SU1313353A3 - Ферментативный способ определени концентрации антибиотика с бета-лактамным кольцом - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к медицине и может быть применено при определении присутстви  антибиотиков в биологических жидкост х и его концентрации в процессах ферментации. Цель изобретени  - повышение чувствительности способа путем использовани  фермента, иммобилизованного ковале нт- но на пoли-(N,N-димeтилaкpиднoй) смоле сетчатой структуры. Дл  этого исследуемую пробу инкубируют с D-ала- нил-В-аланин-карбоксипептидазой, продуцируемой Actinomadura R 39. Затем инкубируют полученный комплекс антибиотика и фермента с раствором субстрата N-альфа, N-эпcилoн-диaцeтил-L- -лизил-В-аланил-В-аланина или N-аль- фа-ацетил-Ь-лизил-В-аланил-В-аланина. Далее определ ют концентрацию образовавшегос  В-аланина, а по ней - остаточную ферментативную активность. Определ ют количество антибиотика по разности концентраций фермента по сравнению с контролем. 5 табл. G со со со сл со сн

Description

113

Изобретение относитс  к медицине, и может быть использовано дл  определени  присутстви  антибиотиков в биологических жидкост х и его концентрации в процессах ферментации,

Целью изобретени   вл етс  повышение чувствительности способа за ичет использовани  иммобилизованного фермента .

Пример I. Определение концентрации пенициллина G в молоке„

Используемую в качестве подложки смолу пoли-(N,N-димeтилaкpилaмид) получают путем сополимеризации, осуществл емой в эмупьсии, смеси 12 г Ы,К-диметилакриламида, 1 г Н,Н-эти- ленбисакриламида и 1,4 г сложного метилового эфира N-акрилоилсаркозина Получают 12-13 г смолы, имеющей вид жемчуга, гранулометрический состав которого равен 0,1-2 мм.

10 г смолы ввод т в 320 мл этилен- диамина, полученную смесь перемешивают в Течение ночи при температуре окружающей среды. Затем смолу отфильтровывают и последовательно промывают ее в Ы,Н-диметилформамиде и воде до установлени  .нейтральной величины рН.

Далее смолу промывают в метаноле и оставл ют дл  устранени  набухани  в присутствии простого диэтилового эфира.

Получают 10 г смолы, содержащей 0,3 моль этилендиамина на 1 г.

6,7 г глутаровой кислоты и 12,7 г N-оксисукцинимида раствор ют в 50 мл Н,Ы-диметилацетамида при О С. Затем в полученный раствор ввод т по капл м раствор дициклогексилкарбодиимида (23,7 г) в дихлорметане (50 мл); Смесь оставл ют до уравнивани  температуры раствора с температурой окружающей среды, а затем после выдержки в течение ночи осуществл ют фильтрование реакционной смеси и выпаривание фильтрата. Остаток кристаллизуют в простом диэтиловом эфире,, Получают сложный диэфир Ы оксисукцинимида глутаровой кислоты при квазиколичественном выходе.

500 мг смолы поли-(Н51 1-диметил- акриламид), содержащей функциональные группы, полученные от этилендиамина (этап q ),, суспендируют в 50 r-yi Н,Ы-диметилацетамида. Затем в смесь ввод т 2 г сложного диэфира N-OXCM- сукцинимида глутаровой кислоты (этап S). Полученную смесь перемеши32

вают в течение 24 ч при температуре окружающей среды. Смолу отфильтровывают и п тикратно про мывают в 100 мл N5N-димeтилaцeтaмкдa, а затем в 100 мл

метанола, смолу оставл ют дл  устранени  набухани  в присутствии простого диэтилового эфира.

600 мг очищенного фермента R 39 с удельной активностью 19,8 ед./мг

протеина (1 ед. фермента R 39 катализирует гидролиз 1 ммоль N-альфа, Ы-эпсилон-диацетил-Ь-лизил-В-аланил- -D-аланина в 1 м при З7 с при инкубации фермента с раствором 8 мМ субстрата в буферном растворе трис-НС1 0,03 М (рН 7,5), содержащем 3 мМ MgClj), раствор ют в 1 мл буферного раствора трис-НС1 О., 1 М (рН /,7), содержащем NaCl 0,2 М и MgClj 0,05 М, и подвергают диализу в течение 6 ч против 200 мл буферного раствора Не- pes 0,1 М (рН 7,7), содержащего NaCl 0,1 М и MgCl,, 0,05 М. Диализ повто

р ют 4 раза.

100 мг г1оли(К,Ы-диметилакриламид- ной) смолы, полученной по этапу 6, оставл ют набухать в 50 мп К,Н-ди метилацета -й€да. Пт; ;- мерно через 3 ч частицы достнг-ашт точки максимального набухани , и-юлу отфильтровывают и п тикратно щломы.зают в 100 мл буферного раствора К грез 0,1 М(рН7,7), а затем повтор ют промывку в 100 мл буферного раствора Hepes О,1 М

(рН 7,7)5 содержащем NaCl О,1 М и KgClj 0,05 М.

Полученную влажную смолу помещают в колбу объемом 10 MJ, прибавл ют 70 мкг фермента R 39, растворенного в 1,75 мл раствора Hepes 0,1 М, содержащего 0,1 М NaCl и 0,05 М MgCl.. Затем колбу вращают со скоростью 100 об, в течение 16 ч при температуре окрузхающе. й среды.

Смолу отфильтровывают, п тикратно промывают в 10 мл буферного раствора Hepes 0,1 М (pEf 7,7), содержащем 0,1 М NaCl и 0,05 М MgCl. Затем смолу выдер.хивают под вакуумом Б течение 30 мин.

Получают 503 мг смолы Ферментативна  активность фермента R 39, иммобилизованного ча смоле,, соответствует 15 мкг. Выход или производита,аьность иммобилизации составл ет 21%«

Готов т раствор субстрата содер 6 мг N-альфа, Ы-э(1СН.;7он--диаце тил-Ь-лизин-0-ал нкл-С-ал :.нкна или

К-альфа-ацетил-Ь-лизил-В-аланил-В- аланина в 1 мл воды.

Готов т суспензию, содержащую 5 мг D-аминокислоты-оксидазы (специфическа  активность 15 ед,/мг) в 1 мл вод- кого трехмольного раствора сульфата аммони .

Готов т раствор флавийа-аденина- динуклеотида (ФАД), содержащий 500 мкг ФАД в 6 мл буферного раствора трис- НС1 0,1 М (рН 8,0)

Приготавливают раствор, содержащий 50 мкг пероксидазы в 1 мл воды, и раствор, содержащий 2,6 мг дихлор- гидрата о-дианизидина в 500 мкл воды

Определение провод т следующим образом.

Готов т серию образцов по 1 мл молока , в которых содержитс  известна  концентраци  пенициллина G, а также два образца (белый и сравнительный) без .пенициллина G. К каждому образцу прибавл ют мг иммобилизованного фермента ft 39 и инкубируют смеси в течение 20 мин при 37°С. После инку- бации молоко отдел ют от фиксированного фермента, промывают последний трехкратно в 1 мл буфера Hepes О,1 М (рН 7,7), содержащего 0,1 М NaCl и 0,05 М MgCl. Затем к ферменту до- бавл ют 20 мкл буфера Hepes 0,1 М (рН 7,7), содержащего 0,1 М NaCl и 0,05 М MgClj и 10 мкл раствора субстрата (дп  сравнительного образца и образцов, содержащих пенициллин G) или 20 мкл буферного раствора Hepes и 10 мкл воды (дл  белого образца). Инкубируют смеси в течение 30 мин при 37 С. В процессе инкубации прибавл ют в полученную смесь 2 мкл сус пензии. D-аминокислоты-оксидазы, 60 мкл раствора ФАД. 1.0 мкл раствора пероксидазы и 5 мкл раствора о-дианизидина . Затем смеси дополнительно инкубируют в течение 10 мин при 37 С

На спектрофотометре измер ют опти ческую плотность полученных окрашенных растворов. Дп   этого ввод т. 1 мл раствора метанол - вода (1:1) в кювету и измер ют оптическую плотность при 460 нм.

Вьрштают значение оптической плотности , найденное дл  белого образца, из значений, полученнь х дл  сравни- тельного образца и всех других образцов . Затем вычисл ют процентное вьфа жение остаточной ферментативной активности дл  каждого образца, исход 

из значений оптической плотности, полученных ранее.

Результаты определени  концентрации пенициллина G в молоке двух серий образцов приведены в табл.1

Полученные результаты воспроизвод т в виде графика, по оси которого откладывают концентрации пенициллина в ед.акт./мл, а по оси ординат - процентное.вьфажение остаточной ферментативной активности« Этот график служит эталоном в последующих определени х концентрации антибиотика в молоке.

Данным способом определ ют концентрацию антибиотика пор дка 0,0005 ед, акт./мл молока (известным способом - 0,01 - 0,001 ед.акт./мл исследуемой жидкости).

Пример 2. Определ ют концентрацию пенициллина G в сыворотке или моче. Опыт провод т аналогично примеру 1, использу  1 мл сыворотки или мочи.

Результаты определени  концентрации пенициллина G в сыворотке представлены в табл.2.

Результаты определени  концентрации пенициллина G в моче представлены в табл.3.

При использовании сыворотки и Мочи способ позвол ет определ ть концентрацию пенициллина G 0,003 ед.акт,/мл.

Известный способ не позвол ет определ ть пенициллин в моче.

П р и М е р 3. Опыт провод т аналогично примерам 1 и 2, но в сыворотке определ ют концентрацию цефалоспо- рина С.

Результаты определени  концентрации цефалоспорина С в сыворотке приведены в табл.4.

Пример 4. Определение концентрации цефалоспорина С в сыворотке при высокой температуре.

Опыт осуществл ют в услови х, аналогичных примеру 3, но инкубацию осуществл ют при температуре.47 G, врем  инкубации сокращают вдвое. К каждому образцу сыворотки объемом 1 мл прибавл ют предварительно 100 мкл буферного раствора Hepes 0,5 М (рН 7,7), содержащего NaCl 0,5 М и MgCl 0525М. Результаты определени  приведены в табл.5.

Из данных опыта следует, что способ можно осуществл ть при повышенной

5

температуре, ускор   врем  проведени  определени .

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Ферментативный способ определени  концентрации антибиотика с бета-лак- тамным кольцом в биологической жидкости , путем инкубировани  исследуемой пробы с В-аланил-В-аланин-карбо- ксипептйдаЗой, продуцируемой Actino- madura R 39, с последующим инкубированием полученного комплекса антибиотика с ферментом с раствором субстрата N-альфа, N-эпсилон-диацетил- -Ь-лизил-В-аланил-В-аланина или N- альфа-ацетил-Ь-лизил-В-апанил-В-ала13353 5

   нина, с последующим определением количества образовавшегос  В-аланина, по концентрации которого определ ют остаточную ферментативную активность,

   5 и определением количества антибиотика по разности концентраций фермента по сравнению с контролем, отличающийс  тем, что, с целью повышени  чувствительности способа,

   JO инкубирование пробы осуществл ют с ферментом, иммобилизованным ковалент- но на поли-(Н,К-диметилакриламидной) смоле сетчатой структуры, перед инкубированием с.раствором субстрата

   15 комплекс антибиотика с ферментом отдел ют и промывают буферным раствором с рН 7j7

   Таблица 1

   Зветло-желтый

   Жепто-коричневый Коричневый 11

   GB етло-желтый

   Светло-желтьм

   Жел тый

   Желто-коричневый

   100Коричневый

   С.В е тл о-жел ThiH

   Таблица2

   ТаблицаЗ

   ТаблицаА

   О.Светло-желтый

   8 44Желто-коричневый

   100Коричневый

   -Светло-желтый

   10 2 1

   О О

   0,040 0,035 0,095

   О, 180 0,035

   Составитель Г.Смирнова Редактор Н.Лазаренко . Техред М.Ходанич Корректор Е.Рошко

   Заказ 1984/59Тираж 500Подписное

   ВНИИГШ Государственного кo raтeтa СССР

   по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушска  наб., д. 4/5

   Производственно-полиграфическое предпри тие, г.Ужгород, ул.Проектна , 4

   ТаблицаЬ

   О

   О

   41

   Светло-желтый

   Желто-коричневый

   100 Коричневый

   - Светло-желтый