DE3316901C2

DE3316901C2 -

Info

Publication number: DE3316901C2
Application number: DE3316901A
Authority: DE
Inventors: Jean Michel Villers Coudun Fr Lebeault; Alain Compiegne Fr Deschamps
Original assignee: COOPERATIVE LAITIERE D'ARTOIS ET DES FLANDRES LA PROSPERITE FERMIERE ARRAS CEDEX FR
Current assignee: COOPERATIVE LAITIERE D'ARTOIS ET DES FLANDRES LA PROSPERITE FERMIERE ARRAS CEDEX FR
Priority date: 1982-05-17
Filing date: 1983-05-09
Publication date: 1988-01-07
Also published as: DK202983A; DE3316901A1; NL8301646A; BE896599A; FR2526808A1; GB8309753D0; GB2120240B; GB2120240A; DK202983D0; FR2526808B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von für Ernährungszwecke verwendbarem L-Lysin und eine metabolisierbare Masse, die durch das beanspruchte Verfahren hergestgelltes Lysin enthält (vgl. die Ansprüche 1 und 5).

Bekanntlich ist es erforderlich, das Viehfutter durch Zufügung von Proteinen zu vervollständigen, wenn die den Tieren gebotene Proteinmenge zu gering ist, was insbesondere der Fall ist, wenn beispielsweise als Grundlage des Futters wenig Proteine enthaltene Getreidekörner verwendet werden.

Die Qualität der Proteine hängt hauptsächlich von deren Aminosäuregehalt, und insbesondere von ihrem L-Lysin-gehalt ab; deshalb verwendt man üblicherweise L-Lysin als Zusatzsubstanz, um den Nährwert gewisser Viehfuttermittel zu erhöhen. Dieses L-Lysin wird üblicherweise in Form eines etwa 10% Lysin in Verbindung mit Füllstoffen und anderen metabilisierbaren Substanzen enthaltenden Pulvers auf dem Futtermarkt vertrieben, das durch Mischen der verschiedenen Bestandteile hergestellt wird. Das zu diesem Zweck verwendete L-Lysin wurde bis jetzt praktisch durch chemische Synthese, Proteinhydrolyse oder Gärung erhalten.

Die Herstellung von L-Lysin durch chemische Synthese beruht insbesondere auf der Verwendung der cyclischen Derivate: Man kennt beispielsweise Herstellungsverfahren, die von Caprolactam, Dihydropyran oder auch von Cyclohexan ausgehen. Ein Nachteil dieser chemischen Verfahren liegt darin, daß sie lediglich zur Herstellung eines racemischen Gemisches von D-Lysin führen, und da D-Lysin kein assimilierbares Futtermittel ist, ist es erforderlich, zusätzliche Verfahrensschritte durchzuführen, nämlich die Trennung der D- und L-Lysinisomeren, oder aber die Umwandlung des D-Isomeren in das L-Isomere. Diese Umwandlung wird im allgemeinen durch Racemase von Achrobacter obae und nachfolgende Aminohydrolase von Cryptococcus laurentii durchgeführt und gestattet eine Umwandlung von 99,8% der Racemiemasse in L-Lysin. Diese zweistufige Verfahrensweise ist umständlich und kostspielig.

Ferner hat sich auch die Erzeugung von L-Lysin durch Hydrolyse der Proteine als im industriellen Maßstab nicht wirtschaftlich günstig erwiesen, da die Ausbeute gering und der Gestehungspreis hoch ist.

Diese Verfahren zur Herstellung durch chemische Synthese oder Proteinhydrolyse haben sich als zu kostspielig erwiesen, und aus diesem Grunde wurden während der letzten Jahre auf einem Gärungsvorgang beruhende Verfahren entwickelt.

So beschreibt Davis (in der Zeitschrift "Nature", London 169, 534 [1952]) eine beim auxotrophen E. coli in einem Zuchtmedium (Kulturmedium) auftretende Ansammlung von Diaminopimelsäure (DAS), die mit einer Ausbeute von 100% durch aerogene Aerobacter-Mikroorganismen in Lysin umgewandelt wurde. Desgleichen erzielte Haskin bei Verwendung zweier U. maydis-Kulturen (US-PS 29 02 409) eine L-Lysinausbeute von 0,2 bis 0,3 g/Liter. In der Tat ist U. maydis der beste L-Lysinabscheidende wilde Mikroorganismenstamm (1 g/Liter); jedoch wurden in industrieller Hinsicht günstigere Produktionsweisen bei Verwendung von auxotrophen Mutanten oder von Regulationsmutanten coryneformer Bakterien erzielt (Veröffentlichung von Sano und Shiio in der Zeitschrift J- Gen. App. Microbiol. 13,349 [1967]). Es ergibt sich, daß z. Zt. das Gärungsverfahren in industrieller Hinsicht das wirtschaftlich günstigste Verfahren darstellt.

Alle vorstehend erwähnten bekannten Verfahren ermöglichen es, Lysin von großer Reinheit zu verhältnismäßig hohem Gestehungspreis herzustellen. Diese Verfahren erfordern in der Tat eine große Anzahl von Verfahrensschritten zwecks Reinigung und Trennung des Lysins, und sodann zwecks seiner Vereinigung mit den verschiedenen oben erwähnten Füllstoffen und metabilisierbaren Produktion im Hinblick auf die Herstellung der die oben erwähnten Futterzuschlagstoffe bildenden Nährmittelmasse.

Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Idee war, ein L-Lysin zu schaffen, dessen Herstellungsverfahren weder die Abscheidungs- und Trennungsschritte, noch die nachfolgenden Kombiantionsschritte erfordert, die bei bisher bekannten Verfahren durchgeführt werden müssen.

Von diesem Grundgedanken ausgehend wurde angestrebt, ein neues Verfahren zur Herstellung von Lysin auf der Grundlage eines Substrats zu schaffen, das an sich als Nahrungs- bzw. Futtermittel verwendbar ist und es gestattet, Hydrolyse-Erzeugnisse zu halten, die ebenfalls an sich als Nahrungs- Bzw. Futtermittel dienen können.

Es wurde ins Auge gefaßt, von Lactoserum und Lactosesaft (Ultrafiltrat) auszugehen, da die die Escherischia coli-Mutanten erzeugenden Stämme sich auf Lactose entwickeln; man versuchte, L-Lysin erzeugende Escherischia coli-Mutanten herzustellen. Es gelang in der Tat, mit Hilfe dieser Mutanten auf Lactose Lysin zu erzeugen, jedoch hat sich dieses Verfahren als nicht zufriedenstellend erwiesen, da die Menge des abgeschiedenen Lysins zu gering war.

Die Forschungs- und Entwicklungsarbeiten, die zur vorliegenden Erfindung führten, ermöglichten die Herstellung eines Zusatzstoffes auf Lysinbasis, der zur Vervollständigung von Viehfutter dienen kann, während der Herstellung keinerlei Reinigungsschritte erfordert und außer dem Lysin von der Hydrolyse oder der Assimilation des Ausgangsgemisches herrrührende Bestandteile enthält, die selbst Nährstoffe darstellen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von zu Nährzwecken verwendbarem Lysin, dadurch gekennzeichnet, daß man Lactoserum oder Lactosesaft einer enzymatischen, sauren oder katalytischen Hydrolyse unterzieht in Gegenwart eines üblichen Lysin erzeugenden Mikroorganismenstammes vergärt und das hierbei entstehende Gemisch sodann trocknet.

Es sei darin erinnert, daß Lactoserum die flüssige Milchfraktion ist, welcher nach Abscheidung der zur Käseherstellung verwendete Matte verbleibt.

Die Zusammensetzung des Lactoserums ist von der Milch selbst, sowie von der Art des hergestellten Käses abhängig.

Die durchschnittliche Zusammensetzung von Lactoserum ist folgende:

- 80 bis 85% Lactose,
- 5 bis 6% Proteine,
- 15 bis 10% Mineralsalze.

Dieses Verfahren weist folgende Vorteile auf:

- die Lysinbildung verläuft verhältnismäßig schnell, da der das Lysin erzeugende Mikroorganismenstamm die bei der enzymatischen Hydrolyse, d. h. bei der ReaktionLactose Glucose + Galactose
entstehende Glucose verbraucht;
- das Verfahren ist ohne weiteres wiederholbar und die Ausbeute ist konstant.

Bei einer Ausführungsform der Erfindung wird die enzymatische Hydrolyse unter Verwendung von Enzymen, vorzugsweise von Enzymen des Typs β-Galactosidase, durchgeführt.

Bei einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der das Lysin erzeugende Mikroorganismenstamm ein üblicher, Lysin erzeugender Stamm der Corneybacterium glutanicum (=Micrococcus glutamicus), Brevibacterium, Arthrobacter sp. und Corynebacertrium umfassenden Gruppe. Gegenstand vorliegender Erfindung ist ebenfalls eine vermittels des vorstehend angegebenen Verfahrens erzeugtes Lysin enthaltende metabolisierbare Masse, in welcher das Lysin 5 bis 30% der Masse darstellt (und der Rest aus metabolisierbaren Stoffen oder Zusatzstoffen, vorzgusweise wengistens zum Teil aus einer durch Lysin abscheidende Rückstände gebildeten Biomasse besteht). Die Ansprüche 2 bis 4, 6 und 7 nennen Ausgestaltungen der Erfindung.

Ein Vorteil vorliegender Erfindung liegt darin, daß sie es ermöglicht, das Lactoserum auszunutzen, das zwar in vielen Fällen getrocknet wird, aber bislang nur unregelmäßig und geringfügig ausgenutzt und häufig als Abfallprodukt entfernt wurde.

Die Erfindung wird nachstehend anhand der beiliegenden Figur und mehrerer, der Erläuterung dienender Beispiele des näheren beschrieben.

Beispiel 1

Beispiel der Herstellung in Schüttelbecher:
Man bereitet das Zuchtmedium von einer Lactoserumlösung (100 g/Liter) ausgehend, die durch Einwirkung von β-Galactosidiase (endgültige Glucosekonzentration 45 g/Liter) hydrolisiert wird, und der man beifügt:

(NH₄)₂SO₄13,4 g/Liter KH₂PO₄ 2,2 g/Liter MgSO₄ 0,8 g/Liter Hefeextrakt 5 g/Liter Thiamin 55 · 10^-4 g/Liter Biotin 5 · 10^-4 g/Liter

Nach einer Sterilisationsbehandlung von 30 Minuten bei 105°C wird das Zuchtmedium mit einem Corynebacterium-Stamm geimpft. Die Becher werden in einem Drehrührwerk (200 U/Min) 72 Stunden lang bei einer Temperatur von 30°C bebrütet. Man erhält - ggf. nach Zermahlen - pro Liter Zuchtmedium 103 g trockenen Pulvers mit folgender Zusammensetzung:

Lysin17,5% Biomasse 5,8% Galactose42,7% Lactose 9,7% Mineralsalze24,3%

Die Lysinbestimmung wird gemäß der Methode von Chinard und Work (JL. BIOL. CHEM. 51, 199 [1952]) durchgeführt.

Der verwendete übliche, Lysin erzeugende Corinebacterium- Stamm besitzt folgende Eigenschaften:

- Gram-positiv,
- aerob,
- unbeweglich,
- nicht sporenbildend,
- widersteht der EC-Säure (0,5 g/Liter),
- widersteht der auf die Replikation wirkenden antibiotischen Naledixinsäure,
- Gelbfärbung der Sprößlinge, meist beim Altern.

Beispiel 2

Beispiel der Herstellung im Gärapparat:
Das gleiche auf der Basis von hydrolisiertem Lactosesaft hergestellte Zuchtmedium (Glucosekonzentration 50 g/Liter) wird in einen 20 Liter Gärapparat gegeben und mit dem oben genannten Corynebacteriumstamm geimpft. Das Experiment wird unter folgenden Bedingungen durchgeführt:

Temepratur30°C pH6,8 Belüftung60 v/v/Std.

und man erhält 20 g/Liter Lysin in 48 Stunden.

Unter den gleichen Versuchsbedingungen, jedoch mit 80 g/Liter Glucose konnte eine Ausbeute von 28 g/Liter Lysin erzielt werden.

Man erhält in der Praxis 154 g/Liter trockenen Pulvers folgender Zusammensetzung:

L-Lysin18,2% Biomasse 9,7% Galactose45,5% Lactose13,0% Mineralsalze13,6%

Der hier verwendete, mit einem Leitzylinder versehene Gärapparat ermöglicht ein Umwälzen des Mediums; er ist hinsichtlich der Temepratur, des pH, sowie der Konzentration des gelösten Sauerstoffs gesteuert und mit einem mechanischen Entschäumsystem ausgerüstet. Dieser Gärapparat besitzt ein Rührwerk, das wesentlich aus einer Schiebe mit leicht geneigten Flügeln besteht (Neigungswinkel ca. 30°), derart, daß das Zuchtmedium vom Umfang des zylindrischen Rohres in eine die Achse umgebende Zone gedrückt wird.

Beispiel 3

Beispiel der Herstellung in einem Gärapparat:
In einem dem im vorgehenden Beispiel verwendeten entsprechenden Gärapparat wird folgendes Medium eingesetzt:

(NH₄)₂SO₄20 g/Liter FeSO₄ 2 · 10^-3 g/Liter MnSO₄ 7,7 · 10^-3 g/Liter MgSO₄ 0,37 g/Liter Lösung50 g/Liter Biotin500 µg/Liter Vitamin B₁500 µg/Liter Hefeextrakt 5 g/Liter

und die Gärung erfolgt unter allmählicher Zugabe von Glucose auf 50 g/Liter Glucose.

Man erzielt folgende Ergebnisse:

endgültige Lysinmenge27,6 g/Liter Zuckerverbrauch81 g Zuckerrückstand 0 g erzeugte Biomassenmenge10 g Lysin/Zucker-Ausbeute34%

Beispiel 4

Gärung mit höchstens 5% Asche enthaltendem, hydrolisiertem und demineralisiertem Lactosesaft:

Trockensubstanz600 g/kg % Hydrolyse 90% stickstoffhaltige Substanz 23 g/kg Asche 50 g/kg Citrat 10 g/kg Lactat 5 g/kg

Bei Verwendung des in Beispiel 3 beschriebenen Mediums erhält man nach erfolgter Gärung ein Pulver folgender Zusammensetzung:

endgültige Lysinmenge19% Lactose 5,5% Galactose49,5% Glucoserückstand10,3% erzeugte Biomassenmenge (Trockengewicht)15,7%

was einer Ausbeute von 38,3% in bezug auf den verbrauchten Zucker entspricht.

Beispiele 5 und 6

Ein Gärprozeß wird auf Lactosesaft aus Pulver, dem einerseits 40 g/Liter und andererseits 62 g/Liter Glucose beigemengt werden, ohne allmähliche Glucose-Beigabe durchgeführt. Man verwendet das gleiche Medium wie in Beispiel 3, abgesehen vom Glucosegehalt. Die folgenden Ergebnisse werden erzielt:

Bei Einsatz von 40 g/Liter Glucose ohne allmähliche Glucosebeimengung macht man folgende Feststellungen:

- das Bakterienwachstum und die Lysinerzeugung sind nach 30 Stunden Züchtung abgeschlossen,
- das Bakterienwachstum verläuft regelmäßig, d. h. ohne Kurvenknick,
- man beobachtet eine Alkalisierung während der ersten Stunden des Gärungsprozesses.

Hingegen zeigt die Bakterienwachstumskurve bei anfänglichem Einsatz von 62 g/Liter Glucose einen zweistufigen Verlauf (zwei Wachstumsstufen). Die erste Stufe beginnt nach zweistündiger Züchtung und ist nach 22 Stunden beendigt, während die zweite Stufe nach 22 Stunden beginnt und nach 40 Stunden Züchtung beendet ist. Die Glukose wird unvollständig verbraucht (Glukoserückstand 17,3 g/Liter). Ferner stellt man fest, daß der Verlauf der Glucoseverbrauchskurve bei Beginn der Latenzperiode der zweiten Wachstumsstufe linear wird.

Beispiele 7 und 8

Beispiele der Herstellung in dem beschriebenem Gärapparat einerseits auf katalytisch hydrolisiertem (folglich demineralisiertem) proteinarmem Lactoserum, und andererseits auf enzymatisch hydrolisiertem proteinarmem Lactoserum mit folgender Zusammensetzung:

Die Gärung wird mit anfänglichem Einsatz von 68 g/Liter Glucose ohne allmähliche Glucosezugabe durchgeführt.

Man erzielt folgende Ergebnisse:

Die beliegende Fig. 1 zeigt eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens.

Diese Vorrichtung weist eine Zuführleitung 1 zum Einleiten von Lactoserum in einen Reaktor 2 für sauere oder enzymatische Hydrolyse auf; die derart behandelte Masse wird durch eine Leitung 3 in einen Gärbottich 4 eingebracht. Das Gemisch aus Mikroorganismenstamm und Nährmedium für denselben (Glucose) wird in einem Behälter 5 hergestellt und gelangt über eine Leitung 6 in den Gärbottich.

Die vergorene Masse wird durch eine Leitung 7 in einem mehrere Vorkonzentriervorrichtungen 8 aufweisende Vorkonzentrationszone eingebracht, und die vorkonzentrierte Masse gelangt über eine Leitung 9 in eine Zerstäubungszone 10, aus deren unterem Ende (Sumpf) das an L-Lysin angereicherte Lactoserum über eine Leitung 11 abgezogen wird.

Die Trocknung durch Zerstäubung kann durch jegliches andere geeignete Verfahren ersetzt werden.

Bei den erfindungsgemäß eingesetzten Mikroorganismen handelt es sich um dem Fachmann geläufige und frei verfügbare übliche Stämme, die Lysin erzeugen.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von für Ernäherungszwecke verwendbarem Lysin,
dadurch gekennzeichnet,
daß man Lactoserum oder Lactosesaft einer enzymatischen, sauren oder katalytischen Hydrolyse unterzieht, in Gegenwart eines üblichen Lysin erzeugenden Mikroorganismenstammes vergärt und das hierbei entstehende Gemisch sodann trocknet.

2. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß die enzymatische Hydrolyse mit Hilfe von β-Galactosidase durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Hydrolyse katalytisch auf Ionenaustausch-Harzen durchgeführt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichent,
daß der Lysin erzeugende Mikroorganismenstamm ein Stamm der Corynebacterium glutacium (=Micrococcus glutamicus), Brevibacterium, Arthrobacter sp. und Corynebacterium lilium umfassenden Gruppe ist.

5. Metabolisierbare Masse, die durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 hergestelltes Lysin enthält, dadurch gekennzeichnet,
daß das Lysin 5 bis 30% der Masse darstellt.

6. Metabilisierbare Masse nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,
daß als Lactoserium ein demineralisiertes Lactoserum eingesetzt worden ist.

7. Metabilisierbare Masse nach Anspruch 5,
dadurch gekennzeichnet,
daß als Lactoserum ein nicht demineralisiertes Lactoserum eingesetzt worden ist.