Opis patentowy opublikowano: 89 06 30 144340 Int. Cl.4 C12Q 1/36 G01N 33/00 TWÓrca wynalazku Uprawniony z patentu: UCB, Bruksela (Belgia) SPOSÓB ENZYMATYCZNEGO OZNACZANIA ANTYBIOTYKÓW 0 PIERSCIENIU BETA-LAKTAMOWYM ORAZ ZESTAW ANALITYCZNY DO OZNACZANIA ANTYBIOTYK** 0 PIERSCIENIU BETA- LAKTAMOWYM Rrzedmiotem wynalazku jest nowy sposób oznaczania antybiotyków o pierscieniu beta-laktamowym w cieczach biologicznych, oraz zestaw analityczny do szybkiego ozna¬ czania antybiotyków o pierscieniu beta-laktamowym w cieczach biologicznych* W chwili obecnej antybiotyki sa bardzo szeroko stosowane nie tylko jako leki do zwalczania chorób infekcyjnych wywolanych bakteriami, lecz takze jako srodki kon¬ serwujace zywnosc oraz jako dodatki do pasz w celu stymulowania wzrostu zwierzat.W tej sytuacji coraz bardziej potrzebna staje sie mozliwosc oznaczania obecnosci anty¬ biotyków, nawet w bardzo malych stezeniaeh, w zlozonych cieczach biologicznych takich jak mleko, mocz, krew, surowica, slina, ekstrakty miesne, ciecze fermentacyjne itp.Za przyklad moze posluzyc produkcja mleka. Znane jest stosowanie penicylin do leczenia niektórych chorób infekcyjnych bydla produkujacego mleko, na przyklad zapale* nie wymion* Z oczywistych wzgledów medycznych mleko przeznaczone do konsumpcji dla lu¬ dzi winno byc wolne od wszelkich sladów antybiotyków* Z drugiej strony moga niekiedy wystapic przy produkcji pochodnych mleka, jak sery, jogurty itp* stezenia penicyliny rzedu 0,003 jednostek miedzynarodowych (tLI*/ml) lub mniejsze* Oczywista staje sie wiec potrzeba szybkiego i precyzyjnego oznaczania stezenia penicylin w mleku produkowanym przez bydlo, korzystnie na miejscu w gospodarstwach hodowlanych lub zlewniach* 2iane sa od dluzszego czasu sposoby mikrobiologiczne pozwalajace na oznaczenie stosunkowo malych stezen antybiotyków beta-laktamowych w cieczach biologicznych* Sposoby te bazuja na pomiarze inhibitowania wzrostu mikroorganizmów wrazliwych na 144 340z 144 340 antybiotyki, w obecnosci próbki cieczy biologicznej. Jednakie sa one czasochlonne i wymagaja wysokiej techniki; w najlepszym przypadku czas potrzebny na uzyskanie wy¬ niku wynosi 2-3 gjodzin, co w praktyce trwa za dlugo* Od niedawna znana jest równiez szybka metoda mikrobiologiczna oznaczania antybiotyków w cieczy biologicznej, zwlaszcza w mleku (opis patentowy Stanów Zjedno¬ czonych Ameryki, nr 4 239 852 )* V metodzie tej próbke badanej cieczy poddaje sie in¬ kubacji, z jedne* strony z komórkami lub czesciami komórek mikroorganizmu bardzo wrazliwego na antybiotyki, zwlaszcza Yaclllus stearothermophilus, 1 z drugiej strony z antybiotykiem znaczonym pierwiastkiem radioaktywnym lub enzymem* W czasie inku¬ bacji antybiotyk ewentualnie wystcrajacy w próbce 1 antybiotyk znaczony zaczynaja konkurowac ze soba o umieszczenie w punktach odbiorczych komórek lub czesci komórek* Nastepnie oznacza sie ilosc antybiotyku znaczonego zwiazanego z komórkami lub z czescia komórek, dostarcza to wskazówki co do obecnosci (lub braku) antybiotyków, przy uwzglednieniu faktu, ze ilosc antybiotyku znaczonego zwiazanego jest odwrotnie pro¬ porcjonalna do stezenia antybiotyku w próbce* Wedlug tego opisu patentowego omawiany sposób pozwala na oznaczenie w mleku w czasie krótszym niz 13 minut stezen antybioty¬ ków wynoszacych zaledwie 0,01 li l/ml, a nawet 0,001 UL I./ml* Jednakie glówna niedogodnosc tego procesu polega na tym, ze dla jego reali¬ zacji niezbedny jest antybiotyk znaczny pierwiastkiem radioaktywnym 0 C lub J), który musi byc oznaczany za pomoca specjalnego aparatu* na przyklad licznika scynty¬ lacyjnego* Fbnadto manipulowanie produktami radioaktywnymi* nawet w bardzo malych ilosciach* nie jest wolne od zagrozenia dla osoby wykonujacej analize* Rrawda jest, ze w przykladzie II wymienionego opisu patentowego opisano wariant tej metody* wedlug którego stosuje sie antybiotyk znaczony enzymem i w którym zawar¬ tosc znaczonego antybiotyku oznacza sie metoda kolorymetryczna-wizualna* Jednakze wariant ten pozwala tylko na oznaczenie czy penicyliny w próbce mleka jest wiecej lub mniej niz 0,05 Ul L/ml* Sposób ten jest wiec duzo mniej czuly 1 w zwiazku z tym duzo mniej interesujacy* W ostatnio opublikowanej pracy J*M»Frere'a,aKlelna9 J.M. Ghuysena, Antimio- robial Agenta and Chemotherapy* 18 (1980, nr 4), str* 306-510 opisano enzymatyczny sposób pozwalajacy na oznaczanie malych stezen antybiotyków beta-laktamowych w suro¬ wicy ludzkiej i w mleku* Metoda ta nazwana metoda J*M»Frere'a jest duzo bardziej inte¬ resujaca, gdyz nie wymaga stosowania produktów radioaktywnych 1 naukowej aparatury pomiarowej, a jest bardzo szybka 1 wysoce precyzyjna* W metodzie tej stosuje sie spe¬ cyficzny enzym* rozpuszczalna D»alanylo-D-alaninokarboksypeptydaze egzokomórkowa* produkowana przez Actinomadura R 39 (nazywana poprzednio Streptomyces R 39)• R)nizej enzym ten bedzie nazywany "enzymem R 39•• Jak wskazuje nazwa, enzym R 39 posiada spe¬ cyficzne dzialanie hydrolizujace terminalne grupy D-alanylo-D-alaniny róznych pepty- dów* fe przyklad* trójpeptyd N,N-dwu-acetylo-L-lizylo-D-alanylo-Ialaniny ulega re¬ akcji hydrolizy pod katalitycznym wplywem enzymu R 39, wedlug równania: iU^-b-Uz-D-Ala-D-Ala+K^O enzrm » Ac2-I^Uz-D-Ala+D-alaiiina Druga wazna wlasciwosc enzymu R 39 polega na tym* ze reaguje on z antybio¬ tykiem o pierscieniu beta-laktamowym tworzac bardzo szybko równomolowy kompleks enzym-antybiotyk, nieaktywny i wyraznie nieodwracalny* W metodzie J*H, F*ere'a wymienione wlasnosci enzymu R 39 wykorzystano do ozna¬ czania bardzo malych stefcen antybiotyków beta-laktamowych* Sposób obejmuje trzy za¬ sadnicze etapy* V pierwszym etapie okreslona objetosc badanej cieczy inkubuje sie144 340 3 z okreslona iloscia enzymu R 39* Inkubacje prowadzi sie w warunkach pozwalajacych antybiotykowi beta-laktamowemu obecnemu ewentualnie w próbce na reakcje z enzymem dla utworzenia równomolowego kompleksu enzym-antybiotyk9 nieaktywnego i wyraznie nieodwracalnego, W drugim etapie okreslona ilosc sunstratu, na przyklad acetylo-I/*lizylo-Ialanylo-I-alaniny inkubuje sie produktem otrzymanym w pierwszym etapie w warunkach pozwalajacych na hydrolizowanie substratu przez enzym dla utworze¬ nia Ialaniny w ilosci odpowiadajacej resztkowej aktywnosci enzymatycznej enzymu R 39, który nie zostal skompleksowany z antybiotykiem w pierwszym etapie. W trzecim etapie oznacza sie ilosc tak utworzonej D-alaniny# W zaleznosci od zawartosci antybiotyku w próbce, odpowiadajaca tej zawartosci ilosc enzymu R 39 ulegnie dezaktywacji w pierwszym etapie, zas ilosc EHalaniny utwo¬ rzonej w diugim etapie (zalezna oczywiscie od resztkowej aktywnosci enzymu) bedzie odwrotnie proporcjonalna do ilosci antybiotyku obecnego w próbce* Jezeli, na przyklad, próbka nie zawiera antybiotyku, enzym R 39 nie jest dezaktywowany 1 ilosc D-alaniny odpowiada calkowitej aktywnosci uzytego enzymu R 39* I przeciwnie, jesli próbka zawie¬ ra antybiotyk w ilosci molowej równej lub wyzszej od ilosci molowej uzytego enzymu R 39, to ta ostatnia jest calkowicie zdezaktywowana przez antybiotyk 1 nie tworzy sie Ialanina, fbmledzy tymi dwoma skrajnymi przypadkami oznacza sie ilosc Ialaniny odpo¬ wiadajacej % resztkowej aktywnosci R 39* Innymi slowy, ilosc wytworzonej D-ananiny dostarcza precyzyjnej wskazówki ilosciowej o stezeniu antybiotyku obecnego w analizo¬ wanej próbce, W procesie J,M# Frere'a te ilosc lalaniny oznacza sie metoda enzymatyczna* Bazuje ona na dwóch sprzezonych reakcjach enzymatycznych, W reakcji pierwszej lala- nine utlenia sie do kwasu pirogronowego za pomoca oksydazy ^aminokwasu (razem z jej koenzymem - flawino-adenino-dwunukleotydem); równoczesnie tworzy sie odpowiadajaca ilosc nadtlenku wodoru z tlenu powietrza, W drugiej reakcji utworzony nadtlenek wodoru stosowany jest do utleniania o-dwuanlzydyny za pomoca peroksydazy, Z tego powodu w trzecim etapie metody J,M» Frere'a inkubuje sie otrzymana w dru¬ gim etapie mieszanine za pomoca zestawu odczynników zawierajacego oksydaze D-amino- kwasu, jej koenzym tj, flawino-adenino-dwunukleotyd (FAD), peroksydaze i o-dwuanizy- dyne, Fbniewaz utleniona forma o-dwuanizydyny jest barwna, w trakcie jej inkubacji powstaje brazowe zabarwienie, którego intensywnosc Jest funkcja ilosci EKalaniny, ftzwala to na oznaczenie D-alaniny metoda kolorymetryczna, badz wizualnie, badz przez pomiar gestosci optycznej na spektrofotometrze (2 BftZ « 460 nm), Rrzez sporzadzenie serii próbek o znanym stezeniu antybiotyku i przy zastoso¬ waniu omawianej metody mozna ustalic krzywa wzorcowa wiazaca % resztkowej aktywnosci enzymatycznej enzymu R 39 ze stezeniem antybiotyku, EflLa uzyskania ilosciowej wskazówki o stezeniu antybiotyku w próbce, poste¬ puje sie dokladnie w takim sam sposób 1 oznacza sie stezenie antybiotyku w oparciu o krzywa wzoroowa. Taka ilosciowa ocena wymaga oczywiscie dysponowania spektrofo¬ tometrem.Jednakze, by okreslic czy stezenie antybiotyku przekracza lub nie pewna war¬ tosc krytyczna, nie Jest konieczne stosowanie spektrofotometru lub innego podobnego aparatu pomiarowego, Wystarczy wiedziec wczesniej przy Jakim krytycznym stezeniu antybiotyku aktywnosc enzymu R 39 jest calkowicie zahamowana, lub, inaczej mówiac, przy Jakim stezeniu antybiotyku nie tworzy sie D-alanina i wobec tego nie powstaje zabarwienie podczas ostatniej inkubacji. Znajac to krytyczne stezenie mozna oczywis-4 144 340 cle poprzez zwykla kontrole wizualna ocenic, czy w badanej próbce stezenie antybio¬ tyku Jest wieksze badz mniejsze od wymienionego wyzej stezenia krytycznego* Wynika z tego, te metoda ta mozna, bez dysponowania zadnym szczególnym aparatem, uzyskac szybko i precyzyjnie informacje o stezeniu antybiotyku w mleku* fbnadto metoda ta pozwala na oznaczenie stosunkowo malych stezen antybiotyku beta-laktamowego w mleku 1 w surowicy ludzkiej* I tak9 m przyklad, wychodzac z próbek mleka o objetosci okolo 2o jul i inkubujac Je z 3 pikomolami enzymu R 39, mozna ozna¬ czyc ilosciowo, stosujac spektrofotometr stezenia penicyliny wnoszace zaledwie 0,02 UI#/ml mleka oraz Jakosciowo, metoda wizualna opisana wyzej, stezenia wyzsze od 0,09 ULI./ml mleka, w ciagu mniej niz 1 godziny* Jednakze sposób J*M* FTere'a ma rózne powazne niedogodnosci* Ib pierwsze, dla oznaczenia antybiotyków w cieczach biologicznych takich jak mleko, surowica, itp* nie- zbedne Jest wczesniejsze usuniecie z analizowanych próbek substancji mogacych zaklócac •znaczenie kolorymetryczne* Na przyklad, w przypadku mleka nalezy najpierw wytracic pro¬ teiny za pomoca kwasu cytrynowego lub cisnienia, nastepnie przesaczyc taka próbke, tak, aby uzyskac klarowny przesacz, który nie bedzie mógl dalej zaklócac oznaczenia kolo¬ rymetrycznego* Taka operacja wytracania protein jest zlozona i uciazliwa, co powoduje, ze analiza moze byc z trudnoscia wykonywana w punkcie produkcji mleka przez osoby nie- wyspecjallzowane* Ib drugie, czulosc metody J*H* F*ere'a, zwlaszcza w przypadku plynów biologicznych (mleko, slina, surowica itp* ) jest niewystarczajaca* frawda jest, ze czulosc te mozmaby poprawic zmniejszajac ilosc uzytego enzymu R 39. W praktyce, gdyby uzylo sie na przyklad 0,3 pikomola enzymu zamiast 3 plkomoli, mozna by teoretycznie oznaczyc dziesieciokrotnie mniejsze stezenie antybiotyku* Jednakze gdy zmniejszy sie ilosc enzymu trzeba takze przedluzyc w tej samej proporcji czas reakcji pomiedzy anty¬ biotykiem i enzymem R 39 oraz czas hydrolizy substratu* Oznacza to, ze zarówno pierwszy jak i drugi etap procesu trwalby okolo dziesieciokrotnie dluzej* W ten sposób omi- nletoby zasadnicze korzysci metody J*N» Fl*ere'a, a wiec Jej szybkosc, czego nie mozna zaakceptowac* Z drugiej strony mozna by takze usilowac zwiekszyc czulosc przez zwiekszenie objetosci próbki inkubowanej z enzymem R 39* W istocie, gdyby na przyklad uzyto próbke o objetosci 200 f& zamiast 2o jil, moznaby teoretycznie oznaczyc dziesieciokrotnie mniej¬ sze stezenia antybiotyku* W tym przypadku nalezaloby tylko przedluzyc czas reakcji po¬ miedzy antybiotykiem i enzymem R 39, tzn* wylacznie czas pierwszego etapu procesu* Niestety, w ten sposób nie mozna poprawic czulosci metody J*M* F*ere'a, zwlasz¬ cza w przypadku cieczy zlozonych pochodzenia biologicznego* V praktyce stwierdzono, ze nie mozna odpowiednio przeprowadzic oznaczenia, gdy objetosc próbki plynu biologicznego przekracza pewna objetosc krytyczna, która zmienia sie w zaleznosci od rodzaju plynu biologicznego* ¥ przypadku mleka, gdy objetosc próbki poddawanej Inkubacji przekracza okolo 20yul obserwuje sie, ze ilosc utworzonej utlenionej o-dwuanlzydyny jest bardzo zredukowana* fetomiast w przypadku surowicy ma to miejsce, gdy objetosc próbki inkubo¬ wanej z enzymem R 39 przekracza okolo 50 yul* I wreszcie, w przypadku moczu nie oznacza sie zadnej aktywnosci enzymatycznej, nawet przy stosowaniu próbek o objetosci 10 /il# Metoda ta nie nadaje sie wiec do ozna¬ czania antybiotyków w moczu* Przypuszcza sie, ze ciecze biologiczne zawieraja substancje inhlbitujace dzia¬ lanie enzymów stosowanych w procesie* Stad wynika niemoznosc stosowania duzych obje^ tosci próbek*144 340 5 Z tego wzgladu podjeto prace nad opracowaniem nowego sposobu enzymatycznego oznaczania antybiotyków o pierscieniu beta-laktamowym w cieczach biologicznych, który bylby wolny od niedogodnosci wystepujacych w znanym sposobie* W trakcie prowadzonych prac nieoczekiwanie stwierdzono, ze mozliwe jest wyeli¬ minowanie szeregu niedogodnosci metody J.M, Frere'a przez unieruchomienie enzymu R 39 na podlozu nierozpuszczalnym w wodzie, zwlaszcza na zywicy poli/N. H-dwumetyloakrylo- amidowej/* Zapewnia to znaczny postep, bowiem oznaczenie antybiotyków zawierajacych pier¬ scien beta-laktamowy, bedzie mozna przeprowadzic: - bezposrednio po plynach biologicznych jako takich, bez uciazliwego wstepnego kompleksowania, - z bardzo duza czuloscia przy bardzo duzej szybkosci, - w duzo wiekszej liczbie plynów biologicznych, a zwlaszcza w moczu, - poza laboratorium specjalistycznym, bezposrednio w miejscu produkcji, przez personel niespecjalistyczny* Nie po raz pierwszy wykorzystuje sie enzymy unieruchomiane na podlozu nieroz¬ puszczalnym w wodzie (patrz na przyklad polskie opisy patentowe nr nr 91 817, 90 704 i 102 119)* Jednakowoz dotychczas unieruchomione enzymy stosowano zawsze jako kataliza¬ tory w reakcjach syntezy* Unieruchomienie enzymu pozwala na latwe jego odzyskanie pod koniec reakcji i zastosowanie ponowne do nastepnych syntez* Tak wiec, w polskich opi¬ sach patentowych nr nr 91 817 i 90 704 opisano miedzy innymi unieruchomienie penicy- lino-acylazy na podlozu stalym i zaproponowano zastosowanie tak unieruchomionej perli¬ cylino-acylazy do produkcji kwasu 6-amino-penicylanowego w penicyliny* W polskim opisie patentowym nr 102 119 zilustrowano w przykladach wykonania wynalazku hydrolize skrobi! do glikozy za pomoca glikozo-amylazy unieruchomionej na nierozpuszczalnym podlozu wprowadzonym do kolumny* Sposób polega na przepuszczaniu roztworu skrobi! przez kolu¬ mne w sposób ciagly przez kolejnych 4o dni* opisano równiez konwersje laktozy do glu¬ kozy i galaktozy w sposób ciagly przez kolejnych 29 dni z uzyciem laktamazy unierucho¬ mionej na podlozu stalym* felezy jednakowo zauwazyc, ze w opisach tych nie wzmianko¬ wano o mozliwosci zastosowanie unieruchomionych enzymów na podlozu w celu oznaczenia antybiotyków w plynach biologicznych* Wedlug wynalazku enzymatyczny sposób oznaczania antybiotyków zawierajacych pierscien beta-laktamowy, w cieczach biologicznych obejmuje etapy: (1) inkubowania wymienionej cieczy biologicznej z rozpuszczalna D-alanylo-D- alanino-karboksypeptydaza produkowana przez Actinomadura R 39, przy czym inkubacje te prowadzi sie w warunkach pozwalajacych antybiotykowi beta-laktamowemu ewentualnie obec¬ nemu w wymienionej cieczy na reakcje z enzymem do utworzenia nieaktywnego i w zasadzie nieodwracalnego równomolowego kompleksu enzym-antybiotyk; (2) lnkubowania produktu otrzymanego pod koniec etapu (1) z roztworem peptydu w warunkach hydrolizy tego peptydu przez enzym z utworzeniem pewnych ilosci D-alaniny odpowiadajacych pozostalosci aktywnosci enzymatycznej; (3) oznaczenia ilosci D-alaniny utworzonej w etapie (2), (4) porównania oznaczenia z etapu (3) ze wzorcem oznaczajac stezenie antybio¬ tyku w cieczy biologicznej 1 polega na tym, ze D-alanylo-D-alaninokarboksypeptydaze lnkubowana w etapie (1) unieruchamia sie na podlozu nierozpuszczalnym w wodzie 1 w wa¬ runkach etapu (1) unieruchomiony enzym oddziela sie od cieczy biologicznej 1 przemywa, po czym przeprowadza sie inkubacje z roztworem peptydu w etapie (2)*6 144 340 Jako nierozpuszczalne w wodzie podloze stosuje sie sieciowana zywice poli/N»ft» dimetyloakryloamidowa), Etozym unieruchamia sie na zywicy poll/N, H-dinetyloakryloanido- wej/ przez polaczenie za pomoca wiazania kowalencyjnego.Sposób ten stosuje sie do oznaczania zawartosci antybiotyków w mleku, surowicy, moczu, krwi, slinie, ekstraktach miesnych i cieczach fermentacyjnych* Zestaw anali¬ tyczny do oznaczania antybiotyków zawierajacych pierscien beta-laktamowy w cieczy bio¬ logicznej sklada sie z (1)3 plkomoli D-alanylo-lalania-karboksypeptydazy produkowanej przez Actinomadura R 39; (2) 160 nanomoli peptydu zawierajacego ugrupowanie D-alanylo-D-alaniny; (3) reagentów do oznaczania D-alaniny obejmujacych (a) oksydaze D-aminokwasowa, (b) peroksydaze i (c) wskaznik redoks, (4) ewentualnie wzorzec w stosunku do którego porównuje sie wyniki próby prze¬ prowadzonej z reagentami (1)(2)l(3)* przy czym zestaw wedlug wynalazku zawiera D-ala- nylo-D-alaninokarboksypeptydaze osadzona na podlozu nierozpuszczalnym w wodzie, W odróznieniu od metody J#M» R*ere'a sposób wedlug wynalazku pozwala na wyko¬ nanie oznaczenia bezposrednio z plynem biologicznym w postaci niezmienionej. Nie ma po¬ trzeby wczesniejszego usuwania z próbek, poddawanych oznaczeniu, substancji mogacych zaklócac oznaczenie kolorymetryczne* Ebniewaz enzym R 39 jest unieruchomiony na podlozu nierozpuszczalnym w wodzie, po jego reakcji z antybiotykiem ewentualnie wystcmjacym w plynie biologicznym, mozna go latwo oddzielic od tego plynu przez zwykle odsaczenie i przemycie, W zwiazku z tym, w czasie dalszych operacji nie ma wiecej zadnych mozliwosci wplywania enzymu na plyn biologiczny, gdyz zostal on usuniety po zakonczeniu etapu (1 ) procesu* W ten sposób unika sie zasadniczych niedogodnosci metody J«M» Frere'a, Ibnadto, nieoczekiwanie stwierdzono, ze stosujac sposób wedlug wynalazku mozna bez najmniejszych trudnosci prowadzic doskonale oznaczenia przy objetosclach próbki plynu biologicznego zawartych pomiedzy 200 yul i 5 ml.Stwierdzenie to ma kapitalne znaczenie. Jak juz wyjasniono wyzej, zwiekszajac objetosc próbki poddawanej inkubacji z enzymem R 39 mozna poprawic czulosc procesu.Otóz, jedna z niedogodnosci metody J,M, Ffcrere'a polegala na tym, ze nie mozna bylo przekroczyc pewnej objetosci krytycznej (rzedu 2o /ii dla mleka i 30 ;ul dla serum), Fb- niewaz w sposobie wedlug wynalazku przeszkoda ta zostala usunieta, stalo sie oczy¬ wiste, ze w odróznieniu od metody J,H, F*ere'a sposób wedlug wynalazku pozwala na uzys¬ kanie duzo wlgcszej czulosci oznaczenia plynów biologicznych, takich jak mleko, suro¬ wica itp. Jak zostanie to pokazane dalej w przakladach, sposób wedlug wynalazku po¬ zwala na oznaczenie w 1 ml próbkach mleka, wizualnie 1 w sposób pewny, stezen penicy¬ liny G powyzej 0,002 Ul I./ml Mleka/1,2 ng/ml/ oraz, ze pomoca spektrofotometru, tak malych stezen jak 0,0005 U, L/ml mleka (0,3 ng/ml) w czasie krótszym od 1 godziny, Ela porównania nalezy przypomniec, ze sposób wedlug opisu patentowego Stanów Zjedno¬ czonych Ameryki nr 4 239 832 pozwala na oznaczanie stezen rzedu 0,01-0,001 U. I,/ml mleka, jednakze pod warunkiem uzycia.produktów radioaktywnych 1 licznika scyntyla¬ cyjnego* Ibnadto stwierdzono, ze sposób wedlug wynalazki moze byc stoowsany z powodze¬ niem nie tylko do oznaczania antybiotyku w mleku i w surowicy lecz takze w innych zlo¬ zonych plynach biologicznych, jak na przyklad w moczu, krwi, slinie, ekstraktach miesnych, cieczach fermentacyjnych ltp# Z tego punktu widzenia sposób wedlug wynalazku stanowi wiec znaczny post9 w porównaniu z metoda J,W* F*ere'a,144 340 7 Zasadnicza korzysc procesu wedlug wynalazku polega wiec na tym, te pozwala on szybko oznaczac bardzo male stezenia antybiotyków beta-laktamowych, na przyklad rzedu 09002 UU I*/ml w najrózniejszych plynach biologicznych, bez stosowania specjalistycz¬ nego aparatu analitycznego.Antybiotyki, których stezenie mozna oznaczac sposobem wedlug wynalazku, naleza do grupy charakteryzujacej sie wystepowaniem pierscienia beta-laktamowego w czastecz¬ ce, tzn* w zasadzie wszystkich penicylin i cefalosporyn* Jako przyklady penicylin moz¬ na przytoczyc benzylopenicyline (penicyline G), ampucyline, fenoksymetylopenicyllne, karbonicyline, meticyllne, oksacyline, kloksacyline itp. Jako przyklady cefalosporyn mozna przytoczyc cefalosporyne 0, cefaloglicyne, cefalotyne cefaloksyne itp.Szczególnie korzystne rezultaty otrzymano z penicylina C# W etapie 1) sposobu wedlug wynalazku okreslona objetosc próbki plynu biologicz¬ nego inkubuje sie z okreslona iloscia enzymu R 39 unieruchomionego na podlozu nieroz¬ puszczalnym w wodzie* Jak wyjasniono powyzej, dzieki unieruchomieniu enzymu R 39 na podlozu nieroz¬ puszczalnym w wodzie mozliwe jest operowanie bardzo duzymi objetosoiami próbek* Zwiek¬ szenie objetosci próbki równolegle zwieksza czulosc procesu* Na przyklad, przy podwo¬ jeniu objetosci próbki czulosc zwiesza sie dwukrotnie, przy potrojeniu objetosci próbki czulosc wzrasta trzykrotnie itd* objetosc próbki mozna wiec dobrac w zaleznosci od pozadanej czulosci* Ni przyklad w przypadku mleka czulosc procesu mozna dostoso¬ wac do ustalonych norm prawnych kraju, w którym jest on stosowany, badz tez do wymagan przemyslu mleczarskiego* frawda jest, ze taki sam rezultat mozna uzyskac przez zmniejszenie, ilosci enzymu R 39* Jednakze w tym przypadku nalezy proporcjonalnie zwiekszyc nie tylko czas trwania etapu (1) lecz takze etapu (2) procesu, podczas gdy przy zwiekszeniu objetosci próbki przedluza sie tylko czas etapu (1)* Korzystne jest wiec operowanie stala iloscia enzymu R 39, na przyklad z iloscia okolo 3 pikomoli i dostosowanie, w zaleznosci od okolicznosci, objetosc próbki do zadanej czulosci* W praktyce stosuje sie objetosci próbki zawarte pomiedzy 200 /ul i 5 al, po¬ zwalajace na oznaczenie bardzo malych stezen antybiotyku, na przyklad rzedu 0,002 U. I*/ml penicyliny, w czasie 1 godziny lub krótszym* Doskonala czulosc, szybkosc i precyzja sposobu wedlug wynalazku wynikaja ze szczególnych wlasciwosci enzymu R 39 z jednej strony oraz z jego unieruchomieniem na podlozu nierozpuszczalnym w wodzie z drugiej strony* Enzym R 39 charakteryzuje siei - wyjatkowo szybkim tworzeniem równomolowego, nieaktywnego kompleksu enzym-antybiotyk - wyjatkowa trwaloscia tego kompleksu, który, raz utworzony, rozklada sie bardzo po¬ woli* Je przyklad, okres póltrwania kompleksu utworzonego z enzymu R 39 i penicyliny C wynosi okolo 70 godzin w temperaturze 37°C; - znakomita aktywnoscia enzymatyczna wyrazajaca sie bardzo szybka hydroliza terminal¬ nych ugrupowan D-alanylo-D-alaniny z substratu peptydowego, DEieki tym trzem wlasciwosciom, enzym R 39 zajmuje uprzywilejowana pozycje w sto¬ sunku do D-alanylo-D-alanino-karboksypeptydaz zidentyfikowanych do chwili obecnej* Biorac pod uwage, ze czas rozkladu kompleksu enzym-antybiotyk jest wielokrotnie dluz¬ szy od calkowitego czasu potrzebnego odpowiednio do utworzenia kompleksu i dc pomiaru resztkowej aktywnosci enzymatycznej, nie ma obawy, ze rezultaty oznaczenia beda falszy¬ we wskutek uwolnienia aktywnego enzymu w wyniku przedwczesnego rozkladu kompleksu enzym-antybiotyk*8 144 340 Gdy bada sie znana obecnie D*lanylo-D-alaninokarboksypeptydazy, stwierdza sie, ta poza enzymem R 39 nie na zadnego innego spelniajacego znakomicie te warunki; chodzi tu badz o szybkosc tworzenia kompleksu, kilkadziesiat razy mniejsza, badz o stabilnosc kompleksu antybiotyk-enzym, która Jest absolutnie niezadowalajaca, badz tez o szybkosc hydrolizy substratu peptydowego, która Jest dulo mniejsza (dzieje sie tak zwlaszcza w przypadku wszystkich karboksypeptydaz endokomórkowych zwiazanych z membrana bakteryjna)* Bazym R 39 jest rozpuszczalna specyficzna Ialanylo-I-alanino-karboksypeptyda- za egzokomórkowa wydzielana przez Actlnomadura R 399 Jesli ten mikroorganizm Jest hodo¬ wany w dogodnym srodowisku (Actlnomadura R 39 zostal zgloszony 10 lipca 1981 r# w Insty¬ tucie ffesteura w Riryzu nr 1-127).Dla stosowania w sposobie wedlug wynalazku enzym ten misi byc oczywiscie abso¬ lutnie czysty* Jego wytwarzanie 1 oczyszczanie moga byc prowadzone sposobami znanymi z literatury (patrz praca J«M,Ft*ere'a i wspólprac, Blochem. J. 143, 233-240 /1974/ pt. "lblecular Weight, Amlnoacid Oomposition and ftoyslcochemlcal froperties of the Bcocellular DD-Carboxypeptldase franspeptidase of Streptomyces R-39). Jednakze enzym ten w stanie czystym jest obecnie dostepny w handlu (UOB BIOFRODUCTS, S.A., Belgia).W sposobie wedlug wynalazku rozpuszczalny enzym R 39 jest unieruchomiony na podloiu nierozpuszczalnym w wodzie.Metoda stosowana do tego unieruchomienia nie Jest krytyczna. Do tego celu moz¬ na stosowac wszystkie konwencjonalne znane sposoby, a sposród nich zwlaszcza te, któ¬ re polegaja badz na zwiazaniu enzymu z podlozem za pomoca wiazania kowalencyjnego, badz na adsorpcji fizycznej enzymu na podlozu, badz tez na zatrzymaniu enzymu w matrycy polimeru.Równiez rodzaj materialu podloza nie jest krytyczny* W zasadzie mozna uzyc do¬ wolny znany material nierozpuszczalny w wodzie, organiczny lub nieorganiczny, stosowa¬ ny zazwyczaj do unieruchamiania enzymu. Jako odpowiednie materialy na podlozu mozna przytoczyc polimery naturalne takie jak celuloza 1 Jej pochodne, agaroza, skrobia 1 jej pochodne, dekstran, kolagen, keratyne itp., polimery syntetyczne takie jak poliakry- loamidy usleciowane w postaci perel lub zeli; polistyreny usleciowane; kopolimery etylen -bezwodnik maleinowy,; poliamidy, polimetakrylany 2-hydroksyetylowe usleciowane; zywice jonowymienne; itp. substancje nieorganiczne takie jak szklo, tlenek glinu, krzemionka, weglan wapnia, hydroksyapatyt, glinki itp.Oczywiscie zrozumiale jest, ze nalezy wybrac taka metode unieruchamiania, która pozostawi nietkniete wszystkie wlasnosci enzymu R 39 i która w zaden sposób nie na¬ ruszy jego aktywnosci enzymatycznej, nawet po dluzszym okresie przechowywania.Szczególnie korzystnym materialem podloza do stosowania w sposobie wedlug wy¬ nalazku Jest zywica poli/N, N-dwumetyloakryloamidowa/ usleclowana, której uzycie propo¬ nowano juz w syntezie pollpeptydów w fazie stalej (R.Arshady 1 wspólprac*, J.Chem^Soc.Oiem. ODmmun. 1979. nr 9, 423-425). Zywica ta ulega latwo spulchenieniu w wielu rozpusz¬ czalnikach, tak organicznych Jak 1 wodnych (woda, metanol, N, N-dwumetyloformamld, N,N- dwumetyloacetamid, pirydyna lub dwuchlorometan) a ponadto Jest latwa do manipulowania.Korzystnie otrzymuje sie ja przez kopolimeryzacje emulsyjna mieszaniny N,H-dwumetylo- akryloamidu, N,N'-etylenoblsakryloamldu 1 estru metylowego N-akrylollosarkozyny# V tych warunkach otrzymuje sie zywice w postaci stalych czastek, na przyklad kulek lub perelek, których granulometrla Jest korzystnie zawarta pomiedzy 0,1 mm i 2 mm 1 które dzieki temu moga byc latwo oddzielone przez filtracje.144 340 9 Zywica taka posiada usieciowana strukture trójwymiarowa, w której lancuchy po¬ limeru sa zwiazane ze soba przez Nf N-etylenobisakryloamid (który dziala Jako srodek sie¬ ciujacy) i która zawiera ponadto grupy estrowe, dzieki wprowadzeniu estru metylowego I^akryloilosarkozyny (CH2 » CH-CO-H/CH^Z-O^-COOCH^) do lancuchów polimeru, R zakonczeniu polimeryzacji takiej zywicy, przeksztalca sie zawarte w niej grupy estrowe w grupy aminowe funkcyjne przez reakcje w etylenodwuamina* wedlug równania: Iblimer-CO-N/CH3/-C^-CCXXM3+H2WCH2/2-M^ Rjlimer -CO-N/CH3/-CH2-CONH-/C^/2-NHk Taka zmodyfikowana zywica poliZN*N-dwumetyloakryloamidowa.Z zawiera zazwyczaj 0,2-1 mmola etylanodwuamlny na gram zywicy* W takiej postaci stanowi ona material ideal¬ nego podloza dla unieruchomienia enzymu R 39# Iliieruchomienie prowadzi sie korzystnie przez zwiazanie enzymu R 39 z zywica poprzez wiazanie kowalencyjne* V odróznieniu od in¬ nych metod unieruchomienia metoda ta pozwala na unikniecie ucieczki enzymu z podloza* Wiazanie kowalencyjne enzymu R 39 z zywica poli/N,N-dwumetyloakryloamidowa/, zmodyfikowana etylenodwuamina jak wyjasniono wyzejf moze byc przeprowadzona na przyklad za pomoca dogodnego srodka wiazacego zawierajacego grupe funkcyjna mogaca reagowac z funkcyjnymi grupami aminowymi zywicy poliZN*N-dwumetyloakryloamldowejZ i druga grupe funkcyjna mogaca reagowac z wolnymi grupami aminowymi enzymu R 39* Korzystnie stosuje sie srodki wiazace zawierajace grupy estrowe, których okres póltrwania w srodowisku wodnym jest wystarczajaco dlugi* Jak na przyklad dwuestry N-hy- droksysukcynimidu kwasu dwukarboksylowego alifatycznego zawierajacego 4-9 atomów wegla, takiego jak kwas glutarowy, suberynowy* itp* Fbniewaz reakcje wiazania z wolnymi gru¬ pami aminowymi enzymu R 39 prowadzi sie w srodowisku wodnym* niezbedne jest* by grupy funkcyjne srodka wiazacego byly w nim wystarczajaco trwale* W celu zwiazania enzymu R 39 z zywica poli/N,N-dwumetyloakryloamidowa/ zmody¬ fikowana etylenodwuamina, najpierw zywice te poddaje sie reakcji z dwuestrem IMrydro- ksysukcynimidu w dogodnym rozpuszczalniku organicznym (na przyklad N, N-dwumetyloaceta- midzie) w celu unikniecia hydrolizy grup estrowych* W reakcji tej funkcyjne grupy ami¬ nowe zywicy sa przeksztalcone w funkcyjne grupy estrowe, wedlug równania przedstawio¬ nego schematem 1. w którym n oznacza liczbe calkowita 2-7* Nastanie prowadzi sie wiazanie enzymu R 39 z zywica przez reakcje funkcyjna grup estrowych* wprowadzonych do tej zywicy poprzez ester N-hydroksyiukcynimidowy, z wolnymi grupami aminowymi enzymu R 39, wedlug równania przedstawionego schematem 2. w którym n oznacza liczbe calkowita 2-7* Reakcje wiazania enzymu R 39 z zywica prowadzi sie w ciagu kilku godzin* a tem¬ peratura 0-20°C* w buforze nadajacym sie do doprowadzenia pH do wartosci 7-8,5 ko¬ rzystnie okolo 7.7# Oczywiscie bufor taki winien nie zawierac amin pierwszorzedowych zdolnych do reakcji z estrowymi grupami funkcyjnymi zywicy* R zakonczeniu reakcji wiazania, nleprzereagowane grupy estrowe blokuje sie grupami aminowymi zwiazków takich Jak etanoloamina lub metyloester glicyny* lak otrzy¬ many unieruchomiony enzym, po przemyciu odpowiednim buforem* moze byc stosowany w ta¬ kiej postaci w sposobie wedlug wynalazku* wydajnosci unieruchamiania uzyskane przy stosowaniu tej metody sa znakomite: moga one zmieniac sie od 15 do 95*. w zaleznosci od pH uzytego buforu oraz od czasu 1 temperatury reakcji wiazania* Rmizej podano szczególowy przyklad ilustrujacy omówiona metode unieruchamiania enzymu R 39 na zywicy poli/N,N-dwuaetyloakryloamidowej/# unieruchamianie enzymu R 39 na zywicy poli/N, !Mwumetyloakryloamidowej10 144 3*0 a) Wytwarzanie zywicy poli/N,N*hnimetyloakiyloamidowej/zawierajacej funkcyjne grupy aminowe pochodne etylenodwuaminy Zywice poli/N, N-dwumetyloakryloamldowa/ stosowana jako podloze otrzymano przez kopolimeryzacje emulsyjna mieszaniny fi, N-dwumetyloakryloamldu (12 g)9 N,N'~etylenobis- akryloamldu (1 g) i estru metylowego N-akryloilosarkozyny (1,4 g)9 metoda opisana w pra¬ cy R.Arshady i wspólpr, (J, Chem, Soc, Chem, Oomm, 9 1979, nr 9, 423*423)* Otrzymano okolo 12-13 g zywicy, w postaci perel o granulometrii od 0,1 mm do 10 g tej zywicy dodano do 320 ml etylenodwuaminy i otrzymana mieszanine miesza¬ no w ciagu nocy w temperaturze pokojowej, Ifestepnle zywice odsaczono i przemyto kolejno N,N-dwumetyloformamldem i woda, do obojetnego odczynu przesaczu* Ib koniec zywice prze¬ myto metanolem 1 pozwolono jej na sklesnlecle w eterze dwuetylowym. Otrzymano 10 g zy¬ wicy zawierajacej 0,3 pnola etylenodwuaminy na gram* b) Wytwarzanie zywicy poli/N, N-dwumetyloakryloamidowej/ zawierajacej funkcyjne grupy estrowe pochodne dwuestru N-hydroksysukcynimidu kwasu glutarowego b,1. Wytwarzanie dwuestru N-hydroksysukcynimidu kwasu glutarowego 6,7 g kwasu glutarowego i 12,7 g IMiydroksysukcynimidu rozpuszczono w 50 ml N, IMwumetylcacetamidu w temperaturze 0°C, Do mieszaniny wkroplono roztwór 23,7 g dwu- cykloheksylokarbodwuimidu w 50 ml dwuchlorometanu. Doprowadzono do temperatury pokojowej, po czym po pozostawieniu na noc, mieszanine przesaczono i odparowano przesacz, Rzosta- losc przekrystalizowano z eteru dwumetylowego. Otrzymano dwuester N-hydroksysukcynimidu kwasu glutarowego z wydajnoscia prawie ilosciowa, b,2. Wytwarzanie zywicy poli/N, N-dwumetyloakryloamidowej/ zawierajacej funkcyjne grupy estrowe 500 mg zywicy poli/N, N-dwumetyloakryloamidovej/ zawierajacej funkcyjne grupy aminowe pochodne etylenodwuaminy, otrzymanej jak opisano w a), zawieszono w 50 ml N,N-" dwumetyloacetamldu. Dodano 2 g dwuestru N-hydroksysukcynimidu kwasu glutarowego (otrzy¬ manego jak opisano w b,1). Otrzymana mieszanine mieszano w ciagu 24 godzin w tempera¬ turze pokojowej. Koniec reakcji stwierdzono za pomoca testu E,Kaisera (Anal, Blochem, 34 /1970/, nr 2-595-8), Zywice przesaczono i przemyto Ja pieciokrotnie 100 ml N,N-dwumety- loacetamidu i pieciokrotnie 100 ml metanolu, po czym pozwolono zywicy na sklesnlecie w eterze dwumetylowym, c) Ulieruchamlanie enzymu R 39 na zywicy poli/N, N-dwumetyloakryloamidowej/ za¬ wierajacej estrowe grupy funkcyjne pochodne dwuestru N-hydroksysukcynimidu kwasu glu¬ tarowego c,1. Wytwarzanie enzymu R 39 Stosowany w procesie enzym R 39 sporzadzono 1 oczyszczono metoda opisana w pra¬ cy J,*VF*ere'a i wspólprac, (Blochem, J, 143 /1974/, 223-240 )? Tak otrzymany enzym posiadal aktywnosc wlasciwa 19,8 jednostek/mg proteiny.Jedna Jednostka enzymu R 39 katalizuje hydrolize 1 jimola #lfa, ffpsllon-dwuacetylo-L- Lizylo-D-alanylo-IValaniny na minute w temperaturze 37°C, jesli enzym Jest ihkubowany z roztworem S mN substratu w buforze frls-HCl 0,03 N (pH 7,5) zawierajacym 3 mM Mg&2» 600 /ig oczyszczonego enzymu R 39, rozpuszczonego w 1 ml buforu Tris-HCl (pH 7,7) zawierajacego 0,2 M NaCl 1 0,05 N tfeCl^, poddano dializie w ciagu 6 godzin przez 200 ml buforu Hepes 0,1 M (pH 7,77) zawierajacego 0,1 M lfeCl i 0,05 M MgClg. Operacje te powtórzono czterokrotnie, Tris-HCl * chlorowodorek 2-amino-2-hydroksymetylo-propandio- lu-1,3 Hepes « kwas 4-hydroksyetylo-1-piperazynoetanosulfonowy.144 340 11 c*2* Wytwarzanie zywicy 100 mg zywicy poli/N, N-dwumetyloakryloamldowej/ zawierajacej funkcyjne grupy estrowe pochodne dwuestru N-hydroksysukcynlmidu kwasu glutarowego, otrzymanej jak opi¬ sano w b*2) speczniono w 50 ml N, N-dwunetyloacetamiduu Gdy perelki osiagnely maksymalny stopien specznienia (po okolo 3 godzinach)9 zywice przesaczono i przemyto pieciokrotnie 100 ml buforu Hepes 0,1 M (pH 7*7) i pieciokrotnie 100 ml buforu Hepes 0,1 N (pH 7,7) zawierajacego 0,1 M Na Cl i 0,05 M Mgd2<. c*3* Sprzeganie enzymu z zywica Wilgotna zywice, sporzadzona, jak opisano w c*2) wieszczono z 10 ml fiolce* Dodano 70yug (1320 pikomoli) enzymu R 39, sporzadzonego jak opisano w c*1) rozpuszczo¬ no w 1,75 ml buforu Hepes 0,1 M (pH 7,7) zawierajacego 0,1 N IbCl 1 0,05 N MgO^* festepnie fiolke poddawano ruchowi obrotowemu o 100 obrotów/minute w ciagu 16 godzin w temperaturze pokojowej* Zywice przesaczono i przemyto pieciokrotnie 10 ml buforu Hepes 0,1 N (pH 7,7) zawierajacego 0,1 M NaCl 1 0,05 M tyg&2* H tej operacji zywice utrzymywano pod próz¬ nia pompki wodnej w ciagu 30 minut* Ciezar tak otrzymanej zywicy wyniósl 503 mg# Aktyw¬ nosc enzymatyczna enzymu R 39 unieruchomionego na tej zywicy odpowiadala 15 mg (283 pikomolom). Wydajnosc unieruchamiania wyniosla wiec 21 %, Enzym R 39 unieruchomiony na stalym podlozu posiada znakomita trwalosc 1 w zwiazku z tym wytrzymuje podwyzszone temperatury, do 70° C* Z tego wzgledu Inkubacja plynu biologicznego z unieruchomionym enzymem R 39 moze byc prowadzona w przedziale tem¬ peratur 20-50°C Korzystna temperatura wynosi 37°C. W praktyce, w tych warunkach czas inkubacji, scisle zwiazany z czasem potrzebnym do utworzenia równomolowego nieaktyw¬ nego kompleksu enzym-antybiotyk, wynosi okolo 2o minut* Rezultatem podwyzszenia tempe¬ ratury inkubacji bedzie skrecenie jej czasu i odwrotnie* Mozliwe jest wiec dalsze ko¬ rzystne skrócenie czasu procesu przez podwyzszenie temperatury* Zgodnie ze sposobem wedlug wynalazku, po zakonczeniu stadium (1) unierucho¬ miony enzym R 39 oddziela sie od plynu biologicznego* oddzielanie to moze byc prowadzo¬ ne dogodnym znanym sposobem, na przyklad przez dekantacje, filtracje lub wirowanie* Korzystna jest zwyczajna filtracja* Nastepnie unieruchomiony enzym przemywa sie raz lub kilka razy odpowiednim buforem* w celu usuniecia sladów plynu biologicznego, który mogloby tam wystepowac* W stadium (2) sposobu wedlug wynalazku unieruchomiony enzym (pozbawiony plynu biologicznego) inkubuje sie z okreslona iloscia peptydu w roztworze* fbdczas tego eta¬ pu frakcje enzymu nie zuzyta przy tworzeniu kompleksu enzym-antybiotyk w etapie (1), stosuje sie do prowadzenia hydrolizy peptydu specyficznego dla enzymu R 39* Ta reakcja hydrolizy bedzie wiec prowadzila do ilosci D-alaniny odpowiadajacej resztkowej aktyw¬ nosci enzymu R 39* Znajac budowe samego enzymu R 39, jest oczywiste, ze jako peptyd mozna stoso¬ wac wszelkie peptydy posiadajace terminalne grupy D-alanylo-D-alaninowe* Wylacznie jako przyklady nleogranlczajace mozna przytoczyc N, N-dwuacetylo-b-lizylo-D-alanylo-lala- nine, N-acetylo-L-lizylo-D-alanylo-lalanine, itp* Ilosc peptydu uzytego do reakcji o tyle nie jest krytyczna, ze stosuje sie duzy nadmiar peptydu w stosunku do ilosci enzymu R 39* W praktyce nalezy zawsze prowadzic proces w warunkach nasycenia enzymu peptydem* Warunki pracy podczas tego etapu sa dokladnie takie same jak wskazano wyzej dla etapu (1 )* Inkubacja moze byc prowadzona w przedziale temperatur 20-50°C* korzystnie w temperaturze okolo 37°C* Czas inkubacji winien byc przynajmniej wystarczajacy do uzyskania mierzalnej ilosci D-alaniny z enzymem R 59 niezdezaktywowanym* Czas ten wy¬ nosi korzystnie okolo 30 minut przy temperaturze Inkubacji 37°C Moze byc on skrócony12 144 340 przez podwyzszenie temperatury inkubacji, lub przeciwnie, przedluzony przez obnizanie temperatury* Korzystne wiec jest podwyzszanie temperatury inkubacji we wszystkich przy¬ padkach gdzie szybkosc oznaczania Jest istotnym czynnikiem, Ela zachowania optymalnej aktywnosci enzymatycznej, srodowisko inkubacji winno korzystnie miec pH 7-8,5* Zazwyczaj utrzymuje sie wartosc pH okolo 7,7, przez prowadze¬ nie inkubacji w srodowisku odpowiedniego buforu* W etapie (3) procesu wedlug wynalazku oznacza sie ilosc D-alaniny utworzonej w etapie (2).Oznaczenie D-alaniny mozna prowadzic dowolnym znanym sposobem* Oiodzl tylko o to, by byl to sposób szybki, tani i pozwalajacy na specyficzne oznaczanie IValaniny z wylaczeniem wszystkich innych produktów obecnych w badanym plynie* Dlatego najkorzys¬ tniejsze sa metody enzymatyczne pozwalajace na kolorymetryczne oznaczanie Ialaniny* Szczególnie przydatna jest metoda enzymatyczna opisana przez J#M.FTere'a i wspólprac* w Jtethods in Enzymology, Vbl* XLV, cz*B, (1976), 610-636", zwlaszcza na stronach 612 i 613* W metodzie tej ]alanina utleniania jest do kwasu pirogronowego za pomoca oksy¬ dazy D-aminokwasu razem z jej koenzymem, flawino-adeninodwunukleotydem; równoczesnie tworzy sie ilosc nadtlenku wodoru odpowiadajaca ilosci Ialanlny* Ten nadtlenek wodoru jest z kolei zuzywany do utleniania o-dwuanizydyny z pomoca peroksydazy* Etonlewaz ilosc tak utworzonej utlenionej o-dwuanizydyny scisle zalezy od ilosci D-alaniny a utleniona o-dwuanlzydyna wywoluje zabarwienie, pomiar intensywnosci tak powstalej barwy moze slu¬ zyc do oznaczania ilosci D-alaniny metoda kolorymetryczna* Oczywiscie, uklad ten opiera sie zasadniczo na stosowaniu jednej substancji, mianowicie o-dwuanizydyny, której forma utleniona 1 forma zredukowana posiadaja rózne zabarwienie* Substancje takie znane sa w technice pod nazwa indykatorów redoks* Aktualnie istnieje caly szereg Indykatorów redoks, które skutecznie moga zaste¬ powac o-dwuanlzydyne w tej metodzie* Dla przykladu mozna przytoczyc sól amonowa kwasu 2,2'-azynobls (3^tylo-2,3-dwuhydro-6-benzotiazolosulfonowego)-4-aminoantyplryne w obec¬ nosci fenolu lub N, N-dwumetyloaniliny itp* HLatego tez, w korzystnym wykonaniu, ilosc D-alaniny oznacza sie przez inku¬ bacje mieszaniny otrzymanej w etapie (2) z - z jednej strony - oksydaza D-aminokwasu katalizujaca utlenianie D-alaniny do kwasu pirogronowego (z równoczesnym wytworzeniem nadtlenku wodoru) i - z drugiej strony - peroksydaza 1 indykatorem redoks, który jest utleniany utworzonym nadtlenkiem wodoru* z pomoca paroksydazy, wywolujac zabarwienie którego intensywnosc jest funkcja ilosci D-alaniny* Lacznie z oksydaza D-aminokwasu stosuje sie zawsze Jej koenzym, flawino-adanino-dwunukleotyd (FAD)* W tym korzystnym wykonaniu wynalazku mozna w zasadzie stosowac kazdy indyka¬ tor redoks zdolny do utleniania poprzez nadtlenek wodoru, w obecnosci pereksydazy jako katalizatora* Szczególnie korzystnymi indykatorami redoks sa o-dwuanizydyna, której postac utleniona na zabarwienie brazowe (maksimum absorpcji przy Ar • 460 nm) oraz sól amonowa kwasu 2,2^azinobis/3-etylo-293-dwuhydro-6-benzotiazolosulfonowego), której postac utleniona ma zabarwienie zielone (maksimum absorpcji przy X « 420 nm)* H&lezy zaznaczyc, ze zabarwienie brazowe utlenionej o-dwuanizydyny korzystnie moze byc zmienione w zabarwienie jaskrawoczerwone przez dodanie kwasu siarkowego* Takie czerwone zabarwienie jest bardzo trwale, co jest niezwykle istotne gdy pragnie sie utrzymac wynik oznaczania w ciagu pewnego czasu* fbnadto, w celu zapewnienia szybkiego oznaczania mozliwe jest prowadzenie eta¬ pów (2 i 3) równoczesnie* W takim wykonaniu, bezposrednio do stadium (2) dodaje sie odczynniki pozwalajace na oznaczanie D-alaniny w mieszaninie unieruchomionego enzymu 1 roztworu peptydu i prowadzi sie pojedyncza inkubacje calosci, w warunkach dokladnie takich samych jak podano wyzej dla etapu (2)«144 3*0 13 W etapie (4) procesu, oznaczenie z etapu (3) porównuje sie z wzorcem dla uzyskania stezenia antybiotyku w cieczy biologicznej* Oznaczenie ilosciowe stezenia antybiotyku mozna prowadzic metoda opisana ponizej* Najpierw sporzadza sie serie próbek cieczy biologicznej zawierajacej znane ste¬ zenie antybiotyku beta-laktamowego* Seria taka bedzie zawierala, oprócz pewnej liczby próbek zawierajacych rosnace stezenie antybiotyku, dwie próbki plynu biologicznego wolne od antybiotyku* Nastepnie wszystkie te próbki poddaje sie w sposób rygorystycznie iden¬ tyczny etapom (1,2 13) sposobu wedlug wynalazku* Z Jednej z próbek wolnych od antybiotyku zastepuje sie roztwór peptydu stosowa¬ nego w etapie (2) Identyczna objetoscia wody* W tym szczególnym przypadku otrzyma sie wiec, po zakonczeniu etapu (3), roztwór zawierajacy wszystkie odczynniki z wyjatkiem peptydu* Etoniewaz nie bedzie peptydu nie powstanie IValanina i w zwiazku z tym o-dwuani- zydyna nie zostanie utleniona* Otrzymany roztwór bedzie mial zabarwienie Jasnozólte* ftróbka ta bedzie oznaczona ponizej Jako slepa próba* lbtomiast druga próbka wolna od antybiotyku ma zabarwienie ciemnobrazowe* Rmie- waz próbka Jest wolna od antybiotyku, enzym R 39 nie Jest zdezaktywowany w etapie (1) i powstaje maksymalna ilosc D-alaniny (odpowiadajaca calkowitej aktywnosci uzytego enzy¬ mu R 39) a wiec i maksymalna ilosc utlenionej o-dwuanizydyny, wobec czego powstanie zabarwienie ciemnobrazowe* Rróbka taka bedzie oznaczona ponizej Jako próbka kontrolna* Zrozumiale Jest takze, ze gdy próbki zawieraja molowa ilosc antybiotyku nizsza od ilosci molowej uzytego enzymu R 39, tylko czesc tego enzymu bedzie zdezaktywowana przez antybiotyk w etapie (1); w takich przypadkach powstanie wiec ilosc lalaniny odpo¬ wiadajaca resztkowej aktywnosci tej czesci enzymu, która nie zostala zdezaktywowana- przez antybiotyk i w zwiazku z tym takze odpowiednia ilosc utlenionej o-dwuanizydyny• V tych przypadkach takze powstanie brazowe zabarwienie, lecz o intensywnosci nizszej od intensywnosci próbki kontrolnej* I wreszcie, gdy próbki zawieraja molowa ilosc antybiotyku równa lub wyzsza od ilosci molowej uzytego enzymu R 39, enzym zostanie calkowicie zdezaktywowany przez anty¬ biotyk podczas etapu (1), nie powstanie wiec lalanlna a o-dwuanizydyna nie hostanie utleniona. W takich przypadkach otrzyma sie zabarwienie jasnozólte identyczne z zabar¬ wieniem slepej próby.Dla uzyskania precyzyjnego oznaczenia mierzy sie spektrofotometrem gestosc optycz¬ na zabarwien otrzymanych odpowiednio ze wszystkimi próbkami, w tym takze z próbka slepa i kontrolna* Rmiewaz dla próbki slepieJ znajduje sie takze pewna wartosc gestosci optycz¬ nej, niezbedne jest odjecie tej wartosci od wartosci znalezionych odpowiednio dla próbki kontrolnej i dla innych próbek* Z tak otrzymanych wartosci gestosci optycznej oblicza sie % aktywnosci resztko¬ wej (enzymu R 39) dla kazdej próbki* % ten jest równy stosunkowi, pomnozonemu przez 100, wartosci gestosci optycznej znalezionych odpowiednio dla oznaczanej próbki 1 próbki kontrolnej* Ifestepnie rysuje sie wykres,. zawieraJacy na osi odcietych stezenia antybiotyku, a na osi rzednych % aktywnosci resztkowej enzymu R 39* Otrzymuje sie prosta, która przecina odpowiednio os rzednych w punkcie odpowia¬ dajacym próbce kontrolnej (100* resztkowej aktywnosci enzymatycznej) oraz os odcietych w punkcie odpowiadajacym próbce zawierajacej ilosc antybiotyku równa ilosci molowej uzy¬ tego enzymu R 39 (0* resztkowej aktywnosci enzymatycznej)*14 144 340 Tak otrzymany grafik stanowi wzorzec pozwalajacy na oznaczenie nieznanego steze¬ nia antybiotyku beta-laktamowego w próbce plynu biologicznego poddanej badaniu* W tym celu próbke te poddaje sie w sposób rygorystyczny identyczny etapom (1, 2 i 3) procesu wedlug wynalazku, mierzy sie spektrofotometrem gestosc optyczna uzyskanego zabarwienia, znaleziona wartosc odejmuje sie od gestosci optycznej znalezionej dla slepej próbki; oblicza sie % resztkowej aktywnosci enzymatycznej w sposób pokazany powyzej i uzyskuje sie stezenie antybiotyku w próbce w oparciu o wzorzec* Mozna tu oznaczyc w sposób ilosciowy tak male stezenia antybiotyku jak 0,0003 U* I*/ml plynu biologicznego w czasie krótszym od 1 godziny* Jednakze metoda ta wymaga stosowania spektrofotometru i analiza winna byc w za¬ sadzie prowadzona w laboratorium* Natomiast, gdy zamierza sie tylko stwierdzic, czy stezenie antybiotyku przekracza lub nie pewien próg (na przyklad maksymalne stezenie wymagane przez przemysl mleczarski), nie ma potrzeby stosowania spektrofotometru* Wy¬ maga to jednak wczesniej kilku wyjasnien* Jak powiedziano wyzej, krzywa wzorcowa przecina os odcietych w punkcie odpowia¬ dajacym próbce zawierajacej ilosc antybiotyku równa molowej ilosci uzytego enzymu R 39* firzy takim krytycznym stezeniu % resztkowej aktywnosci enzymatycznej równa sie zero, poniewaz po zakonczeniu etapu (3) procesu wedlug wynalazku otrzymuje sie jasnozólte zabarwienie, identyczne jak w slepej próbce. fbwyzej tego krytycznego stezenia równiez otrzymuje sie zabarwienie Jasnozólte, poniewaz % resztkowej aktywnosci enzymatycznej wynosi ciagle zero* Rrzeciwnie, ponizej tego krytycznego stezenia otrzymuje sie zabarwienie brazowe, poniewaz wystepuje pewien % resztkowej aktywnosci enzymatycznej* W zwiazku z tym, opierajac sie po prostu na zabarwieniu zaobserwowanym po za¬ konczeniu etapu (3) procesu, mozna ocenic bezposrednio w próbce czy stezenie antybiotyku przekracza czy nie wymienione stezenie krytyczne* Wystarczy wiec znac wymienione stezenie krytyczne, by móc nastepnie, bez uzycia spektrofotometru, oznaczyc szybko czy próbka zawiera stezenie antybiotyku beta-lakta¬ mowego przekraczajace (lub nie) to stezenie krytyczne* W tym celu próbke poddaje sie w sposób identyczny etapom (1, 2 i 3) procesu wedlug wynalazku a nastepnie obserwuje sie po prostu otrzymane zabarwienie; jesli jest ono jasnozólte to stezenie antybiotyku bedzie przynajmniej równe stezeniu krytycznemu; jesli, przeciwnie, bedzie ono brazowe, to stezenie antybiotyku bedzie nizsze od stezenia krytycznego* W ten sposób mozna oznaczyc, wizualnie i w sposób pewny, czy próbki zawieraja wiecej czy mniej niz 0,002 U* I* antybiotyku na 1 ml cieczy biologicznej i to w czasie krótszym od 1 godziny* Metoda ta nadaje sie wiec doskonale do badania serii próbek mleka, nawet poza laboratorium, na przyklad na miejscu w fermie, przez personel niewyspecjalizowany* Metoda oznaczania ilosciowego i jakosciowego stezenia antybiotyku wedlug wy¬ nalazku zostanie wyjasniona szczególowo, zwlaszcza w odniesieniu do zmiany barwy wy¬ wolanej o-dwuanizydyna* Jednakze dla fachowca bedzie jasne, ze poslugujac sie w tej metodzie innymi Indykatorami redoks, zmianie ulegnie tylko barwa* Do realizacji sposobu wedlug wynalazku opracowano zestaw analityczny* Zestaw ten sklada sie zwlaszcza z wymienionej powyzej ilosci rozpuszczalnej D-alanylo-EHala- ninokarboksypeptydazy produkowanej przez Actinomadura R 39, przy czym enzym ten Jest unieruchomiony na podlozu nierozpuszczalnym w wodzie, okreslonej ilosci peptydu, odczynników pozwalajacych na oznaczenie D-alaniny oraz ewentualnie z wzorca, w sto¬ sunku do którego moga byc porównane rezultaty prób przeprowadzonych z odczynnikami (1f 2 13).144 34o 15 W korzystnej formie realizacji - enzym R 39 Jest unieruchomiony na zywicy poll/ -N,N-dwumetyloakryloamldoweJ/ usieclowanej Jako peptyd stosuje sie trójpeptyd N,N-dwu- acetylo-I/-lizylo-D*alamylo-D-alanine, a Jako odczynniki (a) oksydaze D-aminokwasu (wraz z Jej koenzymem, flawinoadenlno-dwunukleotydem, (b) perokdydaze i (c) Indykator redoks9 na przyklad o-dwuanizydyne.Jako wzorzec mozna ewentualnie dolaczyc do zestawu wykres ustalajacy zaleznosc pomiedzy stezeniami antybiotyku i % resztkowej aktywnosci enzymu R 39# W ten sposób mozna przeprowadzic oznaczenia Ilosciowe - Jak to równiez wyjasniono powyzej* wykres ta¬ ki nie Jest Jednak nieodzowny. W praktyce, gdy zestaw bedzie sluzyc wylacznie do ozna¬ czania, czy stezenie antybiotyku przekracza lub nie pewna wartosc graniczna, wystarczy wskazac w przepisie, przy Jakim stezeniu antybiotyku obserwuje sie zmiane barwy, po obróbce próbki sposobem wedlug wynalazku* W szczególnosci korzystnej formie realizacji wynalazku unieruchomiony enzym umieszcza sie w strzykawce wyposazonej na dnie w plytke, z materialu filtrujacego, na przyklad ze spieku szklanego* Takie urzadzenie ulatwia oddzielenie przez filtracje unie¬ ruchomionego enzymu R 39 od plynu biologicznego a takze przemycie enzymu na zakoncze¬ nie etapu (1 )• Ebwyzsze przyklady ilustruja sposób wedlug wynalazku nie ograniczajac Jego zakresu* Przyklad I* Frzyklad ten ilustruje stosowanie sposobu wedlug wynalazku do oznaczania malych stezen penicyliny G w mleku* (a) Otrzymywanie odczynników (1) unleucrhamianie enzymu R 39 Bizym R 39 unieruchomiono na zywicy poli/N,tMwumetyloakryloamldowej/ metoda opisana w przykladowym opisie wykonania wynalazku* (2) Roztwór peptydu Sporzadzono roztwór zawierajacy 6 mg N,N-dwuacetylo-b»lizylo-D-alanylo-D"ala- nlny w 1 ml wody* (3) Zawiesina oksydazy D-aminokwasu Sporzadzono zawiesine zawierajaca 3 mg oksydazy D-aminokwasu (aktywnosc wlas¬ ciwa: 15 U/mg) na 1 ml wodnego 3 M roztworu siarczanu amonu* (4) Roztwór flawlno-adanlno-dwunukleotydu (FAD)* Sporzadzono roztwór zawierajacy 300 mg FAD w 6 ml buforu Tris-Hd 0,1 N (pHt 8,0 )• (3) Roztwór peroksydazy Sporzadzono roztwór zawierajacy 50 yug peroksydazy na ml wody* (6) Roztwór o~dwuanizydyny Sporzadzono roztwór zawierajacy 2,6 mg dwuchlorowodorku o-dwuanizydy w 500 Mg wody. (b) Postepowanie Sporzadzono serie 1 ml próbek mleka, z których kazda zawierala znane stezenie penicyliny, G, a takze dwie 1 ml próbki mleka (slepa i kontrolna), wolne od penicyliny G* Do kazdej próbki dodano 5,5 mg enzymu R 39 unieruchomionego (» 3 pikomole enzymu) 1 inkubowano mieszanine w ciagu 2o minut w temperaturze 37°G Nistepnle przez filtracje oddzielono mleko od unieruchomionego enzymu i przemyto go trzykrotnie 1 ml buforu Hepes 0,1 (pH * 7,7) zawierajacego IfcCl 0,1 M i ngCL2 0,05 M.Naistepnie do tak oddzielonego i przemytego unieruchomionego enzymu dodano 20 /ul buforu Hepes 0,1 N (pH . 7,7) zawierajacego fbCl 0,1 M 1 tfeCLg 0,05 oraz badz 10 /ul roztworu peptydu (w przypadku próbki kontrolnej 1 próbek zawierajacych penicyline G), badz 2o /Jl buforu Hepes 1 10 /ul wody (w przypadku próbki slepej)* Mieszamine inkubowano w ciagu 30 minut w temperaturze 37°C*16 144 34o R zakonczeniu inkubacji do otrzymanego produktu dodano odpowiednio 2/ul zawie¬ siny oksydazy D-aminokwasu, 6o Ali roztworu FAD^ 10 /Ul roztworu peroksydazy i 5 /ii roztwo¬ ru o-dwuanizydyny; nastanie inkubowano mieszanine ponownie w ciagu 10 minut w tempe¬ raturze 37°C* aderzono spektrofotometrem gestosc otrzymanych barwnych roztworów* W tym celu do kuwety dodano 1 ml roztworu metanol-woda (1:1) i zmierzono gestosc optyczna przy 460 nm* Odjeto wartosc gestosci optycznej znalezionej dla slepej próbki od wartosci znalezionych odpowiednio dla próbki kontrolnej i pozostalych próbek* obliczono % resz¬ tkowej aktywnosci enzymatycznej dla kazdej próbki, na podstawie tak otrzymanych wartosci gestosci optycznej* Rezultaty uzyskane dla dwóch serii 1 ml próbek mleka zawierajacych zmienne stezenia penicyliny G zestawiono w tablicy 1 ponizej* Tablica 1 A I seria 2 3 4 5 kontrolna slepa II seria 1 2 3 4 kontrolna slepa B 0,0082 0.0041 0,0020 0,0010 0,0005 0 0 0,0020 0,0015 0,0010 0,0005 0 0 C 0,035 0,040 0,035 0,150 0,170 0,200 0,035 0,040 0,055 0,100 0,145 0,195 0,035 A 0,000 0,005 0,000 0,115 0,135 0,165 - 0,005 0,020 0,065 0,110 0,160 ¦»»—¦»¦ MM M^M^M % 0 3 0 69 82 100 - 3 12 41 69 100 - D jasnozólte jasnozólte jasnozólte zóltobrazowe brazowe brazowe jasnozólte jasnozólte zólte zóltobrazowe zóltobrazowe brazowe jasnozólte A - nwer próbki; B - stezenie penicyliny G (U. I*/ml); C - gestosc optyczna przy 460 nm; A - gestosc optyczna znaleziona (kolumna 3) - gestosc optyczna slepej próbki; % - % resztkowej aktywnosci enzymatycznej; D - zaobserwowane zabarwienie Tak otrzymane rezultaty odtworzono w postaci wykresu przedstawionego na zala¬ czonym rysunku* fe wykresie tym na osi odcietych naniesiono stezenia penicyliny G w lLI»/ml, a na osi rzednych % (symbol %) resztkowej aktywnosci enzymatycznej* Wykres ten stanowi wzorzec pozwalajacy na oznaczenie stezenia penicyliny G w innych 1 ml próbkach mleka* W tym celu próbki te przerabia sie w sposób opisany w przy¬ kladzie 1 okresla w nich stezenie penicyliny G w oparciu o wzorzec* Z tablicy 1 wynika, ze dla próbki zawierajacej 0,002 UL I* penicyliny lub wie¬ cej na ml mleka znaleziono resztkowa aktywnosc enzymatyczna rzedu 0 % i stwierdzono za¬ barwienie jasnozólte identyczne z zabarwieniem slepej próbki* Z drugiej strony* dla próbek zawierajacych mniej niz 0,002 U* X* penicyliny na ml mleka stwierdzono pewien % resztkowej aktywnosci enzymatycznej 1 zaobserwowano zabarwienie zóltobrazowe lub brazowe*144 340 17 W zwiazku z tym, opierajac sie po prostu na zabarwieniu zaobserwowanym po za¬ konczeniu ostatniej inkubacji mozna oznaczac wizualnie 1 w sposób pewny, czy próbka mle¬ ka zawiera stezenie przynajmniej równe 0,002 U. I* penicyliny na ml mleka, czyli 1,2 ng/ml mleka. Przy takim lub wyzszym stezeniu otrzymuje sie zabarwienie jasnozólte, identyczne z zabarwieniem slepej próbki. I przeciwnie, ponizej tego stezenia (na przyklad jesli próbka nie zawiera penicyliny) zabarwienie zmienia sie z jasnozóltego na brazowe.J&k widac, sposób wedlug wynalazku pozwala na przeprowadzenie bardzo szybko oznaczenia bardzo malych stezen penicyliny w mleku, bez uzycia spektrofotometru lub innego podobnego aparatu analitycznego# Na tym polega korzysc ze stosowania sposobu wedlug wynalazku, pozwalajacego na szybkie 1 seryjne badanie mleka, nawet na miejscu Je¬ go odbioru, tzn. na fermie.Rnadto jest oczywiste, ze sposób ten moze byc równiez stosowany do prowadze¬ nia oznaczen ilosciowych w laboratorium. Wykres przedstawiony na zalaczonym rysunku Jasno wskazuje, ze mozliwe jest przy stosowaniu spektrofotometru oznaczac tak male stezenia penicyliny Jak 0,0005 UL/ml mleka, czyli 0,3 ng/ml mleka.Przyklad II. Brzyklad ten ilustruje stosowanie sposobu wedlug wynalazku do oznaczania malych stezen penicyliny G w surowicy i w moczu. fbstepowano jak w przykladzie I i stosowano te same odczynniki, zastepujac 1 ml próbki mleka 1 ml próbkami surowicy lub moczu.Otrzymane rezultaty zestawiono w tablicach 2 13, odpowiednio dla surowicy i dla moczu.Tablica 2 (surowica) A 1 2 kontrola slepa A 1 2 kontrola slepa B 0,010 0,003 0 0 B 0,010 0,003 0 0 c 0,030 0,035 0,145 0,030 Tablica C 0,035 0,040 0,150 0,030 A 0,000 0,005 0,115 3 (mocz) A 0,005 0,010 0,120 * 0 4 100 % 4 8 100 D Jasnozólte Jasnozólte brazowe Jasnozólte D Jasnozólte Jasnozólte brazowe jasnozólte Tablice 2 13 wskazuja, w sposób jasny, ze sposób wedlug wynalazku moze byc stosowany z powodzeniem do oznaczania wizualnego czy próbka surowicy lub moczu zawiera stezenie przynajmniej równe 0,003 U* X. penicyliny na ml surowicy lub moczu. ft*zy takim lub przy wyzszym stezeniu zaobserwowane zabarwienie Jest Jasno¬ zólte, Nalezy zaznaczyc, ze w przypadku moczu nie mozna takiego oznaczenia przepro¬ wadzic metoda J.M.firere'a, w której stosuje sie enzym R 39 rozpuszczalny lecz nie unieruchomiony i to nawet przy tak malych objetosciach moczu Jak 10 lii*18 144 340 Przyklad HI* Rrzyklad ten ilustruje stosowanie sposobu wedlug wy¬ nalazku do oznaczania cefalosperyny C w surowicy* Rstcowano Jak w przykladzie I i stosowano te same odczynniki, lecz zaste¬ pujac 1 ml próbki mleka 1 ml próbkami surowicy, z których kazda zawierala znane ste¬ zenie cefalosporyny C.Otrzymane rezultaty zestawiono w tablicy 4 ponizej: Tablica 4 A 1 2 3 kontrola slepa B* 10 2 1 0 0 c 0,030 0,040 0,085 0,155 0,030 A 0,000 0,010 0,055 0,125 - * 0 8 44 100 D Jasnozólte Jasnozólte zóltobrazowe brazowe Jasnozólte X'B - stezenie cefalosporyny C (ng/ml) Przyklad IV# frzyklad ten ilustruje stosowanie sposobu wedlug wyna¬ lazku do oznaczania cefalosporyny C w surowicy, prowadzonego w wyzszej temperaturze* Fbstepowano Jak w przykladzie III, lecz kazda inkubacje prowadzono w tempera¬ turze 47°C i w czasie o polowe krótszym* Etonadto do kazdej 1 ml próbki surowicy dodano wczesniej 100 ul buforu Hepes 0,5 M (pH 7,7) zawierajacego NaCL 0,5 M i JfcCl2 0,25 M.Otrzymane rezultaty zestawiono w tablicy 5 ponizej: Tablica 5 A 1 2 3 kontrola slepa B* 10 2 1 0 0 c 0,040 0,035 0,095 0,180 0,035 0,005 0,000 0,060 0,145 ¦»—MMMM»» ^^^^m 0 0 41 100 - D Jasnozólte Jasnozólte zóltobrazowe brazowe Jasnozólte X'B - stezenie cefalosporyny C (ng/ml) Rrzyklad ten Jasno wskazuje, te przez podwyzszenie temperatury inkubacji mozli¬ we Jest znaczne skrócenie czasu procesu* PL PL