SU575037A3 - Способ получени зеаксантина - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЗЕАКСАНТИНА

Изобретение касаетс  шособа псшучени   катого пигмента, именуемого зеаксавтином или 3,3 дигидрокси - Jj - каротина, путем культ вированн  микроорганизма, производ щего это вещество.

Такой пигмент может быть использован, например , в качестве добавки в корм дл  кур с целью интенсифицировани  желтой окраски их кожи дп  интенсифицировани  окраски желтков  щ. Кроме того, зеаксантин можно примен ть в каэдстге красител , например, в косметической промытленности .

Синтез пигмейтоа некоторыми микроорганизмами и, в частности синт езкаротиноидных пигментов бaктepн  ш вида Flavobacter известен. Однако промышленное производство зтих пигментов путем биосинтеза представл етс  обычно тонким делом и достигаемые выходы малы и дл  получени  существенных количеств пигмента приходитс  прибегать к очень большому количеству срер, дл  культивировани .

Изобретение относитс  к получению зеаксантина путем биосинтеза простым способом с повышением выхода пигмента. Изобретение касаетс  способа получени  зеаксантина путем культивировани  производ щего этот пигмент микроорганизма вида Flavobacter, при котсфом микроорганизм культивируют в питательной среда до получени  клеток на стадии роста производств зеаксантина , после чего эти клетки культивируют орт температуре 22- 25° С в услови х достаточного насьпцешг  кислородом в ферментационной питательной q)eдe, содержащей не менее 25-35 мг/мл угг лерода,  вл ющегос  источником усво емого углерода , источник ассимилируемого аминированно го азота, содержащего свободные аминированкыв кислоты; содержание зтих веществ поддерживают примерно в посто нном отношении, постепенно ввод  их в процессе культивировани  в ферме тадионную среду, причем культивирование продолжают до накоплени  в среде достаточного-количества зеаксашина.

Микроорганизм вида Ftavobacter представл ет собой микроорганизм, избранный среди бакретиА зтогр вида, или мутант подобного микроорганизма. Выражение в услови х достаточного насыщени  кислородом означает, что содержание кислорода в культивируемой среде никогда не опускаетс  ниже порогового значетш, ниже которого оно становитс  фактором, ограш1чивающим степень роста микроорганизмов в услови х культивировани .

Услови  достаточного насыщени  кислородом могут быть| например, обеспечены нродуванием возгуха и энергичным размешиванием культивируемой среды. Питателыа  означает среду культивировани , содержащую вещества, необходимыв дл  жизнеде тельности микроорганизма ими всшмилируемые; Среди таких веществ можно назвать источники углерода, азота и минеральные соли. Однако питательна  среда может содержать и иные веп ества - витамины, факторы роста и микроэлементы .

Согласно изобретению гЛов т культуру микроорганизма вида Fiavobacter, которую потом инокулируют в питательную среду, помепданную в ферментер и со держанную в качестве источника усво емых микрооргашзмамй углерода и азота. Рост микроорганизмов в ферментере поддерживают путем достаточного насыщени  среды кульйшировани  кислородом и поддержаю1ем надЛежащей температуры - пор дка 18 и 30° С и соответ ствующего рН.

Когда культура вступИт в фазу экспоненциального роста и клетки достигнут С1.4ШН производства зеаксантина (легко обшруживающую, бтагодар  желтой окраске этого пигмента), культивирование клеток продолжают в услови х достаточнш-о насыщени , кислородом при те&отературе от 22 до 25° С в водной питательной среде, содержащей от 15 до 35 мг/мл хот  бы одного .углевода н источник усво емого аминировагшого азота, содерхшщего свободные аминокислоты, причем неизменное соотнощение соответствуювдйх количеств обеспечиваетс  последовательной добавкой обоих веществ в питательную феду.

Углевод, который  вл етс  основным источНИКОМ усво емого микроорганизмом углерода, может избиратьс  среди таких веществ как глюкоза , лактоза и сахароза. Основным источником усво емого углерода может также быть смесь этах веществ.

Среди веществ, приемлемых в качестве компонентов основного источника аминного азота, можно указать, например, настой от вымачивани  кукурузы, зкстракт дрожжей, гидролизаты протеина , в частности продукты, полученные при кислотном или ферментативном гидролизе протеинов растительного происхождени , например протеины сои или арахиса и/ю1И гидролизат казеина (трилтон). Этот источник аминного азота может также содержать вещество, приготовленное путем кислотного или ф- рментативного гидролиза биомассы , вьщеленной в качестве побочного продукта биосинтеза каротиноидного пигмента при культивиpOBai-ти бактерии вида Fiavobacter, в частности путем гидролиза биомассы Fiavobacter, культивирсванной с целью получени  зеаксантина, из кото . рой пигме1п уже выделен.

Затем культивирован} ; продолжают в этих услови х в течение време}ш, достаточного дл  получени  в культивируемой среде значительного

количества зеаксантина, содержащегос  в клетках пигмента. К концу зтого периода можно прекратить добавление источников углерода и азота, дав композиции культивируемой среды развиватьс  по мере потреблени  микроорганизмами ннтатепьных вешрств.

Во врем  ферментации рН культивируемой среды регулируетс  в пределах 6,5-8,0, предпочтительно между 7,0 и 7,5. Регулирование рН может бьггь обеспечено с помощью щелочных растворов, например водных растворов едкого натра, едкого

кали или гидроокиси аммони  или с помощью струи аммиака, предоочтительны два последних вещества, поскольку они одновременйо - источники ассимилируемого микроорганизмами аминного азота.

Затем зто культивирование продолжают в течение времени, достаточном дл  образовани  -в среде значительного количества зеакс ита. Купьтивировалие можно продолжать и после прекращени  добавзюни  питательных веществ.

Иослючительно интересные результаты получены при описанном выще культивировании в случае воздействи  1 - метил - 1 - нитро - 1 - нитрозогуандина (МННГ) на некоторые бактерии вида Fiavobacter по способу мутации, заключающемус  в том, что воздействие МННГ на бактерии провод т в отвержденной среде.

Согласно специальной форме осуществлени  зтого способа мутации готов т культуру бактерии вида Fiavobacter, производ щей зеаксантин.

Эту культуру разбавл ют в стерильном физиологическом растворю и полученный раствор потом смещивают в надлежащем отнощении в чаппсе Петри с водным раствором МННГ, например с эквивалентным объемом водного раствора МННГ, содержаищм 1-10 мг этого вещества на 1 мль Затем в полученный раствор выливают расплавленньШ агар, который тщательно смешивают с раствором. После затвердевани  агара полученную твердую среду поддерживают при температуре инкубации 25-28° С до по влени  в среде колоний. Колонии затем забирают и несколько раз подр д пересаживают на твердые питательные подложки.

МутантНый микроорганизм может стать объектом одной или нескольких исследующих операций мутации в затвердевшей среде.

Результаты экспериментов показали, что мутаци , осуществленна  в затвердевщей С)реде с помощью мутагенного агента позвол ет получить из бактерий вида Fiavobacter мутанты, произво)11дацие в идентичных услови х культивировани  зеаксантин в количестве, шмного превосход щем результаты действи  мутантов, полученных при обычных способах мутации из тех же бактерий и с помошью того же мутагенного агента.

Результаты экспериментов показали, что при культивировании мокроорганизма предлагаемым способом производство зеаксантина намного превышает выход его из культуры того же микроорганизма , но при обычно практикуемых услови х. После концентрировани  бульона культуры экстрагируют из клеток зеаксантин с помощью пол рного органического растворител , например адатона, этилового спирта или хлорирсдааниого растворител , например хлороформа.

Сепарирование биомассы из культуры можно осуществить, например, центрифугированием, декантацией или фильтрованием. Биомасса может использоватьс  в качестве добавки к корму дл  кур, или может быть подвержена экстрагированию с помощью пол рного органического растворител . Пример 1. Готов т начальную культуру вида Flavobacter (АТСС № 21588), которую пересаживают в количестве 5 об.% в наход щуюс  в ферментере водную питательную среду. Питательна  среда, предварительно простерилизованна  в течение 40 мин. при 120° С и потом охлажденна  до 28 С, рН регулируемьпй с помощью аммиака в даапазЬне 6,9-7,1 имела следующий состав,%: Глюкоза (отдельно стерилизованна  в концентрированном растворе)7,0

Настой от вь1мачива1ш  кукурузы 1,6 Гидролиэат казеина (триптон) 0,8 Экстракт дрожжей1,8

Сернокислый магний0,5

Кукурузное масло0,08

Вода вод(Я1роводна До 100

Микроорганизм культивируетс  в ферментере 1ФИ 28° С продуванием воздуха при энергичном размеишвании с непрерьшным регулированием рН в диапазоне 7,2-7,3 путем систематитеского добавлени  разбавленного водного раствора аммиака.

Осуществленна  в таких услови х культура обладает 6-7-часовой латентной фазой, производство зеаксантина начинаетс  через 14 час культивировани .

Когда содержание глюкозы в ферметационной среде достигнет, уменьша сь 25 кг/мл; т.е. через 24 час после начала культивировани , температуру среды довод т до 24° Сив ферментер постепенно ввод т питательный субстрат, пред аоительно простере изованньш в отдельном сосуде так, чтобы содержание глюкозы было посто нным. Состав питательного субстрата,%:

Глюкоза32

Настой от намачивани  кукурузы4,7

Гидро.изаг казеина (тоиптон)4,3

Экстракт дрожжей5,5

Вода водопроводна До 100

рН7,7

Постепенную добавку состава продолжают в течение 20 Ч1:, причем температура поддерживаетс  244.

После суммарного культивировани  в течение 50 час измер ют содержавшем зеаксантина в культуральной среде. Дл  этого биомассу отдел ют от питательг го субстрата путем центриф.-ированн  и

зеакгангин экстрапфуют из клеток ацетоном. Раствор зеаксантина в ацетоне определ ют путем колорометрического сопоставлени  с титрованными растворами синтетического зеаксантина в том же растворителе.

Изькренное таким образом содержание зеаксантина в ферментационной среде составило 20 мкг/мл.

Дд1. сравнени , также начальна  культура выращквалась обш пр1ш тым способом. С этой целью ею инокулировали 5.об.% в таком же количестве предварительно простерилизованной jf охлажденной до 28° С питательно.; среды рН, регулировавшемс  в пределах 6,9-7,1. Композици  имела следующий

состав,%:

Глюкоза10,0

Настой от вымачивани; кукурузы1,85

Гидролизат казеина (трштточ)1,25

Экстракт дрожжей2,1

Еернокисльй магшй0,5

Кукурузное масло0,08

Вода водопроводна До 1000

Культипвирование проводилось с размешнваfffleM при энергичном продувании воздуха с непрерьшным регулированием рН до уровн  7,2-7,3. Д1штельность латентной фазы 8 час. Получение зеаксантина начиналось через 15 час. Температура среды поддерживалась спуст  24 час с начала кул

тивировани  на уровне 24° С. Через 55 час после начала культивировани  содержание зеаксантина в ферментационной среде (определенное вышеуказанным образам) равн лась 12 мкг/мл.

Пример2, Культуру вида Flavobacter (АТСС

fP 21081) готов т в водной питательной среде (с рН поддерживавшемс  на уровне 6,5), имевшей следующий состав,%: Глюкоза3,0

Экстракт дрожжей1,0

Гидролизат казеина (триптон)1,0

Сернокислый магний0,5

Г ада водолроводна До 100

Культуру, содержащую 5 г клеток -микроорганизмов на 1 л питательной среды, разбавл ют в

отношении 1:10 (по объему), путем р да последовательных операций, в физиологическог. стерильном растворе, содержащем 0,9 вес.% хлористого натри . Затем тщательно смешивают 1 мл этого

раствора с 1 мл водного раствора МННГ, содержащего 5 мг/мл этого вещества в чашке Петри. Потом 1Ш приготовленный таким образом iраствор- выливают 10мл агара и производ ттщательное смешивание агара с раствором. После затвердени 

агара чв жу Петри инкуСируют при температуре пор дка 25-28° С до по влени  в отвержденной среде колоний, т.е. через двое-четверо суток. Затем колонии отбирают из ташки Петри и помещают (путем р да последовательных операщш) на питательные агаровые подложки в отсутствии МННГ.: Полученный мутант потом инокулируют в количестве 5 о6.% в 100 мл стерильной питательной Cf9ffti рН, поддерживаемым на уровне 6,5, имеющей следующий состав,%: Глюкоза3,0 Экстракт дрожжей1,0 ГЬдролизат казеинд (триптон)1,0 Оернокиспый магний1,0 Вода водс роводна До 100 Микроорганизм культивируют в этой среде при 28° С в аэробдасс услови х в Tewime 24 час, потом эта ку ьтура вновь переноситс  в 2л нитательноа срека такого хвз состава. Спуст  24 час фврменавауан осущесталенвюй в тех же услови х, кубатуре веревюс тс  5об.% в иаход щун)с  в ферментере питатедизую среду. Шггательиа  среда, предварительно простершгазованна  в течение 40 мин П{Ж и охлажданва  до 20° С рН регулируемым аьолиаком на уровне 6,9-7,1, имеет следукшос соспш,%: Глюкоза (предварительно простерилизованна  в концентрированном растворе)7,0 Настой от вымашваЁшг кукурузы1,0 Гидролнзат калена (трш1тон)0,8 %сстракт дрож еей1,8 Сернокислый ,S Кукурузное масло0,08 Вопа водопроводна До 100 Культивирование произвохугт в фе нлентере при 28° С с аэ1 фова1тем, энергичным размешиванием и автокетшюским регу1ВфоваШ1ем рН среды на уровне 7,2-7,3. Длительность татентнш фазы 5-6 час, о6разова гше зваксантина ш%наетс  через 12 час после начала культивировани . Когда содержание глкжозы в этсж культуре достигнет, уменьша сь, 25 кг/мл, т.е. через 22 час после качала кулынвированн  температуру среды довод т до 24° С, и в нее с таким расчетом, чтобы сохранить примерно посто нный уровень содержани  глюкозы, ввод т, предаарительно простерилизованный питательный субстрат, рН которого регулируетс  на уровне 7,2, имеющий следующий состав ,%: Глнжоза32 Настой от намачивани  кукурузы4,7 Гидролизат казеина (триптон)4,3 Экстракт дрожжей4,5 Вода водопроводна До 100 Состав ввод т постепенно в течение 20 час, причем температуру среды поддерживают на уровне 24° С. После суммарного культивировани  в течение 48 час концентраци  глюкозы в среде достегает 6 мг/мл, а содержание зеаксантина, измеренное . описанным в примере 1 способом, составл ет 335 мкг/MJi. Пример 3. Описанным в примере 2 образом готов т мутант Flavobacter (АТСС 21081). Мутант инокулируют в 4 об.% в водную, предарительно простерилизованную в течение 40 мин ри 120° С, питательную среду и охлажденную до 28° С и помещают в ферментер. Эта питательна  среда с рН регутшруемым с помощью аммиака, в пределах 6,9-7,1 имеет следующий состав,%: Глкнсоза7,8 Настой от вымачивани  кукурузы1,8 Гидролизат жмыха0,7 Экстракт дрожжей2,0 Сершжнсльш магний0,5 Кукурузное масло0,08 Вода вощ гроводва До 1QO Мжрооргавазм культдав1вдтот в фермен1ат рв 1ФИ 2:8° С, как описано в примере 2. После того, как содерхонве глюкозы в  реде достигнет 25 мг/мл, температуру среды дсшод т рю 24 Сив нее постеоенноУ что обеспешть пример о оосто нный уровень содержани  глюкозы, ввод т вредаа1ште1аво просте нигазованный питательш )1й субстрат, с рН регулируемым на уровш 7,2% оюдук цего состава,%: Dmaco3a12 от вымачивани  кукурузы4,7 Гащюлизат жмыха арахиса3,5 страк дрожжей6,0 Вода водрар(юодаа До 100 осуществл ть в течевЕие 20 час при температуре 24° С. Спуст  51 час общего кульгавировани , содержание гакисозы в среде доходит до 7,5 мг/мл. Содержаиш зеаксантшга, определенное по описанному в примере 1 , равн етс  312 мкг/мл. Пример 4. Приготовленную культуру бактерии Flavobacterium aguatile (АТСС № 11974) инокулируют в наход щуюс  в ферментере питательную среду. Это предварительно простерилизованна  в течение 40 мин при температуре 120С5 охлажденна  до 28° С водна  питательна  среда, { которой поддерживаетс  аммиаком на уровне 6,9-7,1, идентична  питательной среде, описанной в примере 1. Культивируемый в ферментере в тех же услови х температуры рН и продувани  воздуха, как в примере 1, микроорганизм обладает 6-7-часовой латентной фазой и начинает производить зеаксантин через 14 час от начала культивировани . -Когда содержание глюкозыв ферментационной среде достигнет, постепенно уменьша сь, 25 мг/мл, т.е. спуст  24 час после начала культивировани  температуру устанавливают на уровне 24° С и в ферментер ввод т, предварительно простерилизованный в отдельном сосуде питательный субстрат с рН, .регулируемым на уровне 7,2. Состав субстрата аналогичен составу субстрата, описанному в примере 1. Субстрат вводитс  в фермеитер с расчетом на сохранение посто нного уровн  содержани  глюкозы в среде (25 мг/мл) в течение 20 час. Температура среды поддерживаетс  на 24° с.

Спуст  50 час суммарного культивировани  содержание зеаксантина в ферментациокмой среде определ ют хромагрифированием в тонком слое и ультрафиолетовой спектроскопией.

Содержание зеаксантина в ферментационной среде пр  таких методах измерени  16 мкг/мл.

Дл  сравнени  бактери  культивировалась обычным образом (списанным, также дл  сравнени  в примере 1). Через 55 час от начала культивировани  содержание зеаксантина в ферментационной среде оказалось равным только 4 кжг/мл.

П р и м е р 5. Приготовлен по сшисашюму в примере 2 способу и при тех же самых услови х Flavobacteriufn aguatUe (ATCCN 11947).

Мутант культивировалс  затем в тех же питательных средах, с постепенным дoбaвлeJffieм того же питательного субстрата, как в примере 2, щжчем в тех же услови х.

Отуст  48 час суьвушрного культивировани  концентраци  глюкозы достагла 5 мкг/мл, а содержание зеаксантина в среде, измеренное аналогично описанному в примере 4, рг «а 40 мг/мл.

Claims (7)

1. Способ получени  жаксанпша вутем культивировани  микроорганизма рода Flavobacter как продуцента этого пигмента, отличающийс  тем, что, с целью получени  пигмента в «шстом виде, этот микроорганизм культивируют на питательной среще до стадии роста клеток и образовани  зеаксантина , после чего клетки этой культуры выдерживают при температуре 22-25° С в аэробныХ услови х в жидкой питательной среде, содержащей не менее 25-35 мг/мл углевода источника усво емого углерода и по меньшей мере один источник усво емого аминного азота, содержйирш свободны аминокислоты, притом соответствующие количества этих веществ поддерживают в посто нном соотношешш путем постененного добавлени  этих веществ в культуральную среду, и продолжают культивирование до образовани  в среде достаточного количества межклеточного зеаксантина.

2.Оюсоб иоп. 1,отлича ю.щ и и с   Тем, что культивиро шрше продуцента ведут в среде

рН 6,5-8,0.

3.Способ по п. 1,отличающийс  тем, что в качестве углевода берут глюкозу, лактозу или сахарозу.

4.Сйособ поп. 1,от.1ич1ющийс  тем,что источник аминного азота содержит экстракт

кукурузы.

5.Оюсоб по п. 1,отличающийс  тем, что углевод и источник алашногс азота добавл ют в культуральную cpeisy в весовом соотношении

1,6:3,4 соответстеешю.

6.Способ по п. 1,отличающийс  тем, что клетки с зеаксантином выдел ют из культуральной среды путем сепарировани .

7. Способ по п. 1-6, отличающийс  тем,

что зеаксактин выдел ют из клеток путем эксграгироваш«  пол рным растворителем.