agar, danner kun lidt luftmycelium på næringsagar og kartoffelprop og har ingen vækst på cellulosesubstrat.

10 Blandt de kendte stammer af Streptomycesslægten er der relativt få mikroorganismer, der er ikke-kromogene, men har et grønt luftmycelium ligesom Streptomyces tosaensis nov. sp. Ved den ovenstående sammenligning af de kendte stammer og mikroorganismen Streptomyces tosaensis nov. sp.

15 findes der ikke stammer, der er identiske med mikroorganismen Streptomyces tosaensis nov. sp., blandt de kendte arter af Streptomycesslægten. Som en følge heraf er det rimeligt at antage, at Streptomyces tosaensis nov. sp. er en hidtil ukendt art. Den ukendte mikroorganisme kaldes 20 Streptomyces tosaensis. Stammen blev isoleret fra en jordprøve, der blev optaget i Kouchipræfekturet, Japan.

Egenskaberne af Streptomyces flavus (deponeret i P.R.I. under deponeringsnummeret 605) beskrives i det følgende.

1. Morfologiske egenskaber 25 (1) Luftmycelium: Sporoforerne er lange, alminde ligvis ingen spiraler, selv om nogle åbne spiraler kan dannes. Konidier dannes ved knopskydning og opdeling af hyfer i ellipsoid form.

(2) Sporer: Sporerne er ovale og måler 1,2 mikron.

30 Overfladestrukturen af sporerne er glat.

143906 11 2. Egenskaber på forskellige kulturmedier.

Ku1turmed ium Vækst Luftmycelium Opløseligt pigment

Saccharose- gult på over- strågult intet nitrat-agar fladen, gul- 5 lig farve

Glucose-aspa- svovlgult hvidt til gråt intet ragin-agar bliver brunt mod midten

Stivelsesagar cremefarvet grå farve intet 10 med lyserød tone Næringsagar gråt udbredt lidt hvidt intet

Kartoffelskive gul farve gråt intet

Egenskaberne af Streptomyces aureofaciens (deponeret i 15 F.R.I. under FRI deponeringsnummeret 606) er som følger: 1. Morfologiske egenskaber (1) Luftmycelium: Hvidt, bliver brunligt-gråt til mørkt, brungråt efter 5 til 10 dage.

Sporoforerne er lige og bøjelige? 20 ingen spiraler.

(2) Sporer: Sporerne er kugleformede til ellip tiske med største diameter 1,5 mikron. Overfladestrukturen af sporerne er glat.

25 2. Egenskaber på forskellige kulturmedier:

Kulturmedium Vækst Luftmycelium Opløseligt pigment

Saccharose- lysgul lidt hvidt, svagt brun- nitrat-agar lysegråt ligt

Glucose-aspara- klar til orange- hvidt til svagtgulligt 30 gin-kødekstrakt-gul eller blålig-askegråt agar rød—brun Næringsagar transparent til intet intet brunlig farve 35 Kartoffelagar lys orangegul intet intet til brunrød og blåligrød 12 143906

Streptomyces hygroscopicus var. angustomyceticus (deponeret i F.R.I. under FRI deponeringsnummeret 607) er en mikroorganisme, der også er kendt som stammen 6A-704, og som er beskrevet i The Journal of Antibiotics, Ser. A, 5 Vol VII, nr. 4 aug. 1954, p. 116-119. Egenskaberne af Streptomyces hygroscopicus var. angustomyceticus er kort som følger: 1. Morfologiske egenskaber: (1) Luftmycelium: Hyferne er lange, forgrenede og 10 diameteren er fra 0,8 til 1,0 mikron.

Der forefindes adskillige spiraler, smalle og sædvanligvis korte, lukkede.

(2) Sporer: Sporerne er ellipsoide og størrel- 15 sen er 0,8 - 1,0 x 1,0 - 1,2 mikron.

Overfladestrukturen af sporerne er glat eller undertiden rynket.

2. Egenskaber på forskellige kulturmedier:

Kulturned ium Vækst Luftmycelium Opløseligt pigment 20 Saccharose- foldet vækst lidt hvidt til intet nitrat-agar hvidt til askegråt cremefarvet

Glucose-aspara- farveløs hvid farve intet gin-agar 25 Stivelsesagar farveløs hvid til intet lysegrå farve Næringsagar lysgul intet eller intet lidt hvidt

Kartoffelskive cremefarvet hvid farve intet 30 Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan anvendes et næringssubstrat, som f.eks. indeholder et eller flere af følgende stoffer: opløselig stivelse, glucose og kornmel som carbonkilde; 143906 13 og et eller flere af følgende: affedtet sojabønnemel; affedtet bomuldsfrømel, hvedekim, jordnøddemel, gæringsmedier, fiskemel, tørgær, skummetmælk, casein, maltekstrakt, gærekstrakt; natriumnitrat og kaliumnitrat som nitrogen-5 kilde.

Desuden kan der anvendes og inkorporeres et eller flere uorganiske salte, såsom kaliumdihydrogenphosphat, magnesiumsulfat, mangar^sulfat, ferrisulfat og calciumcarbonat, i næringssubstratet samt, om nødvendigt, sporelementer for at 10 fremskynde mikroorganismens vækst og forøge enzymproduktionen.

Por at udvinde amylasen kan næringssubstratet eller næringsvæsken, hvori dyrkningen af Streptomyces-stammen er sket, behandles på kendt måde. Næringsvæsken filtreres for at 15 fjerne mycellumkagen, hvorefter filtratet enten kan underkastes udsaltning ved tilsætning af vandopløselige, uorganiske salte, såsom ammoniumsulfat, eller der kan foretages en udfældning ved tilsætning af med vand blandbare, organiske opløsningsmidler, såsom ethanol, methanol, iso-20 propylalkohol og acetone, eller der kan adsorberes/elueres på en ionbytterharpiks, således at amylasen skilles fra næringssubstratet. Den fraskilte amylase kan yderligere behandles ved spray-tørring, varmluft-tørring, vakuumtørring, frysetørring eller lyofilisering, hvorved der fås et 25 råpulver af amylase.

Dette råpulver kan renses efter sædvanlige rensningsmåder for enzymer. Et elektrofopetisk homogent, rent amylasepul-ver fås ved rensning af råpulveret efter nedennævnte metode. Næringsvæsken, hvori Streptomycesdyrkningen har fundet sted, 30 filtreres, hvorved der fås kulturfiltrat (15 liter), hvortil der sættes ethanol, indtil ethanolkoncentrationen er 60% (vol/vol), således at der sker en udfældning. Det udfældede drænes og tørres, og herved fås et pulver (100 g), der ekstraheres under omrøring med 2 liter ledningsvand.

35 Blandingen filtreres, og ekstraktionsresten bortkastes.

14 U3306

Til filtratet sættes calciumacetat (44 g), hvorpå blandingen filtreres, og bundfaldet bortkastes. Det nu fremkomne filtrat mættes 30% med ammoniumsulfat, og blandingen filtreres for yderligere at skille bundfaldet fra.

5 Det derved opnåede mættes 70% med ammoniumsulfat, og der fås et bundfald. Dette optages i 260 ml ledningsvand og dialyseres mod rindende ledningsvand. Den dialyserede opløsning koncentreres ved fordampning under reduceret tryk og lyofiliseres derpå. Det lyofiliserede pulver 10 (1,21 g) underkastes nu søjlekromatografi på DEAE-

Sephadex'A-50 (søjlekapacitet: 4,8 x 54 cm). (DEAE-Sephadex A-50 er et kommercielt tilgængeligt gel-filtreringsmiddel fra firmaet Pharmacia Co., Sverige, og det indeholder en dekstrangel, der er tværbundet med epi-15 chlorhydrin). Denne kromatografering sker ved at hælde en vandig opløsning af 700 g lyofiliseret pulver på søjlen, der er pufret med en pufferopløsning, der består af en 0,005 molær tris-hydroxymethylamino-methan, saltsyre og 0,001 molær calcium (pH 8,5). Først elueres søjlen 20 med den samme pufferopløsning, dernæst med den samme pufferopløsning, der nu yderligere indeholder 0,05 molær natriumchlorid, og til sidst med den samme pufferopløsning, blot indeholdende 0,1 molær natriumchlorid. De aktive eluatfraktioner, der har høje amylasekoncentrationer, 25 hældes sammen (440 ml). De forenede fraktioner koncentreres ved fordampning under reduceret tryk, og koncentratet herfra dialyseres mod destilleret vand og lyofiliseres; det fremkomne produkt er på 61 mg. Dette underkastes igen søjlekromatografi på DEAE-Sephadex A-50 (søjlekapacitet 30 1,15 x 33 cm) ved at hælde en vandig opløsning af 45 mg af det ovennævnte produkt på søjlen og eluere denne, først med en pufferopløsning, der består af 0,005 molær tris-hydroxymethylaminomethan og saltsyre (pH 8,5) og derpå med en 0,05 molær vandig natriumchloridopløsning og 35 sidst med en.0,1 molær vandig natriumchloridopløsning.

De aktive eluatfraktioner, der indeholder høje amylasekoncentrationer, samles. Fraktionsblandingen (40 ml) .15 143906 koncentreres ved fordampning under reduceret tryk, og koncentratet dialyseres mod destilleret vand og lyofilise-res, hvorved der fås 24 mg pulver, der er det elektroforetisk homogene og rene amylaseprodnkt.

5 At dette lyofiliserede amylaseprodukt er et enkelt og rent stof bekræftes ved et udføre en elektrofopese på celfulose-acetatgel på følgende måde; gelen mættes med en pufferop*· løsning, der består af trie-hydroxymethylaminOmethan og saltsyre (pH 8,7; 0,05y). Ved gennemgang af en el-strøm 10 på 0,6 mAmp/cm i 65 minutter og farvning af det enzymatiske protein med Schwartz's aminoopløsning, viser det sig, at prøven vandrer 2,2 cm mod den positive side, og at der fås et enkelt bånd.

Den omtalte amylase, der er opnået ud fra en Streptpmyces 15 hygroscopicuskultur og renset efter ovennævnte rensningsmetode, har egenskaber, der gennemgås i detaljer nedenfor.

1. Enzymatisk virkning.

Omsættes et rent amylasepræparat, der er fremstillet ved hjælp af Streptomyces hygroscopicus, med stivelse henholds-20 vis amylose, vil kulhydraterne hydrolyseres i betydeligt omfang, idet der dannes små mængder glucose og relativf store mængder maltose, som vist nedenfor.

Tabel 4

Relativ mængde af sukkerprodukter 25 Substrat Hydrolysegrad Glucose Maltose Jialtooligo-' ~ saccharfder

Stivelse 74,8% 3,2% 58,2% 3&,6%

Amylose 78,6% 0 62,8% 34,9% "Hydrolysegraden" angivet i tabel 4 er bestemt ved at omsætte amylasen i 20 timer og ved 50°C med et substrat, 30 der har pH lig 5,5-5,8 og substratkoncentrationen 1% (amylasen doseres med 500 forsukringsenheder pt. 1 g substrat) 16 143906 og bestemme totalmængden af fremstillede, reducerende sukker-arter efter somogyi's titreringsmetode og beregne den analyserede totalmængde som maltose, "Hydrolysegraden" er da

totalmængden af dannede reducerende sukker-5 arter, beregnet som maltose_ χ 10Q

stivelsesmængden, beregnet som maltose hvor "stivelsesmængden, beregnet som maltose" bestemmes ved fuldstændig hydrolyse af substratet, idet dette opvarmes sammen med en tilstrækkelig mængde 2 N saltsyre på et vandbad ved 100°C, hvorpå reaktionsblandingen neutrali-10 seres med natriumhydroxid, og den dannede glucosemængde bestemmes efter Somogyi, hvorefter glucosemængden omregnes til maltose, dvs. glucosemængden gange 0,95 sættes til "stivelsesmængden, beregnet som maltose".

"Relativ mængde af sukkerprodukter" bestemmes ved frak-15 tionering af de hydrolyserede produkter fra substrat, idet hver isoleret sukkerkomponent bestemmes særskilt og angives i vægtprocent.

2. Substratspecificitet.

Reagerer et rent amylasepræparat, der er fremstillet ved 20 hjælp af Streptomyces hygroscopicus, med forskellige substrater, fås de i tabel 5 viste resultater.

Tabel 5 17 143906

Dannede sukkerarter

Substrat Forsukrings- G^ G^ G4 G,.

Opløselig stivelse 100% + +++ ++ + + 5 Majsstivelse 92,8% + +++ ++ + +

Glycogen 45,8% - +++ ++ + +

Amylose 106,5% - +++ ++ - +

Dekstrin 91,0% + +++ ++ + + β-Cyclodekstrin - - - + 10 α-Cyclodekstrin - + - - +

Maltohexaose - ++ + + -

Maltopentaose -++++-

Maltotetraose + ++ +

Maltotriose - 15 Maltose

Phenyl-a-D-glucosid "Forsukringsgraden" angivet i tabel 5 bestemmes i en sådan skala, at "hydrolysegraden" for opløselig stivelse sættes til 100% for en given mængde ren amylase.

20 "Dannede sukkerarter" bestemmes papirkromatpgrafisk for de enkelte arter efter reaktion mellem enzymet og substratet ved pH 5,5 i 1 time ved 40°C, idet substratkoncentrationen er 0,8% og enzymets koncentration 0,00017%.

I tabel 5 betyder bogstaverne G^, Gg, G^, G4 og hepholds-25 vis glucose, maltose maltotriose, maltotetraose og maltopentaose. Skalaen har følgende betydning: +++ : Der findes en meget stor mængde af sukkerarten ++ : Der findes en stor mængde af sukkerarten + : Der findes noget af sukkerarten' 30 + : Der findes spor af sukkerarten - : Der findes intet af sukkerarten.

18 143906

Den omtalte amylase prøves på samme måde med andre substrater, f.eks. glucan, såsom laminaran (araban β-1,3:β-1,6 = 7:3), pachyman (β-1,3) og dekstran (tilgængelig som Sephadex G-100, a-1,6), men det viser sig, 5 at disse glucaner ikke hydrolyseres af amylasen.

3. Optimal pH, stabil pH og andre egenskaber.

Den omtalte rene amylase fra Streptomyces hygroscopicus har pH-optimum, pH-stabilitet, temperatur-optimum og termisk stabilitet, molvægt og andre enzymkemiske, fysiske 10 og kemiske egenskaber, som vist i tabel 6 nedenfor og vist grafisk i figurerne 1-5 på tegningen.

Tabel 6

Egenskaber_Værdi_

Optimum pH for aktivitet 4,5-5,0 15 Optimum temperatur for

aktivitet 50-60 C

pH-stabilitet Den resterende enzymatiske aktivitet er mindst 90% af den oprindelige, efter enzy- 20 met er behandlet ved 40°C i 1 time ved pH 4,5-9,8

Termisk stabilitet Den resterende enzymatiske aktivitet er mindst 50%, efter enzymet er behandlet 25 ved pH 6,8 i 15 minutter

ved 30-95°C

Specifik aktivitet Omdannelsesstyrke: 23100 enheder/mg N Forsukringstyrke:

30 59600 enheder/mg N

Elementæranalyse C 44,87%, H 6,84%, N 13,84%

Molvægt ca. 35.000 (bestemt ved gel filtrering)

1 CL

Ultraviolet absorption Elcm = 13,1 ved 280 πιμ (pH = 6,8) 35 Isoelektrisk punkt ca. pH 4,3 (målt ved elektro- forese)

Elektroforese (i cellu- En vandring på 2,2 cm mod lose-acetat-gel) den positive side efter 65 minutters el-strøm på 0,8 mAmp/cm, under anven- 143906 19

Tabel 6 (fortsat)

Egenskaber _Værdi_ delse af en tris-saltsyre-pufferopløsning (indstilling 5 til pH 8,7) (y = 0,05)

Under henvisning til tegningen viser fig. 1 den enzymatiske aktivitet (ordinat) i afhængighed af pH (absqisse) for den omtalte amylase, der fås fra Strepto-myces hygroscopicys. Bestemmelsen sker således: aktiviteten 10 er her forsukringsaktiviteten, og den bestemmes under følgende betingelser: indstilling af reaktionsblandingens pH til 2-3 ved hjælp af Q,1 M natriumacetat-saltsyre-pufferopløsning, derpå til pH 3,5-6,0 ved hjælp af 0,1 M acetatpuf feropløsning og endelig til pH 6,5-8,0 ved hjælp af 15 0,1 M phosphorsyre-natriumphosphat-pufferopløsning.

Fig. 2 viser den enzymatiske aktivitets pH-stabllitet (enzymatisk aktivitet er ordinat, pH er abscisse). Bestemmelsen sker således: aktiviteten er stadig forsukringsaktiviteten, men her bestemt, efter enzymet har været udsat for 20 forskellige pH-værdier ved 40°C i 1 time, hvorefter reaktionsblandingen er indstillet til pH 5,5.

Fig. 3 viser den enzymatiske aktivitets (ordinat) afhængighed af temperaturen (abscisse) for den omtalte amylase, der fås ved hjælp af Streptomyces hygroscopicus. Bestem-25 melsen af aktiviteten, der her er forsukringsaktiviteten, er sket på sædvanlig måde for amylaser, idet enzymet er holdt ved forskellige temperaturer.

Fig. 4 viser den enzymatiske aktivitet? temperaturstabili tet. (Enzymatisk aktivitet er ordinat, temperaturen er 30 abscisse). Bestemmelsen er sket således: aktiviteten er også her forsukringsaktiviteten, der er bestemt umiddelbart efter, at enzymet i 15 minutter har været anbragt ved pH 6,8 og forskellige temperaturer og dernæst er afkølet 20 143906 til stuetemperatur.

Fig. 5 viser den omtalte amylases UV-spektrum. Den fuldt

optrukne kurve er for pH 6,8, den punkterede for 0,1 N

NaOH basisk. (O.D. er ordinat, bølgelængden i my er abscisse).

5 4. Inaktiveringsbetingelser, pH, temperatur og andre faktorer.

(a) Udsættes den omtalte amylase, der er fremstillet ved hjælp af Streptomyces hygroscopicus, for en pH-værdi på mindst 11 i 1 time ved 50°C, kan den inaktiveres.

(b) Udsættes amylasen for en pH-værdi på 10 i 1/2 time 10 ved 90°C, kan den inaktiveres.

5. Inhibitorer.

Den nedenstående tabel angiver virkningerne af nogle inhibitorer, f.eks. uorganiske salte og andre kemikalier, på den omtalte amylases enzymatiske aktivitet.

15 Tabel 7

Virkning af inhibitorer, uorganiske salte og andre kemika-lier på den omtalte amylases enzymatiske aktivitet__

Enzymets reste- Enzymets resterende smeltnings- forsukringsakti-20 aktivitet_vitet_

Reagens- % af Reagens- % af op-koncen- oprin- koncen- rindelig tration delig tration aktivitet aktivi-

Reagens_tet_ 25 Uorganiske metalsalte

Bariumchlorid 10 97,6 10 109,8

Calciumchlorid " 97,6 " 103,9

Cobaltchlor id " 95,5 " 99,7

Chromichlorid " 95,5 " 94,8 30 Ferrosulfat " 102,3 " 100

Mercurochlorid " <6 " 0

Mercurichlorid " 91,3 " 87,1

Kaliumbromid " 100 " 100 21

Tabel 7 (fortsat) 143906

Enzymets reste- Enzymets resterende smeltnings- forsukringsakti-aktivitet_ vltet _i___ 5 Reagens- % af Reagens- % af op- koncen- oprin- koncen- rindelig tration delig tration aktivitet aktivi-

Reagens__ tet __ 10 Lithiumchlorid 10"2M 102,3 10^½ 96,9

Magnesiumsulfat " 100 " 95,1

Manganchlorid " 93,4 " 88,6

Natriumchlorid " 93,4 " 95,1

Nikkelchlorid " 91,3 " 94,3 15 Stannochlorid " x " 8,2

Strontiumchlorid " 95,5 " 105,2

Zinksulfat " 85,8 " 89,9

Ammoniummolybdat " 105,9 " 93,4

Organiske reagenser 20 Natriumoxalat " 97,6 " 96,9

Mono-iodeddikesyre " 96,5 " 97,0 L-Ascorbinsyre " x " 107,4

Cystinhydrochlorid 10-½ 98,6 10-½ 96,6

Urinstof 10-2M 101,0 1Q-2M 95,8 25 Ethanol 20% 65,7 20% 51,8

Ethanol 10% 98,9 10% 86,3

Anilin 10-2M 98,6 1Q-2M 95,1

Glutathion (reduce- .

ret type) 10-½ 101,0 10-½ 95,1 30 Amylase-inhibitor 0,001% 85,8 0,001% 91,4

Ethylendiamin-tetra- eddikesyre 0,1 M 94,9 0,1 M 108,5 behandlet behandlet ved pH 6,7 ved pH 6,7 og 30°C i og 30°C i 35 60 min. 60 min.

o-Phenanthrolin 10-½ 94,9 10-½ 112,0 behandlet behandlet som oven- som ovenfor for

Tabel 7 (fortsat) 22 143906

Enzymets reste- Enzymets resterende smeltnings- forsukringsakti-aktivitet_vitet______ 5 Reagens- % af Reagens- % af op- koncen- oprin- koncen- rindelig tration delig tration aktivitet aktivi-

Reagens_tet_ 10 Kviksølv-p-chlorbenzoat 2,5x10 100,0 2,5x10 4M 93,0 (PCMB) behandlet som ovenfor

Antibiotika 15 Nojirimycin 10 86,1 10 x

Kanamycinsulfat 10 101,0 10 Si 96,5

Penicillin G-kaliumsalt " 101,0 " 96,5

Chloramphenicol " 101,0 " 92,5

Chlortetracyclin- ” 101,0 " 95,6 20 hydrochlorid 6. Bestemmelse af den enzymatiske aktivitet-Aktiviteten af amylasen, der fås fra Streptomyces hygro-scopicus, beskrives i tabellerne 4, 5 og 6 ovenfor, medens analysemetoden for aktiviteten og angivelse af amylasens 25 styrke ses nedenfor.

(A) Bestemmelse af forsukringsaktiviteten på stivelse.

2 ml vandig 2%'s opløsning af opløselig stivelse, 2 ml Mcllvaine's pufferopløsning, der har pH 5,5, og 1 ml vandig enzymopløsning blandes, og det hele opvarmes i 3 minut-30 ter ved 40°C for at hydrolysere stivelsen. Derefter tages 1 ml reaktionsblanding og sættes til Somogyi's cuprorea-gens for at afbryde reaktionen. Den dannede mængde af reducerende sukkerarter i 1 ml blanding bestemmes ved titrering efter Somogyi. Mængden af reducerende sukkerarter pr. 5 ml 35 beregnes derpå og omsættes til maltoseækvivalenter, idet alt reducerende sukker antages at være maltose.

143906 23 (B) Angivelse af forsukringsaktiviteten på stivelse.

Amylasestyrken angives som forsukringsaktivitet på stivelse, bestemt som ovenfor; det fastsættes, at den enzymmængde, der frigør 1 mg maltose pr. 5 ml reaktionsblanding ved 5 1 times reaktion på ovennævnte måde, er ækvivalent med én amylaseenhed.

(C) Bestemmelse af smeltningsaktiviteten på stivelse.

5 ml vandig 2%'s opløsning af opløselig stivelse (der pr. 100 ml indeholder 10 ml 1 M acetatpufferopløsning med 10 pH 5,5), 0,5 ml 1 M acetatpufferopløsning med pH 5,5, 1,5 ml destilleret vand og 0,5 ml vandig enzymopløsning blandes, og det hele opvarmes ved 30°C for at hydrolysere stivelsen. Efter en forud bestemt reaktionstid tages 0,2 ml reaktionsblanding og sættes til 2 ml iodopløsning (der er 15 fremstillet ved opløsning af 88 mg elementært iod og 44 g kaliumiodid i 1 liter destilleret vand). Farven af den således fremkomne iodopløsning sammenlignes med en standardfarve-opløsning (der er fremstillet ved blanding af 1 rumfang opløsning af 25 g FeCl^.e^O i 50 ml 2%'s salt-20 syre med 9 rumfang opløsning af 25 g CoC12.6H20 i 50 ml 2%'s saltsyre). Man bestemmer den reaktionstid (i minutter) for reaktionsblandingen, der er nødvendig til at få samme farve af iodprøveopløsningen og standardopløsningen. Enzym-prøveopløsningen er fortyndet successivt med en faktor n 25 til en fortynding, ved hvilken reaktionstiden, der kræves til at opnå samme farve som standardopløsningens, er mindre end 5 minutter.

(D) Angivelse af smeltningsaktiviteten på stivelse.

Aktiviteten af den omtalte amylase kan også angives i 30 smelteaktiviteten på stivelse, som bestemt ovenfor, og omregnet ved hjælp af Wohlgemuth's tal (W.V.), der beregnes af ligningen: W.V. = i x n x 400 hvor T er den ovenfor definerede reaktionstid (i minutter) 35 for reaktionsblandingen, dv.s den tid, der kræves for at 143906 24 få samme farve på iodprøveopløsningen og standardopløsningen, n er fortyndingsfaktoren, til hvilken enzymopløsningen, der skal afprøves, er fortyndet. Det foretrækkes, at 1 W.V. er ækvivalent med én amylaseenhed for smeltningsaktivitet på 5 stivelse.

Yderligere undersøgelser angående dyrknings- eller inkube-ringsbetingelserne for en Streptomycesstamme for at forbedre den kommercielle fremstilling af den omtalte amylase er beskrevet i det følgende: (a) Næringssubstratets sammensætning er modificeret på 10 forskellige måder til Streptomyces hygroscopicus-dyrkningen for at fremstille den omtalte amylase. Til denne dyrkning blev der først anvendt et næringssubstrat, der indeholdt 1% affedtet sojabønnemel, 3% opløselig stivelse og 0,2% KH2P04, og hvor carban/nitrogen-vægtforholdet var ca. 13,5.

15 Derpå anvendtes næringssubstrater med forskellige sammensætninger, som vist nedenfor, hvor C/N-forholdet antager forskellige værdier mellem 1 og 100. Derpå undersøgtes enzymaktiviteten af filtrater, der fås fra næringssubstraterne af forskellig sammensætning. Det har vist sig, 20 at filtraterne har en maksimal enzymaktivitet, når C/N-forholdet er ca. 20 i substratet, og at den maksimale enzymaktivitet er ca. 2 gange større, end når C/N-forholdet er 13,5. Betydningen af C/N-forholdet i næringssubstratet på amylasefremstillingen ved dyrkning af Streptomyces 25 hygroscopicus kan ses i tabel 8 nedenfor.

Tabel 8 25 143906 C/N-forhold Mængde af Mængde af Carbonind- Nitrogen- Enzymaktivi- i nærings- affedtet opløselig hold i næ- indhold i tetsindeks i substratet sojabønne- stivelse i ringssub- næringssub-næringsfil- 5 mel i næ- næringssub-stratet (%) stratet (%) tratet ringssub- stratet _stratet _ . _i_ 1 1 (%) 0,01 (%) 0,079 0,079 4,2(%) 5 1 1,1 0,47 0,079 30,4 10 10 1 2,0 0,77 0,078 52,8 20 1 4,2 4,14 0,208 100,0 30 1 6,4 2,23 0,075 49,2 40 0,23 2,0 0,72 0,018 12,7 60 1 13,1 4,20 0,070 3,3 15 100 1 21,9 6,49 0,065 0

Tabel 8's resultater fås ved følgende afprøvningsmåde: hvert af næringssubstraterne med de forskellige sammensætninger tilsættes 0,2% K^PO^, og 30 ml af hvert anbringes i hver sin 100 ml koniske kolbe og indstilles på pH 7,0-20 7,2. Kolberne opvarmes ved 121°C i 15 minutter for at steri lisere næringssubstraterne. Imedens podes Streptomyces hygroscopicus på et podesubstrat, der indeholder 2% stivelse, 1% pepton, 0,5% kødekstrakt og 0,05% kaliumdihydrogen-phosphat og har pH 7,0, hvorpå mikroorganismen dyrkes 25 under omrystning i 24 timer ved 28°C for at få en podekultur. Denne indpodes til en koncentration af 3% i hver af de sterile næringssubstrater, der er fremstillet ovenfor.

De podede næringssubstrater dyrkes derpå i 90 timer ved 28°C i et roterende rysteapparat. Efter dyrkningen bestem-30 mes den enzymatiske aktiviteteti næringsfiltratet.

(b) Det er desuden undersøgt, hvordan carbon- og nitrogenkoncentrationen i et næringssubstrat, der har et C/N-for-hold på 20, påvirker amylasefremstillingen fra Streptomyces hygroscopicus-dyrkningen. Det har vist sig, at fil-35 tratet har maksimal enzymaktivitet, når carbonindholdet (C vægtprocent) i næringssubstratet er 2-6%, og nitrogen- 26 143906 indholdet (N vægtprocent) er 0,1-0,3. Nitrogenkoncentrationens betydning i et næringssubstrat, der har et C/N-forhold på 20, på amylasefremstillingen ved Streptomyces hygrosco-picus-dyrkning, kan ses i tabel 9 nedenfor.

5 Tabel 9

Nitrogenkilde Carbonkilde

Tilsat mængde Tilsat mængde Enzymakti- affedtet soja- opløselig vitetsin- N% bønnemel (%) C%_stivelse (%) deks (%) 10 0,019 0,24 0,356 1,0 19 0,037 0,47 0,738 2,0 25 0,076 1,0 1,520 4,2 60 0,145 2,0 2,885 8,4 86 0,208 3,0 4,138 12,7 100 15 0,317 5,0 6,325 21,1 57 0,525 10,0 10,503 42,3 37 (c) Nitrogenkoncentrationens betydning i næringssubstrater, der har et C/N-forhold på 20, på amylasefremstillingen ved Streptomyces hygroscopicus-dyrkning kan også ses 20 af tabel 10 nedenfor.

Tabel 10

Carbonkilde Nitrogenkilde

Tilsat mængde op- Tilsat mængde Enzymakti- løselig stivelse affedtet soja- vitetsin- 25 (%) bønnemel (%) deks i næ- ringssub- C%_ _N%_ stratet {%) 0,356 1 0,019 0,24 19 0,738 2 0,037 0,47 25 1,520 4,2 0,076 1,0 60 30 4,138 8,4 0,208 2,0 100 6,325 12,7 0,317 3,0 57 10,503 42,3 0,525 10,0 37

Resultaterne i tabel 9 og 10 opnås på samme måde som resultaterne i tabel 8, og de tilsatte carbon- og nitrogenmæng- 143906 27 mængder angives i tabel 9 og 10.

Det har således vist sig, at den optimale sammensætning i næringssubstratet til Streptomyces hygroscopicus-dyrkning, hvorved der produceres og akkumuleres den omtalte amylase, 5 har et C/N-forhold i nærheden af 20 og en carbonkoncentra-tion på 2-6%, beregnet som % C, og en nitrogenkoncentration på 0,1-0,3%, beregnet som % N.

(d) Tilsætning af aminosyrer til næringssubstratet for Streptomyces hygroscopicus-dyrkningen viser, at trypto- 10 phan- og methionintilsætning effektivt forbedrer amylase-udbyttet.

TryptophantiIsætningens betydning for amylasefremstillin-gen ved Streptomyces hygroscopicus-dyrkning ses nedenfor i tabel 11.

15 Tabel 11

Tilsat tryptophanmængde Enzymaktivitetsindeks i (i % af substratet) næringsfiltratet (%) 0 100 0,005 110 20 0,01 120 0,05 130 0,1 146 (e) Methionintilsætningens betydning for amylasefremstil-lingen ved Streptomyces hygroscopicus-dyrkning ses af 25 tabel 12 nedenfor.

Tabel 12

Tilsat methioninmængde Enzymaktivitetsindeks af (i % af substratet) nærinqsflltratet (%)_ 0 100 30 0,02 190 0,05 185 0,1 195 143906 28

Resultaterne i tabel 11 og 12 fås ved indpodning af en Streptomyces hygroscopicus-podekultur, magen til den under tabel 8 omtalte, på et basalmedium, der indeholder 1% affedtet sojabønnemel, 3% opløselig stivelse og 0,2% 5 kaliumdihydrogenphosphat og har pH 7,0, og hvortil der er sat forskellige mængder aminosyrer, idet dyrkningen sker ved 28°C i 90 timer, hvorefter enzymaktiviteten af næringsfiltratet måles.

(f) Der er desuden gennemført en række Streptomyces hygro-10 scopicus-dyrkninger for at vurdere dyrkningstemperaturens betydning for amylasefremstillingen. Sker afprøvningen ved forskellige temperaturer mellem 28°C og 40°C, kan ingen bemærkelsesværdig forskel ses i mikroorganismevæksten, men det iagttages, at en dyrkningstemperatur nær 35°C er opti-15 mal for enzymproduktionen. Dyrkningstemperaturens betydning for amylasefremstillingen fra Streptomyces hygrosco-picus ses i tabel 13 nedenfor.

Tabel 13

Dyrkningstemperatur (°C) Mycelievolumen (ml) Enzymaktivi-20 tetsindeks i næringsfiltra- _tet (%)_ 28 4,7 60 35 4,4 100 25 40 4,2 0 "Mycelievolumen", der er angivet i tabel 13, bestemmes ved at anbringe 10 ml kulturvæske i et centrifugeglas og centrifugere 10 minutter ved 3000 omdr./min. samt aflæse volumen af den bundfældede myceliekage.

30 Resultaterne i tabel 13 fås ved at indpode 3% Streptomyces hygroscopicus-podekultur, magen til den i tabel 8 anvendte, i prøveglas, der hver indeholder et næringssubstrat af 4% majsstivelse, 2% skummetmælkepulver, 0,2% KH2P04, 0,2% MgS04.7H20 og 0,01% MnSO^ indstillet til pH 7,0, og U3906 29 derpå gennemføre dyrkningen ved forskellige temperaturer i 90 timer i en temperaturgradient-inkubator, hvorefter enzymaktiviteten måles i næringsfiltraterne.

Ifølge en foretrukket udførelsesform af fremgangsmåden iføl-5 ge opfindelsen dyrker man en stamme af Streptomyces hygro-scopicus ved en temperatur på ca. 35°C og under aerobe betingelser i et næringssubstrat, der indeholder kendte carbon- og nitrogenkilder ved koncentrationer på 2-6% C og 0,1-0,3% N og ved et C/N-forhold på ca. 20/1 (vægtbasis), 10 hvorved der produceres og akkumuleres amylase, der har følgende enzymatiske aktiviteter og karakteristika: det optimale pH er 4,5-5,0, graden for hydrolysestivelse med denne amylase er 82% af den teoretiske maltosemængde, forholdet mellem glucose og maltose er 0,055/1 (på vægtbasis), 15 hvorefter amylasen udvindes fra næringssubstratet på kendt måde.

Af de før omtalte Streptomycesarter, der dyrkes ved den omhandlede fremgangsmåde, har Streptomyces hygroscopicus vist sig at producere og akkumulere den største mængde 20 amylase.

Som nævnt ovenfor er de omtalte amylaser, der fremstilles som omtalt fra de særlige Streptomycesarter, fordelagtige og nyttige på grund af deres enzymatiske aktiviteter og karakteristika, nemlig at deres optimale pH er relativt 25 sur (pH 4,5-5,0), og at den optimale temperatur er relativt høj, 50-60°C, hvorhos graden af hydrolyse af stivelse med disse enzymer er mindst 75% af det teoretiske maltoseindhold, og at forholdet mellem glucose og maltose hidrørende fra denne hydrolyse er højst 0,06/1 30 (på vægtbasis). Denne kombination af fordelagtige karakteristika hos disse amylaser gør dem nyttige til fremstilling af diætetiske og naturlige sødemidler, der hovedsagelig består af maltose.

1A3906 30 1 1819 opdagede De Sau Suure, at maltose findes i hydrolyseprodukterne fra stivelse og i 1847 gav Dubruntant det navnet "maltose". Maltose er kemisk et disaccharid, i hvilket 2 molekyler D-glucose er bundet i α-form. Ren maltose er 5 et hvidt pulver, der er let opløseligt i vand. (Optaget ren maltose et mol vand, udkrystalliserer hydratet). Maltosens sødeevne er 1/2-1/3 gange rørsukkers. Imidlertid har maltose en meget velsmagende sødhed og kan karakteriseres som en sukkerart, der er gavnlig for menneskers sundhed, 10 idet den forhindrer vægtforøgelse og caries, i modsætning til rørsukker. Normalt fremstilles maltose ved hydrolyse af stivelse under påvirkning af malt og er derfor kaldt maltsukker. Imidlertid er maltoseudbyttet relativt lavt, når malt reagerer med stivelse, hvorfor maltanvendelsen 15 ikke er særlig fordelagtig til kommerciel maltosefremstil-ling. Hydrolyseres stivelsen nemlig med malt, fås der normalt hydrolysater med relativtlavt maltoseindhold, ca. 40%, beregnet på tør vægt. Disse hydrolysater kan underkastes speciel behandling, såsom fraktionering eller molekylær-20 si-behandling, hvorved de kan koncentreres mere eller mindre, men højst til ca. 50% maltose.

I den senere tid har maltose været meget efterspurgt af konfekture- og fødevareindustrien på grund af den velsmagende sødhed og de fremragende egenskaber som søde-25 middel. Endvidere anvendes maltose som udgangsmateriale til maltitolfremstilling. Maltitol, der kan fremstilles ved katalytisk hydrogenering af maltose, er stedse mere efterspurgt, fordi maltitol er en sukkerart, der hverken indgår i menneskets stofskifte eller forårsager vægtfor-30 øgelse ved indtagelse, og fordi maltitol har andre anvendelsesmuligheder på grund af dets karakteristiske fysiske, kemiske og biologiske egenskaber. Det kan således forventes, at en kommerciel maltoseproduktion vil blive iværksat.

Ved indvirkning af amylase fremstillet ved fremgangsmåden 35 ifølge opfindelsen på stivelse dannes der et produkt, der 31 1439-06 hovedsagelig består af maltose, dvs. indeholder mindst 70% maltose, regnet på tør vægt. Det dannede maltosepro-dukt kan anvendes som et diætetisk og naturligt sødemiddel.

I de følgende eksempler illustrerer eksempel 1-8 frem-5 gangsmåden ifølge opfindelsen, medens eksempel 9-13 illustrerer anvendelsen af en ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillet amylase.

Eksempel 1

En stamme af Streptomyces hygroscopicus, der er identi-10 ficeret som F.R.I. 602 eller ATCC. 21722, podes i 9 liter podningsmedium, der indeholder 2% majsmel, 1% hvedespirer og 0,5% gærstoffer (ferma media) og er indstillet på pH 7,0.

Der foretages inkubering ved 28°C i 24 timer i en gæringsbeholder med omrører og luftgennembobling for at fremstille 15 en podekultur. Imedens fyldes 300 liter produktionssubstrat, der indeholder 3% majsstivelse, 1% skummetmælk, 0,2% kaliumdihydrogenphosphat, 0,05% magnesiumsulfat, 0,01% mangansulfat og en lille smule antiskummiddel i en 600 liters gæringsbeholder, steriliseres i 30 minutter ved 121°C og 20 afkøles. Den fremstillede podekultur indpodes i det steriliserede produktionssubstrat, hvorpå dette inkuberes i 85 timer ved 28°C under luftgennembobling og omrøring. Den fremkomne kulturvæske filtreres, og der fås et kulturfiltrat, der koncentreres under 40°C og formindsket tryk til 25 1/5 af det oprindelige væskerumfang. Til koncentratet sættes et 2 gange større rumfang koldt ethanol, hvorved amylasen, der er produceret og akkumuleret i kulturvæsken, udfældes.

Det tørrede bundfald er på 341 g råenzym med styrken 43.800 enheder/g.

30 Eksempel 2

100 ml portioner af et næringssubstrat, der har samme sammensætning som i eksempel 1, anbringes i omrystningskolber på 500 ml og steriliseres. Streptomyces hygroscopicus (ATCC. 21722) podes deri og dyrkes i 24 timer ved 28°C

143906 32 under omrystning for at fremstille en podekultur. Samtidig fyldes 20 liter produktionssubstrat, der indeholder 12% opløselig stivelse, 3% affedtet sojabønnemel, 0,2% kaliumdihydrogenphosphat og har en pH-værdi på 7,0, i en 5 gæringsbeholder på 30 liter, steriliseres og afkøles. I det steriliserede næringssubstrat indpodes podekulturen og dyrkning sker i 90 timer ved 35°C. Den fremkomne kulturvæske behandles som i eksempel 1 og giver 77 g råamylase med styrken 45.000 enheder/g.

10 Eksempel 3

En stamme af Streptomyces viridochromogenes, der er identificeret som F.R.I. 603 og ATCC. 21724, dyrkes som i eksempel 2 i et produktionssubstrat, der indeholder 8,4% majsmel, 2% polypepton og 0,2% kaliumdihydrogenphosphat 15 og har en pH-værdi på 7,0. Af den fremkomne kulturvæske udvindes 28 g råenzym med styrken 22.000 enheder/g.

Eksempel 4

En stamme af Streptomyces albus, der er identificeret som F.R.I. 604 og ATCC. 21725, dyrkes som i eksempel 2 i et 20 produktionssubstrat, der indeholder 9,4% opløselig stivelse, 1,3% fiskemel og 0,2% kaliumdihydrogenphosphat og har en pH-værdi på 7,0. Af næringsvæsken udvindes 53 gråenzym med styrken 10.000 enheder/g.

Eksempel 5 25 En stamme af Streptomyces hygroscopicus var. angustomycetes, der er identificeret som F.R.I. 607, dyrkes flydende som i eksempel 2, hvorved der fås 55 g råenzym med styrken 15.000 enheder/g.

Eksempel 6 30 Streptomyces tosaensis nov. sp., der er identificeret som ATCC 21723, dyrkes som i eksempel 2 og giver 72 g råenzym med styrken 38.000 enheder/g.

U3906 33

Eksempel 7

En stamme af Streptomyces aureofaciens, der er identificeret som F.R.I. 606, dyrkes som i eksempel 2 og giver 26 g pulverformigt råenzym med styrken 29.000 enheder/g.

5 Eksempel 8

En stamme af Streptomyces flavus, der er identificeret som F.R.I. 605, dyrkes i et næringssubstrat med den samme sammensætning som det i eksempel 4; der fås 38 g pulverformigt råenzym med styrken 30.000 enheder/g.

10 Eksempel 9 9 kg stivelse af sød kartoffel dispergeres i 12 liter ledningsvand, indstilles til pH 6,0 og tilsættes 0,1% af en bakteriel, smeltende amylase. Blandingen sættes dråbevis til 18 liter varmt vand, medens temperaturen stadig holdes 15 på 84-87°C. Således afsluttes stivelsessmeltningen, hvorefter den smeltende amylase inaktiveres ved 5 minutters opvarmning til 100°C. Når opløsningen efter henstand har en temperatur på 65°C, sættes der til denne et kulturfiltrat, der indeholder amylase fra Streptomyces hygroscopi-20 cus i en mængde på 400 enheder/g stivelse. Opløsningens temperatur reguleres til 55°C, og forsukringen sker ved et begyndelses-pH på 6,0 og i løbet af 40 timer ved 55°C.

Næringsfiltratet, der indeholder amylase fra Streptomyces hygroscopicus, og som anvendes i eksemplet her, fremstilles 25 på følgende måde. Streptomyces hygroscopicus (ATCC. 21722) dyrkes under omrystning ved 28°C i 24 timer i 900 ml substrat, der indeholder 2% majsmel, 1% hvedekim, 0,5% gærstoffer og har en pH-værdi på 7,0, i en 2 liters gæringsbeholder med luftgennembobling og omrøring for at frem-30 stille en podekultur. Samtidig fyldes 30 liter produktionssubstrat, der indeholder 3% majsstivelse, 1% affedtet skummetmælk, 0,2% kaliumdihydrogenphosphat, 0,05% magnesiumsulfat, 0,01% mangansulfat samt en passende mængde anti-skummiddel, i en 60 liters gæringsbeholder, steriliseres i 1 A3906 34 1/2 time ved 121°C og afkøles. Til dette steriliserede produktionssubstrat sættes den ovennævnte podekultur, og inkuberingen sker i 85 timer ved 28°C under luftgennem-bobling og omrøring. Den fremkomne kulturvæske filtreres 5 og giver 27 liter kulturfiltrat med styrken 2000 enheder/ml.

Forsukringen afsluttes som ovennævnt, og reaktionsblandingen filtreres, affarves rutinemæssigt med aktivt kul og afsaltes med en afsaltningsionbytterharpiks. Den affarvede og afsaltede reaktionsblanding koncentreres ved for-10 dampning af vandet til 10,6 kg farveløs, klar sirup, der indeholder 4,2% glucose, 74,2% maltose, 9,8% maltotriose og 11,8% dekstrin (vandindhold 25%) , og som er anvendelig som et diætetisk og naturligt sødemiddel, der hovedsagelig består af maltose.

15 Eksempel 10

Fremgangsmåden i eksempel 9 gentages på samme måde, når undtaget, at kulturfiltratet, der fremstilles af en Strep-tomyces hygroscopicus-kultur, erstattes med et renset amylasepræparat fra Streptomyces hygroscopicus, der frem-20 stilles ved at tilsætte ammoniumsulfat til kulturfiltratet og udfælde råamylasen og derpå elektrodialysere den. Der fås 10,2 kg farveløs, klar sirup, der indeholder 3,2% glucose, 74,0% maltose^ 8,8% maltotriose og 14,0% dekstrin (vandindhold 25%), og som er anvendelig som diætetisk og 25 naturligt sødemiddel, der hovedsagelig består af maltose.

Det rensede amylasepræparat fra Streptomyces hygroscopicus, der anvendes i eksemplet her, fremstilles på følgende måde.

10 liter kulturfiltrat fra eksempel 9 tilsættes ammoniumsulfat til 60%'s mætning, hvorefter det udfældede fjernes 30 ved centrifugering og dernæst optages i 2 liter vand. Den fremkomne, vandige opløsning elektrodialyseres gennem en ionbytterharpiks ved 5°C og under sådanne dialysebetingelser, at el-strømmen passerer i 3 timer ved en konstant spænding på 10 V og en maksimal strømstyrke på 5,2 Amp.

143906 35 Således fjernes ammoniumsulfatet, og der fås en opløsning af renset amylase.

Eksempel 11

Stivelse af sød kartoffel dispergeres i vand, og der til-5 sættes 1% af en bakteriel, smeltende amylase. Smeltningen sker ved en temperatur på 84-87°C og en pH-værdi på 6,0, hvorefter udfældet Streptomyces hygroscopicus-amylase tilsættes i en mængde af 400 enheder/g stivelse. Porsukringen sker med et begyndelses-pH på 6,0 og i 40 timer ved 55°C, 10 hvorefter blandingen filtreres.

Filtratet koncentreres og sendes derpå igennem en affarvningssøjle af ionbytterharpiks med en hastighed på SV = 2.

Herefter udsaltes filtratet ved at passere igennem en ion-bytterharpikssøjle, hvorved der fås en afsaltet opløsning.

15 Opløsningen koncentreres og spraytørres. Der fås 17,4 g pulver, der indeholder 3,0% glucose, 72,5% maltose, 8,5% maltotriose, 12,0% dekstrin og 4,0% vand, og som er anvendeligt som et diætetisk og natuligt sødemiddel, der hovedsagelig består af maltose.

20 Det udfældede amylase, der anvendes i eksemplet her, tørres ikke og fremstilles på følgende måde. 10 liter kulturfiltrat fra eksempel 9 koncentreres til 1/5 af det oprindelige rumfang og tilsættes derpå det dobbelte rumfang koldt ethanol for at fremkalde udfældning. Det udfældede anven-25 des som enzympræparat uden forudgående tørring.

Eksempel 12 12 kg kartoffelstivelse dispergeres i 14 liter ledningsvand; der indstilles til pH 6,0, hvorpå der umiddelbart efter tilsættes Streptomyces hygroscopicus-amylase i en 30 mængde på 200 enheder/g stivelse. Denne vandige blanding sættes derpå dråbevis til 14 liter varmt vand, medens temperaturen holdes på 70-72°C for fuldstændigt at smelte stivelsen.

Herefter lader man blandingen køle af til 55°C. Til bian- 143906 36 dingen sættes nu mere Streptomyces hygroscopicus-amylase, svarende til 200 enheder/g stivelse. Forsukringen sker ved 55°C i 48 timer.

Når denne er afsluttet, filtreres reaktionsblandingen, af-5 farves rutinemæssigt med aktivt kul og afsaltes med en af-saltningsionbytterharpiks. Den affarvede og afsaltede opløsning koncentreres, og der fås en klar, fafveløs sirup, der indeholder 4,9% glucose, 70,0% maltose, 9,2% malto-triose, 15,9% dekstrin (vandindhold 25%), og som er anven-10 delig som et diætetisk og naturligt sødemiddel, der hovedsalgelig består af maltose.

Eksempel 13 100 g amylose opløses i 3 liter 0,2 N vandig natriumhydroxidopløsning under opvarmning, og blandingen afkøles til 15 65°C, indstilles på pH 6,0, hvorefter den tilsættes amylase fra Streptomyces hygroscopicus i en mængde på 1000 enheder/g amylose. Forsukringen sker ved 62°C i 40 timer. Når forsukringen er afsluttet, inaktiveres enzymet ved opvarmning. Reaktionsblandingen filtreres på sædvanlig måde, affarves, 20 afsaltes og koncentreres til et faststofindhold på 50%, hvorved der fås en vandig sirup eller opløsning af stivelseshydrolysat, hvilken sirup indeholder 1,0% glucose, 82,5% maltose og 16,5% oligosaccharider, beregnet på tør vægt.

Til denne sirup (0,2 liter) sættes 4,5 g Raney-nikkelkata-25 lysator; blandingen indstilles på et begyndelses-pH på 9,0 og hydrogeneres derpå katalytisk ved en reaktionstemperatur på 130°C i 3 timer under et hydrogentryk på 100 kg/cm^. Reaktionsblandingen befries for katalysatoren ved filtrering, hvorpå blandingen afsaltes og koncentreres til 120 g 30 vandig sukkeralkohoIblanding, der har et faststofindhold på 75%, og som indeholder 80% maltitol, 2,5% sorbitol og for restens vedkommende af maltotriitol og andre produkter.