CN1227365C - 生产水解蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及到一种能防止水解蛋白褐变的方法，该水解蛋白是通过植物蛋白原料酶水解而获得的。在液体反应系统中，含糖植物蛋白原料和真菌培养物混合，进行酶的水解作用。首先，反应在15℃～39℃的温度范围内、通气、搅拌条件下进行，然后，在停止通气后，在40℃～60℃的温度范围内进行和完成反应。

Description

生产水解蛋白的方法

                      技术领城

本发明涉及到一种生产水解蛋白的方法。更具体而言，它涉及这样一种生产水解蛋白的方法，其中在酶水解含有固态蛋白的植物蛋白原料的步骤中，水解作用以一种特殊方式进行，由此水解终产物不变褐或者水解终产物不变褐的时期被明显地延长。

                      技术背景

关于通过酶水解一种含有固态植物蛋白的蛋白原始原料来获得氨基酸的方法，已经知道大量的方法。

例如，JP-A-51-35461描述了一种液体调味品的生产方法，该方法组合起来包括，第一步反应是将含有可溶性氮指标为50或更少的未变质处理过的脱脂大豆与pH9~12的一种碱性蛋白酶反应2小时，由此，溶解并抽提70％或者更多的蛋白衍生氮组成物，以便于进行固—液分离，第二步是用一种多肽酶在一种密闭容器中在40~60℃水解抽提物。

再者，JD-A-6-125734描述了一种酶制剂及一种生产液体蛋白调味品的方法。该酶制剂是用有机溶剂浸提通过固态培养一种微生物而来的清酒曲产物而获得，它含一种通过清酒曲自溶释放的外肽酶；该方法包含用一种动物或植物蛋白原料与可溶性蛋白酶反应，然后上述反应产品与含外肽酶的酶制剂反应。

再者，JD-A-9-75032描述了生产一种调味品的方法，其中在酒精存在的条件下，当用于生产酱油(soy sauce)的清酒曲被用于35℃~45℃进行的酶水解时，进行强制性的蒸发使得酒精浓度在水解完成后是2％或者更少，并且这种水解产物是发酵和陈酿的。

此外，JP-A-9-121807描述了一种多用途的调味品，该调味品有高的谷氨酸含量和一种酸水解调味品的独特风味，没有酱油味和酿造味。这种调味品是在培养一种清酒曲霉菌(Aspergillus曲霉)的同时，在缺乏盐和存在少量盐的条件下，用清酒曲霉菌的培养物中的酶水解培养基中的蛋白质而生产的。

然而，存在的问题是，当用这些传统的方法生产的水解产物在贮存时，在相当短的时期内就会产生颜色并且会快速地褐变，导致其商业价值显著地降低。

任何已知的通过酶水解含有固态蛋白的蛋白原料而生产氨基酸的方法都存在以下问题：除了在水解步骤中作为酶源的微生物外，其它所谓的污染菌也生长，从而降低了水解产物质量和减少氨基酸的产量。为了解决这些问题，在传统方法的水解步骤中，用如酒精、氯化钠和乙酸乙酯作为抑菌剂。在这些方法中，水解步骤完成后必须增加分离和除去这些抑菌剂的额外步骤。特别是氯化钠被用作抑菌手段时，将氯化钠减少到低于一个适当浓度而不降低水解终产物的质量十分困难。而且在水解步骤中使用抑菌剂获得的产品，几乎不可避免地会产生所谓的酿造味或酱油味，导致很大程度地限制了所获得的水解蛋白的使用范围。

除此之外，也是在传统的方法中，要在除去或杀死在含有固态蛋白的蛋白原料中掺入或含有的污染物或作为酶源的微生物培养物后，水解步骤才进行。原始原料在灭菌后进行蛋白水解反应的方法在实验性的小量生产是相对容易的。但是，在工业化的大批量生产中，它就涉及到十分严重的问题如灭菌步骤和蛋白水解步骤中污染物的控制。

                      发明公开

本发明的一个目标是建立一种方法，该方法阻止了通过酶水解一种含固态植物蛋白的蛋白原料而获得的水解蛋白的褐变，从而在长时间内稳定地保持其商业价值。

本发明的另一个目标是提供一种生产水解蛋白的方法。该水解蛋白可用作多用途调味品原料或多用途食品原料，该水解蛋白甚至在缺乏抑菌物质的情况下也没有细菌污染，这使该方法可用于工业化的大批量生产。

为了解决这些问题，发明人进行了大量试验和艰苦的研究，研究了酶水解含有各种植物蛋白原料的方法和水解条件与水解终产物褐变的相关关系，最终，发明人获得了以下(1)~(3)的新发现。

(1)水解产物褐变的发生和发展与水解反应发生后反应产品中还原糖浓度密切相关。那就是，当还原糖浓度高时，水解反应后褐变立即发生且甚至在普通的贮存条件下快速地进行。

(2)一旦褐变发生，找到抑制褐变发展的有效方法就十分困难。

(3)通过特殊的水解方法和水解条件能够控制水解后反应产品中的还原糖的浓度，使其低于预定的浓度。除此之外，用这样特殊的水解方法和条件，蛋白自身的水解率和最终氨基酸的组成比例基本上不变。

发明人也获得了以下(4)~(6)的关于蛋白原料和培养基灭菌的新发现。

(4)水解步骤中生长的污染菌存在于固态的蛋白原料中和作为酶源的微生物培养物中。

(5)在蛋白原料和培养基能彻底灭菌的情况下，水解步骤能在无污染物的条件下充分地进行。

(6)在存在有空气和气泡的地方，蛋白原料和培养基的灭菌受到极大程度的抑制。换言之，在空气和气泡被完全除去后进行热灭菌，就能得到基本上处于无菌状态的蛋白原料和无细菌污染的作为酶源的微生物培养物。

基于这些新发现，发明人完成了本发明。

那就是，第一个发明是一种生产水解蛋白的方法，该方法是在一种液体反应系统中将一种含糖的植物蛋白原料用一种真菌培养物进行酶水解。包括混合植物蛋白原料与真菌培养物，首先在通气、搅拌的条件下在15℃~39℃的温度范围内进行反应，然后在停止通气后，在40℃~60℃的温度范围内进行和完成反应。

第二个发明是根据第一个发明的生产水解蛋白的方法，其中植物蛋白的原料选自小麦谷蛋白、玉米谷蛋白、脱脂大豆及其处理产物。

第三个发明是根据第一个发明的生产水解蛋白的方法，其中当反应开始后反应进行到从反应开始到反应完成所需总反应时间的10~60％时，将在15℃~39℃的温度范围进行的反应转为在40~60℃的温度范围内进行的反应。

第四个发明是根据第一个发明的生产水解蛋白的方法，其中在反应完成时存在于获得的反应产品中的还原糖比例被调整到反应产品中总固体的含量的5％或更低。

第五个发明是根据第一个发明的生产水解蛋白的方法，其中真菌培养物的制备和植物蛋白原料的水解在一种深层培养的罐(或箱)型反应容器中进行。

第六个发明是根据第一个发明的生产水解蛋白的方法，其中植物蛋白原料至少部分呈固体状态，且在酶水解之前被粉碎到300um或者更细，分散于高于80℃的热水中，在含于粉碎产物中的气泡被基本上除去后立即进行灭菌。

本发明被详细描述如下。

本发明所用的起始原料是含糖的植物蛋白原料。即它是一种富含可食用植物蛋白的植物蛋白起始原料，这种可食用植物蛋白原料至少部分呈现固体；还含有包括淀粉和除淀粉之外的其它糖类，如葡萄糖、果糖、蔗糖和半乳糖。

使用的这些植物蛋白原料的形态没有特别限制。起始原料包含各种形态，如粉末状、颗粒状、片状、在水溶剂中呈分散状态或者膏状物。更进一步说，只要是植物蛋白的原料，来源不受限制。

植物蛋白原料具体的例子包括起始原料如小麦谷蛋白，玉米谷蛋白、脱脂大豆、分离的大豆蛋白、分离的土豆蛋白，以及已处理过的这些植物蛋白原料的产品。在这个发明中，这些植物蛋白原料中的小麦谷蛋白和脱脂大豆是特别重要的蛋白原料。

植物蛋白原料的酶水解处理是如下一个步骤，将已灭菌的蛋白原料或保持在抑菌状况下的蛋白原料分散于水溶剂中，并使之与分散于水溶剂中的含有高蛋白水解活性的真菌培养物接触，进行蛋白原料的水解。

使用以下一个实施方案非常重要：在水解反应的开始时期进行通气、搅拌，经过一定时期后，确证水解反应系统达到了预期状态，然后清楚地将反应温度转换到一个高温区并继续接触。在这方面该方法明显地不同于普通的酶水解蛋白原料的方法。因此这是本发明方法的主要特色特征。

为具体实施这一方案，必须有一个至少装备有一个温度控制装置、一个通气装置和一个搅拌装置的水解反应容器或发酵罐。在反应中，1/1vvm或更少的通气比例已足够。搅拌装置没有特别限制，只要与反应容器大小相匹配和完全能承受如初始分散物的粘度或反应系统的负荷。各种搅拌装置都可以利用。例如，一种用于氨基酸产品发酵的深层培养设备就是一种特别优选的反应设备。

将所用的起始原料粉碎或精细的粉碎，使之不妨碍在起始原料的灭菌时期或水解反应之前的搅拌过程。用发酵工业通常使用的方法和设备进行灭菌处理。为了使水解反应不被细菌污染，作为酶源的真菌的培养需在无污染的条件下进行。此外，理所当然的是要很好的实施防止细菌污染的措施和进行反应步骤期间程序的管理。

在进行蛋白水解之前，优选将蛋白原料粉碎到大小为300um或更细，并分散在80℃或更高的热水中。可以用干的蛋白原料进行粉碎。但若将已初步粉碎的蛋白原料在进行分散于热水中的处理的同时进行粉碎，则便于此步骤继续转换到灭菌步骤。

根据在不同蛋白原料上许多次实验的结果，归纳确定了粉碎条件和用于分散的热水温度条件。若尽可能地在这些条件下粉碎和在接近于沸点的高温下分散处理，在随后的灭菌步骤中，预期能够得到较好的灭菌效果。

也就是当含有大小为300um或更大颗粒的分散物经热交换器处理时，在分散物中的这些蛋白原料颗粒就会沉淀，并且有阻塞熟交换器液流路径的可能。因此，灭菌处理实际上已变得不可能。

同时，发现一种现象，那就是在80℃或更高的温度下，细颗粒的蛋白原料分散物的粘度急剧下降。

图1是一个线形图，显示了在60℃-90℃温度范围内的热水中，含32％浓度的小麦谷蛋白分散物的温度与粘度的关系。在图1中，纵坐标表示粘度的单位刻度为10⁴cps(Centiposes厘泊)，横坐标的单位刻度为℃。在此实施例中，可以看到在温度80℃-85℃时，粘度显著下降。

本发明中的技术进步之一就在于此。即在特定的温度范围内，由于蛋白原料分散物的粘度突然下降，而使得控制的显著改进与有效的热灭菌相互衔接。

当蛋白原料遭受粉碎并分散于热水中时，蛋白原料的分散物在许多场合呈现一种乳化状态。但分散物的粘度不增加，而且分散物变成一个低粘度的不粘溶液，因此，这种处理过的分散物中不舍有空气和气泡。

当蛋白原料被粉碎和分散于热水时，可以使用一种能满足此目的的方法和装置。例如可以使用这样一种方法，其中将粉状的蛋白原料输入一个含有维持在预定温度的水溶液的发酵罐中，并输入乳化器进行搅拌来乳化和分散。

在分散处理中重要的是要确保在分散处理后没有空气和气泡粘附和存在于分散物中的细颗粒蛋白原料上。这时，在显微镜下用低倍放大的视野观察经分散物处理后的分散物，确定基本上没有气泡粘附在分散的细颗粒上，分散的细颗粒直接与液体部分接触。

假如在分散处理后，有气泡存在于分散物中，那么在紧接着进行的灭菌步骤中即使高温处理也不能达到预期的灭菌效果。而且，在灭菌操作过程中，可能出现如阻塞的严重问题。

当气泡存在于分散物中时，可以预测灭菌不能彻底地进行，因为热量不是被均匀的分散在灭菌物中，而且不能作用于气泡包围的细菌细胞和孢子。

在分散处理后，分散于热水中的蛋白原料接着进行灭菌步骤。灭菌的方法和设备没有特别的限制。在水解装置中进行连续灭菌或分批灭菌的方法对顺利地实施整个步骤是有利的。通过这种灭菌处理，蛋白原料的分散物基本上变成无菌状态。另外也可根据需要进行样品收集并确定其为所需的无菌状态。

对于用于连续灭菌的设备，一种板式热交换器或一种喷嘴式加热器非常适合。在常规操作条件下，用这些热灭菌设备处理上述方法生产的及被确证无气泡的蛋白原料热水分散物时，设备中如堵塞、烧焦的事件就不会发生。另外在处理完成后，设备的清洗和保养就十分容易。

对于用于水解反应的真菌培养物，通过培养一种具有高蛋白酶产率的真菌菌株而新鲜制备的培养物是合适的，由这种培养物预期可得到产生的蛋白酶的活性。

对于具有高蛋白酶产率的真菌，不管其分类学地位如何，各种真菌都能被利用。考虑到产品是用于食品的这一事实，选用迄今为止被用于食品和酿造工业的真菌，尤其是一种清酒曲霉菌(曲霉)是可取的。在蛋白水解反应的实践中，清酒曲霉菌在水解反应的控制或在水解产品的纯化和后处理方面是方便的。

至于清酒曲霉菌，可以使用从商品清酒曲霉菌的米中和用于酿造酱油的商品清酒曲中新近分离的、具有固定的菌株属性的菌株。不用说，也可以利用这些微生物的保藏菌株。

用于水解反应的具有高蛋白酶活性的真菌培养物，以液体清酒曲的形式灭菌后添加到蛋白原料中，并与其混合。液体清酒曲的生产原料可以相同于也可不同于被水解的蛋白原料。但是当水解反应在无细菌污染的状态下进行时，在制备的液态清酒曲中不应该存在有细菌。因此，制备液体清酒曲所用的蛋白原料的灭菌需要特别小心。

顺便说一下，当害怕灭菌处理在水解反应系统中可能没有有效地进行的时候，或者当灭菌处理由于一些原因未能满意地进行的时候，也可在存在有抑菌物质的情况下进行水解反应，抑菌物质是为了抑制共存于此系统中细菌的生长。

加入到水解反应系统中的抑菌物质的例子包括氯化钠、乙醇和乙酸乙酯。而且，根据加入的方式，将适当量的抑菌物质添加到系统中，此外，关于乙醇，具有有效形成酒精能力的酵母，可能导致系统中的共存。

假如使用了以上任何一种抑菌物质，都需要在水解反应完成后，通过分离将抑菌物质从反应混合物中除去。在不降低水解终产物质量的情况下，通过分离有效地除去抑菌物质是相当困难的，而且是不经济的。特别是要通过分离完全除去氯化钠，需要新的设备。因此，除了获得含有相当大量的氯化钠的水解产物外，没有其它选择。自然这种产品的用途受到限制。

图2是一个线形图，显示了在每一反应时间后在每一温度处，水解反应系统中谷氨酸(GH)形成和积累的浓度(单位：mg/dl毫克/10升)。此外，图3是一线形图，显示了每一反应时间后在每一温度处，水解反应系统中葡萄糖(Glc)的浓度(单位：mg/dl毫克/10升)

比较图2和图3可清楚地看到，可以理解，通过在水解反应期间有目的地改变反应温度，在基本不影响蛋白水解反应速度，即用形成并积累的谷氨基酸浓度代表的氨基酸形成的速度的条件下，用形成和积累的葡萄糖浓度代表的糖类含量，尤其是还原糖含量被选择性地降低。此外也可理解，存在于最终得到的反应产品的糖浓度和量能被调整到预期水平以下。

图2揭示了随着反应温度的增加和反应时间的延长，形成和积累的谷氨酸浓度也随之增加。同时，图3揭示了在36℃~39℃的反应温度，随着反应时间的延长(5~10小时之后)，形成和积累的葡萄糖浓度急剧地下降。根据这一事实，可以预期在36℃~39℃反应温度条件下，葡萄糖一旦形成就快速地被真菌在反应过程中分解和消耗掉了。

也就是说，在一个水解反应容器中混合无菌的植物蛋白原料和真菌培养物一液体清酒曲。此后，混合物首先在15℃~39℃的温度范围内反应，优选25℃~38℃，并且通气和搅拌，然后停止通气，在40℃~60℃的温度范围内完成反应，优选41~50℃。结果，在基本上不影响蛋白水解速度，即氨基酸形成的速度的情况下，糖含量尤其是形成、积累和存在于水解反应系统中的还原糖的含量被选择性地降低，且存在于最终得到的反应产品中的还原糖比例可被调整到反应产品中总固体含量的5％或更低。

另外，从15℃~39℃的温度范围内进行的反应转换到40~60℃的温度范围内进行的反应的时间被设置为，当反应进行到从反应开始到反应完成所需的总反应时间的10％~60％的时候。结果，在基本上不影响蛋白水解速度，即氨基酸形成的速度的情况下，糖含量，尤其是形成、积累和存在于水解反应系统中的还原糖的含量被选择性地降低，且存在于最终得到的反应产品中的还原糖比例可被调整到反应产品中总固体的含量5％或更低。

根据反应产品的总固体含量，调整存在于最终反应产品中的还原糖比例到5％或更低，由此所得到的水解反应产品能长期稳定地维持其质量而不变褐。

图4是一线形图，显示了使用上述试验产品和对照产品进行的剧烈加热试验的结果，对照产品是在水解反应期间不改变反应温度、整个反应过程一直在45℃进行所得到的。

在图4中，纵坐标表示波长为545nm的光吸收的增长速度，横坐标表示温度维持在105℃的时间。此外，图4中的空箭头表明产品的褐变能被显著地抑制，如这个箭头的下垂度显示的那样。

剧烈加热试验的进行是在密封状态下，将液体产品和调整到20％白利糖度的对照液体产品在105℃下维持6小时。这种试验条件相当于产品维持在室温12个月的条件。这表明即使产品贮存12个月，仍能保持稳定的质量而不变褐。

在水解反应中，两种类型温度范围的设置、温度转换时间的设置及存在于最终反应产品中的还原糖比例是从用不同的植物蛋白原料和不同条件下、大量不同菌种的液体清酒曲所进行的大量详细试验所得的结果归纳确定的。

此外，根据这些详细的实验结果，尽可能清楚地区分上述两种类型的温度范围是可取的。即水解反应先在相对低的温度条件下开始，在温度改变后，反应在相对高的温度条件下进行是可取的。此外，考虑到在许多情况下水解反应所需的总时间大约是24小时，已经发现温度转换的时间设置在从反应开始后大约8小时的时候，即经过了大约30％的预期总时间的时候，由此可得到好的结果。此外，存在于反应终产品中的还原糖比例应该是总固体含量的5％或更低，优选3％或更低，更优选1.5％或更低。即5％的比例是其上限。

因此，至于用某一种具体的植物蛋白原料、液体清酒曲和温度转换时间的设置进行水解反应时，使用的两种温度范围，必须根据具体的蛋白原料，在上述范围内进行初步的试验，以确定最适范围和值。

在上述水解反应条件下获得的水解产物是一种淡黄色、半透明液体，有清酒曲霉菌细胞分散于其中。在添加活性炭进行脱色和除臭处理后，通过固液分离得到的一种淡黄色、清澈的液体是一种氨基酸溶液，该溶液具有浓烈的、令人愉快的味道，没有特别的令人不愉快的味道或令人讨厌的气味。

通过上述水解反应得到的酶水解蛋白溶液可被直接用作调味品原料。但是，在许多情况下，该溶液要经过脱色、除臭处理，例如活性炭处理，或纯化处理，如为制备一种产品而进行的浓缩处理。此外，根据使用目的，它可被制成浓缩膏状物、小薄片粉末、喷雾干燥粉末、颗粒或立方体大块。在水解反应步骤中，偶尔没有用抑菌物质如氯化钠所得到的产品，除了具有不容易变褐的特性外还具有多种用途的特征，得到广泛的接受。

                       附图简述

图1是一个线形图，表明在热水中小麦蛋白分散物的粘度与温度的关系。

图2是一个线形图，表明在不同反应温度下，水解反应系统中形成和积累的谷氨酸的浓度与时间的关系。

图3是一个线形图，表明在不同反应温度下，水解反应系统中形成和积累的葡萄糖的浓度与时间的关系。

图4是一个线形图，表明在反应期间通过转换温度所得的产品与不转换温度条件所得的产品在进行剧烈加热试验中，光吸收的增加有显著区别。

                实施本发明的最佳方式

通过参考本发明的具体实施例来说明本发明。并且以下实施例不限制本发明的技术范围。

例1：抗褐变的小麦谷蛋白水解产物的生产。

(小麦谷蛋白的乳化预处理)

将400升自来水引入1000升的、连接有乳化器的罐中，用冲击剪切式Homoicline Mill(Tokushu Kikako K K提供)进行乳化。加热罐中的水。当水温达到95℃时，开始乳化操作。将20公斤的活性小麦谷蛋白加入罐中，操作开始后，小麦谷蛋白在30分钟内变成一种完全乳化的分散物，此时，小麦谷蛋白特有的粘弹性消失。在低倍放大的显微镜视野中，根本观察不到这种分散物中的小麦谷蛋白凝聚成块和含有气泡。

乳化分散物中小麦谷蛋白粒子的直径平均为150um，最小的10um，最大的900um。此外，小麦谷蛋白粒子的浓度为50g/l。

(生产液体清酒曲的脱脂大豆的预处理)

经初步粉碎未变质的脱脂大豆得到的脱脂大豆粉末，在用一种能进行加热处理的混合器混合时，在98℃加热处理20分钟。

(生产液体清酒曲的脱脂大豆的灭菌处理)

将3千克热处理过的脱脂大豆粉末，加入到已经装入生产氨基酸产品的深层培养发酵罐的200升温度为25℃的水中，同时搅拌，以获得均匀的、无气泡的脱脂大豆粉的分散物。随后，该分散物进行分批灭菌，用高温蒸汽在120℃灭菌20分钟。

(液体清酒曲的生产)

在这种热灭菌的脱脂大豆粉末分散物中，接种1％体积的清酒曲霉菌种子培养物，该霉菌为米曲霉(Aspergillus oryzae ATCC15240)，种子培养物是在5升的发酵罐中、装入含1.5％的脱脂大豆粉培养基、接种10⁴/ml的清酒曲霉菌孢子后培养得到的。接种后，在通气率为1/4vvm、搅拌速度为520rpm、30℃条件下培养24小时获得液体清酒曲。

(液体清酒曲的评价)

最终的液体清酒曲的蛋白酶活性为304单位/ml，除了清酒曲霉菌外，既没有观察到除清酒曲霉以外的细菌污染，也没有观察到它们的生长。

(小麦谷蛋白的水解)

用上述方法获得的乳化了的小麦谷蛋白分散物全部转入一个用于氨基酸产品生产的1000升发酵罐中。随后，这种小麦谷蛋白分散物进行分批热灭菌，用高温蒸汽在120℃灭菌20分钟。完成热灭菌后，当溶液温度降低至50℃时，在其中加入1/2数量的液体清酒曲。水解反应从反应开始到第8小时，通气率为1/4vvm，搅拌速度为200rpm，同时控制分散物的温度为35℃，水解反应的第8小时到第24小时反应完成，不通气，同时控制分散物的温度为45℃。

在反应期间，从反应开始，反应系统中用谷氨酸浓度表示的氨基酸浓度持续地增加。同时，在反应的前3小时，反应系统中用葡萄糖浓度表示的还原糖浓度迅速地增加，并在反应的3~8小时基本上维持在最大值。然而从第8小时，当反应系统中分散物的温度升高、维持并控制在45℃时，随着反应的继续进行，还原糖浓度急剧地下降。到24小时反应完成时，葡萄糖浓度降低至反应产品总固体含量的1.0％或更低。

(作为对照的小麦谷蛋白的水解)

将200升上述方式所得的乳化小麦谷蛋白分散物装入到1000升用于氨基酸发酵的发酵罐中。然后，用高温蒸汽进行分批热灭菌，在120℃灭菌20分钟。热灭菌后，当分散物的温度降至50℃时，在其中加入1/2数量的液体清酒曲。水解反应在通气、搅拌的条件下进行，同时始终维持分散物的温度为45℃，从反应开始到反应结束的整个24小时期间不进行温度转换。

反应期间，从反应开始，在反应系统中用谷氨酸浓度表示的氨基酸浓度持续地增加。同时，从反应开始至第3小时，反应系统中用葡萄糖浓度表示的还原糖浓度迅速地增加，并在反应8小时至24小时反应完成时，基本上维持在最大值。到24小时反应完成时，葡萄糖浓度达到6.6％。已经确定，与上述在反应期间增加和控制溶液温度的情况相比，在整个反应期间谷氨酸浓度趋向于增加得要缓慢一些。

(获得的水解产物的储存试验)

通过上述方法获得的小麦谷蛋白试验水解产物(下文称为试验产品)和用于比较的小麦谷蛋白对照水解产物(下文称为对照产品)进行离心，以分离和除去其中的清酒曲霉菌细胞。然后，除去了霉菌细胞的余液通过一个用于调制的颗粒状的活性炭层，获得纯化的水解产物。每种纯化的水解产物装入一个500ml带有橡皮塞的无色透明玻璃瓶中，瓶的上半部分不留空间。

玻璃瓶中的样品，储存于不特别控制温度、具有散射光的房间内，在装入后立即肉眼观察褐变的发生和进展状况和在1周、2周、1个月、3个月、6个月及12个月后观察褐变的发生和进展状况。表1显示了褐变的结果，同时也显示了各储存期后打开橡皮塞时味道的变化状况。在表1中，“褐变”栏中的“+”分5个等级表示评价结果。即褐变最严重的状况定义为5，可轻微观察到的褐变状况定义为1。此外，“烧焦味”栏中的“+”分5个等级表示评价结果。即褐变伴随有刺激性味道，所谓“烧焦味”显著地发生的状况定义为5，轻微发现有“烧焦味”的状况定义为1。顺便提及，评价由5位专家进行。专家给的评价分数被平均并四舍五入。所得的分数用“+”的数目表示。

                       表1

             小麦谷蛋白水解产物的褐变

储存期	试验产品		对照产品
					褐变	烧焦味	褐变	烧焦味
	装入后立即1周后2周后1个月后3个月后6个月后12个月后	无无无无无++	无无无无无无+	无无+++++++++++++++					无+++++++++++++

如表1所示，试验产品甚至储存12个月后，褐变程度微弱，且很少发现烧焦味的发生。由此，判断试验产品维持了满意的商业价值。同时，在对照产品中，装瓶后立即观察就已发现了褐变的迹象，而且发现了烧焦味的存在，尽管微弱。1个月后，清楚地发现了褐变和“烧焦味”。3个月后，显著地发现了褐变和“烧焦味”。因此，判断对照产品极度地损害了商业价值。

例2：来源于其它植物蛋白原料的抗褐变的水解蛋白的生产。

用如例1中的同样方式从玉米谷蛋白和脱脂大豆生产抗褐变的水解蛋白。

(植物蛋白原料的预处理)

来源于美国明尼苏述州的粉状玉米谷蛋白，如例1中的方式进行乳化。此外，粉碎未变质的脱脂大豆(Toyo seiyu K.K.提供)，然后如例1中的方式进行乳化。任何一种以上的乳化产品既没有凝聚成块，也根本观察不到包含和存在有气泡。

(液体清酒曲的生产)

如例1中的同样方式用脱脂大豆粉生产液体清酒曲。

(植物蛋白原料的水解)

玉米谷蛋白的乳化分散物和脱脂大豆的乳化分散物分别被转入30KL的发酵罐中，灭菌。当分散物的温度降至50℃时，如例1中的方式加入液体清酒曲到每一发酵罐。水解反应的条件与例1中的一样。即水解反应从反应开始到第8小时，通气、搅拌、同时控制分散物的温度为35℃。从第8小时至第24小时反应完成，不通气、同时控制分散物温度为45℃。在水解反应完成后，反应产品中的葡萄糖浓度是反应产品总固体含量的0.9％。

(作为对照的植物原始原料的水解)

根据上述方法所得的玉米谷蛋白乳化分散物和脱脂大豆乳化分散物分别被转入30KL发酵罐，灭菌。当分散物的温度降至50℃时，加入液体清酒曲到每一发酵罐。水解反应在搅拌下进行，同时控制温度为45℃，从反应开始到反应结束的24小时期间不进行温度转换。当水解反应完成时，反应产品中的葡萄糖浓度是总固体含量的6.4％。

(水解终产物的储存试验)

用例1中的同样方式进行水解终产物的储存试验。其比较结果显示于表2、表3。

                        表2

              玉米谷蛋白水解产物的褐变

储存期	试验产品		对照产品
					褐变	烧焦味	褐变	烧焦味
	装入后立即1周后2周后1个月后3个月后6个月后12个月后	无无无无无++	无无无无无无+	无无+++++++++++++++					无无++++++++++++

                      表3

              脱脂大豆水解产物的褐变

储存期	试验产品		对照产品
					褐变	烧焦味	褐变	烧焦味
	装入后立即1周后2周后1个月后3个月后6个月后12个月后	无无无无无++	无无无无无无+	无＞+++++++++++++++					无＞+++++++++++++++

如表2、表3所示，在玉米谷蛋白和脱脂大豆的试验产品中，甚至12个月后，褐变程度微弱且烧焦味的发生很少发现，这样，判断试验产品维持了满意的商业价值。同时，在它们的对照产品中，装瓶后立即观察就已发现了褐变迹象，尽管与试验产品比较只有轻微的区别，且发现了烧焦味的存在，尽管微弱。1个月后，清楚地发现了褐变和“烧焦味”。3个月后，显著地发现了褐变和“烧焦味”。因此，判断对照产品极度地损害了商业价值。

                          工业实用性

按照本发明的方法，用一种真菌培养物、在一个液体反应系统中用植物蛋白原料生产的水解蛋白能长期不变褐而维持稳定的商业价值。

Claims (4)

1.在液体反应系统中，用真菌培养物进行含糖植物蛋白原料的酶水解而生产水解蛋白的方法，包括混合植物蛋白原料和真菌培养物，首先在15℃～39℃的温度范围内、在通气、搅拌条件下反应，在停止通气后，在40℃～60℃的温度范围内进行和完成水解反应；其中，当反应进行到从反应开始至反应结束所需总反应时间的10％～60％时，反应从15℃～39℃转换到40℃～60℃进行；在反应完成时，存在于获得的反应产品中的还原糖比例被调整到反应产品中总固体含量的5％或更低。

2.权利要求1的生产水解蛋白的方法，其中，植物蛋白原料选自小麦谷蛋白，玉米谷蛋白，脱脂大豆及其处理产品。

3.权利要求1的生产水解蛋白的方法，其中，真菌培养物的制备和植物蛋白原料的水解在一深层培养罐型反应容器中进行。

4.权利要求1的生产水解蛋白的方法，其中，植物蛋白原料至少部分呈固体状态，在酶水解之前，先被粉碎到300μm或更细，分散于高于80℃的热水中，在含于粉碎产品中的空气气泡基本上被除去后立即进行灭菌。

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