SU1311256A1 - Консорциум дрожжей CaNDIDa тRорIсаLIS ЦМПМ У-507 и бактерий АсINетовастеR SpecIeS ЦМПМ В-3243-продуцент экзополисахарида - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к микро- - биологической промышленности и касаетс  новой смешанной культуры микроорганизмов, продуцирующей высоков зкий экзополисахарид, который мо^жет быть использован в различных отрас—' л х народного хоз йства. Смешанна  культура микроорганизмов включает штамм дрожжей Candida trc^picalis ЦМПМ У-507 и штамм бактерий Acineto- bacter species ЦМПМ В-3243, которые в соотношении 1:3- 1:9 продуцируют при.28-30*'С, рН 6,5-7,5 в услови х аэрации и перемешивани  до 9,1* г/л экзополисахарида, имеющего высокие физико-механические и химические характеристики. 5 табл.о 9(Л

Description

to

ел.

05

11

Изобретение относитс  к микробиологической промьшшеннос-тн и касаетс  новой смешанной культуры микроорганизмов , продуцирующей высоков зкий экзополисахарид, который может бьгть использован в различных отрасл х народного хоз йства.

Целью изобретени   вл етс  получение новой смешанной культуры микроорганизмов , продуцирующей экзополисахарид с хорошими физико-химическими свойствами. .

Смешанна  культура микроорганизмов включает штамм дрожжей Candida tropical is ЦМПМ,У-507 и штамм-бактерий Acinetobacter species IJMTIM В-3243, которые в соотношении 1:3 1:9 образуют консорциум, способный продуцировать до 9,1 г/л нового, гетерополисахарида .

Штаммы микроорганизмов выделены из активного ила станции биологической очистки сточных вод Надворн нjCKoro НПЗ (УССР)« Культуры .депонированы в Центральном Музее промышлентных микроорганизмов института ВНИИгенетики под номерами ЦМПМ

У-507 и ЦМПМ В-3243 и имеют следующие морфолого-культуральные и физиолого-биохимические признаки.

Характеристика штамма Candida tropical is ЦМПМ У-507 (шт.6),

Морфолого-культуральные признаки, Кпетки овальные, иногда почти круглые , размеры 4-8 х мкм. Размножение - многосторонним почкованием. Штрих - культура беловато-кремова , м гка , гладка  с возрастом становит-с  морщинистой, складчатой. Образует псевдомицелий и истинный мицелий, Б жидкой среде образует -Ьсадок и кольцо ..

Физиолого-биохимические признаки. Штамм сбраживает глюкозу, сахарозу, мальтозу. Не сбраживает галактозу, лактозу, раффинозу. Ассимилирует глюкозу , галактозу, L-сорбозу, сахаро ау, мальтозу, целлобиозу, О-ксилозу, : танол, рибит, маннит, сорбит, метилD-глюкозу ,  нтарную и лимонную кислоты . Слабо усваивает растворимый крахмал, глицерин, молочную кислоту, .we усваивает лактозу, раффинозу, йнулии , L-арабинозу, D-арабинозу, D-рибозу , L-рамнозу, дульцит, салицин, инозит. Не усваивает нитраты, растет при 15-39С, не патогенен.

56- . 2

Штамм Acinetobacter species ЦМПМ В-3243 (шт. 12) имеет следугоп ую характер .истику.

Морфолого-культуральные признаки.

Клетки представл ют собой короткие толстые палочки размером 0,95x1,5 к 1,2-2,5 Мкм в логарифмической фазе роста, в стационарной фазе - кокки, расположенные в парах. Спор не обра-..

зуют, жгутиков.нет, неподвижные, образуют капсулу, грамотрицательные, При росте на сусло-агаре образуют выпуклые блест щие слизистые колонии кремоватого цвета с ровными кра ми,

поверхность колоний гладка , консистенци  - слизиста , т гуча , при сн тии с агара вс  колони  т нетс  за петлей,

Фи иолого-биохимические признаки,

Строгий аэроб, кислотонеустойчивый, каталозоположительный, оксидазоотри-. цательный, не разжижает желатину, не образует ацетоин, индол, сероводогрод , В присутствии дрожжевого автолизата ассимилирует глюкозу, сахарозу , целлобиозу, ксилозу, маннит, этанол , арабинозу,  нтарно-кислый натрий , уксусно-кисльй натрий,Не ассимилирует лактозу,, мальтозу, дульцит,

формальдегид, парафин, карбоксиметилцеллюлозу , валин, лизин, аргинин, глютаминовую кислоту. Олигокарбоннтрофил . Не патогенен.

i

Количество этанола, примен емого в качестве единственного источника углеродного питани , составл ет 12 об,%, В качестве источника азота примен ют недрганический азот, в частности хлорид аммони . Концентраци  азота в исходной среде 0,016%, Б ка-. честве источников фосфора используют однозамещенный фосфат кали  и двуза 1ещенньй фосфат натри . Примен ют следующие минеральные соли; сульфат магни , сульфат железа, хлорид кальци .

Состав среды дл  культивировани  смешанной культуры дрожжей и бактерий следующий, мас,%:

,0

0,55

,06

,019 3 ремешивани , рН среды - 6,5-7,5,пред почтительнее 7,0, продолжительность культивировани  18-96 ч. Соотношение клеток дрожжей и бактерий в смешанной культуре составл ет 1:3-1:9, .что соответствует количеству дрожжевых клеток 1,74-10 в 1 мл и бакте риальных 5,23-108 - 15,69 1 мл По окончании культивировани  суспензию разбавл ют водой в 3-4 раза, добавл ют хлорид натри  до конечной концентрации 0,01 М, центрифугируют при 20000-30000 об/мин в течение 30 мин или дважды при 12000 об/мин в течение 30 мин. Из надосадочной жидкости осаждают полисахарид добавлением органического растворител  , (ацетона, этанола, изопропанола в тройном объеме. Полученный полисахарид раствор ют в дистиллированной воде, провод т деминерализацию диали зон против дистиллированной воды.Пре парат может быть высушен лиофильно или после повторного осаждени  органическим растворителем при комнатной температуре под вакуумом. Физико-химические свойства полисахарида . Средн   молекул рна  масса полиса харида, определенна  методом седимен тации и диффузии, составл ет 3 -10 5-10 . Препарат представл ет собой кислы гетерополисахарид, дает положительну реакцию с антроном, фенол серной кЛ лотой. Осаждаетс  этанолом, ацетоном , пропан-2-олом, цетавлоном. Растворим в воде, муравьиной кислоте, мочевине щелочи,рН в интервале в 2-11 не вли ет на в зкость растворов зкзополисахарнда ( ЭПС), термоустойчив в интервале от 30 до , характеризуетс  биологической стабильностью, устойчив к воздействи м микроорганизмов. В зкость растворов ЭПС повьппаетс  в присутствии одно- и двухвалентных катионов (К, Nat, NH Са, Zn, Ва. С сол ми хрома образует устойчивы гели. В зкость 0,1% раствора ЭПС при 20°С равна 7,73 сП, ИК - спектры - характерные полосы поглощени , см при 3500 - 3200, 3000-2800, 1290-1230, 1736-1724, 1660-1630, 1400, 1170, 890. В состав гетерополисахарида вход т моносахара: арабиноза, ксилоза, манноза, галактоза, глюкоза, в соотйошении 0,66:1,22:0,20:3,78:1,00: .. :3,00. 256 Качество и свойства полисахарида, синтезируемого сметанной культурой дрожжей и бактерий в соответствии с ГОСТом 15.001-73, следующие: 1. Внешний вид - порошок кремоватого цвета; 2.Эффективна  в зкость 0,5%ного раствора в дистиллированной воде при при 300 об/мин 39 сП; при 600 об/мин 30 сП; 3.Запах водного Отсутствует; раствора 4.Продолжительность полного растворени  ЭПС (концентраци  1% при 20°С) 3 ч 45 мин; 5.Содержание основного вещества в очищенном препарате 6.Содержание влаги 0-2% в зависимос7 .Содержание белка ти от очистки препарата. Изобретение иллюстрируетс  .следующими примерами. Пример 1. Бактерий Acinetobacter species ЦМПМ В-2343 при росте на богатой органической среде (жидком сусле) в услови х аэрации при 28-30 С в течение 72 ч продуцируют 23-25 г полисахарида, превраща , культуральную жидкость в гель. Осуществл ют культивирование штамма на жидкой минеральной среде следующего состава, мас.%; КН,Р04 0,55; NaHPO 1,0;. NH4.C1 0,06; MgS04 0,019; CaCI 0 00075; FeSO,. 0,0006, Вода Остальное. В качестве ирточника углеродного питани  используют сахарозу в концентрации 4% или глюкозу в концентраии 2%,клиэтанол вколйчёотве 1 об.%. При культивировании на жидкой миеральной среде Acinetobacter specis требует дополнительных факторов оста Количество дрожжевого автолизата , примен емого в качестве стимул торов роста, составл ет 0,2%. Выращивание осуществл ют при 2830 С в услови х аэрации и перемешивани  в колбах объемом 750 мл со 100 мл среды указанного состава в те513

чение 72-96 ч на качалках (п 1 220 об/мин. При этом происходит подкисление среды до рН 4,4 за счет вьщелени  органических кислот в культуральную жидкость . Концентраци  ЭПС в среде невысока  и составл ет 1,82 ,5 г/л„ Установлено, что оптимальное значение рН дл  роста культуры Acinetobacter species 6,5-7,О,дл  синтеза ЭПС - 6,5-8,0.

П р и м е р 2. Показывает биосинтетическую активность монокультур, составл ющих консорциум, смешанной культуры дрожжей и бактерий, вли ние фильтратов после двухсуточного культивировани  дрожжей на рост и образование ЭПС штамммом Acinetobacter sp.,

Культивирование осуществл ют на среде и в услови х, указанных в примере 1, В качестве источника углерода используют :этанол в количестве 2 об.%.

Количество биомассы определ ют. весовым методом. .Определение количества синтезированных полисахаридов провод т следующим образом: после выращивани  отдел ют клетки центрифугированием при 30000 об/м.ин в течение 30 мин (культуральную жидкость предварительно разбавл ют дистиллированной водой в 3-4 раза) .Из надоса-дочной жидкости выдел ют ЭПС путем осаддени  ацетоном в соотношении 1:3. Осадок ЭПС раствор ют в дистиллированной воде, переосаждают и высушивают до посто нного веса при под вакуумом.

В качестве инокул та используют суточную культуру дрожжей Candida tropicalis ЦМПМ У-507, и бактерий Acinetobacter sp. ЦМПМ В-3243, выра-, щйнныХ на скошенном сусло-агаре. Количество инокул та 10%. Соотношение дрожжевых и бактериальных клеток в сметанной культуре 1:3, что соответствует количеству дрожжевой клеток 1,74 10 и бактериальных клеток 5,23 - 10 в 1 МП.

Результаты представлены в табл. 1.

Как видно из табл. 1, добавление 50% фильтрага после двухсуточного культивировани  дрожжей в среде с этанолом стимулирует рост бактериальной культуры и интенсифицирует синтез ЭПС, В фильтрате обнаружены витамины - биотин, пиридоксин в количес .тве 0,9 мкг/л и 8,5 мкг/л соотвёт6 . .6

ственно и аминокислоты (в /иМ/мл): пролн - о,АО, глицин -.0,378, аланин - 0,262, палии - 0,1Д8, серин 0 ,113, лейцин - 0,100, которые  вл ютс  стимул торами роста бактериальной культуры. Однако значение рН к концу процесса культивировани  бактериальной культуры на среде с 50% фильтрата ниже оптимального значени 

дл  синтеза ЭПС штаммом Acinetobacter species.

Совместное культивирование дрожжей и бактерий позвол ет получить наиболее высокий выход ЭПС. Одним из важных регулирующих факторов в этом случае  вл етс  значение рН, которое при совместном выращивании дрожжей и бактерий остаетс  в пределах оптимального значени , .

Составленна  ассоциаци  представл ет собой устойчивую систему и мо-жет хранитьс  в течение 2-3 мёс. при +4 С; В дальнейшем она может быть использована в.качестве инокул та. Ассоциаци  хранитс  в течение 8 лет, потери ЭПС - образующей способности не наблюдалось.

П р и м е р 3. Показывает оптимальное соотношение клеток дрожжей

и бактерий в смешанной культуре, оп- тимум рН, t в процессе синтеза ЭПС. В минеральную среду вьшеуказанного состава внос т 10% инокул та к объему среды. В качестве инокул та .

используют 1-2-х суточные культуры дролсжей Candida tropicalis шт. 6 и бактерий Acinetxjbacter sp. шт, 12, выращенных на скошенном сусло-агаре при и смешанных в соотношении

1:2 - 1:10, что соответствует 1,74: :3,48 - 1,74:17,4-10 клеток дрожжей и бактерий в 1 мл. Культивирование осуществл ют в услови х согласно примеру 1..

результаты приведены в табл. 2,

Как видно из табл. 2, оптимальным соотношением клеток дрожжей и бактеий в ассоциации дл  получени  максиального выхода ЭПС  вл етс  соотноение дрожжевой и бактериальной культур 1:3 - 1:9i что соответствует количеству клеток дрожжей и бактерий 1,74:5,23-1,74:15,69-10 в 1 мл. Из . 7 социацин концентраци  ЭПС уменьшает с  на 20%. Исследовали процесс синтеза ЭПС смешанной культурой дрожжей и бакте рий (соотношение клеток дрожжей и бактерий 1:3) в. интервале РН 5,5-8,0 и в интервале температур 26-32 0. Дл достижени  необходимого значени  рН . проводили подтитровку 10%-ными растворами НС1 и NaOH, Культивирование осуществл ли в услови х согласно примеру 1, Концентраци  этанола 2 об.%. Данные приведены в табл. 3. Таким образом, снижение рН ниже оптимального уровн  (6,5-7,5) и повы шение его значений приводит к уменьшению концентрации ЭПС на 22%. Оптимальное значение температуры дл  получени  максимального выхода ЭПС - 28-30°С, Изменение температуры до значений, выход щих за указанные пре делы влечет за собой снижение количества синтезируемого ЭПС на 20-22%. П р и м е р 4. Периодическое купъ тивирование дрожжей и бактерий осуще ствл ют в аппаратах типа АНКум объе МОМ.10 л. Рабочий объем 4л. Используют среду вышеуказанного состава. В качестве источника углеродного питани  примен ют этанол в копичестве 1 ofi.%. В качестве инокул та используют смешанную культуру дрожжей и . бактерий, полученную по примеру 3 в колбах на качалке. Количество инокул та -10%. Соотнощение клеток дрожжей и бактерий 1:3 (1,74-10® дрожжевых клеток и 5,23-10 бактериальных клеток в 1 мл). Услови  проведени  процесса: температура 2В-30С, рН 6,5-7,5, подача воздуха 0,5 л/л среды в 1 мин ..скорость перемешивани  500 об/мин, концентраци  растворенного кислорода .20-30%, по мере увеличени  в зкости культуральной жидкости повышают рас|Ход воздуха до 3,5 л/мин, скорость перемешивани  до 800 об/мин. Врем  культивировани  18-20 ч. Результаты исследований представлены в табл. 4. Результаты исследований показывают , что консорциум дрожжей и бакте56 рий при росте на минеральной среде с этанолом синтезирует, в зкий ЭПС с лыходом от 54 до 70% т использоранного субстрата. Процесс идет стабильно, ассоциаци  устойчиво сохран ет свой .ство синтезировать в ЭПС в п ти последовательных ферментаци х. ПримерЗ. Осуществл ют периодическое культивирование смешанной культуры дрожжей и бактерий согласно примеру 4. Выделение ЭПС провод т следующим образом: разбавл ют суспензию в 3-4 раза дистиллированной водой , добавл ют хлористый натрий до конечной концентрации 0,005-0,01 М, центрифугируют при 9,5 тыс.об/мин в течение 50 мин. Клетки отдел ют, супернатант повторно центрифугируют до . прекращени  осалдени  клеток. Полученную культуральную жидкость диализуют против дистиллированной воды в течение 3-5 сут,концентрируют в вакууме при до первоначального объема, полисахарид вццел ют осажде трехкратным количеством ацетона . Осадок ЭПС высушивают при комнатной температуре под вакуумом. Динамическую в зкость растворов ЭПС определ ли.на ротационном виске- . зиметре Reomat-1Q8, диаметр внутреннего цилиндра 25; км, длин,а -36 мм, диаметр внешнего цилиндра 33 мм. Данные по измерению динамической в зкости 1%-ного раствора ЭПС (вспз) при 20с представлены в табл. 5. Дл  (сравнени  вз т ксантан фирмы Sigma, Как видно из таблищ г, в зкость раствора ЭПС, синтезируемого смешанной культурой дрожжей и бактерий, значительно превьштает в зкость раствора ксантана.; , , о р мула изобретени  Консорциум дрожжей Candida ttrbpialis ЦМПМУ-507 и бактерий Acinetobacer species ЦМПМ В-3243(коллекци  ентрального Музе  промышленных никоорганизмов института ВНИИгенетиа , коллекционные номера соответстенно ЦМПМ У-507 и ЦМПМ В-3243) родуцент экзополисахарида.

ри- Вариант опыта Количество Содержание рИ кон. ербиомассы, экзополисаг/ л харида, г/л

1Acinetobacter

species 1,1 1.8 А,40

2Candida tropicalis 10,0 0,8 6,35

3Acinetobacter . species

на среде с 50%

фильтрата после

двухсуточного

культивировани 

дрожжей 2;2 3,5 4,65

---- ---.-.-...„.«.«..

4 Acinetobgcter.

species + Candida tro- . picalia 5,2 3,8 6,80

СоотношениеКоличествоВыход

дрожжей и бак-биомассы,полисахатер й в ассо-г/лрида, г/л циации 5,20 5,00 5,15 4,50

- Т a 6 л и ц a 2

6,45

6,50 9,10 8,85 8,90 7,20.

; 5,50 6,00

6,so

7,00 7,50 8,00

5,85 7jlO 8,80 9,iO 8,90 7,00

t,C° 26 28 30 32

Параметры роста и образовани  полисахаридов.микробной ассоциацией дрожжей и бактерий в течение п ти ферментации Продолжительность лаг/фазы, ч 1,00 Максимальна  удельна  скорость роста, ч Максимальна  удельна  скорость образовани  ЭПС, ,10 Врем  ферментации, ч ..20,00 Конечна  концентраци  биомассы , г/л3,00

7,15 9,10 9,00 7,25

Т a 6 л и ц a 4 0,500,50 8,0018,00

Выход ЭПС от использованного

субстрата, %.

В зкость культуральной зюидкости в конце ферментации,

ест

64,60 69,90 12500,00 1220,00

.jE.,.

Таблица 5

133U 916 .628 440 313 226 166 117