SU536757A3 - Способ получени молокосвертывающего фермента - Google Patents

Description

1

Изобретение может быть использовано в ферментной и молочной промышленности дл  получени  ферментов, вызывающих свертывание молока.

Известен способ получени  молокосвертывеющего фермента путем культивировани  микроорганизмов, продуцирующих фермент на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в аэробных услови х с последующим выделением фермента из этой питательной среды 1.

Предлагаетс  в качестве микроорганизмов, продуцирующих мопокосвертывающий фермент, использовать Plivsarum poEvceptioiEurn.

При этом из микроорганизмов PVivsotPum poEvcepholEurnиспользуют щтамм 491.61.

Способ осуществл ют следующим образом .

Культивируют микроорганизмы, продуцирующие фермент, в качестве Есоторых используют щтамм 491.61 Phvsarum poEvcepTiaEuTr относ щийс  к классу миксомицетов.

Этот микроорганизм в фазе роста находитс  в форме, называемой pEasTnodiUTn и представл ющей собой неравномерную маесу протоплазмы, содержащую мпой ество  дер, не раэдепенных на клетки, имеет х елтую окраску и покрывает собой кескспько квадрат-;;-1ых сантиметров. В благопри тш 1х дл  жизнеде тельностк услови х плазмодий PhvscsrUTn poEvcsPboiBum растет ъ аэробных услови х при 2О-25- С в аодиой Г;.итател;)Ной среде при рН 4,5-4.6. При этом водна  питательна  среда содержит источники углерода , азота, а также минерального cojiii. Кроме того, питательна  среда может содержат витамины, факторы роста и микроэлементы, а также TaKiie источники углероде, как глюкоза , гидролизаты протеинов, экстракты дрожжей и эмбриона кур, причем гидрохшзаты протеинов и экстракты и эмбриона кур могут быть заменены соответственно смесью аминокислот, биотином или гематином ,

-Микроорганизмы выращивают на поверхности твердой подложки или в погруженном состо нии, например, во встр хиваемых колбах или бродильном чане.

При выращивании на поверхности в nnTLi3 тельную среду дооавп ют агг.р в предварительно стерилизованную водную питательную , содержащую глюкозу, экстракт дрож жей, гидролизат протеина, минеральные соли и гематин, при этом последний добавл ют после стерилизации водной среды. В ука занную питательную среду внос т микроорганизмы PhvsoiruTn poEvcephaCum, заливают чашки Петри и выдерживают при 25°С. Культура развиваетс  в течение несколь ких дней, покрывает поверхность чашек Петри и остаетс  в форме плазмоди  в течение 7 дней до по влени  склероти . Выращивание на поверхности осуществл  ют также на фильтровальной бумаге, питаемой жидкой питательной средой, с помошью капилл ров. В случае роста микроорганизмов в погруженном состо нии микроорганизмыPhvsaгитп potvceplioiEuTn имеют вид плазмоди , разделенного на мелкие частички (микроплазмодий ) и наход щегос  в питательной водной среде во взвешенном состо нии. В случае выращивани  в колбе в послед нюю ввод т предварительно стерилизованную питательную среду, затем внос т плазмодий полученный из культуры на поверхности или из культуры в погруженном состо нии. Выращивание провод т при 2 при встр хиваНИИ колбы дл  насыщени  микроорганизма кислородом. После скрытой фазы, котора  длитс  12 час, если инокул цию осуществл ют в погруженном состо нии, или 2-3 дн , если ино кул цию осуществл ют на поверхности с помощью агара, клетки достигают своих мак симальных размеров через 3 дн . В случае использовани  бродильного чана в погруженных услови х разведени  в последний ввод т жидкую питательную среду и стерилизуют, при этом глюкозу ввод т только после стерилизации других компонен тов чана. Из погруженной среды берут посев и ввод т в бродильный чан. который вы держивают при температуре роста микрооргашгзма , напри.-ер при 25°С. Разведение провод т при перемешивании с помощью сме сител  со скоростью, достаточной дл  нормального обеспечивани  питательной среды кислородом. Получаемый протеолитический фермент, свертывающий молоко, выдел ют из водного раствора при выращивании на поверхности путем промывки микроорганизма солевым раствором хлористого натри , содержащим 9,0 г NaC6 на 1 л воды. При рьтрашиватжи в колбе или бродильном Чоне фермент выдел ют путем декантации , фильтрации или центрифугировани  с по4 ледующим сбором остаточного водного расвора , содержащего фермент. Водный растор фермента подвергают медленному замоаживанию , затвердевщую фазу отдел ют и обирают остаточную жидкость путем смеивани  ее с буферным раствором, рН котоого способствует активности протолитичес ого фермента. Дл  получени  чистого продукта протелитический фермент отдел ют от концентрированного раствора путем осаждени , дл  чего готов т новый водный раствор этих ротеинов и раздел ют его хроматографическим методом. Получаемый фермент разрушает фенилаланиново-метиониновую св зь пептидной цепи каппа-казеина, оказыва  на молоко коагулирующее действие. Пример 1. Культуру выращивают в погруженном состо нии из микроорганизMOBpilvsoiruTn poE cepliatum, полученного в Швейцарском научно-исследовательском институте рака (Лозанна, Швейцари ) в 15 л бродильном чане, на питательной среде состава , вес. %: Глюкоза1,0; Экстракт дрожжей0,15; Гидролизат казеина ( триптон)1.0; СаСе ,06; 0,2; О, Об; 0,006; 0,О085; 0,0035; Лимонна  кислота0,35; Гематин0,ООО5; Вода (водопроводна ) Баланс до 1ОО%. В бродильный чан ввод т 8 л водного раствора указанной питательной среды (кроме глюкозы и гематина). Раствор стерилизуют , подогрева  его до 121°С под давлением в течение 15 мин. Глюкозу раствор ют в воде из расчета 5О г на 1 л и стерилизуют . Затем раствор в бродильном чане охлаждают до 25°С и в чан ввод т стерильный водный раствор глюкозы, устанавливают рН смеси 4,5 водным раствором едкого натри , а затем добавл ют гематин, предварительно стерилизованный при 12О°С в течение 15 мин в водном щелочном растворе. После этого в питательную среду внос т 2 л посеба, полученного путем выращивани  в колбах в погруженном состо нии в течение 2 дней микроплазмоди  Phvsarutn poJvcepTioiEuTnПитательщю среду перемешивают мешалкой