NL8301646A - Werkwijze ter bereiding van l-lysine. - Google Patents

Description

· !" „ 833045/vdV/vdKl/dw

Korte aanduiding: Werkwijze ter bereiding van L-lysine

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze ter bereiding van L-lysine en heeft meer in het bijzonder betrekking op een werkwijze voor het verkrijgen van een metalboliseerbare massa die L-lysine bevat, welke massa bestemd is als voedingstoevoegsel voor dierlijke voeding.

5 Bekend is dat men dierlijke voedingsmiddelen ten aanzien van de eiwitten aan moet vullen wanneer de hoeveelheid van de aan de dieren gevoerde eiwitten te laag is, wat in het bijzonder geldt wanneer een voeding voornamelijk is gebaseerd op bijvoorbeeld graankorrels die, zoals algemeen bekend is, een laag eiwitgehalte bezitten.

10 De kwaliteit van de eiwitten wordt namelijk vooral bepaald door hun aminozuurgehalte en in het bijzonder hun 1-lysinegehalte; daarom wordt L-lysine momenteel toegepast als toevoegsel om de voedingswaarde van bepaalde voedingsmiddelen die bestemd zijn om aan dieren te worden toegevoerd te verbeteren. Dit L-lysine is gewoonlijk in de handel verkrijg-15 baar in de vorm van een poeder dat bestaat uit een mengsel dat 10¾ lysine naast vulstoffen of toevoegsels en andere metalboliseerbare produkten bevat, welk poeder is gevornddoor de verschillende bestanddelen te vermengen.

Het voor dit doel toegepaste L-lysine is tot nu toe voornamelijk 20 bereid door chemische synthese, eiwithydrolyse of fermentatie.

De bereiding van lysine door chemische synthese is voornamelijk gebaseerd op het gebruik van cyclische derivaten. Voor dit doel zijn derhalve bereidingsmethoden bekend die uitgaan van caprolactam, dihydropy-ran, of eveneens cyclohexaan. Het nadeel van deze chemische werkwijzen is 25 echter dat zij alleen leiden tab een racemisch mengsel van D- en L-lysine en daar D-lysine geen assimileerbaar voedingsmiddel vormt, is het noodzakelijk om aanvullende bewerkingen uit te voeren, ofwel de D- en L-iso-meren van lysine te scheiden, ofwel het D-isomeer om te zetten in het L-isomeer. Deze omzetting wordt gewoonlijk uitgevoerd met een Achromobacter 30 obae racemase, gevolgd door een aminohydrolase van Cryptococcus laurentii en leidt tot een omzetting van 99,8¾ van het recemische mengsel in L-lysine 8301646 -2- i 1

Deze werkwijze die twee trappen omvat is ingewikkeld en duur.

Bovendien is de bereiding van L-lysine door hydrolyse van eiwitten industrieël niet voordelig gebleken, terwijl de opbrengst laag en de kostprijs hoog is. .

5 Deze methoden volgens chemische synthese of eitwithydrolyse zijn inderdaad te duur gebleken, en gedurende de afgelopen jaren zijn de werkwijzen, gebaseerd op een ver gistingsproces, ontwikkeld.

DAVIS (in het tijdschrift Nature, Londen, 169, 534 (1952) heeft aangetoond dat auxotrope E. Coli een opeenhoping van diaminopi*melinezuur 10 (DPA) in een kweekmedium vertonen, waarvan de omzetting in lysine wordt uitgevoerd met een opbrengst van 100¾ door aerogere Acrobacter.

HASKINS (Amerikaans octrooischrift 2.902.409) heeft een opbrengst bij de bereiding van L-lysine van 0,2 tot 0,3 g/liter verkregen door gebruik van twee stammen van U.maydis. U.Maydis is namelijk de 15 beste, natuurlijke L-lysine afscheidende stam (lg/1); de beste opbrengsten worden echter vanuit industrieël oogpunt verkregen door gebruik van auxotrope mutanten en regelende mutanten van Coryneforme bacteriën (artikel van SAN0 en SHII0 in het tijdschrift J.Gen. App. Microbiol.

13, 349 (1967). In feite is vergisting momenteel de meest economische 20 werkwijze.

Alle beschreven werkwijzen leiden tot bijzonder zuiver lysine, waarvan de kostprijs betrekkelijk hoog is. Zij omvatten namelijk een groot aantal bewerkingen om de zuivering en isolatie van lysine te verkrijgen, daarna de kombinatie ervan met de verschillende vulstoffen en bovenge-25 noemcfemetavrboliseerbare produkten om voedingsmassa's te vormen die het hierboven genoemde voedingstoevoegsel vormen.

Het basisidee dat heeft geleid tot de onderhavige uitvinding was het verkrijgen van L-lysine door toepassing van een werkwijze die geen scheidings- en isolatiebewerkingen, noch'rekombinatiebewerkingen vereist 30 zoals noodzakelijk is bij de tot nu toe uitgevoerde processen.

Uitgaande van dit idee is getracht een nieuwe werkwijze te ontwikkelen voor de bereiding van lysine uit een substraat dat zelf een voedingsmiddel kan vormen en aanleiding kan geven tot hydrolyseprodukten die zelf voedingsmiddelen zijn.

35 Men heeft besloten uit te gaan van lactoserum en lactose bevat tende vloeistof (ultrafiltraat); in aanmerking nemend dat de stammen die in staat zijn Escherischia Coli te vormen die groeien op lactose, is echter getracht Escherischia Coli mutanten te vormen die L-lysine afscheiden.

8301646 * · -3-

Produktie van lysine is verkregen door het gebruik van deze mutant op lactose, doch deze werkwijze is niet bevredigend daar de hoeveelheid afgescheiden L-lysine te klein is.

Door het onderzoek en de ontwikkeling die hebben geleid tot 5 de onderhavige uitvinding is het mogelijk geworden een op lysine gebaseerd toevoegsel te verkrijgen, dat kan worden toegepast om dierlijke diëten aan te vullen, dat tijdens de bereiding ervan geen zuivering vereist en dat naast lysine de bestanddelen bevat die afkomstig zijn van de hydrolyse of assimilatie van het oorspronkelijke mengsel, die 10 zelf voedingsmiddelen zijn.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor de bereiding van lysine bestemd voor voedingsdoeleinden, in het bijzonder voor dierlijke voedingsmiddelen, waarbij men uitgaat van lactoserum of lactoserum bevattende vloeistof, dit onderwerpt aan een enzymatische, zure of kata-15 lytische hydrolyse in tegenwoordigheid van een lysine-vormende stam, en daarna het aldus verkregen mengsel droogt.

Opgemerkt wordt nogmaals dat lactoserum de vloeibare fraktie van melk is die aanwezig is na afscheiding van de voor de kaasbereiding bestemde wrongel.

20 De samenstelling van lactoserum hangt af van de melk zelf en eveneens van de aard van de gevormde kaas.

- 80 tot 85¾ lactose; - 5 tot 6% eiwitten; - 15 tot 10¾ minerale zouten.

25 Deze werkwijze bzit het voordeel: - dat de vormingssnelheid van lysine betrekkelijk hoog is door het feit dat de lysine-vormende stam glucose verbruikt die afkomstig is van de enzymatische hydrolyse, d.w.z. volgens de reaktie: 30 lactose -— 1 —> glucose + galactose - dat hij gemakkelijk reproduceerbaar is en leidt tot konstante opbrengsten.

Volgens een uitvoeringsvorm van de uitvinding wordt de enzy-35 matische hydrolyse uitgevoerd door middel van enzymen, bij voorkeur van het fi-galactosidase type.

8301646 . , · -4-

Volgens een andere uitvoeringsvorm van de uitvinding is de stam die lysine vormt een van de stammen van de groep, bestaande uit Corynebacterium qlutamicum (= Micrococcus qlutamicus), Brevibacterium, Arthrobacter sp., Corynebacterium lilium.

5 De uitvinding heeft eveneens betrekking op een meta^boliseer- bare massa die lysine bevat dat is verkregen door toepassing van de bovengenoemde werkwijze, welke lysine 5 tot 30?ó van deze massa vormt, waarbij het overige gedeelte bestaat uit vulstoffen of metaboliseerbare produkten en bij voorkeur tenminste gedeeltelijk uit een biomassa die bestaat uit 10 de lysine-afscheidende resten.

De uitvinding bezit het voordeel dat lactoserum waardevol kan worden gemaakt, welk produkt vaak wordt gedroogd, doch waarvan het waardevol maken onregelmatig en slecht was,, en verder vaak werd weggegooid als afval.

15 Andere kenmerken en voordelen van de onderhavige uitvinding blijken uit de volgende beschrijving en niet beperkende voorbeelden en uit de tekening.

Voorbeeld I

Bereiding in een geroerde kolf: 20 - men vormt een kweekmedium uit een oplossing van gehydrolyseerde lactose rum (100 g/1) door inwerking van f*- galactosidase (uiteindelijk glucose concentratie 45 g/1) waaraan is toegevoegd: (NH4)2S04 13.4 g/1 KH2P04 2.2 g/1 25 MgS04 - 0.8 g/1 gistextract 5 g/1 thiamine 5.10*"^ g/1 -4 biotine 5.10 g/1

Na 30 min. bij 105°C steriliseren wordt het kweekmedium geënt 30 met een stam van Corynebacterium♦ De kolven zijn 72 uren bij een temperatuur van 30°C onder roeren (200 rpm) geïncubeerd.

Na eventueel fijnmalen verkrijgt men 103 g droog poeder uit 1 liter kweek, welk poeder de volgende samenstelling bezit: lysine 17.5 % 35 biomassa 5.8 % galactose 42.7 % lactose 9.7 % minerale zouten 24.3 % 8301646 • « -5-

Het lysinegehalte is.bepaald volgens de werkwijze van CHINARD en WORK (J. BIOL. Chem. 51, 199 (1952)).

De toegepaste Corynebacteriumstara bezit de volgende eigenschappen: 5 - gram positief - aëroob - onbeweeglijk - vormt geen sporen - ECA resistent (0,5 g/1) 10 - resistent voor naledixinezuur (30 pg), een antibioticum dat inwerkt op de eplicatiej

- gele pigmentvorming van de oplossingen, meestal tijdens veroudering. Voorbeeld II

Voorbeeld van de bereiding in een vergistingsvat:

15 - men brengt hetzelfde medium, bereid uit gehydrolyseerde lactose-bevat-tende vloeistof (glucoseconcentratie 50 g/1) in een Biolafitte vergistingsvat van 20 liter dat is geënt met de hierboven genoemde Corynebacte-riumstam. De experimentele uitvoeringsomstandigheden zijn als volgt: temperatuur 30°C

20 pH 6.8 beluchting 60 v/v/h

Men verkrijgt 20 g/1 lysine in 48 uren.

Onder dezelfde experimentele omstandigheden, doch onder toepassing van 80 g/1 glucose, verkrijgt men 28 g/1 lysine.

25 In feite verkrijgt men 154 g/1 droog poeder dat bevat: L-lysine 18.2 % biomassa 9.7 % galactose 45.5 % lactase 13.0 % 30 minerale zouten 13.6 %

Het toegepaste Biolafitte vergistingsvat is voorzien van een besturingscilinder die het circuleren van het medium mogelijk maakt en de temperatuur, pH, concentratie opgeloste zuurstof daarvan wordt geregeld. Het is verder voorzien van een mechanisch schuimwerend systeem. Dit ver-35 gistingsvat omvat een roerder, bestaande uit een schijf met enigszins gekantelde bladen (hoek ongeveer 30°) zodat het kweekmedium wordt voortbewogen vanaf de omtrek van de cilindrische buis naar een zone nabij de as.

8301646 m t -6-

Voorbeeld III

Voorbeeld voor de bereiding in een Biolafitte vergistingsvat: - in een Biolafitte vergistingsvat, gelijk aan dat welke is toegepast in het voorgaande voorbeeld, past men het volgende medium toe: (ΜΗ4)2504 ' 20 g/1 5 Fe S04' 2.10"3 g/1

Mn S04 7.7.10”3 g/1

Mg S04 0.37 ' g/1 oplossing 50' ml biotine 500 yuxj/1 10 vitamine B^ 500 yug/1 gistextract 5 g/1 en voert men de vergisting uit op glucose met een concentratie van 50 g/1 die in de tijd wordt gevormd.

Men verkrijgt de volgende resultaten; 15 uiteindelijke opeenhoping van lysine 27.6 g/1 verbruikte suiker 81 g overgebleven suiker 0 g vorming van biomassa 10 g lysine/suiker opbrengst 34· %

20 Voorbeeld IV

Vergisting met gedemineraliseerde, gehydrolyseerde, lactose-bevattende vloeistof, die slechts 5¾ as bevat: droge stof 600 g/kg % gehydrolyseerd 90 % 25 genitrogeneerde stof 23 g/kg as 50 g/kg citraat 10 g/kg lactaat 5 g/kg

Onder toepassing van hetzelfde medium als dat welke is weer-30 gegeven in voorbeeld III verkrijgt men na vergisting een poeder met de volgende samenstelling: uiteindelijke opeenhoping van lysine 19 % lactose 5.5 ?ó galactose 49.5 % 35 overgebleven glucose 10.3 ft vorming van biomassa (droog gewicht) 15.7 % 8301646 -7- 9 # dat overeenkomt met een opbrengst, ten opzichte van de verbruikte suiker, van 38,3¾.

Voorbeelden \f en VI

Men voert een vergisting uit met een lactose-bevattende vloei-5 stof, in poedervorm, waaraan, door stapsgewijze vermenging, respektieve-lijk 40 g/1 en 62 g/1 glucose is toegevoegd. Hetzelfde medium als dat van voorbeeld III is toegepast, behalve het glucosegehalte. Men verkrijgt de volgende resultaten: 40 % g/1 62 SS g/1 10 uiteindelijke opeenhoping van lysine 11.8 g/1 11 g/1 lactose 8.8 g/1 14 g/1 galactose 40 g/1 62.5 g/1 verbruikte glucose 40 g/1 45.2 g/1 15 overgebleven glucose 0 17.3 g/1 vorming van biomassa (droog gewicht) 13 g/1 16 g/1 verhouding(¾)r lysine/verbruikte suiker 28.75 24.3 totale specifieke werkzaamheid van lysine 20 bereiding 0.91 0.69 opbrengst = gevormde(biomassa/2 + lysine) xiqq_29 5¾ 42 % verbruikte glucose

Onder deze omstandigheden : 40 g/1 glucose en zonda* verdere geleidelijke bijmenging van glucose, neemt men het volgende waar: 25 - het einde van de groei van de bacteriën evenals die van de lysinevorming vindt plaats na 30 uren kweken, - de groei van de bacteriën is regelmatig, d.w.z., er is geen breuk in de kromme, - het alkalisch worden vindt plaats in de eerste uren van de vergisting.

^ Anderzijds is de voor de oorspronkelijke toegepaste 62 g/1 glucose de kromme van de groei van de bacteriën twee-fasisch (twee fasen in de groei). De eerste begint bij 2 uren kweken en eindigt bij 22 uren en de tweede begin-t bij 22 uren en eindigt bij 40 uren kweken. Het verbruik van glucose is onvolledig (overgebleven glucose : 17,3 g/1).

^ Opgemerkt wordt verder dat het glucoseverbruik lineair wordt vanaf de latente fase van de tweede groeifase.

8301646 -8-

Voorbeelden VII en VIII

Voorbeelden voor de bereiding in een Biolafitte vergistingsvat met een gedeproteïniseerd lactoserum, dat enerzijds katalytisch is gehydrolyseerd (derhalve gëdemineraliseerd) en anderzijds enzymatisch is gehydrolyseerd, met de volgende samenstellingen: 5 gehydrolyseerd lactoserum op katalytische op enzymatische wijze wijze

voorbeeld VII voorbeeld VIII

totale droge stof 60 g/100 g 60 g/100 g 10 minerale stof sporen 5.7 g/100 g genitrogeneerde stof (totaal) 0.3 g/100 g 2.7 g/100 g % gehydrolyseerd 80 % 80 % lactose 11.7 g/100 g 10 g/100 g glucose 24.0 g/100 g 20.8 g/100 g 15 galactose 24.0 g/100 g 20.8 g/100 g.

pH 7.5 6

Men voert het vergisten uit met 68 g/1 glucose dat oorspronkelijk is toegepast en zonder geleidelijke bijmenging van glucose.

Men verkrijgt de volgende resultaten:

20 Voorbeeld VII Voorbeeld VIII

katalytische enzymatische wijze wijze gevormde lysine 16 g/1 11 g/1 gevormde biomassa (droog gewicht) 14 g/1 16.5 g/1 25 lactose 34 g/1 20 g/1 verbruikte glucose 68 g/1 33 g/1 overgebleven glucose 0 17.4 g/1 galactose 68 g/1 51 g/1 8301646 -9- e - * »

Fig. 1 toont een inrichting waarin de werkwijze volgens de uitvinding kan worden uitgevoerd.

Deze inrichting omvat een leiding 1 voor het toevoeren van lactoserum aan een reaktor 2 voor de zure of enzymatische hydrolyse, waar-5 bij de aldus behandelde massa via leiding 3 wordt gevoerd in een vergis-tingstank 4. Het mengsel van de stam en de voedingsbasis voor de stam (glucose) wordt bereid in een vat 5 en via leiding 6 in deze vergistings-tank 4 toegevoerd.

Men brengt de gefermenteerde massa via leiding 7 in een precon-10 centratiezone die verschillende preconcentratie-inrichtingen omvat en vandaar brengt men de verkregen voorgeconcentreerde massa via leiding 9 in een verstuivingszone 10 waaruit in een vat de met L-lysine verrijkte lactoserum via leiding 11 wordt onttrokken.

Het drogen door verstuiven kan warden vervangen door elke 15 andere draogwerkwijze.

Vanzelfsprekend is de onderhavige uitvinding op geen enkele wijze beperkt tot de beschreven en we^egeven uitvoeringsvormen; hij kan worden toegepast op verschillende volgens de deskundige mogelijke varianten zonder dat buiten het kader van de uitvinding wordt getreden.

8301646

Claims (9)

1. Werkwijze ter bereiding van lysine, bestemd voor voedingsdoel-einden, waarbij men uitgaat van laetoserum of lactoserum-bevattende vloeistof, dit onderwerpt, aan een enzymatische, zure of katalytische hydrolyse in tegenwoordigheid van een lysine-vormende stam en het aldus ver- 5 kregen mengsel droogt.

2. Werkwijze volgens conclusie l,met het kenmerk, dat de enzymatische hydrolyse wordt uitgevoerd met enzymen.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2,met het kenmerk, dat de enzymatische hydrolyse wordt uitgevoerd met |3 -ipLactosidase.

4. Werkwijze volgens conclusie l,met het kenmerk, dat de hydrolyse op katalytische wijze wordt uitgevoerd met ionenui twisselende harsen.

5. Werkwijze volgens conclusie 1-4, met het kenmerk, dat de lysinevormende stam behoort tot de groep Corynebacterium glutamicum 15 (= micrococcus glutamicus), Brevibacterium, Athrobacter sp., Corynebacte- rium lilium.

6. Metaboliseerbare massa die lysine bevat, verkregen onder toepassing van de werkwijze volgens conclusie 1-5, met het kenmerk, dat 5 tot 30% van de massa bestaat uit lysine, waarbij het 20 overige gedeelte bestaat uit meta«fboliseerbare stoffen of produkten.

7. Metaboliseerbare massa volgens conclusie 6, m e t het kenmerk, dat het overige gedeelte tenminste gedeeltelijk bestaat uit de biomassa gevormd abor lysine-afscheidende resten.

8. Metaboliseerbare massa volgens conclusie 1-7, met het 25 kenmerk, dat het laetoserum gedemineraliseerd laetoserum is.

9. Metalboliseerbare massa volgens conclusie 1-8, met het kenmerk, dat het laetoserum niet-gedemineraliseerd laetoserum is. 8301648